Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Гонадотоксические эффекты платиносодержащих цитостатических препаратов

На правах рукописи

Пахомова Ангелина Владимировна

ГОНАДОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ПЛАТИНОСОДЕРЖАЩИХ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

14.00.25 -фармакология, клиническая фармакология 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 2004

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН доктор биологических наук

Гольдберг Евгений Данилович Боровская Татьяна Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Зуева Елена Петровна

кандидат медицинских наук Чернова Евгения Николаевна

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт онкологии Томского научного центра СО РАМН

Защита состоится "_"_2004г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 001.031.01 в ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Автореферат разослан

2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Амосова Е.Н.

Актуальность проблемы: Среди существующих методов лечения онкологических больных в последние годы большое внимание уделяется цитостатической химиотерапии. Успехи противоопухолевой химиотерапии сегодня очевидны. Так, в настоящее время можно выделить группы злокачественных новообразований, при лекарственном лечении которых можно добиться длительных полных ремиссий [McVie J. Gordon, 1999; Переводчикова Н.И., 2000]. Однако возможности химиотерапии опухолей ограничиваются высокой токсичностью противоопухолевых препаратов [Гер-шанович М.А., Филов ВА., Акимов М.А., 1999; Свинцицкий B.C., Увтушенко Г.В., 2001; Shi Zhou-yin, 2001; Charalabopoulos К., Karkabounas S.Joachim E. Et all, 2002]. Большую чувствительность к их токсическому действию проявляют нормальные (не поврежденные опухолью) активно обновляющиеся клеточные системы организма, к которым, наряду с другими, относятся и ткани репродуктивных органов [Франкфурт О.С., 1976; Feneux Danielle, 2001]. В настоящее время нет исчерпывающей информации о механизмах гонадотоксических эффектов противоопухолевых препаратов, сравнительно недавно вошедших в онкологическую практику, в частности комплексных соединений платины [Урманцева Л.Ф., Кутушева Г.Ф., 2002]. Между тем, плати-носодержащие цитостатические препараты являются базисными во многих программах комбинированной химиотерапии [Бухман В.М., 2001]. В клинике широкое применение получили препараты платины первого и второго поколения - платидиам и карбоплатин. Они заменяют друг друга при лечении многих, хотя и не всех видов опухолей и отличаются друг от друга по лимитирующей токсичности. Так, платидиам обладает большей нефро- и меньшей гематологической токсичностью. Использование в клинической практике как того, так и другого препарата дает обнадеживающие результаты при лечении опухолей целого ряда локализаций (Бухман В.М., 2001]. В связи с этим возникает актуальная задача сохранения качества жизни пациентов, особенно учитывая их молодой возраст [Bacon C.G., Glass T.A., Kawachi I ct all, 1999; Feneux Danielle, 2001]. Следует отметить, что 75% из них считает репродуктивную функцию важным фактором их жизни [Siston Amy К., List Marsy A., Schieser Robert et all, 1997]. Актуальность изучения проблемы бесплодия, как одного из последствий действия ан-тибластомных средств, и в частности, препаратов группы платины, обусловлена также совершенствованием методов диагностики злокачественных новообразований, позволяющих проводить максимально щадящее хирургическое лечение органов репродуктивной системы, на фоне которого адьювантная химиотерапия комплексными соединениями платины позволяет добиться длительных полных ремиссий [Новикова Е.Г., Свиридова И.С., Антошечкина М.А., Роиина Е.А., 1996; Возный Э.К., Гуров С.Н., Добровольская Н.Ю., 2001]. Клинические наблюдения свидетельствуют о выраженных нарушениях функционального состояния как мужской, так и женской репродуктивной систем пациентов, перенесших полихимиотерапию на основе платино-содержащих антибластомпых средств [Hansen S.W., Berhelsen J.C. et all, 1990]. В то

же время, в ряде случаев наблюдается

M., Baki M., Bodrogi J., 1992]. Результаты экспериментальных работ, проводимых в этом плане, также носят противоречивый характер [Kopf- Maer Р., 1992; Malarvizhi D., Mathur P. P., 1996; Смирнова М.Е., 1997]. Кроме того, нерешенным является вопрос о том, препараты платины какого поколения являются в этом плане более токсичными [Bacon C.G., Glass T.A., Kawachi I et all, 1999; Feneux Danielle, 2001]. Судя по данным литературы, открытым остается также вопрос о реализации гоиадотоксических эффектов препаратов платины второго поколения в постнатальном развитии потомства. Между тем, они обладают способностью вызывать цитогенетические нарушения в половых клетках [Katoh M, Cain K., Hughes L. Et all, 1990], в связи с этим нельзя исключить возможность появления неполноценного потомства на фоне их использования.

В последние годы ведется интенсивный поиск путей коррекции гонадотоксиче-ских эффектов цитостатической химиотерапии [Растригин Н. А., Пивник А.В., 1997; Шилин Д.Е., Игнашина Е.В., 1999]. В клинике с этой целью уже используются овари-опротекторы [Шилин Д.Е., Игнашина Е.В., 1999; Урманцева А.Ф., Кутушева Г.Ф., 2002]. Однако, они обладают рядом побочных эффектов и имеют много противопоказаний. В связи с этим, является актуальным поиск средств, снижающих повреждающее действие цитостатических препаратов на репродуктивную функцию.

Цель исследования: Изучить в эксперименте морфологическое и функциональное состояние репродуктивной системы в ранние и отдаленные сроки после введения платиносодержащих цитостатических препаратов.

Задачи исследования:

1. Изучить характер, глубину и продолжительность морфологических и функциональных изменений репродуктивной системы крыс (самцов и самок) в ранние и в отдаленные сроки после введения платиносодержащего препарата - карбоплатина.

2. Провести сравнительный количественный анализ повреждающего действия на процессы созревания половых клеток препарата платины I поколения платидиама и препарата платины II поколения карбоплатина

3. Провести анализ состояния потомства, один из родителей которого перенес воздействие карбоплатином за 1,3 и 6 мес до спаривания.

4. Изучить возможность фармакологической коррекции нарушений репродуктивной системы, вызванных карбоплатином, с помощью модификаторов биологических реакций противоопухолевых препаратов.

Научная новизна и практическая значимость работы: В работе впервые с помощью современных методов исследования дана характеристика повреждающего действия платиносодержащего цитостатического препарата - карбоплатина на органы репродуктивной системы крыс (самцов, самок) и на их потомство. Принципиальную новизну представляют данные, касающиеся характера, глубины, динамики и механизмов нарушений репродуктивной системы при введении карбоплатина, а так же результаты сравнительной характеристики структурных повреждений платиноидов I и

II поколения (платидиама и карбоплатина). Оригинальные данные получены при изучении состояния потомства от родителей, один из которых получал карбоплатин, что может прогнозировать вероятность появления здорового ребенка.. В работе впервые показана возможность фармакологической коррекции нарушений репродуктивной функции, вызванных платиносодержащими цитостатическими препаратами, с помощью модификаторов биологических реакций.

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференциях «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2001, 2002, 2004), «Функциональные и прикладные аспекты базисной и клинической фармакологии» (Омск, 2002). Материалы работы были представлены на II Всесоюзном съезде научного общества фармакологов (Москва, 2003), сессии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск, 2003).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Объем и структура работы: Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 32 таблицами. Библиографический указатель включает 178 литературных источника, из них 97 отечественных и 81 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Эксперименты проведены на виргинных равиобредных крысах в количестве: 570 животных (самцов, самок), 185 из них составили контрольную группу, массой 150250 г.

