Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние мелатонина на терапевтическую эффективность и токсичность комбинированной противоопухолевой терапии при экспериментальной неоплазии

ДИССЕРТАЦИЯ
Влияние мелатонина на терапевтическую эффективность и токсичность комбинированной противоопухолевой терапии при экспериментальной неоплазии - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Влияние мелатонина на терапевтическую эффективность и токсичность комбинированной противоопухолевой терапии при экспериментальной неоплазии - тема автореферата по медицине
Вашуркина, Ирина Михайловна Саранск 2013 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.03.06
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Влияние мелатонина на терапевтическую эффективность и токсичность комбинированной противоопухолевой терапии при экспериментальной неоплазии

005531278

На правах рукописи

ВЛШУРКИНА ИРИНА МИХАЙЛОВНА

ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА ТЕРАПЕВТИЧЕСКУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ТОКСИЧНОСТЬ КОМБИНИРОВАННОЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

НЕОПЛАЗИИ

14.03.06-Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

-4 ИЮЛ 2013

Саранск - 2013

005531278

Работа выполнена на кафедре фармакологии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» (г. Саранск)

Научный руководитель: доктор медицинских наук доцент

Сипров Александр Владимирович

ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный

университет им. Н. П. Огарёва».

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор

Кузин Владимир Борисович, заведующий кафедрой общей и клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 603005, г. Нижний Новгород, пл. Минина, 10/1

доктор медицинских наук профессор Балыкова Лариса Александровна, заведующий кафедрой педиатрии ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева», 430005, г. Саранск, Республика Мордовия, ул. Большевистская, 68

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Казанский государственный

медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49.

Защита диссертации состоится >> 2013 года в /У^часов на

заседании диссертационного совета Д 212.117.08 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» (430032, г. Саранск, ул. Ульянова, 26).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева» (430005, г. Саранск, ул. Большевистская, д. 68), с авторефератом - на официальном сайте Минобрнауки.

Автореферат разослан 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

А.Г. Голубев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что злокачественные опухоли занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности населения. Использование комбинированного химиолучевого лечения злокачественных опухолей является одним из перспективных направлений в клинической онкологии (Parkin D.M. et al., 2005; Канаев C.B., 2008). Однако сочетанное применение лучевой терапии с химиопрепаратами наряду с усилением резорбции опухоли сопровождается более выраженными побочными реакциями, в том числе миелосупрессией. Незапланированные перерывы в лечении, обусловленные развивающимися осложнениями, ухудшают отдаленные результаты противоопухолевой терапии (Черниченко A.B. с соавт., 2008).

Разработка подходов к реализации максимально возможной специфической активности широко применяемых в клинике цитостатических методов терапии осуществляется по разным направлениям, в том числе путем снижения их токсичности при использовании антитоксических модификаторов (Давыдов М.И., Барышников А.Ю., 2003).

В клинической онкологии все более прочные позиции занимает поддерживающая терапия, позволяющая не только предупредить или уменьшить проявления нежелательных побочных эффектов лекарственной и лучевой терапии, но и в значительной степени уменьшить степень проявления тяжелых осложнений, обусловленных распространенным опухолевым процессом (Константинова М.М., 2002). Не менее важным является тот факт, что в процессе злокачественного роста происходит изменение показателей антиокислительной активности и окислительного статуса опухоли, что может отражаться на органах и тканях организма.

Известно, что свободнорадикальное окисление играет важную роль в процессах возникновения и развития опухоли (Лебедева В.А. с соавт., 2007; Меньщикова Е.Б. с соавт., 2008; Белоногов Р.Н. с соавт., 2009). С учетом патогенетической значимости активации свободнорадикальных реакций в развитии опухолевого процесса и многих осложнений противоопухолевой терапии (Ефремов A.B. с соавт., 2009; Свистунов A.A. с соавт., 2010) исследуется эффективность применения препаратов, обладающих антиоксидантным действием, с различным механизмом и уровнем воздействия на процессы перекисного окисления липидов в качестве антитоксических модификаторов. Вместе с тем, сведения о влиянии таких средств на специфическую активность и токсичность химио- и лучевой терапии и морфофункциональные изменения в опухолевом узле и органах-мишенях в сравнительном аспекте неоднозначны и немногочисленны.

В ранее проведенных исследованиях (Немцова Е.Р., 2006; Сипров A.B., 2009; МикулякН.И., 2011; Зорькина A.B., Скопин П.И., 2011) доказана эффективность и целесообразность включения некоторых

з

антиоксидантов в схему противоопухолевой химиотерапии. Однако поиск средств, наиболее эффективно снижающих токсические осложнения противоопухолевой химио- и лучевой терапии, и оптимизирующих терапевтический эффект лечения основного заболевания, по-прежнему остается актуальным.

Наличие у мелатонина антиоксидантных свойств, превышающих таковые у известных антиоксидантов токоферола и аскорбиновой кислоты (Арушанян Э.Б. с соавт., 2006), а также малочисленные и противоречивые сведения в литературе о возможности его применения при онкопатологии, стали основанием для исследования эффективности применения мелатонина как препарата сопровождения в сравнении с антиоксидантом мексидолом при комбинированной противоопухолевой терапии.

Цель работы: провести сравнительную оценку влияния мелатонина и мексидола на терапевтическую эффективность, миело- и гепатоксичность комбинированной химиолучевой терапии мышей с карциномой легкого Лыоис.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать влияние мелатонина на противоопухолевый и антиметастатический эффекты химиолучевой терапии у мышей с карциномой легкого Лыоис.

2. Оценить влияние мелатонина на некоторые показатели перекисного окисления липидов в сыворотке крови, первичном опухолевом узле и печени мышей с карциномой легкого Лыоис на фоне комбинированной противоопухолевой терапии.

3. Сравнить терапевтическую эффективность комбинаций химиолучевой терапии с мелатонином и препаратом сравнения мексидолом, а также миело- и гепатопротекторные свойства этих препаратов у мышей с карциномой лёгкого Лыоис.

4. Изучить влияние мелатонина в сравнении с мексидолом на патоморфологические изменения в тканях первичного опухолевого узла и печени у мышей с карциномой легкого Льюис при комбинированной противоопухолевой терапии.

Научная новизна работы.

В работе показано, что мелатонин не снижает терапевтическую эффективность комбинированной химиолучевой терапии. Мелатонин в сопоставимой с мексидолом степени предупреждает развитие лейкоцитоза на 14-е сутки эксперимента при химиолучевой терапии, корригирует лимфопению, но эффективнее мексидола препятствует снижению содержания гемоглобина в крови. Установлено, что мелатонин эффективнее мексидола препятствует снижению содержания полихроматофильных и оксифильных нэрмоцитов в костном мозге (на 22-е сутки эксперимента) при химиолучевой терапии.

Показано, что мелатонин в сопоставимой с мексидолом степени

оказывает гепатопротекторное действие, уменьшая концентрацию AJ1T и ACT в сыворотке крови, структурные изменения долек печени и лимфогистиоцитарную инфильтрацию портальных трактов.

Установлено, что мелатонин в сопоставимой с мексидолом степени препятствует активации процессов перекисного окисления липидов в сыворотке крови у животных при химиолучевой терапии, и не снижает интенсифицированную активность свободнорадикальных процессов в первичном опухолевом узле.

Сочетанное использование химиолучевой терапии с мелатонином и мексидолом сопровождается положительными патоморфологическими изменениями в ткани первичного опухолевого узла, что проявляется в уменьшении полиморфизма опухолевых клеток и фигур митоза, очагов некроза и рыхлом расположении клеток карциномы.

Научно-практическая ценность и внедрение результатов исследования.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего исследования возможности применения мелатошша при комбинированном лечении злокачественных новообразований с целью поддержания эффективности и снижения токсичности химиолучевой терапии. Результаты исследования углубляют представления о фармакодинамике мелатошша и внедрены в научно-исследовательскую работу кафедры фармакологии, а также используются в системе послевузовского профессионального образования при подготовке аспирантов и клинических ординаторов по фармакологии в ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева».

