Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Патогенетическое обоснование дифференцированной коррекции лейкопений при миелосупрессиях

леи

МИРОШНИЧЕНКО ЛАРИСА АРКАДЬЕВНА

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ КОРРЕКЦИИ ЛЕЙКОПЕНИЙ ПРИ МИЕЛОСУПРЕССИЯХ

14.03.03 - патологическая физиология

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 2 ЯНВ 2С12

Томск - 2011

005007185

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии Сибирского отделения РАМН

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ Дыгай Александр Михайлович

доктор медицинских наук,

профессор Жданов Вадим Вадимович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор, член-корреспондент РАМН Лишманов Юрий Борисович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт физиологии СО РАМН (г. Новосибирск)

Защита состоится "_"___2012 г. в_часов на заседании

диссертационного совега Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН

доктор медицинских наук доктор медицинских наук

Чернышёва Галина Анатольевна Воронкова Ольга Владимировна

Автореферат разослан

М-

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Как известно, токсическое действие противоопухолевых препаратов на гемопоэз является наиболее частым побочным эффектом, возникающим при лечении больных злокачественными новообразованиями. В большинстве случаев глубокая миелодепрессия проявляется в ранние сроки развитием в периферической крови лейкопении, затем тромбоцитопении и в последнюю очередь - анемии. Многочисленные исследования доказывают, что индуцированная химиотерапией нейтропения - распространённый фактор риска развития тяжелых инфекционных осложнений, которые являются частыми причинами смерти онкологических больных [Переводчикова Н.И., 2011; Сакаева Д.Д. и др., 2007; Di Maio М. et al., 2005; Lyman G.H. et a!., 2005; Luftner D., Possinger К., 2005; Sharma A., Lokeshwar N., 2005; Takata Т., Tamura K„ 2006]. Несмотря на современное лечение, продолжают погибать от 3 до 10% пациентов с фебрильной нейтропенией. Особенно следует учитывать, что в их число входят педиатрические пациенты с гематологическими злокачественными заболеваниями, а также потенциально излечимые больные [Groll А.Н., Ritter J., 2005; Kamps W.A. et al., 2005; Laws HJ. et al., 2005]. В период нейтропении источником инфекции становится эндогенная и экзогенная флора, резко возрастает роль внутрибольничной инфекции [Manterola А. et al., 2004; Sharma А., Lokeshwar N., 2005; Mays S.R. et al., 2006]. К факторам, усиливающим риск развития инфекции, относятся глубина и длительность нейтропении, иммуносупрессия, изменения микрофлоры.

В связи с этим, изыскание новых способов профилактики и лечения ней-тропений, возникающих при проведении противоопухолевой терапии злокачественных заболеваний, приобретает все большее значение.

Весьма перспективной в этом направлении является разработка патогенетически обоснованных методов коррекции патологии системы крови, основанных на принципе подражания естественным регуляторным системам организма [Гольдберг Е.Д. и др., 2008; Дыгай A.M., Жданов В.В., 2010]. Согласно современным представлениям о механизмах регуляции кроветворения, решающая роль в поддержании адекватного плацдарма гемопоэза принадлежит гемопо-эзиндуцирующиму микроокружению. При этом элементы микроокружения определяют пролиферативный и дифференцировочный статус кроветворных клеток-предшественников посредством продукции гуморальных регуляторов (ци-токинов) и межклеточных взаимодействий (в частности, комплекс гликозами-ногликанов и экстрацеллюлярных белков обеспечивает концентрацию гемопо-этических ростовых факторов и модуляцию их функции). Кроме того, пусковым звеном, определяющим адаптивный ответ кроветворной ткани, являются центральные нейроэндокринные механизмы, реализующие свое влияние посредством универсальных стресс-реализующих (вегетативной, гипофизадрена-ловой) и стресс-лимитирующих систем (гамкергической и др.) [Гольдберг Е.Д. и др., 1997,1999,2001,2007; Воробьев А.И., 2002].

Учитывая центральные и локальные механизмы регуляции кроветворения, представляется целесообразным подход к коррекции возникающих нару-

шений в системе крови, заключающийся в модуляции функций гемопоэзинду-цирующего микроокружения (ГИМ), центральных нейроэндокринных механизмов регуляции кроветворения и изменении уровней цитокинов путем введения их извне. С патогенетических позиций наиболее перспективными в этом направлении могут быть препараты на основе производных гликозаминоглика-нов (ГАГ), рекомбинантных форм цитокинов (колониестимулирующие факторы), а также препараты с ноотропным типом действия. Считается, что различные типы ГАГ тесно связаны с тем или иным ростком кроветворения. Кроме того, показано, что ГАГи являются составной частью клеточной мембраны, входят в состав гемопоэтинов, основного вещества соединительной ткани костного мозга и играют определенную роль в процессах пролиферации и диффе-ренцировки клеток гемопоэтической ткани [Науменко О.И., 1992; Юшков Б.Г., Попов Г.К. и др., 1994; Захаров Ю.М., 1998; Jelkmann W., 1994; Egrie J.C., 2003; Kishore V., 2011]. Все это свидетельствует о возможном использовании препаратов на основе ГАГ для компенсации повреждений в системе крови при экстремальных воздействиях. Многие отечественные и зарубежные авторы указывают на способность препаратов на основе рекомбинантных форм цитокинов, в частности Г-КСФ, целенаправленно стимулировать процессы пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников гранулоцитопоэза, что позволило предложить их использование в качестве одного из методов рациональной терапии нейтропений [Попова Н.О., 2005; Дыгай A.M., Жданов В.В., 2010; Bronchud М.Н. et al., 1988; Lord B.I. et al., 1989; Nicola N.A. et al., 1989; Williams M.E., Quesenberry P.J., 1992; Basu S. et al., 2002; Parvez T. et al., 2005; Roberts A.W., 2005]. Кроме того, данные о влиянии нейроэндокринной системы на кроветворение свидетельствуют о возможности применения в гематологической практике ноотропных препаратов, способных оптимизировать течение самых разнообразных физиологических процессов, в том числе процессов клеточной пролиферации и дифференцировки, через центральную нервную систему [Гольдберг Е.Д. и др., 1997, 2003, 2007].