Препараты вводили животным однократно внутривенно в МПД Карбоплатин (ке-мокарб, "Дабур Индия Лтд"., Индия) и Кетоплатин (платидиам, АБИК Лтд., Израиль), рассчитанных методом графического пробит-анализа при наблюдении за животными в течение 30 дней [Беленький М.М., 1963]. За величину МПД принимали дозу на про-битной сетке, вызывающую 5% гибель животных, которая оказалась равной для кар-боплатина - 60 мг/кг и для платидиама - 4 мг/кг. Карбоплатин растворяли водой для инъекций. Экстракт шлемника байкальского вводили - внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг в течение 2-х недель, начиная со следующего дня после введения карбоплатина, урометиксан (месиа) - внутримышечно в дозе 30 мг/кг за 30 и 5 минут до введения карбоплатина и через 15 и 30 минут после введения цитостатика. Контрольные животные получали растворитель в эквивалентном объеме.

Изучение состояния репродуктивной системы крыс проводили на 2, 5, 10, 15, 3040, 90-100 и 180-190-е дни (самцы) и на стадии эструс (самки) в течение первого месяца после введения препаратов и на 30-35, 90-95 и 180-185 дни эксперимента.

Сроки исследования потомства: плоды на 20-й день беременности, крысята в течение 2-х месяцев после рождения.

Функциональное состояние репродуктивной системы самцов и самок оценивали пугем изучения плодовитости животных и показателей эмбриональной гибели. Для этого животных опытной и контрольной групп ссаживали с интактными в соотношении 2 самки : 1 самец в течение 10 дней (продолжительность двух эстральных циклов). Спаривание регистрировали с помощью вагинальных мазков. Для оценки плодовитости вычисляли:

число самок, ссаженных с самцами

Самок умерщвляли методом смещения шейных позвонков на 20-й день беременности. Затем животных вскрывали и подсчитывали количество желтых тел в яичниках и мест имплантации в матке, число живых и мертвых плодов (из расчета на 1 самку). Показатели пре- и постимплантационной смертности вычисляли по формулам :

кол-во желтых тел - кол-во мест имплантации

смертность количество желтых тел

кол-во мест имплантации — кол-во живых плодов

смертность количество мест имплантации

Для оценки функционального состояния зрелых сперматозоидов животных (по 5 самцов на каждый срок эксперимента) умерщвляли методом смещения шейных позвонков. Извлекали придаток семенника, гомогенизировали в физиологическом растворе и, используя клеточную взвесь половых клеток эпидидимиса, определяли процент подвижных форм сперматозоидов и максимальную длительность их движения [Саноцкий И.В., Фоменко В.И., 19791.

Функциональное состояние репродуктивной системы самок изучали по изменению гормональной активности яичников, которую оценивали путем исследования продолжительности каждой из фаз эстрального цикла, изучая вагинальные мазки [Са-ноцкий И.В., Фоменко В.И., 19791. Работу с животными начинали после адаптации и установления у них регулярных эстральных циклов. Препараты вводили крысам, находящимся на стадии проэструса.

Для изучения морфологических показателей семенников крыс забивали на 2, 5, 10, 15, 30, 90 и 180-й дни после введения цитостатиков (по 5 животных на каждый

срок эксперимента). Извлекали семенник и эпидидимис, взвешивали, определяли весовые коэффициенты. Семенники фиксировали в жидкости Карнуа, готовили парафиновые срезы. Депарафинированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. На срезе семенника в каждом просмотренном канальце определяли количество слоев сперматогенного эпителия и вычисляли индекс сперматогенеза по формуле:

где а- количество слоев сперматогенного эпителия, обнаруженных в каждом канальце; А - количество подсчитанных канальцев (обычно просматривают 100 канальцев) [Саноцкий И.В., Фоменко В.И., 1979].

Кроме того, определяли количество нормальных сперматогоний, относительное количество клеток Лейдига, число канальцев с 12-й стадией мейоза, число канальцев со спущенным сперматогенным эпителием (расчет проводили на 100 канальцах) [Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф., 1983].

Для подсчета общего количества сперматозоидов, приходящихся на придаток, использовали гомогенизированную клеточную взвесь эпидидимиса в дозированном количестве физиологического раствора с применением лейкоцитарного меланжера и камеры Горяева [Саноцкий И.В., Фоменко В.И., 1979]. Второй придаток разрезали на предметном стекле и делали мазок. Мазок фиксировали в метиловом спирте, окрашивали азур Н-эозином и подсчитывали процент дегенеративных форм зрелых сперматозоидов [Пашутин Г.В., Михайлов Н.Н., Козло Н.Е.,1976].

Для исследования морфологических изменений в яичниках цитостатические препараты вводили крысам-самкам, находящимся в стадии проэструс. Самок забивали в стадии эструс на протяжении первого месяца после введения препаратов и на 30-35, 90-95 и 180-185 сут опыта по 5 животных на каждый срок эксперимента. Животных вскрывали, извлекали яичники, фиксировали их в жидкости Карнуа. Серийные парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. На срезах яичников подсчитывали количество примордиальных фолликулов и фолликулов с одним, двумя и более слоями гранулезных клеток, количество зрелых фолликулов (граафовы пузырьки), атрезирующих фолликулов, желтых тел и общее число генеративных элементов. Подсчет проводили по всей поверхности среза (фолликулы примордиальные и с одним слоем гранулезных клеток учитывали в каждом 10-м срезе, результат умножали на 10; фолликулы зрелые и с двумя и более слоями гранулезных клеток, атре-тические фолликулы - в каждом 5-м срезе и умножали на 5; желтые тела - в срединном срезе). При количественной оценке микроструктуры яичника фиксировали только фолликулы, яйцеклетка в которых содержала ядро и ядрышко [Саноцкий И.В., Фоменко В.И., 1979].

При изучении состояния потомства в антенатальном периоде развития плоды, извлеченные на 20-й день беременности (первым днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов в вагинальном мазке), взвешивали, проводили внешний осмотр и определяли их кранио-каудальний размер. После этого часть плодов помещали в раствор Боуэна для фиксации и последующего исследования состояния внутренних органов по методу Вильсона в модификации А. П. Дыбана. Оставшуюся часть плодов фиксировали в 96 % спирте и окрашивались по методу Доусона в модификации А.П. Дыбана с целью оценки процессов оссификации [Дыбан А.П., Баранов B.C., Акимова И.М., 1970].

Часть беременных самок оставляли до родов для изучения состояния потомства в постнатальном периоде развития. Фиксировали продолжительность беременности и день родов, вычисляли индекс выживаемости (как отношение числа крысят, выживших на 4-й день, к числу родившихся живыми х 100 %) [Диннерман А.А., 1980]. Для оценки физического развития потомства исследовали динамику массы крысят на 5, 15, 30 и 60-й дни жизни, устанавливали сроки отлипания ушной раковины, появления первичного волосяного покрова, прорезания резцов, открытия глаз, опускания семенников и открытия влагалища. Па 5-й и 15-й дни жизни изучали двигательную активность и формирование сенсорно-двигательных рефлексов по тестам: переворачивание на плоскости, избегание обрыва, способность удерживаться и подтягиваться на горизонтальной веревочке. В месячном возрасте наблюдали ориентировочно-исследовательское поведение в условиях "открытого поля" [Вихляева Ю.И., 1982]. На 60-й день жизни у крысят оценивали способность к обучению в тесте "условный рефлекс пассивного избегания" [Балынина Е.С., Тимофеевская Л.А., 1978] и способность к адаптивному поведению методом избегания стресс-ситуации по Хандерсону в модификации Н.А. Бондаренко [Бондаренко ИЛ., 1986].