Положения выносимые на защиту:

1. Мелатонин не снижает терапевтическую эффективность комбинированной химиолучевой терапии, эффективнее мексидола восстанавливает эритропоэз, а также в сопоставимой с мексидолом степени оказывает гепатопротекторное действие.

2. Мелатонин в сопоставимой с мексидолом степени препятствует активации процессов перекисного окисления липидов в сыворотке крови у животных при химиолучевой терапии и не снижает интенсифицированную активность свободнорадикальных процессов в ткани первичного опухолевого узла.

3. Сочетанное использование химиолучевой терапии с мелатонином и мексидолом характеризуется положительными патоморфологическими

- изменениями в ткани первичного опухолевого узла.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на X, XII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009, 2011); XIV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2010г); XVIII -XIX Российском национальном конгрессе

«Человек и лекарство» (Москва 2011, 2012); VI пленуме президиума Российского общества патологоанатомов (Н.Новогород, 2012).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 научные работы в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 158 источника (103 отечественных и 55 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 16 рисунками и 14 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на 200 мышах-самках линии С57В1/6 массой 20-22 г разводки питомника ГУ НЦБМТ РАМН «Столбовая». Все экспериментальные животные содержались в стандартных условиях вивария МГУ им. Н.П. Огарева со свободным доступом к питьевой воде на стандартном рационе брикетированных кормов. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (ETS N123, Страсбург, 18 марта 1986г.). В каждую экспериментальную группу входило 25 мышей. Характеристика экспериментального раздела представлена в таблице 1.

Т а б л и ц а 1.

Дизайн исследований_

Экспериментальные группы Условное обозначение групп Схема введении препаратов

X 2 3

Интактные животные (п=25) (ИК) Препараты не вводили и опухолевые клетки LLC не перевивали

1-опухолевый штамм LLC (контроль) (п=25) (LLC) 1х106 опухолевых клеток LLC внутримышечно

II- LLC, цнклофосфан (п=25) (LLC+ЦФ) 1х106 опухолевых клеток LLC внутримышечно, цнклофосфан -внутрибрюшинно, 2 раза с интервалом 96 часов, в дозе 100 мг/кг, начиная с 7-х суток

IV-LLC, цнклофосфан, мексидол 50 мг/кг (п=25) (LLC+ЦФ+М ексидол) так же, как и во II тр., мексидол ежедневно, внутримышечно, в дозе 50 мг/кг, начиная с 7-х суток в течение 14 дней

о

окончание табл. 1.

1 2 3

V—LLC, циклофосфан, лучевая терапии (п=25) (LLC+ЦФ+ЛТ) Г106 опухолевых клеток LLC внутримышечно, циклофосфан -внутрибрюшинно, в дозе 60 мг/кг, 2 раза с интервалом 120 ч, начиная с 7-х суток после имплантации опухолевых клеток, за 20-30 мин до облучения, лучевая терапия - дистанционное у-облучение локально на область первичного опухолевого узла в дозе 2 Гр, 2 раза с интервалом 120 ч (СОД 4 Гр), начиная с 7-х суток эксперимента

VI-LLC, циклофосфан, лучевая терапия, мелатонин 45 мг/кг (п=25) (LLC+4®+ ЛТ+Мелатоинн) так же, как и в V гр., мелатонин ежедневно, внутримышечно, в дозе 45 мг/кг, начиная с 7-х суток после имплантации опухолевых клеток в течение 14 дней

VII-LLC, циклофосфан, лучевая терапия, мексидол 50 мг/кг (п=25) (llc+l;®+ ЛТ+Мексилол) так же, как и в V гр., мексидол ежедневно, внутримышечно, в дозе 50 мг/кг, начиная с 7-х суток в течение 14 диен

Использовали готовые лекарственные формы препаратов - циклофосфан (порошок для приготовлеиия раствора во флаконох по 0,2 г, ОАО «Биохимик», Россия), мелатонин (мелаксен) (таблетки по 0,003 г, «Юнифарм Инк.», США, которые перед применением растворяли в изотоническом растворе натрия хлорида). В качестве препарата сравнения служил антиоксидант мексидол (5% раствор в ампулах по 2 мл, «Фармасофт», Россия).

Препарат сравнения мексидол вводился в дозе 50 мг/кг (Сипров А.В.,2009), мелатонин - в эквимолярной дозе 45 мг/кг внутримышечно 14 дней, начиная с 7-х суток после имплантации опухолевых клеток.

Дистанционное у-облучение проводили на установке АГАТ-PI, локально на область первичного опухолевого узла в дозе 2 Гр, дважды с интервалом 120 ч (СОД 4 Гр), начиная с 7-х суток эксперимента.

Противоопухолевую эффективность химиолучевой терапии изучали на сингснной опухолевой системе из банка опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН - карциноме легкого Льюис (LLC). Опухолевую ткань LLC трансплантировали мышам линии С57В1/6 внутримышечно в бедро задней лапки слева в количестве 1x10б клеток в растворе Хенкса (ООО «Биолот», Россия).

Материалами исследования явились костный мозг, кровь, ткани первичного опухолевого узла, печени, легких мышей.

Противоопухолевое и антиметастатическое действие химиолучевой

7

терапии оценивали в соответствии с существующими «Методическими указаниями по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ» и «Методическими указаниями по доклиническому изучению средств, обладающих способностью ингибировать процесс метастазирования и повышать эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей» (Хабриев Р.У., 2005).

Противоопухолевый эффект оценивали по объему первичного опухолевого узла на 7-е, 12-е, 14-е, 16-е, 18-е, 20-е сутки опыта и в конце эксперимента (на 22-е) - по его массе. Антиметастатический эффект оценивали по следующим показателям: процент животных с метастазами (частота метастазирования), среднее число поверхностных метастазов в легких на одно животное. Вычисляли индекс ингибирования процесса метастазирования (ИИМ).

Для оценки гематологической токсичности дважды производился забор крови под эфирным наркозом: на 14-е сутки опыта (у 6-ти мышей из каждой группы) и в конце эксперимента на 22-е сутки, также у 6 мышей в каждой группе, с последующим определением содержания эритроцитов, гемоглобина, тромбоцитов и лейкоцитов (с помощью камеры Горяева, подсчет лейкоформулы производили в мазках крови, которые фиксировали в растворе Май-Грюнвальда, затем окрашивали по методу Романовского). Костный мозг у животных выделяли из бедренной кости и на предметном стекле приготавливали мазок с последующей оценкой миелограмм. Фиксацию и окраску препаратов проводили по Паппенгейму-Крюкову.

На 22-е сутки после трансплантации опухолевых клеток животные выводились из эксперимента под эфирным наркозом.

В сыворотке крови определяли содержание АлТ и АсТ (по Райтману-Френкелю), общего белка (биуретовой реакцией), альбуминов (по реакции с бромкрезоловым зеленым), а также уровень МДА, Fe-МДА с использованием набора реактивов для определения ТБК-активных продуктов фирмы «Агат-Мед» (Москва), активность каталазы (по М.А. Королюк), а в гомогенатах тканей - МДА, Fe-МДА, активность каталазы и СОД (по С. Чевари).

Для гистологического исследования структуры печени и опухолевого узла кусочки соответствующих тканей фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Зафиксированные образцы после промывки в проточной воде подвергались обезвоживанию путем помещения исследуемого материала в спирты возрастающей концентрации. После дегидратации материал по общепринятой методике заливали в парафин, а затем на санном микротоме получали срезы, окрашивали их гематоксилином и эозином с последующим исследованием светооптическим методом в световом микроскопе "Микмед II" при увеличении хЮО и х400.