Анализ состояния потомства был проведен у 8 опытных и 2 контрольных групп плодов и крысят, полученных при следующих видах скрещивания:

1. интактные самки с самцами, которым вводили карбоплатин за 1, 3 и 6 месяцев до спаривания;

2. интактные самцы с самками, получившими карбоплатин в те же сроки до скрещивания;

3. интактные самцы с самками, получившими карбоплатин и один из модификаторов биологических реакций (месна, ЭШБ) за 3 мес до скрещивания;

4. интактные самцы и самки контрольной группы;

5. интактные самки и самцы контрольной группы.

Для проведения статистической обработки полученного экспериментального материала производили подсчет среднего значения параметра и стандартной ошибки отклонения. Значимость различий определяли по непараметрическому критерию Вилкоксона - Манна - Уитни и угловому преобразованию Фишера. Значимость различий считали достоверной при Р<0,05 [Лакин Г.Ф., 1990].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении влияния карбоплатина и платидиама на сперматогенез крыс было установлено, что они не приводят к снижению весовых коэффициентов семенников на протяжении всех сроков исследования. В тоже время гистологический анализ показал, что оба препарата вызывали в мужских половых железах крыс выраженные морфологические изменения, сходные по характеру. Так, в первые 10 суток после их введения на фоне отека интерстиция и расширения сосудов отмечались дистрофические и деструктивные изменения эпителиоцитов и интерстициальных эндокриноцитов. В просвете канальцев нередко можно было наблюдать скопление погибших клеток. Сперматоген-ный эпителий выглядел истонченным. Отмеченные морфологические изменения в семенниках выяачены и при введении эквивалентных доз противоопухолевых антибиотиков антрациклино-вого ряда (доксорубицин, фарморуби-цин), препаратов растительного происхождения (венезид) [Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., 2003; Сухачева Т.В., Богуш ТА., Коломиец О.Л., 2003].

Канальцы со спущенным эпителием

% от контроля

Рис. 1, а, б. Морфологические показатели генеративной функции семенников крыс после однократного введения препаратов в МПД. Стрелками отмечены точки, имеющие достоверные различия по сравнению с контролем при о - контроль; - карбоплатин;

А- платидиам.

Нормализация морфологической картины мужских половых желез на фоне введения платидиама наблюдалась через 1 мес, а при использовании карбоплатина - только спустя 6 мес после начала эксперимента. Другие особенности гонадотоксического действия каждого из исследуемых препаратов позволил выявить количественный анализ структурных нарушений. Так, при подсчете количества канальцев со сгущенным эпителием было установлено (рис. 1, а), что этот показатель возрастал по сравнению с контролем в первые дни эксперимента при введении, как того, так и другого препарата, что свидетельствует о прямом их повреждающем действии на спермато-генную ткань. В то же время, на фоне введения карбоплатина усиленное слущивание

наблюдалось вплоть до 180-х суток опыта, что, очевидно, связано с образованием, под его действием, генерации патологически измененных клеток, которые подвергались элиминации. Количество канальцев с 12-й стадией мей-оза в ранние сроки после введения кар-боплатина было ниже, чем в контроле (особенно на 15-й день опыта), но различия оказались статистически не значимыми (рис.1, б). Введение плати-диама приводило к статистически значимому снижению этого показателя в первые дни опыта, что является результатом прямого токсического действия на сперматоциты 2-ого порядка. Затем происходила быстрая нормализация этого показателя. В отдаленные сроки после введения препаратов не было выявлено угнетения пролиферативной активности. Более того, через 3 и 6 мес после введения платидиама и через 6 мес после введения карбоплатина наблюдалось более высокое, чем в контроле количество клеток с 12-й стадией мейоза, что свидетельствует о стимуляции процессов репаратизной регенерации (рис. 1, б). Сопоставляя данные о скорости пролиферативных процессов на фоне введения платиносодержащих

Индекс сперматогенеза % от контроля

15 30 90 180

сут

Количество нормальных сперматого-ний

% от контроля

120 100 I

801 604020 -

2 5 10 15 30 90 180

Р и с 2, а, б. Морфологические показатели генеративной функции семенников крыс после однократного введения препаратов в МПД. Стрелками отмечены точки, имеющие достоверные различия по сравнению с контролем при Р<0,05

- пла-

тидиам.

препаратов с таковыми при использовании в эквивалентных дозах противоопухолевых препаратов других групп (производных подофиллотоксинов, антрациклиновых антибиотиков) [Боровская Т.Г., Фомина Т.И., Полуэктова М.Е. и др., 1999], следует отметить, что угнетение мейотической активности при введении платиносодержащих цитостатических препаратов выражено в меньшей степени.

Индекс сперматогенеза (рис. 2, а) в семенниках крыс, получавших карбопла-тин, не отличался от контрольных значений на протяжении всего опыта. На фоне же введения платидиама статистически значимое снижение этого показателя отмечалось с 5 по 30-е сут эксперимента, что может быть связано с его более выраженной

способностью, по сравнению с карбоп-латином, угнетать мейотическую активность гоноцитов. Количество нормальных сперматогоний (рис. 2, б) снижалось до 60-70% от контроля в семенниках животных обеих опытных групп, но карбоплатин приводил к статистически значимому сокращению численности этой клеточной популяции в первые дни после введения, а платидиам - с 10 - 30-е сут опыта. Последнее может быть, обусловлено истощением пролиферативного пула го-ноцитов в результате повреждающего действия платидиама на стволовые клетки. Через 3 и 6 мес после начала эксперимента количество нормальных сперматогоний во всех сравниваемых группах было сходно. Оба препарата приводили, в ранние сроки после введения, к статистически значимому снижению (на фоне введения карбопла-тина на 27%, платидиама на 30% от контроля) количества клеток Лейдига. При изучении других морфологических и функциональных показателей, характеризующих генеративную функцию семенников, было установлено, что оба платиносодержащих препарата

Общее количество сперматозоидов % от контроля 200 т

сут

Максимальная продолжительность движения сперматозоидов % от контроля

150

100 <

сут

Рис. 3, а, б. Морфологические показатели генеративной функции семенников крыс после однократного введения препаратов в МПД. Стрелками отмечены точки, имеющие достоверные различия по сравнению с контролем при Р<0,05

1 - пла-

тидиам.

приводили, в первые дни опыта, к снижению общего количества половых клеток, приходящихся на придаток (рис. 3, а), максимальной продолжительности их движения (рис. 3, б), количества их подвижных форм (рис. 4, а), а также процента дегенеративных форм зрелых сперматозоидов (рис. 4, б), что является результатом прямого токсического действия препаратов на зрелые мужские половые клетки. Большинство отмеченных изменений были выражены в большей степени при введении карбопла-тина. У животных, получавших карбоплатин, снижение количества подвижных форм спермиев, наблюдалась на 15-30-е сут опыта, что свидетельствует (с учетом длительности сперматогенеза у крыс) об их токсическом действии на формирующиеся спер-матиды и сперматоциты.