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере Pentium IV с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel». Статистическая обработка включала расчет средних

арифметических значений (М), ошибок средних арифметических (±ш), определение достоверности различий средних арифметических (р) с помощью ^критерия Стыодента и и-критерия Манна-Уитни. Различия считались достоверными при значении р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В группе с совместным использованием циклофосфана и мелатонина объем первичного опухолевого узла на протяжении всего периода наблюдения был достоверно меньше, чем в контрольной группе, и составил на 12-е сутки эксперимента 2133,37±387,87 мм3 против 3500,25±70,98 мм3 (в контроле), на 14-е сутки - 2311,16±320,29 мм3 против 4583,13±79,22 мм3, на 16-е сутки -3519,54±119 мм3 против 5748,12±107,68 мм3, на 18-е сутки - 3607,27±291,63 мм3 против 6467,29±162,77 мм3, на 20-е - 5397,12±206,78 мм3 против 7207,3±176,6 мм3.

На 22-е сутки эксперимента масса первичного опухолевого узла у мышей в группе ЦФ+мелатонин составила 6,69±0,3г, что не отличалось от таковой в группе с одним ЦФ (6,45±0,18г). Препарат сравнения мексидол при совместном применении с ЦФ также не влиял на рост первичного опухолевого узла по сравнению с использованием одного цитостатика.

мм3

—♦— Контроль(1ХС) —1ХС+ЦФ+ЛТ

-в- ЬЬС+ЦФ+ЛТ+мел атонии -Ж- ЬЬС+ЦФ+ЛТ+мексидол

Рис. 1. Влияние мелатонина и препарата сравнения мексидола на динамику роста первичного опухолевого узла у мышей с карциномой легкого Льюис при комбинированной химиолучевой терапии.

Частота и интенсивность метастазирования в группе ЦФ+мелатонин не отличались от таковых в группе с одним ЦФ (100%, 8,86±6,0 против 100%, 5,0±1,25, соответственно), а в группе с мексидолом достоверно снижалась интенсивность метастазирования (до 1,0±0,45).

При совместном использовании химиолучевой терапии и мелатонина объем первичного опухолевого узла в течение всего периода наблюдения был достоверно меньше, чем в контроле, и составил на 12-е сутки эксперимента 2643,2±211мм3, против 3500,25±70,98 мм3 (в контроле) (рис. 1), на 14-е сутки -2646,27±127,32 мм3 против 4583,13±79,2 мм3, на 16-е сутки - 2938,72±71,98 мм3 против 5748,12±107,68 мм3, на 18-е сутки - 3565,81±105,55мм3 против 6467,29±162,77мм3, на 20-е сутки - 4537,22±226,51 мм3 против 7207,32±176,61 мм3 (рис. 1).

На 22-е сутки эксперимента масса первичного опухолевого узла у мышей в группе ЦФ+ЛТ+мелатонин составила 7,24±0,3 г, что не отличалось от таковой при использовании одной химиолучевой терапии (6,97±0Д8 г) и было достоверно меньше контрольного значения (9,18±0,19 г). В группе с ЦФ+ЛТ+ мексидол масса первичного опухолевого узла составила 7,28±0,17 г, что также меньше, чем в контроле (р<0,05)(рис.2.).

Примечание:

1- Контроль с LLC;

2- LLC+ЦФ+ЛТ;

3- LLC+ЦФ+ЛТ +мелатонии;

4- LLC+ЦФ+ЛТ+мексидол.

* -достоверность отличий по отношению к контрольной группе при р<0,05.

Рис. 2. Влияние мелатонина и мексидола на массу первичного опухолевого узла при комбинированной химиолучевой терапии у мышей с карциномой легкого Льюис.

Частота и интенсивность метастазирования в группе с химиолучевой терапией и мелатонином не отличались от таковых в группе ЦФ+Л'Г (табл. 2).

ю

Аналогичная картина отмечалась и в группе с мексидолом (табл. 2).

Таблица 2

Показатели антимстастатичсской эффективности сочетанного применения хнмиолучевой

Группа % животных с метастазами Среднее число метастазов НИМ, %

KoнтpoльLLC 100 95,7±8,23 -

LLC+ЦФ+ЛТ 100 8,17±2,21 Pi<0,05 91,46

LLC+IJ«I>+J1T+ мслатоннн 85,7 11,3+4,3 Pi <0,05 89,88

LLC+LJcI>+JIT+ мексндол 100 8,4+2,9 Pi <0,05 91,21

Примечание:

рг достоверность различий с группой LLC

У животных всех экспериментальных групп (кроме интактных) в месте имплантации суспензии клеток развивались опухолевые узлы карциномы Льюиса.

При микроскопическом исследовании первичных опухолевых узлов у мышей I экспериментальной группы (LLC) ткань узла была представлена скоплением крайне полиморфных клеток. Значительная часть клетки была занята ядром с крупными ядрышками и конденсированными зернами хроматина. В связи с конденсацией зерен хроматина в крупные глыбки, встречались светлоокрашенные участки кариоплазмы. Обнаруживались также гигантские полиморфные клетки.

В отдельных опухолевых клетках наблюдались фигуры митоза (анафаза), что отражает их высокую пролиферативную активность.

У животных экспериментальной группы LLC+ЦФ+ЛТ в ткани карциномы Лыоиса опухолевые клетки характеризовались плотным расположением, выраженным атипизмом и полиморфизмом, со смещением ядерно-цитоплазматического соотношения в сторону увеличения размеров ядер. В ткани опухоли обнаруживалось большое количество гигантских клеток с крупными ядрами, содержащими полиплоидный набор хромосом. Кроме того, отмечалось наличие многоядерных клеток, ядра которых имели округлую, полигональную, бобовидную, палочковидную форму, встречались клетки с сегментированными ядрами. Строма опухоли была выражена недостаточно, с немногочисленными гиперемированными капиллярами. В опухолевой ткани выявлялись множественные массивные очаги некроза с перифокальными воспалительными инфильтратами. Наблюдалась инвазия опухолевых клеток в поперечнополосатую скелетную мышечную ткань, с деструкцией миофибрилл.

В ткани перевиваемых неоплазий у мышей экспериментальной группы LLC+ЦФ+ЛТ+мелатонин, при микроскопическом исследовании узлов опухолевые клетки имели преимущественно округло-овальную форму,

•г п

небольшие размеры, встречались клетки с сегментированными ядрами, состоящими из 3-4 фрагментов.

В опухолевых узлах выявлялись гигантские клетки с округлыми и бобовидными ядрами. Отмечалось рыхлое расположение клеток, в отдельных участках опухолевая ткань имела ячеистое строение. Фигуры митоза выявлялись редко. Строма опухоли представлена тонкопетлистой соединительнотканной сетью, с участками склероза. В ткани карциномы обнаруживались обширные очаги некроза. Воспалительно-клеточная реакция выражена умеренно.

Гистологическая картина ткани опухолей экспериментальных животных группы ЬЬС+ЦФ+ЛТ+мексидол была представлена рыхло расположенными, округлыми клетками. Заметно снижался полиморфизм опухолевых клеток. Встречались единичные гигантские клетки.

Стромальный компонент опухолевой ткани был представлен тонкими прослойками соединительной ткани с небольшим количеством сосудов микроциркуляторного русла. В ткани неоплазий выявлялись отдельные небольшие очаги некроза.

При оценке состояния процессов перекисного окисления липидов у животных установлено, что в группе с химиолучевой терапией (ЦФ+ЛТ) в сыворотке крови достоверно снижался уровень МДА на 31% и повышалась активность катапазы на 176,5% по сравнению с контрольной группой. У животных с сочетанным применением химиолучевой терапии и мелатонина концентрация МДА в сыворотке крови снижалась на 53,3% (р<0,01) и повышалась активность каталазы на 176,5% (р<0,001) по отношению к контролю. В группе с мексидолом содержание МДА достоверно снижалось на 38,2%, активность каталазы повышалась на 229,4% в сравнении с контролем (табл. 3).