Таким образом, сравнительный Подаижтге формы

анализ состояния сперматогенеза у сперматозоидов

крыс, получавших платидиам и карбо-платин, показывает, что последний обладает большим повреждающим действием на процесс созревания мужских половых клеток. О чем свидетельствует, прежде всего, усиленная элиминация созревающих клеток вплоть до 6-и мес после введения карбоплатина, а так же более выраженное по сравнению с платидиамом снижение показателей функционального состояния спермиев. Анализ полученных данных позволяет так же заключить, что платиносодер-жащие препараты повреждают эпите-лиоциты, находящиеся в разных фазах клеточного цикла (сперматогонии, сперматозоиды, сперматиды, спермато-циты), что, в свою очередь, может быть обусловлено отсутствием фазовоспе-цифических свойств у данных цитоста-тических препаратов и, следовательно, способностью повреждать гоноциты, находящиеся в различных фазах клеточного цикла.

Оценка функционального состояния репродуктивной системы крыс-самцов на фоне введения карбоплатина показала, что в первые дни опыта

наблюдается снижение их способности к спариванию. При изучении эффективности спаривания было выявлено, что препарат приводит к частичной временной стерильности на 1-10-е и 10-20-е сутки после введения. Это может быть обусловлено снижением количества подвижных форм и максимальной продолжительности движения спермиев, выявленным в этот период наблюдения. Сопоставляя полученные нами данные с таковыми при введении крысам-самцам платидиама в МПД [Смирнова М.Е., 19971, следует отметить, что платиносодержащий препарат I поколения не приводит к снижению эффективности спаривания, что позволяет заключить о его меньшем повреждающим действии на генеративную функцию семенников по сравнению с карбоплатином. Это, очевидно, обусловлено, большим повреждающим действием

Рис. 4, а, б. Морфологические показатели генеративной функции семенников крыс после однократного введения препаратов в МПД. Стрелками отмечены точки, имеющие достоверные различия по сравнению с контролем при Р<0,05

о - контроль; ■ - карбоплатин; А-- пла-тидиам.

последнего на сперматогенез, что было Примордаальные фолткулы

выявлено при сравнительном анализе гонадотоксических эффектов препаратов. При сравнительной оценке другого интегрального показателя воспроизводящей функции - способности к спариванию — выявлено, что угнетение половой активности крыс-самцов наблюдается только на фоне введения карбоп-латина. Учитывая, что животные при этом вели себя вяло, апатично, у них наблюдалась диспепсия - это может быть обусловлено токсическим действием препарата на желудочно-кишечный тракт. Нельзя исключить также возможности снижения уровня половых гормонов, так как при морфологическом анализе было выявлено сокращение численности клеточной популяции клеток Лейдига. Одним из показателей, характеризующих генеративную функцию крыс-самцов, является уровень эмбриональной смертности у спаренных с ними самок. Уменьшение количества выживших зигот свидетельствует о функциональной, в том числе и генетической неполноценности

спермиев [Саноцкий И.В., Фоменко В.И., 1979]. Показатели пре- и постимплантаци-онпой смертности, на фоне введения карбоплатина, возрастали по сравнению с контролем, но из-за большого разброса данных различия оказались статистически не значимы.

При изучении влияния платиносодержащих'цитостатических препаратов на процесс созревания женских половых клеток было установлено, что в яичниках крыс, получавших карбоплатин и платидиам, возникали однотипные морфологические изменения, сходные по степени выраженности. Так, в течение 1 мес после введения препаратов наблюдался интерстициальный отек, массовая гибель клеток фолликулярного эпителия, распад ядер яйцеклеток, образование фолликулярных кист, кист желтого тела. Отмеченные изменения были наиболее выражены в течение первой недели после введения препаратов (1 -2-й эструсы). Через 3 и 6 мес после начала эксперимента в яичниках крыс сравниваемых групп наблюдалось развитие

Рис. 5, а, б. Содержание структурно-функциональных элементов яичников крыс после введения платиносо-держащих противоопухолевых препаратов. Стрелками отмечены точки, имеющие достоверные различия по сравнению с контролем при Р<0,05. о -контроль; плати-

диам.

атрофических процессов, связанных с возрастом. В то же время в половых железах животных, получавших препараты, разрастание соединительной ткани было более значительным, чем в контроле.

Количественный подсчет структурно-функциональных элементов яичников показал, что примордиальные фолликулы являются мишенью действия, как того, так и другого препаратов (рис. 5, а). Так, их число, в ранние сроки, снижалось на 25% на фоне введения карбоплатина и на 35% - на фоне пла-тидиама, что может быть следствием, как гибели клеток фолликулярного эпителия, так и дегенеративных изменений яйцеклеток [Волкова О.В., 1980]. В яичниках крыс, получавших плати-диам, в первые дни опыта, наблюдалось еше и уменьшение (более чем в 2 раза) числа двух- и многослойных фолликулов (рис. 5, б). Повреждающее действие на примордиальные и многослойные фолликулы оказывают, судя по данным литературы противоопухолевые препараты других групп, в частности Тио-Тэф [Арсеньева A.M., Бакунина Э.Д., Головкина Л.В. и др., 1967]. В первые

Лтретические фолликулы

Рис. 6, а, б. Содержание структурно-функциональных элементов яичников крыс после введения платиносо-держащих противоопухолевых препаратов. Стрелками отмечены точки, имеющие достоверные различия по сравнению с контролем при о -

контроль; ш — карбоплатин; А- плати-диам.

дни после введения карбоплатина (1-й, 2-й эструсы) количество двух- и многослойных фолликулов, напротив, возрастало (рис. 5, б). Кроме того, достоверно снижалось еще и число атретических фолликулов (рис. 6, а). Стимуляция фолликулогенеза, наблюдаемая на фоне введения карбоплатина, обусловлена, очевидно, гормональным дисбалансом. В связи с этим нельзя исключить токсическое действие препаратов на гормон продуцирующие клетки (клетки внутренней, внешней теки, интерстициаль-ные клетки, а так же клетки фолликулярного эпителия), повреждение которых могло привести к нарушению процессов стероидогенеза. Следует отметить так же, что ускоренное созревание фолликулов не является, в данном случае, положительным моментом, так как при этом наблюдалось повреждение ядер яйцеклеток. В последующие сроки (2-й эструс) атретические процессы усиливались (рис. 6, а), что, возможно, яви-

лось следствием как ускоренного фолликулогенеза, так и непосредственного повреждающего действия препарата на клетки гранулезы. Количество граафовых пузырьков и желтых тел при введении платиносодержащих препаратов в отдельные сроки наблюдения были ниже контрольных значений, но различия оказались статистически не значимыми. Сравнивая полученные нами данные с результатами исследования других авторов можно заключить, что платиносодержащие препараты обладают меньшим повреждающим действием на яичники, чем другие алкилирующие соединения, в частности циклофосфан, так как по данным Е. Jarrell с соавт. (1987) однократное введение последнего в эквивалентных дозах крысам приводит к резкому снижению количества преовуляторных фолликулов и желтых тел [JarreU E., Voung Loi E., Barr R. et all, 1987]. Подсчет общего количества генеративных элементов показал, что этот показатель снижался в обеих экспериментальных группах через один день после начала эксперимента (рис. 6, б), что является, прежде всего, результатом снижения количества примордиальных фолликулов. Возрастание этого показателя в яичниках крыс, получавших карбоплатин, в течение следующих эстральных циклов связано, очевидно, со стимуляцией фолликулогенеза. Увеличение количества генеративных элементов выше контрольного уровня происходит, по-видимому, за счет пополнения пула при-мордиальных фолликулов, так, как у крыс процесс их формирования продолжается до 3-х месячного возраста [Manova-Todorova К., Baralska- Nesheva M.t Shnstov J. et all, 1986].