В печени у животных в группе ЦФ+ЛТ отмечалось снижение уровня МДА и Ре-МДА на 41,8% и 78,2% соответственно (р<0,001), снижение активности каталазы на 79,5% (до уровня показателя у интактных животных), а также активности СОД на 24,5% (р<0,05) по отношению к контролю (табл. 3). При этом активность СОД была достоверно ниже на 31% и по сравнению с интактными мышами. В группе ЦФ+ЛТ+мелатонин регистрировалось достоверное снижение концентрации МДА на 51,5% и повышение активности каталазы на 331% по сравнению с группой ЦФ+ЛТ, а также снижение активности СОД по отношению к контролю и интактным животным на 39,5% и 44,7% соответственно (табл. 3). При совместном использовании химиолучевой терапии и мексидола концентрация МДА достоверно снижалась, а активность каталазы - повышалась на 35,7% и 337% соответственно по сравнению с группой ЦФ+ЛТ, однако активность СОД не отличалась от таковой у интактных животных.

В ткани опухолевого узла у животных группы ЦФ+ЛТ отмечалось достоверное увеличение концентрации МДА на 118%, снижение содержания

Ре-МДА и активности каталазы на 48,5% и 68,5% соответственно, повышение активности СОД на 245,5% (табл. 3). При комбинированном применении химиолучевой терапии и мелатонина содержание МДА достоверно возрастало на 98,2%, а активность каталазы снижалась на 60,7%, что не отличалось от соответствующих показателей в группе ЦФ+ЛТ. При этом концентрация 1'е-МДА не отличалась от таковой в контроле, а активность СОД резко снижалась и была на 74% меньше, чем в контрольной группе, и на 92,5% меньше, чем в группе ЦФ+ЛТ (табл. 3).

ТаблицаЗ

Влияние комбинированного применения химиолучевой терапии и мелатонина на процессы перекненого окисления липидов у мышей с карциномой легкого Лыонс, __ (М±т)_

Показатели Субстрат Пнтактныс животные Экспериментальные группы

Ь1Х (контроль) ЫХ+ЦФ + лт ЬЬС+ЦФ+ ЛТ+ мексидол ЬЬС+ЦФ+ ЛТ+ мелатонин

МДА, мкмоль/л сыворотка 3,52±0,38 6,1±0,44 Р1<0,01 4,2±0,74 р2<0,05 3,77±0,45 р2<0,01 2,85±0,55 р2<0,01

печень 8,7+0,96 18,4±0,93 р,<0,001 10,7±1,17 р2<0,001 6,88+1,07 р2.з<0,05 5,18+0,76 р2.з<0,01

опухолевый узел - 5,04±0,62 10,99±2,2 р2<0,01 12,6+1,02 р2<0,001 9,99+2,79 р2<0,05

Ре-МДЛ, мкмоль/л сыворотка 4,69+0,48 4,6+0,6 3,68±0,67 5,3±0,52 4,2±0,66

печень 8,82±1,64 23,9±2,28 Р1<0,001 5,2±1,04 р2<0,001 5,89+0,88 р2<0,001 5,99+0,87 р2<0,001

опухолевый узел - 9,4±0,88 4,84±0,77 р2<0,01 3,6+0,92 р2<0,01 8,4±1,38 р4<0,05

катал аза, мккат/л сыворотка 0,4±0,08 0,17+0,01 р2<0,05 0,47+0,07 Р2<0,01 0,56+0,08 р2<0,001 0,47+0,05 р2<0,001

печень 0,19+0,02 0,78+0,03 Р1<0,001 0,16+0,03 р2<0,001 0,7+0,07 ри<0,001 0,69+0,05 р,.з<0,001

опухолевый узел - 0,89+0,02 0,28+0,05 р2<0,001 0,5+0,04 Р2.3<0,01 0,35+0,05 Р24<0,05

сод, ед.акг/г ткани печень 39,4+2,93 35,87+0,4 8 27,17+3,8 Р1,2<0,05 28,54+4,67 21,77+2,65 Р!.2<0,01

опухолевый узел - 13,4±1,2 46,3±6,67 р2<0,01 3,27+0,95 р2.з<0,001 3,49+0,63 р2.з<0,001

Примечание:

Р1 -достоверность различий рассчитана по отношению к интактным животным;

Р2 - к группе И.С;

рз - к группе 1ХС+ЦФ+ЛТ;

Р4 - к группе ЕХС+ЦФ+ЛТ+мексндол.

При сочетанном применении химиолучевой терапии и мексидола концентрация МДА и Ре-МДА не отличалась от таковой в группе ЦФ+ЛТ, а активность каталазы возрастала на 78,5% (р<0,01), однако оставалась ниже, чем в контроле, на 43,8% (р<0,01). Активность СОД не отличалась от таковой в группе с мелатонином и была достоверно ниже на 75,6% по сравнению с

13

контролем и на 93% по отношению к группе ЦФ+ЛТ (табл. 3).

Анализ перефирической крови показал, что на 14-е сутки эксперимента на фоне опухолевого роста развивалась анемия и лейкопения с выраженной лимфопенией (табл. 4). Введение ЦФ усиливало анемию и лейкопению у животных: содержание эритроцитов и гемоглобина снижалось на 23,9% и 17,1% соответственно (р<0,05), а количество лейкоцитов - на 65%, по сравнению с нелеченными животными. Мелатонин эффективнее мексидола препятствовал снижению содержания гемоглобина после введения ЦФ: его уровень увеличивался на 49,9% по отношению к группе с монотерапией ЦФ. При этом мелатонин не предупреждал развития лейкопении, однако достоверно повышал количество лимфоцитов на 220,8%. Мексидол препятствовал развитию анемии после введения ЦФ, увеличивая уровень гемоглобина и эритроцитов на 25,4% и 31,13% соответственно (р<0,05) и, в отличие от мелатонина, уменьшал выраженность лейкопении, достоверно повышая количество лейкоцитов на 52,8% по сравнению с группой с монотерапией ЦФ (табл. 4).

Г а 6 л и ц я 4

Влияние мелатоиина на клеточный состав периферической крови мышей с карциномой легкого Льюис при введении пнклофосфаиа

Показатели Экспериментальные группы

Пнтактные Контроль (ЬЬС) ЬЬС+ЦФ ЬЬС+ЦФ+ мелатонин 1ХС+ЦФ+ мексидол

Гемоглобин г/л 143,4±3,15 61,17±1,9 р1<0,05 50,7±3,08 р1.2<0,05 76Ь2,5 р,,„<0,001 63,613,06 Р1.Л.4 <0,05

Эритроциты х1012/л 8,23±0,18 3,97±0,09 р,<0,05 3,02±0,2 Р1.2<0,05 3,05±0,22 р..2<0,01 3,96±0,2 Р 1.3.4 <0,05

Тромбоциты хЮ'/л 376,7±14,7 356,7±18,6 428±24,98 р2<0,05 406,7±51,4 442±27,5 р1.2<0,05

Лейкоциты хЮ'/л 5,84±0,48 3,52±0,3 р1<0,05 1,23±0,2 Р1.2<0,05 2,1±0,4 р1.2<0,05 1,88±0,2 Р1.2.з<0,05

Пентрофилы хЮ'/л 1,7±0,21 2,26±0,21 0,9610,18 Р1.2<0,05 1,13±0,25 р2<0,05 1,27±0,11 р2<0,05

Лимфоциты хЮ'/л 4,1±0,32 1,28±0,15 Р.<0,05 0,24±0,04 Р1.2<0,05 0,77±0,22 р1.з <0,05 0,51 ±0,0 6 Р1.2.3<0,01

Примечание:

Р1 — достоверность отличий рассчитана по отношению к интактной группе;

Рг - по отношению к контролю;

рз - по отношению к группе ЕХС+ЦФ;

Р4 - по отношению к группе 1ХС+ЦФ + мелатонин.

В костном мозге при химиотерапии ЦФ наблюдалось снижение количества сегментоядерных нейтрофилов в 5,2 раза в сравнении с нелеченными животными и полихроматофильных нормоцитов п 2 раза по сравнению с интактными мышами. В группах с сочетанным введением ЦФ с мелатонином и мексидолом отмечалось достоверное увеличение числа

сегментоядерных нейтрофилов в 2,8 и в 2,3 раза соответственно. В группе с мексидолом, в отличие от мелатонина, отмечалось увеличение числа полихроматофильных нормоцитов в 1,6 раза по сравнению с группой ЬЬС+ЦФ.