При подсчете количества структурно-функциональных элементов яичников в отдаленные сроки после цитостатических воздействий было выявлено, что через 6 мес после введения как платидиама, так и карбоплатина наблюдалось снижение количества примордиальных фолликулов (рис. 5, а). В яичниках крыс, получавших плати-диам, было снижено и количество двух- и многослойных фолликулов, а также общее количество генеративных элементов. Это позволяет заключить, что платидиам вызывает более выраженное истощение резервных возможностей по сравнению с карбоп-латином. Более раннее, чем в контроле, истощение резервных возможностей яичников, наблюдаемое в отдаленные сроки после введения препаратов является, очевидно, следствием прямого их повреждающего действия на примордиальные фолликулы.

Изучение эстрального цикла на фоне введения карбоплатина показало, что у 36% крыс-самок сразу после введения препарата наблюдаюсь остановка эстрального цикла на 24-48 часов, оставшиеся 64% животных сразу вступили в очередной эст-рааьный цикл. У 35% последних длительность циклов была сходна с таковой в контроле, у других продолжительность первого, второго, третьего циклов была увеличена за счет удлинения стадии диэструс на 15,62±5,88 ч. Впоследствии фазовая структура цикла восстанавливалась и происходила нормализация его длительности. В отдаленные сроки после введения карбоплатина продолжительность каждой из фаз эст-рального цикла была сходна с таковою в контроле. При сопоставлении полученных

данных с результатами изучения эст-рального цикла после однократного введения платидиама в МПД [Смирнова М.Е., Боровская Т.Г., 1996], выявлено, что платидиам не вызывает нарушений фазовой структуры цикла, а только несколько увеличивает его длительность. Следует отметить, что наблюдаемое, на фоне введения карбоп-латина, угнетение гормональной активности яичников, так же не является значительным, так как при этом не было обнаружено существенного снижения способности к спариванию, которая определяется в течение 2-х эстральных циклов. Этот показатель у крыс, получавших карбоплатин, во все сроки исследования, был сходен с контрольными значениями. На протяжении всего эксперимента эффективность спаривания не снижалась, что может свидетельствовать о том, что препарат не приводил к 100% гибели зигот, оплодотворенных на различных стадиях созревания фолликулов. В то же время, при изучении показателей

Преимплантационная

Рис. 7, а, б. Эмбриональная смертность у крыс-самок, получавших карбоплатин при скрещивании в сроки соответствующие различным стадиям созревания фолликулов. * - достоверные различия по сравнению с контролем, а - контроль, - карбоплатин.

эмбриональной гибели было выяалено, что у самок, получавших карбоплатин, этот показатель возрастал при воздействии на преовуляторные, зрелые фолликулы (скрещивание с 1-х по 10-е сут), двух- и многослойные (скрещивание с 30-х по 40-е сут) и примордиальные фолликулы (скрещивание через 3 и 6 мес; рис. 7, а, б). Следует отметить, что высокая эмбриональная гибель у самок отмечается не только на фоне введения карбоплатина, но и платидиама, а так же антибластомных средств других групп [Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., Полуэктова М.Е., 2000]. Отмеченный токсический эффект может быть следствием повреждающего действия препаратов как на половые железы, так и на другие органы репродуктивной системы и на материнский организм в целом. Сопоставляя полученные нами данные с таковыми у животных, которым вводили эквивалентные дозы платидиама [Смирнова М.Е., Боровская Т.Г., 1996], следует отметить, что последний вызывал частичное временное бесплодие крыс (в первые дни после введения), что позволяет, по-видимому, утверждать, что карбоплатин обладает меньшим повреждающим действием на яйцеклетки зрелых фолликулов по сравнению с платидиамом.

Безусловный интерес представляет собой выяснение вопроса о реализации го-надотоксических эффектов карбоплатина в анте- и постнатальном развитии у потомства. В клинике состояние потомства, один из родителей которого перенес цитоста-тическую химиотерапию, изучается особенно тщательно [Mormor D., 1993; Retsas S., Mackenzei H., Mohith A., 1996; Byrne J., Rasmussen S., Steinhorm S. et all, 1998], что связано, прежде всего, с выраженной гснотоксичностью противоопухолевых препаратов. Данные литературы свидетельствуют о том, что плагиносодержащие препараты обладают способностью вызывать цитогенетические нарушения как в соматических [Карпова Г.В., Фомина Т.И., Воронова О.Л. и др., 2001], так и в половых [Katoh MA.. Cain K.T., Hughes L.A. et all, 1990] клетках. Следствием мутагенных эффектов может быть элиминация неоплодотворенных половых клеток, формирование нежизнеспособных зигот, а так же появление жизнеспособного, но неполноценного потомства. Нами было изучено состояние потомства, полученного от родителей, один из которых (самец или самка) получал карбоплатин за 1,3 и 6 мес до спаривания. Оценка состояния потомства была проведена по критериям, рекомендованным фармакологическим комитетом МЗ РСФСР при изучении репродуктивной токсичности. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Установлено, что у интактных крыс-самок, скрещенных с самцами, которым вводили карбоплатин, показатели эмбриональной гибели не возрастали по сравнению с контролем, что подтверждает экспериментальные данные Witt K.L. и Bishop J.B. (1996) свидетельствующие о том, что платиноиды не вызывают повышения уровня ДЛМ в мужских половых клетках.

При изучении других исследуемых показателей был выявлен ряд токсических эффектов, характерных для потомства интактных самок и самцов, получавших карбоплатин (табл.1). Так, потомство характеризовалось возрастанием количества плодов с патологическими изменениями внутренних органов, торможением процессов оссифи-кации. У родившихся крысят было выявлено снижение индекса выживаемости, замедление физического развития (задержка прорезания резцов), снижение скорости формирования сенсорно-двигательных рефлексов, мышечного тонуса, способности к обучению и адаптивному поведению, повышение горизонтальной и вертикальной двигательной активности (тест «открытое поле»). Следует отметить, что торможение процессов оссификации, патологические изменения внутренних органов, замедление физического развития выявлялись в потомстве крыс-самцов после введения плати-диама и цитостатических препаратов других групп, в частности противоопухолевых антибиотиков антрациклинового ряда [Shima Y., 1994; Takashima Hiromosa, Kaneko Yosuo, Wada Azusa, 1996; Гольдберг Е.Д. Боровская Т.Г., 2000].

При оценке состояния потомства крыс-самок, получавших карбоплатин, обращает на себя внимание факт возрастания показателей пре- и постимплантационной смертности. Грубых внешних аномалий развития на фоне введения карбоплатина выявлено не было. В тоже время, было выявлено увеличение, по сравнению с

Таблица 1

Состояние потомства крыс, скрещенных в различные сроки после введения платиносодержащих цитостатиков

контролем, количества плодов с патологическими изменениями внутренних органов, отмечалось торможение процессов оссификации, снижение кранио-каудального размера плодов. У родившихся крысят этой группы наблюдалось нарушение физического развития (снижение массы тела), снижение скорости формирования сенсорно-двигательных рефлексов, низкая жизнеспособность потомства. Так, у самок, получавших карбоплатин за 3 мес до спаривания, индекс выживаемости к 15-м сут жизни составил 0%. Эти изменения не являются специфическими для препаратов этой группы и выявляются в потомстве экспериментальных животных, получавших платидиам

и антибластомные средства с другим механизмом цитостатического действия, в частности антибиотики антрациклинового ряда [Смирнова М.Е., 1997; Гольдберг Е.Д., Боровская Т.Г., 2003].

Следует отметить, что токсические эффекты, выявленные только в потомстве крыс-самок, получавших препарат, такие, как повышенная эмбриональная гибель, низкая выживаемость потомства, могут быть следствием повреждающего действия карбоплатина на материнский организм. Учитывая, что у беременных самок через 3 мес после введения карбоплатина, наблюдалось выраженное снижение жизнеспособности потомства, у животных этой группы были изучены показатели периферической крови, костного мозга [Карпова Г.В., Тимина Е.А., 2003]. Проведенное исследование показало, что у животных, на фоне беременности, наблюдалось развитие прогрессирующей регенераторной анемии гемолитического характера, что может быть одной из причин низкой жизнеспособности потомства [Савченко Ю.И., Шилов С.Н., 2001]. Анализируя причины высокой эмбриональной гибели у крыс-самок, получавших кар-боплатин, следует обратить внимание на сравнительно недавно установленный фаю возможности повышения уровня доминантных летальных мутаций в женских половых клетках под действием платиносодержащих препаратов [Katoh MA, Cain K.T., Hughes L.A. et all, 1990]. В связи с этим нельзя исключить генетическую обусловленность высокой смертности эмбрионов у самок, получавших карбоплатин.

Учитывая, что при введении препарата крысам-самкам, наблюдалось увеличение показателей эмбриональной гибели и низкая выживаемость потомства, можно утверждать, что потомство самок опытной группы характеризовалось более низкой жизнеспособностью, чем потомство интактных самок и самцов, получавших препарат. Анализируя состояние потомства животных, получавших карбоплатин, в зависимости от сроков скрещивания после цитостатического воздействия, следует отметить, что жизнеспособность потомства интактных самок и самцов, получавших препарат за 6 мес, оказалась более высокой по сравнению с таковой при спаривании в более ранние сроки (табл. 1). Так, на фоне введения карбоплатина самцам такие токсические эффекты, как снижение индекса выживаемости, замедление физического развития, понижение мышечного тонуса, повышение горизонтальной двигательной активности отмечались при скрещивании только через 1 мес после цитостатического воздействия. Подобная закономерность не выявлялась при оценке состояния потомства крыс-самок, получавших препарат, о чем свидетельствовали, прежде всего, высокие показатели эмбриональной гибели, наблюдаемые при скрещивании через 6 мес введения карбоплатина (таб. 1).

Таким образом, однократное введение платиносодержащего препарата II поколения (карбоплатина) крысам (самцам и самкам) за 1, 3 и 6 мес до скрещивания с ин-тактными партнерами, оказывает токсическое действие на потомство. Степень выраженности токсических эффектов у потомства животных, получавших карбоплатин,

зависела от пола родителя, получавшего препарат, и от срока скрещивания после его введения (потомство крыс-самцов).

Сравнительный анализ состояния потомства на фоне введения карбоплатина и платидиама [Смирнова М.Е., 1997] показывают, что препарат платины II поколения обладает большим повреждающим действием.

В настоящее время ведется интенсивный поиск путей снижения гонадотокси-ческих эффектов цитостатической химиотерапии [Растригин Н.А., Пивник А.В., 1997; Шилин Д.Е., Игнашина Е.В., 1999; Сухачева Т.В., 2001; Урманцева А.Ф., Кутушева Г.Ф., 2002]. В онкологической клинике (в частности при лечении гемобластозов), с целью уменьшения потенциальных клеток мишеней в яичниках, во время цитостати-ческой химиотерапии, уже используются эстроген-гестогенные препараты, но их применение ограничено, так как они имеют целый ряд противопоказаний и вызывают побочные эффекты [Шилин Д.Е., Игнашина Е.В., 1999; Урманцева А.Ф., Кутушева Г.Ф., 2002]. В наших экспериментах была сделана попытка фармакологической коррекции гонадотоксических эффектов карбоплатина. С этой целью нами были использованы два корректора: первый - синтетического происхождения — месна (урометик-сан); второй - природного происхождения - экстракт шлемника байкальского (ЭШБ). Оба препарата являются модификаторами биологических реакций цитостатических препаратов, обладающих способностью, не уменьшая лечебный эффект цитостатика, снижать их токсическое действие на систему кроветворения, желудочно-кишечный тракт. Так, месна, являясь SH-содержащим соединением, инактивирует образующиеся, в ходе воздействия антибластомных средств на клетки, перекиси, гидроперекиси, супероксидные и гидроксидные радикалы [Богуш Т.А., Колдаева Е.Ю., Смирнова Г.Б. и др., 2001]. В экспериментальных исследованиях, проведенных Сайфутдиновым P.P. (1997) показано, что экстракт шлемника байкальского обладает антиоксидантными свойствами [Сайфутдинов P.P., I997].

Учитывая, что наибольшее угнетение воспроизводящей функции было выявлено через 3 мес после введения карбоплатина крысам-самкам, в этот период наблюдения, в отдельной серии экспериментов, было изучено состояние их репродуктивной функции на фоне его сочетанного введения: с месной; с ЭШБ. Функциональное состояние репродуктивной системы оценивалось по проценту родившихся крыс, показателям эмбриональной смертности, индексу выживаемости, количеству плодов с патологическими нарушениями внутренних органов. Установлено, что оба используемых корректора оказывали положительное влияние на воспроизводящую функцию самок. Так, в группе крыс, получавших карбоплатин как с месной, так и с ЭШБ число родивших крыс составило 100%, в то время как у животных, которым вводили только цитостатик, беременность закончилась родами лишь у 45% самок (Р<0,05). Использование корректоров приводило также к увеличению индекса выживаемости потомства (рис. 8). Кроме того, на фоне введения месны выявлялось меньшее число плодов с па-

тологическими изменениями внутренних органов. Защитное действие ЭШБ оказалось более выраженным. Так, на фоне его введения с карбоплатином наблюдались более низкие значения, чем при использовании одного цитостатика, показателей эмбриональной смертности (рис.8).

индекс выживаемости потомства, %

пре- и постимплантационная смертность, %

Рис.8. Индекс выживаемости потомства и показатели эмбриональной смертности крыс-самок, получавших карбоплатин и корректоры.

1 - контроль; 2 - карбоплатин; 3 - карбоплатин + ЭШБ; 4 - карбоплатин + месна. *- различия достоверны по сравнению с контролем. ** - по сравнению с группой кар-боплатин.

Полученные данные свидетельствуют о том, что использование месны и ЭШБ на фоне цитостатического воздействия способствовало сохранению способности к деторождению, потомство рождалось в срок и более жизнеспособным по сравнению с таковым при введении одного карбоплатина. Это может быть следствием, как уменьшения количества потенциальных клеток мишеней в самих половых железах, так и снижением токсического влияния препаратов на материнский организм. ЭШБ оказал более выраженное защитное действие по сравнению с месной. Следует отметить, что преимуществом ЭШБ, по сравнению с месной являются, выявленные в экспериментальных исследованиях [Разина Т.Г., 1988], его антиметастатические свойства. Кроме того, на крысах с перевиваемой опухолью, было показано [Зуева Е.П., Разина Т.Г., Карпова Г.В. и др., 2002], что введение ЭШБ на фоне введения карбоплатина не только не снижает его противоопухолевое действие, ио даже усиливает его. При этом наблюдается его благоприятное воздействие на миелодепрессию, вызванную цитоста-тическим препаратом.