К 22-м суткам эксперимента у нелеченных животных развивалась тромбоцитопения: количество тромбоцитов снижалось на 31% по сравнению с интактной группой. Терапия ЦФ приводила к сокращению числа тромбоцитов в крови на 24,6% по отношению к контролю. Мелатонин и мексидол в сопоставимой степени препятствовали усилению тромбоцитопении после введения ЦФ. Мелатонин, в отличие от мексидола, уменьшал степень тяжести анемии и достоверно увеличивал уровень гемоглобина и эритроцитов на 60% и 47,8% соответственно по сравнению с группой с одним ЦФ.

В контрольной группе к 22-м суткам отмечались лимфопения и нейтрофиллез без изменений общего количества лейкоцитов по сравнению с интактными животными. В группе с ЦФ регистрировался лейкоцитоз с нейтрофиллезом и сохранением лимфопении. В группах с мелатонином и мексидолом на фоне лейкоцитоза происходили существенные изменения в лейкоформуле: отмечалось достоверное увеличение числа лимфоцитов на 97,8% и 76,4% соответственно по сравнению с группой с ЦФ.

В костном мозге у мышей, получавших монотерапию ЦФ, регистрировалось увеличение в 2 раза количества сегментоядерных нейтрофилов и сокращение числа базофильных нормоцитов в 2,9 раза и полихроматофильных нормоцитов в 5,8 раза по сравнению с контролем. Мексидол, в отличие от мелатонина, увеличивал количество базофильных нормоцитов в 2,19 раза по сравнению с группой с монотерапией ЦФ.

Сочетанная химиолучевая терапия приводила к усилению эритроцитопении у животных на 14-е сутки эксперимента - количество эритроцитов достоверно снижалось на 22,7% по сравнению с нелеченными животными, и развитию лейкоцитоза за счет увеличения числа нейтрофилов на 271% (р<0,01, табл. 5), вероятно, в связи с развитием асептического воспаления в ткани опухоли. Мелатонин и мексидол достоверно предупреждали развитие лейкоцитоза после химиолучевой терапии: количество нейтрофилов не отличалось от такового у интактных животных и в группе без лечения. Число лимфоцитов при этом оставалось ниже, чем у интактных животных, и не отличалось от такового у мышей, не получавших лечения (табл. 5). Кроме того, мелатонин, в отличие от мексидола, способствовал увеличению содержания гемоглобина на 17% по отношению к группе с химиолучевой терапией.

В клеточном составе костного мозга мышей группы с химиолучевой терапией к 14-м суткам наблюдалось достоверное увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов на 33,7%, снижение числа базофильных и полихроматофильных нормоцитов в 3,2 раза (р<0,05) и увеличение количества моноцитов в 2 раза по отношению к интактным животным.

В группах с сочетанием химиолучевой терапии с мелатонином и мексидолом отмечалось достоверное снижение содержания палочкоядерных

нейтрофилов на 64,4% и 40% соответственно по отношению к группе LLC, а также сокращение количества полихроматофильных нормоцитов в 2,2 и 3,4 раза по сравнению с группой с использованием одной химиолучевой терапии. Однако, в отличие от последней, в группах с мелатонином и мексидолом содержание базофильных нормоцитов не отличалось от такового у интактных животных.

Т а б л и ц а 5

Влияние мелатопина и мекеидола на клеточный состав периферической крови

мышей с карциномой легкого Льюис при химиолучевой терапии __(14-е сутки эксперимента )_

Показатели Ннтактные животные Экспериментальные группы

LLC 1ХС+ЦФ+ JIT LLC+H®+ ЛТ+мслатонин LLC+UO+ ЛТ+мексидол

Гемоглобин г/л 143,4±3,15 61,17+1,9 Pi<0,05 66,83+2,91 Pi <0,05 78,2+3,94 PI.2.3<0,05 74,25+6,5 pi <0,05

Эритроциты х1012/л 8,23±0,18 3,97+0,09 р,<0,05 3,07±0,1 Pl.2<0,01 3,36+0,26 Pi.2<0,05 3,46+0,2 p,.2<0,05

Тромбоциты х109/л 376,7+14,7 356,7±18,6 373,3+76,5 342,0+61,8 407,5+54,5

Лейкоциты х109/л 5,84+0,48 3,52+0,3 Pi<0,05 11,28+2,04 Pl.2<0,01 3,54+0,3 Pu<0,01 3,0+0,5 Pu<0,01

Нейтрофилы х109/л 1,7+0,21 2,26±0,21 8,4+2,07 Pi.2<0,05 2,36+0,29 Рз<0,05 2,1+0,44 Рз<0,05

Лимфоциты х109/л 4,1+0,32 1,28+0,15 Pi<0,05 2,42+0,26 Pu<0,01 0,92+0,1 Pu<0,01 0,79+0,15 Pu<0,01

Примечание:

pi - достоверность отличий рассчитана по отношению к интактной группе;

Р2 - по отношению к контролю;

рз - по отношению к группе LLC+ЦФ+ЛТ.

К 22-м суткам эксперимента у нелеченных животных развивалась тромбоцитопения, которая сохранялась и в группе с мелатонином. В группах с химиолучевой терапией и ее сочетанием с мексидолом количество тромбоцитов не отличалось от такового у интактных животных. Однако, мелатонин, в отличие от мекеидола, уменьшал степень тяжести анемии после химиолучевой терапии, достоверно увеличивая уровень гемоглобина на 11,6% по отношению к животным в группе с одной химиолучевой терапией. При этом количество эритроцитов не отличалось от такового у животных-опухоленосителей без лечения.

В группе LLC к 22-м суткам отмечались лимфопения и нейтрофиллез без изменений общего количества лейкоцитов по сравнению с интактными животными. В группе с ЦФ+ЛТ регистрировался лейкоцитоз с нейтрофиллезом и увеличением числа лимфоцитов на 88,9% (р<0,05) по отношению к группе без лечения. В группах с мелатонином и мексидолом на фоне лейкоцитоза с нейтрофиллезом количество лимфоцитов превышало таковое в группе ЦФ+ЛТ на 107% и 135% соответственно (р<0,05).

В костном мозге на 22-е сутки в группе LLC+ЦФ+ЛТ отмечалось выраженное угнетение эритроидного ростка кроветворения - полностью отсутствовали базофильные нормоциты и снижалось количество полихроматофильных нормоцитов в 24,7 раза (р<0,05) по сравнению с группой без лечения и интактными животными.

В группе с мелатонином в костном мозге сохранялись базофильные нормоциты, достоверно увеличивалось содержание полихроматофильных нормоцитов в 4,54 раза и оксифильных нормоцитов в 18 раз по сравнению с группой LLC+ЦФ+ЛТ. При использовании мексидола в сравнении с мелатонином регистрировались менее четкие изменения в эритроидном ростке кроветворения - также сохранялись базофильные нормоциты и их количество не отличалось от такового в группе без лечения, отмечалась тенденция к росту числа полихроматофильных нормоцитов, однако эти изменения не оказались статистически значимыми по сравнению с группой LLC+ЦФ+ЛТ.

Опухолевый рост у животных сопровождался снижением содержания в сыворотке крови общего белка и альбуминов на 22% и 30% соответственно (р<0,05), и ростом уровня АЛТ и ACT на 62,6% и 70,2% соответственно (р<0,05), по сравнению с интактными мышами (табл. 6).

Таблицаб

Влияние мелатонииа и мексидола на биохимические показатели сыворотки крови у

мышей с карциномой легкого Лыонс при хнмнолучевой терапии, (М±т)

Группы животных Показатели

Общий белок, г/л Альбумины, г/л АЛТ, мкм оль/л ACT, мкм оль/л

Интакгные 47,3±1,41 30,8+1,93 1,07±0,05 0,88+0,09

Контроль (LLC) 37,1+1 pi <0,05 21,3+1,02 pi<0,05 1,74±0,14 pi<0,05 1,5±0,06 pi<0,05

LLC+ЦФ+ЛТ 43,8±1,38 рг<0,05 21,8 ±1,66 pi <0,05 1,48±0,15 pi<0,05 1,182+0,07 pi,2<0,05

LLC+ЦФ+ЛТ мсксидол 50мг/кг 51,3±1,74 Р24<0,05 21±1,26 pi <0,05 0,902+0,12 рг,з<0,05 1,096±0,06 р2<0,01

LLC+ЦФ+ЛТ мслатонин 45м г/кг 39,6 ±3,1 pi,4<0,05 26,4±2,4 рг<0,05 1,19 ±0,19 рг<0,05 1,16+0,07 рг<0,05

Примечание:

Р1 - достоверность отличий рассчитана по отношению к интактной группе;

Р2 - по отношению к контролю;

р.1 - по отношению к группе [ХС+ЦФ+ЛТ;

Р4 - по отношению к группе 1ХС+ЦФ+ЛТ+мексидол.

Химиолучевая терапия приводила к увеличению содержания общего белка на 18,1% и снижению концентрации АСТ на 21% (р<0,05) по сравнению с контрольной группой.

В группе с мелатонином отмечалось достоверное снижение содержания общего белка на 16,3% по отношению к интактным животным, увеличение концентрации альбуминов на 14,3%, уменьшение уровня АЛТ и АСТ на 31,6%

и 22,5% соответственно по сравнению с контролем (табл. 6).

В группе с мексидолом достоверно повышалось содержание общего белка на 38,3% и снижалась концентрация ACT на 26,8% по сравнению с контролем. При этом содержание AJIT снижалось на 39% по отношению к группе ЦФ+ЛТ (р<0,05).

При микроскопическом исследовании ткани печени животных контрольной группы (LLC) отмечалось выраженное нарушение балочного строения долек. В портальных и перипортальных трактах отмечались явления лимфогистиоцитарной инфильтрации. Наблюдалась глубокая баллонная дистрофия и участки колликвационного некроза гепатоцитов.

В ткани печени животных в группе с сочетанным применением ЦФ и лучевой терапии отмечалось нарушение балочного строения долек. Наблюдалась выраженная лимфогистиоцитарная инфильтрация в области портальных и перипортальных трактов. В отдельных гепатоцитах развивалась паренхиматозная белковая вакуольная дистрофия. Обнаруживались единичные гепатоциты с явлениями кариолизиса и деструкции клеточных мембран.

При совместном использовании мелатонина и химиолучевой терапии отмечалось сохранение балочной структуры долек. Наблюдалось значительное расширение синусоид. Обнаруживалась лимфогистиоцитарная инфильтрация в области портальных трактов и по ходу синусоид. Размеры гепатоцитов были незначительно увеличены, цитоплазма клеток гомогенная. В отдельных гепатоцитах выявлялись пузырьковидные ядра.

При патоморфологическом исследовании ткани печени у мышей при сочетанном использовании химиолучевой терапии и мексидола отмечалось сохранение балочной структуры долек, синусоиды были незначительно расширены. Наблюдались единичные лимфогистиоцитарные инфильтраты в области портальных трактов. В отдельных гепатоцитах обнаруживались пузырьковидные ядра.

В результате проведенных исследований показано уменьшение миело- и гепатотоксичности химиолучевой терапии при совместном ее использовании с мелатонином, что свидетельствует о целесообразности его включения в комбинированную схему лечения злокачественных новообразований.

ВЫВОДЫ

1. Мелатонин не снижает терапевтическую эффективность комбинированной химиолучевой терапии у мышей с карциномой легкого Льюис.

2. Мелатонин эффективнее мексидола восстанавливает эритропоэз и снижает тяжесть анемии после химиолучевой терапии, а также в сопоставимой с мексидолом степени корригирует лимфопению.

3. Мелатонин в сопоставимой с мексидолом степени препятствует активации процессов перекисного окисления липидов в сыворотке крови у животных при химиолучевой терапии. Мелатонин в меньшей степени, чем

препарат сравнения мексидол корригирует активность супероксиддисмутазы в печени. Мелатонин и мексидол не снижают интенсифицированную активность свободнорадикальных процессов в первичном опухолевом узле.

4. Сочетанное использование химиолучевой терапии с мелатонином и мексидолом сопровождается положительными патоморфологическими изменениями в ткани первичного опухолевого узла, что проявляется в уменьшении полиморфизма опухолевых клеток и фигур митоза, очагов некроза и рыхлом расположении клеток карциномы.

5. Мелатонин оказывает гепатопротекторное действие при комбинированной химиолучевой терапии. При этом снижается выраженность патоморфологичсских изменений в ткани печени, что выражается в сохранении балочной структуры долек, уменьшении очагов некроза гепатоцитов и лимфогистиоцитарной инфильтрации портальных трактов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные являются экспериментальным обоснованием для дальнейшего исследования эффективности применения мелатонина при комбинированном и комплексном лечении злокачественных новообразований с целыо поддержания эффективности и снижения токсичности противоопухолевой терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вашуркина И.М. Оценка эффективности мексидола в профилактике и комбинированной с цитостатиком терапии экспериментальных неоплазий / И.М. Вашуркина, A.C. Крутских, A.B. Сипров, H.A. Плотникова // Сборник научных статей и тезисов X Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» -М.,2009. - С.856.

2. Вашуркина И.М. Оценка клеточного состава периферической крови при использовании комбинаций циклофосфана с мелатонином и мексидолом у мышей с экспериментальной неоплазией / И.М. Вашуркина, A.B. Сипров, М.В. Галов // Материалы XIV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева. Часть 1.-Саранск, 2010. -С.171-174.

3. Вашуркина И.М. Влияние мелатонина на свободнорадикальные процессы у животных с экспериментальной неоплазией при химиотерапии циклофосфаном. / И.М. Вашуркина, A.B. Сипров, М.В. Галов // XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» : сборник материалов конгресса. - М., 2011. - С.424-425.

4. Вашуркина И.М. Исследование миелопротекторных свойств мелатонина при противоопухолевом лечении у мышей с карциномой легкого Льюис / И.М. Вашуркина, H.A. Плотникова, A.B. Сипров, П.М. Канаев // Сборник научных статей и тезисов XII международного конгресса «Здоровье и

образование в XXI веке» — М.,2011. — С.296.

5. Вашуркина И.М. Сравнительная оценка влияния мелатонина и производного З-гидроксипиридина на гсматотоксичность и противоопухолевую эффективность алкнлирующего цнтостатика у мышей с карциномой легкого Лыоис / И.М. Вашуркина, ILA. Плотникова, A.B. Сипров // Современные технологии в медицине. -Н.Новгород, 2011. - №4. -С.158-161.

6. Вашуркина И.М. Возможности мелатонина в коррекции свободнорадикальных процессов у мышей с карциномой легкого лыоис при химиолучевой терапии / И.М. Вашуркина, A.B. Сипров, H.A. Плотникова // XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» : сборник материалов конгресса. - М., 2012. - С. 570-571.

7. Вашуркина И.М. Патоморфология карциномы Льюса при сочетанном использовании комбинированного лечения и антиоксидантной терапии / И.М. Вашуркина, H.A. Плотникова, С.П. Кемайкин, Т.В. Харитонова // Ремедиум Приволжье: Материалы VI пленума президиума Российского общества патологоанатомов. - Н. Новгород, 2012. - №5.- С.

8. Вашуркина И.М. Морфогенез первичного узла карциномы Льюиса при коррекции антиоксидантами/ И.М. Вашуркина, H.A. Плотникова, С.П. Кемайкин, Т.В. Харитонова // Материалы XVI-юбилейной межрегиональной научно-практической конференции ГБОУ ДПО ПИУВ Минздравсоцразвития России. - Пенза, 2012. - С. 94-96.