ВЫВОДЫ

1. В ранние сроки после однократного введения крысам платиносодержащего цито-статического препарата карбоплатина в МПД (60 мг/кг) в половых железах отме-

чаются деструктивные и дистрофические изменения, угнетение процессов созревания половых клеток. У крыс-самцов снижается способность к спариванию и воспроизводящая способность. У крыс-самок наблюдается увеличение эстрально-го цикла за счет удлинения стадий метиэструс и диэструс, носящее обратимый характер. При скрещивании крыс-самок, получавших карбоплатин с интактными самцами, наблюдается увеличение эмбриональной гибели.

2. В отдаленные сроки после однократного введения в МПД карбоплатина в мужских половых железах крыс наблюдается усиленная элиминация эпителиоцитов; в женских половых железах - снижение количества генеративных элементов. Способность к спариванию и его эффективность при этом не снижаются. При скрещивании крыс-самок в отдаленные сроки после введения карбоплатина (3, 6 мес) с интактными самцами отмечается увеличение эмбриональной гибели.

3. Повреждающее действие на процессы созревания мужских половых клеток выражены в большей степени при введении карбоплатина, чем платидиама.

4. Структурно - функциональные элементы яичников проявляют различную чувствительность к токсическому действию карбоплатина и платидиама. Более выраженное истощение резервных возможностей яичников наблюдается на фоне введения платидиама, чем карбоплатина.

5. Потомство животных (самцов и самок) экспериментальных групп характеризуется сниженной жизнеспособностью: увеличением количества плодов с патологическими изменениями внутренних органов, торможением процессов оссификации. В постнатальном развитии наблюдается снижение индекса выживаемости, нарушение физического развития, понижение мышечного тонуса, замедление скорости формирования сенсорно-двигательных рефлексов, пониженная эмоциональная реакция, увеличение горизонтальной, вертикальной и двигательной активности.

6. Введение модификаторов биологических реакций (месна, ЭШБ) крысам-самкам на фоне воздействия карбоплатином снижает повреждающее действие цитостати-ка на воспроизводящую функцию.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние противоопухолевых препаратов на морфологическое и функциональное состояние семенников крыс.//Актуальныс проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2001. - С.22-27. (соавт. Т.Г. Боровская, М.Е. Полу-эктова, Т.Н. Фомина, О.П. Лоскутова).

2. Состояние сперматогенеза у крыс после введения карбоплатина.// Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии.. - Томск, 2001. -С.105-108.

3. Влияние платиносодержащих препаратов на сперматогенез у крыс.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - приложение № 3. - С. 23-27. (соавт. Т.Г. Боровская, Т.И. Фомина, О.П. Лоскутова, В.Е. Гольдберг).

4. Влияние платиносодержаших препаратов на антенатальное развитие потомства.// Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2002. - С. 128-131. (соавт. М.Е. Полуэктова, СИ. Боровская).

5. Постнатальное развитие потомства самцов, половые клетки, которых были подвергнуты воздействию препаратами платины второго поколения.// Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2002. -С. 124-128. (соавт. Т.Г. Боровская).

6. Отдаленные эффекты повреждающего действия карбоплатина на репродуктивную систему крыс.// Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2002. - С. 120-124. (соавт. Т.Г. Боровская).

7. Морфологическое состояние семенников крыс в ранние и отдаленные сроки после введения противоопухолевых препаратов разных групп.// Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии. -Томск, 2002.- Выпуск 2. - С. 9092. (Сборник научных трудов, посвященных 150-летию со дня рождения А.С. Догеля.) (соавт. Т.Г. Боровская, Т.И. Фомина).

8. Состояние сперматогенеза у крыс, получавших противоопухолевые препараты.// Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - приложение №1-С. 110-113.(соавт. Т.Г. Боровская, М.Е. Полуэктова, В.Е. Гольдберг).

9. Влияние противоопухолевых препаратов на сперматогенез крыс.7/ Функциональные и прикладные аспекты базисной и клинической фармакологии (материалы Всероссийской научной конференции 6 декабря 2002 года)/ Омск, 2002. - С. 9297. (соавт. Е.Д. Гольдберг, Т.Г. Боровская).

10. Состояние репродуктивной системы при введении платиносодержаших цитоста-тических препаратов. // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. - 2003. -приложение №2. - С. 55-61. (соавт. Т.Г. Боровская, М.Е. Полуэктова, ЕА. Тимина, Г.В. Карпова, Е.Д. Гольдберг, Т.И.Фомина).

11. Ранние и отдаленные эффекты цитостатических препаратов на репродуктивную систему крыс и пути их фармакологической коррекции // Актуальные проблемы фармакологии: Материалы конференции. - Томск, 2004. - С.36-39. (соавт. Т.Г. Боровская, М.Е. Полуэктова, Е.А. Тимина, Ю.А. Кочегурова, Т.И. Фомина, В.Е. Гольдберг).

12. Морфологическое и функциональное состояние яичников крыс в ранние и отдаленные сроки при введении платиносодержащих цитостатических препаратов // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. - 2004. -Т. 134, №4. - С. 374-378. (соавт. Т.Г. Боровская, В.Е. Гольдберг, Т.И. Фомина, СИ. Ксенева, М.Е. Полуэк-това).

13. Реакции системы красной крови (эритрона) в отдааенные сроки после воздействия карбоплатина у беременных крыс // Экспериментальная и клин. Фармакология. -2004. - Т.67, №2. - С. 38-40. (соавт. Г.В. Карпова, Т.Г. Боровская, Е.А. Тимина).

1И22И

Подписано в печать 26.05.04. Формат 60x90/16. Гарнитура Times. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1 ,5. Тираж 100 экз. Заказ № 16.

А

"^ЕМ" Отпечатано в типографии ООО «Аграф-Пресс». ^ 634061, г. Томск, пр.Фрунзе, 59а, тел.249423.

Актуальность проблемы: Среди существующих методов лечения онкологических больных в последние годы большое внимание уделяется цитостатической химиотерапии. Успехи противоопухолевой химиотерапии сегодня очевидны. Так, в настоящее время можно выделить группы злокачественных новообразований, при лекарственном лечении которых можно добиться длительных полных ремиссий [McVie J. Gordon, 1999; Переводчикова Н.И., 2000]. Однако возможности химиотерапии опухолей ограничиваются высокой токсичностью противоопухолевых препаратов [Гершанович М.А., Филов В.А., Акимов М.А., 1999; Свинцицкий B.C., Увтушенко Г.В., 2001; Shi Zhou-yin, 2001; Charalabopoulos К., Karkabounas S.,Ioachim E. Et all, 2002]. Большую чувствительность к их токсическому действию проявляют нормальные (не поврежденные опухолью) активно обновляющиеся клеточные системы организма, к которым, наряду с другими, относятся и ткани репродуктивных органов [Франкфурт О.С., 1976; Feneux Danielle, 2001]. В настоящее время нет исчерпывающей информации о механизмах гонадотоксических эффектов противоопухолевых препаратов, сравнительно недавно вошедших в онкологическую практику, в частности, комплексных соединений платины [Урманцева А.Ф., Кутушева Г.Ф., 2002]. Между тем, платиносодержащие цитостатические препараты являются базисными во многих программах комбинированной химиотерапии [Бухман В.М., 2001]. В клинике широкое применение получили препараты платины первого и второго поколения - платидиам и карбоплатин. Они заменяют друг друга при лечении многих, хотя и не всех видов опухолей. Кроме того, они отличаются друг от друга по лимитирующей токсичности. Так, платидиам обладает большей нефро- и меньшей гематологической токсичностью. Использование в клинической практике как того, так и другого препарата дает обнадеживающие результаты при лечении опухолей целого ряда локализаций [Бухман В.М., 2001]. В связи с этим возникает актуальная задача сохранения качества жизни пациентов, особенно, учитывая их молодой возраст [Bacon С.G., Glass Т.А., Kawachi I et all, 1999; Feneux Danielle, 2001; Thiebeaugeorges Olivier, Fernandez Herve, 2001]. Следует отметить, что 75% из них считает репродуктивную функцию важным фактором их жизни [Siston Amy К., List Marsy A., Schieser Robert et all, 1997; Brinkworth Martin H., Nieschlag Eberhard, 2000]. Актуальность изучения проблемы бесплодия, как одного из последствий действия антибластомных средств, и, в частности, препаратов группы платины, обусловлена также совершенствованием методов диагностики злокачественных новообразований, позволяющих проводить максимально щадящее хирургическое лечение органов репродуктивной системы, на фоне которого адьювантная химиотерапия комплексными соединениями платины позволяет добиться длительных полных ремиссий [Новикова Е.Г., Свиридова И.С., Антошечкина М.А., Ронина Е.А., 1996; Возный Э.К., Гуров С.Н., Добровольская Н.Ю., 2001]. Клинические наблюдения свидетельствуют о выраженных нарушениях функционального состояния как мужской, так и женской репродуктивной систем пациентов, перенесших полихимиотерапию на основе платиносодержащих антибластомных средств [Hansen S.W., Berhelsen J.C. et all, 1990]. В то же время, в ряде случаев наблюдается быстрое ее восстановление [Gundy S., Babosa M., Baki M., Bodrogi J., 1992]. Результаты экспериментальных работ, проводимых в этом плане, также носят противоречивый характер [Kopf- Maer P., 1992; Malarvizhi D., Mathur P. P., 1996; Смирнова M.E., 1997]. Кроме того, нерешенным является вопрос о том, препараты платины какого поколения являются в этом плане более токсичными [Bacon C.G., Glass T.A., Kawachi I et all, 1999; Feneux Danielle, 2001]. Судя no данным литературы, открытым остается также вопрос о реализации гонадотоксических эффектов препаратов платины второго поколения в постнатальном развитии потомства. Между тем, они обладают способностью вызывать цитогенетические нарушения в половых клетках [Katoh M., Cain К.,

Hughes L. Et all, 1990], в связи с этим нельзя исключить возможность появления неполноценного потомства на фоне их использования.

В последние годы ведется интенсивный поиск путей коррекции гонадотоксических эффектов цитостатической химиотерапии [Растригин Н. А., Пивник A.B., 1997; Шилин Д.Е., Игнашина Е.В., 1999]. В клинике с этой целью уже используются овариопротекторы [Шилин Д.Е., Игнашина Е.В., 1999; Урманцева А.Ф., Кутушева Г.Ф., 2002]. Однако, они обладают рядом побочных эффектов и имеют много противопоказаний. В связи с этим, является актуальным поиск средств, снижающих повреждающее действие цитостатических препаратов на репродуктивную функцию.

Цель исследования: Изучить в эксперименте морфологическое и функциональное состояние репродуктивной системы в ранние и отдаленные сроки после введения платиносодержащих цитостатических препаратов.

Задачи исследования: L Изучить характер, глубину и продолжительность морфологических и функциональных изменений репродуктивной системы крыс (самцов и самок) в ранние и в отдаленные сроки после введения платиносодержащего препарата - карбоплатина.

2. Провести сравнительный количественный анализ повреждающего действия на процессы созревания половых клеток препарата платины I поколения платидиама и препарата платины II поколения карбоплатина

3. Провести анализ состояния потомства, один из родителей которого перенес воздействие карбоплатином за 1, 3 и 6 мес до спаривания.

4. Изучить возможность фармакологической коррекции нарушений репродуктивной системы, вызванных карбоплатином, с помощью модификаторов биологических реакций противоопухолевых препаратов.

Научная новизна и практическая значимость работы: В работе впервые с помощью современных методов исследования дана характеристика повреждающего действия платиносодержащего цитостатического препарата -карбоплатина на органы репродуктивной системы крыс (самцов, самок) и на их потомство. Принципиальную новизну представляют данные, касающиеся характера, глубины, динамики и механизмов нарушений репродуктивной системы при введении карбоплатина, а также результаты сравнительной характеристики структурных повреждений платиноидов I и II поколения (платидиама и карбоплатина). Оригинальные данные получены при изучении состояния потомства, что может прогнозировать вероятность появления здорового ребенка у родителей, один из которых получал карбоплатин. В работе впервые показана возможность фармакологической коррекции нарушений репродуктивной функции, вызванных платиносодержащими цитостатическими препаратами, с помощью модификаторов биологических реакций.

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались и обсуждались на конференциях «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2001, 2002, 2004), «Функциональные и прикладные аспекты базисной и клинической фармакологии» (Омск, 2002). Материалы работы были представлены на II Всесоюзном съезде научного общества фармакологов (Москва, 2003), сессии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск, 2003).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Объем и структура работы: Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 32 таблицами. Библиографический указатель включает 178 литературных источников, из них 97 отечественных и 81 иностранных.

117 ВЫВОДЫ:

1. В ранние сроки после однократного введения платиносодержащего цитостатического препарата карбоплатина в МПД (60 мг/кг) крысам в половых железах отмечаются деструктивные и дистрофические изменения, угнетение процессов созревания половых клеток. У крыс-самцов снижается способность к спариванию и к зачатию. У крыс-самок наблюдается увеличение астрального цикла за счет удлинения стадий метиэструс и диэструс, носящее обратимый характер. При скрещивании крыс-самок, получавших карбоплатин с интактными самцами наблюдается увеличение эмбриональной гибели.

2. В отдаленные сроки после однократного введения в МПД карбоплатина крысам в мужских половых железах наблюдается усиленная элиминация эпителиоцитов; в женских половых железах — снижение количества генеративных элементов. Способность к спариванию и к зачатию при этом не нарушены. При скрещивании крыс-самок, в отдаленные сроки после введения карбоплатина (3, 6 мес), с интактными самцами отмечается увеличение эмбриональной гибели.

3. Повреждающее действие на процессы созревания мужских половых клеток выражены в большей степени при введении карбоплатина, чем платидиама.

4. Структурно - функциональные элементы яичников проявляют различную чувствительность к токсическому действию карбоплатина и платидиама. Более выраженное истощение резервных возможностей яичников наблюдается на фоне введения платидиама, чем карбоплатина.

5. Потомство животных (самцов и самок) экспериментальных групп характеризуется сниженной жизнеспособностью: увеличением количества плодов с патологическими изменениями внутренних органов, торможением процессов оссификации. В постнатальном развитии наблюдается снижение индекса выживаемости, нарушение физического развития, понижение мышечного тонуса, замедление скорости формирования сенсорно-двигательных рефлексов, пониженная эмоциональная реакция, увеличение горизонтальной, вертикальной и двигательной активности. 6. Применение модификаторов биологических реакций (месна, ЭШБ) у крыс-самок на фоне воздействия карбоплатином снижает повреждающее действие цитостатика на воспроизводящую функцию.