9. Вашуркина II. М. Сравнительная оценка влиянии средств с антиоксидантньш действием на терапевтическую эффективность химиолучевой терапии и оксидантный статус у мышеи / А. В. Сипров, П. ¡VI. Вашуркина, В. А. Масягин // Саратовский научно-медицинский журнал. — Саратов, 2012. - Т. 8, № 4.-С. 906-910.

10. Вашуркина И. М. Сравнительная оценка эффективности мелатонина и производного 3-гидрокснниридина в снижении гематотоксичности комбинированной химиолучевой терапии у мышей с карциномой легкого Льюис / А. В. Снпров, И. М. Вашуркина // Известия Высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские наукин. -Пенза, 2012. -№ 4(24) - С. 49-55.

Подписано п печать 17.05.13. Объем 1,25 и. л. Тираж 100 экз. Заказ № 734. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24

 
 

Текст научной работы по медицине, диссертация 2013 года, Вашуркина, Ирина Михайловна

МИНОБРНАУКИ России

ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени

Н.П. Огарева»

ВАШУРКИНА ИРИНА МИХАЙЛОВНА

ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА ТЕРАПЕВТИЧЕСКУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ТОКСИЧНОСТЬ КОМБИНИРОВАННОЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

НЕОПЛАЗИИ

На правах рукописи

04201359418

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

Диссертация на соискание

ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент Сипров Александр Владимирович

Саранск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................10

1.1. Современные подходы к комбинированной противоопухолевой терапии: проблемы и перспективы.......................................................................10

1.2. Проблемы и перспективы фармакологической регуляции эффективности и токсичности комбинированной химиолучевой терапии злокачественных

опухолей.....................................................................................18

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................34

2.1. Характеристика лабораторных методов исследования.......................34

2.2. Статистическая обработка результатов..........................................39

Глава 3. ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА ТЕРАПЕВТИЧЕСКУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ХИМИОЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ У МЫШЕЙ С КАРЦИНОМОЙ ЛЕГКОГО ЛЬЮИС...................................................43

3.1. Влияние мелатонина на противоопухолевый и антиметастатический эффекты циклофосфана у мышей с карциномой легкого Льюис.....................43

3.2.Влияние мелатонина на противоопухолевый и

антиметастатическийэффекты химиолучевой терапии у мышей с карциномой легкого Льюис.......................................................................................................46

3.3. Влияние мелатонина на морфологическую структуру первичного опухолевого узла у мышей с карциномой легкого Льюис при

комбинированной противоопухолевой терапии.................................................51

Глава 4. ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА ПРОЯВЛЕНИЕ МИЕЛОТОКСИЧНОСТИ У МЫШЕЙ С КАРЦИНОМОЙ ЛЕГКОГО ЛЬЮИС ПРИ КОМБИНИРОВАННОЙ ХИМИОЛУЧЕВОЙ

ТЕРАПИИ....................................................................................57

4.1.Влияние мелатонина на клеточный состав периферической крови мышей с карциномой легкого Льюис при введении циклофосфана............................57

4.2. Влияние мелатонина и мексидола на клеточный состав периферической крови мышей с карциномой легкого Льюис при комбинированной

химиолучевой терапии..........................................................................................63

Глава 5. ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ, ПЕРВИЧНОМ ОПУХОЛЕВОМ УЗЛЕ И ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ С КАРЦИНОМОЙ ЛЕГКОГО ЛЬЮИС НА ФОНЕ КОМБИНИРОВАННОЙ

ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ..............................................70

Глава 6. ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ТКАНИ ПЕЧЕНИ У МЫШЕЙ С КАРЦИНОМОЙ ЛЕГКОГО ЛЬЮИС ПРИ КОМБИНИРОВАННОЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ...................................................................................74

6.1.Влияние мелатонина на функциональное состояние печени при химиолучевой терапии...........................................................................................74

6.2. Влияние мелатонина на морфологическую структуру ткани печени у мышей с карциномой легкого Льюис при комбинированной противоопухолевой терапии..................................................................................77

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................82

ВЫВОДЫ....................................................................................94

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ................................................95

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.................................96

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AJ1T - аланиновая аминотрансфераза; ACT - аспарагиновая аминотрансфераза; LLC - карцинома легкого Льюис; JIT - лучевая терапия; МДА - малоновый диальдегид;

Fe-МДА - железоиндуцированный малоновый диальдегид; ПОЛ - перекисное окисление липидов; ЦФ - циклофосфан.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Известно, что злокачественные опухоли занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности населения. Использование комбинированного химиолучевого лечения злокачественных опухолей является одним из перспективных направлений в клинической онкологии (Parkin D.M. et al., 2005; Канаев C.B., 2008). Однако, сочетанное применение лучевой терапии с химиопрепаратами наряду с усилением резорбции опухоли сопровождается более выраженными побочными реакциями, в том числе миелосупрессией. Незапланированные перерывы в лечении, обусловленные развивающимися осложнениями, ухудшают отдаленные результаты противоопухолевой терапии (Черниченко A.B. с соавт., 2008).

Разработка подходов к реализации максимально возможной специфической активности широко применяемых в клинике цитостатических методов терапии осуществляется по разным направлениям, в том числе путем снижения их токсичности при использовании антитоксических модификаторов (Давыдов М.И., Барышников А.Ю., 2003).

В клинической онкологии все более прочные позиции занимает поддерживающая терапия, позволяющая не только предупредить или уменьшить проявления нежелательных побочных эффектов лекарственной и лучевой терапии, но и в значительной степени уменьшить степень проявления тяжелых осложнений, обусловленных распространенным опухолевым процессом (Константинова М.М., 2002). Не менее важным является тот факт, что в процессе злокачественного роста происходит изменение показателей антиокислительной активности и окислительного статуса опухоли, что может отражаться на органах и тканях организма.

Известно, что свободнорадикальное окисление играет важную роль в процессах возникновения и развития опухоли (Лебедева В.А. с соавт., 2007; Меньшикова Е.Б. с соавт., 2008; Белоногов Р.Н. с соавт., 2009). С учетом патогенетической значимости активации свободнорадикальных реакций в

развитии опухолевого процесса и многих осложнений противоопухолевой терапии, а также паранеопластических расстройств (Ефремов A.B. с соавт., 2009; Свистунов A.A. с соавт., 2010), исследуется эффективность применения препаратов, обладающих антиоксидантным действием, с различным механизмом и уровнем воздействия на процессы перекисного окисления липидов в качестве антитоксических модификаторов.

В ранее проведенных исследованиях (Немцова Е.Р., 2006; Сипров A.B., 2009; МикулякН.И., 2011; Зорькина A.B., Скопин П.И., 2011) доказана эффективность и целесообразность включения некоторых антиоксидантов в схему противоопухолевой химиотерапии. Однако поиск средств, наиболее эффективно снижающих токсические осложнения противоопухолевой химио- и лучевой терапии, и оптимизирующих терапевтический эффект лечения основного заболевания, по-прежнему остается актуальным.

Вместе с тем, сведения о сравнительном влиянии таких средств на специфическую активность и токсичность химиолучевой терапии в сочетании с морфофункциональными изменениями в опухоли и органах-мишенях неоднозначны и немногочисленны.

Наличие у мелатонина антиоксидантных свойств, превышающих таковые у известных антиоксидантов токоферола и аскорбиновой кислоты (Арушанян Э.Б. с соавт., 2006), а также малочисленные и противоречивые сведения в литературе о возможности его применения при онкопатологии, определили выбор наших исследований по эффективности применения мелатонина как препарата сопровождения в сравнении с антиоксидантом мексидолом при комбинированной противоопухолевой терапии.

Цель работы: провести сравнительную оценку влияния мелатонина и мексидола на терапевтическую эффективность, миело- и гепатоксичность комбинированной химиолучевой терапии мышей с карциномой легкого Льюис.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать влияние мелатонина на противоопухолевый и антиметастатический эффекты химиолучевой терапии у мышей с карциномой легкого Льюис.

2. Оценить влияние мелатонина на некоторые показатели перекисного окисления липидов в сыворотке крови, первичном опухолевом узле и печени мышей с карциномой легкого Льюис на фоне комбинированной противоопухолевой терапии.

3. Сравнить терапевтическую эффективность комбинаций химиолучевой терапии с мелатонином и препаратом сравнения мексидолом, а также миело- и гепатопротекторные свойства этих препаратов у мышей с карциномой лёгкого Льюис.

4. Изучить влияние мелатонина в сравнении с мексидолом на патоморфологические изменения в тканях первичного опухолевого узла и печени у мышей с карциномой легкого Льюис при комбинированной противоопухолевой терапии.

Научная новизна работы.

В работе показано, что мелатонин не снижает терапевтическую эффективность комбинированной химиолучевой терапии. Мелатонин в сопоставимой с мексидолом степени предупреждает развитие лейкоцитоза на 14-е сутки эксперимента при химиолучевой терапии, корригирует лимфопению, но эффективнее мексидола препятствует снижению содержания гемоглобина в крови. Установлено, что мелатонин эффективнее мексидола препятствует снижению содержания полихроматофильных и оксифильных нормоцитов в костном мозге (на 22-е сутки эксперимента) при химиолучевой терапии.

Показано, что мелатонин в сопоставимой с мексидолом степени оказывает гепатопротекторное действие, уменьшая концентрацию АЛТ и

ACT в сыворотке крови, структурные изменения долек печени и лимфогистиоцитарную инфильтрацию портальных трактов.

Установлено, что мелатонин в сопоставимой с мексидолом степени препятствует активации процессов перекисного окисления липидов в сыворотке крови у животных при химиолучевой терапии, и не снижает интенсифицированную активность свободнорадикальных процессов в первичном опухолевом узле.

Сочетанное использование химиолучевой терапии с мелатонином и мексидолом сопровождается положительными патоморфологическими изменениями в ткани первичного опухолевого узла, что проявляется в уменьшении полиморфизма опухолевых клеток и фигур митоза, очагов некроза и рыхлом расположении клеток карциномы.

Научно-практическая ценность и внедрение результатов исследования.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего исследования возможности мелатонина при комбинированном лечении злокачественных новообразований с целью поддержания эффективности и снижения токсичности химиолучевой терапии. Результаты исследования углубляют представления о фармакодинамике мелатонина и внедрены в научно-исследовательскую работу кафедры фармакологии, а также используются в системе послевузовского профессионального образования при подготовке аспирантов и клинических ординаторов по фармакологии в ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева».

Положения выносимые на защиту:

1 .Мелатонин не снижает терапевтическую эффективность комбинированной химиолучевой терапии, эффективнее мексидола восстанавливает эритропоэз, а также в сопоставимой с мексидолом степени оказывает гепатопротекторное действие.

2. Мелатонин в сопоставимой с мексидолом степени препятствует активации процессов перекисного окисления липидов в сыворотке крови у животных при химиолучевой терапии и не снижает интенсифицированную активность свободнорадикальных процессов в ткани первичного опухолевого узла.

3. Сочетанное использование химиолучевой терапии с мелатонином и мексидолом характеризуется положительными патоморфологическими изменениями в ткани первичного опухолевого узла.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на X, XII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009, 2011); XIV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2010); XVIII -XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2011, 2012); VI пленуме президиума Российского общества патологоанатомов (Н.Новогород, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Здравоохранение XXI века: проблемы и пути решения» (Саранск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 научные работы в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 158 источника (103 отечественных и 55 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 16 рисунками и 14 таблицами.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные подходы к комбинированной противоопухолевой терапии: проблемы и перспективы

Определенные успехи в лечении злокачественных новообразований, достигнутые в последние годы, обычно связывают с развитием методик хирургического лечения, химио- и биотерапии. Однако полностью решить проблему местной девитализации опухоли без столь мощного фактора, как лучевая терапия, на современном этапе развития онкологии не представляется возможным. При этом основной задачей повышения эффективности воздействия является достижение излечения при минимальном риске развития лучевых реакций и осложнений (Виноградов В.М., 2007).

Лучевая терапия на протяжении последних десятилетий является одним из ведущих, высокоэффективных методов лечения различных форм онкологической патологии (Канаев C.B., 2002).

Повышение эффективности лучевой терапии возможно при обеспечении селективного усиления повреждения опухоли и снижении лучевой нагрузки на нормальные ткани, т.е. при соответствующем расширении радиотерапевтического интервала. Наиболее доступным и воспроизводимым способом усиления повреждения опухоли являются химиопрепараты, обладающие радиосенсибилизирующими свойствами.

Решающую роль в эффективности противоопухолевого действия химиопрепарата играет его доза. Однако увеличение дозы в большинстве случаев приводит к развитию побочных реакций, обусловленных токсическим повреждением нормальных органов и тканей (Гаузе Г.Ф., 1987).

По данным некоторых авторов, почти в 25% случаев лечение цитостатиками приходится прекращать из-за развития выраженных побочных эффектов (Гершанович М.Л., 1982, Kehrer J.P, 2000). В связи с этим поиск адекватной противоопухолевой терапии заслуживает пристального внимания и требует решения ряда проблем, связанных, прежде

всего, с ранней диагностикой и коррекцией побочных токсических эффектов химиотерапевтических препаратов (Арчаков А.И., 2004).

В клинической онкологии использование многокомпонентных программ лечения злокачественных заболеваний, в том числе сочетанного применения химио- и лучевой терапии, практикуется давно (Киселева Е.С., 1984; Fischer В., 1988; 1989; Anderson D.E. et al., 1989; Brady L.W., 1988).

Клинический опыт свидетельствует о том, что наибольшего прогресса в терапии злокачественных опухолей удалось достигнуть благодаря сочетанию облучения и химиотерапии, то есть химиолучевому лечению (Belka С. et al., 2006). Это, прежде всего, касается мультиморфной глиобластомы, опухолей головы и шеи, рака пищевода, прямой кишки, шейки матки и легкого (Канаев C.B., 2008).

Метод комбинированной химиолучевой терапии имеет ряд теоретических обоснований. Противоопухолевые препараты усиливают лучевое повреждение опухолевых клеток за счет нарушения механизма репарации поврежденной ДНК, синхронизации вступления опухолевых клеток в фазы клеточного цикла, наиболее чувствительных к лучевому повреждению, уменьшения числа опухолевых клеток, находящихся в фазе покоя, и способности убивать резистентные к облучению опухолевые клетки, находящиеся в гипоксии. Кроме того, сами противоопухолевые препараты обладают цитостатическим эффектом не только в отношении первичной опухоли и региональных метастазов, но и способны контролировать имеющиеся отдаленные метастазы (Кравец О.А и соавт., 2008).

Известно, что радиочувствительность клеток зависит от адекватности кислородного снабжения. В частности, в больших по размеру опухолях головы и шеи имеются большие области гипоксии и даже аноксии, что ведет к уменьшению радиочувствительности опухолевых клеток в этих областях. Предполагалось, что в сочетании с облучением химиопрепараты, которые способны к эрадикации гипоксических клеток, могут оказаться весьма эффективными, благодаря влиянию на радиорезистентные гипоксические

клетки. Сравнивая эффекты нескольких цитостатиков в комбинации с радиацией на рост СЗН карциномы молочной железы, удалось установить, что циклофосфамид, адриамицин и митомицин С оказывают наиболее значительное влияние на гипоксические клетки. В противоположность этому, блеомицин и цисплатин не имеют подобного выраженного эффекта на гибель гипоксических клеток (Belka С. et al., 2006).

Радиация вызывает нарушение синтеза ДНК путем разрыва как одной нити ДНК, так и двух. После облучения различные молекулярные системы вовлекаются в репарацию этих повреждений. Наиболее перспективны для химиолучевого лечения химиопрепараты, которы