Наблюдаемый в последнее время значительный рост частоты лейкопений различного генеза в клинической практике диктует необходимость разработки дифференцированных подходов к терапии нейтропений в зависимости от механизмов их развития, что обусловлено неодинаковыми повреждениями отдельных звеньев системы крови различными факторами. С другой стороны, предполагаемые и уже известные закономерности действия гемостимуляторов дают основания ожидать существенные различия в эффективности их применения в зависимости от патогенеза лейкопении. В то же время, многочисленные исследования показали, что удобными моделями для изучения механизмов развития миелосупрессивного синдрома и разработки методов стимуляции подавленного кроветворения являются цитостатические миелодепрессии.

Цель исследования. Изучить общие закономерности и особенности действия отдельных гемостимуляторов на гранулоцитарный росток кроветворения после введения различных по механизму действия цитостатических препаратов.

Разработать патогенетически обоснованные подходы к коррекции лейкопений при цитостатических миелосупрессиях.

Задачи исследования:

1. Изучить механизмы восстановления гранулоцитопоэза, подавленного циклофосфаном либо 5-фторурацилом.

2. Оценить эффективность стимуляции процессов восстановления гранулоцитопоэза с помощью пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного коло-ниестимулирующего фактора и О-глюкуроновой кислоты при миелосупрессиях, вызванных различными цитостатиками.

3. Исследовать механизмы реализации стимулирующего действия пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и О-глюкуроновой кислоты в отношении гранулоцитопоэза, регенерирующего после введения циклофосфана либо 5-фторурацила.

4. Патогенетически обосновать дифференцированное применение гемо-стимуляторов в зависимости от механизмов, лежащих в основе изменений, развивающихся в кроветворной ткани при применении различных цитостатических препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основной причиной различных темпов и характера восстановления подавленного цитостатическими агентами гранулоцитарного ростка кроветворения при введении пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и Б-глюкуроновой кислоты является неодинаковая чувствительность кроветворных элементов грануломоноцитопоэза и ге-мопоэзиндуцирующего микроокружения к действию цитостатиков и гемости-муляторов.

2. Более выраженный стимулирующий эффект изучаемых препаратов в отношении кроветворения, подавленного алкилирующим агентом, связан с менее токсичным действием циклофосфана на клеточные элементы кроветворного микроокружения по сравнению с антиметаболитом 5-фторурацилом.

3. В основе активирующего действия пантогематогена и глицирама на костномозговой гранулоцитопоэз в условиях цитостатических миелосупрессий лежит стимуляция продукции гуморальных регуляторов кроветворения клетками ГИМ и нормализация структурно-функциональной организации костного мозга. Вместе с тем, ускорение процессов регенерации кроветворной ткани под действием Г-КСФ и Б-глюкуроновой кислоты при назначении антибластомных препаратов связано с непосредственным влиянием на функциональную активность пула коммитированных прекурсоров.

4. В условиях введения алкилирующего агента наиболее предпочтительными корректорами нарушений, возникающих со стороны гранулоцитарного

ростка, являются Г-КСФ и Б-глюкуроновая кислота, в случае назначения фтор-пиримидинового антиметаболита значительная стимуляция подавленного гра-нулоцитопоэза наблюдается под влиянием пантогематогена и глицирама.

Научная новизна. В работе впервые расшифрован ряд тонких, специфичных для каждого из гемостимуляторов (пантогематоген, глицирам, Г-КСФ и Б-глюкуроновая кислота) механизмов активации гранулоцитарного ростка кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. При этом прослежен различный уровень изменений показателей, характеризующих механизмы регуляции гранулоцитопоэза, в ответ на введение исследуемых препаратов на фоне различных по механизму действия цитостатиков (циклофосфан, 5-фторурацил).

Гемостимулирующий эффект пантогематогена обусловлен возрастанием функциональной активности стромальных элементов ГИМ и накоплением в кроветворной ткани прекурсоров грануломоноцитопоэза. В основе активации регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения глицирамом лежит ускорение процессов дифференцировки (в условиях введения циклофосфана) либо пролиферации (на фоне 5-фторурацила) прекурсоров грануломоноцитопоэза вследствие повышения уровня гуморальных регуляторов кроветворения (КСА от адгезирующих миелокариоцитов).

Гемостимулирующая активность Г-КСФ и Б-глюкуроновой кислоты связана с непосредственным их эффектом в отношении кроветворных клеток-предшественников, а именно, повышением их функциональной активности. Г-КСФ ускорял выход гранулоцитомакрофагапьных прекурсоров в дифференци-ровку либо увеличивал их пролиферативную активность, в том числе, благодаря повышению секреторной активности неприлипающих миелокариоцитов. Б-глюкуроновая кислота в условиях введения циклофосфана ускоряла дифферен-цировку гранулоцитомакрофагапьных клеток-предшественников за счет быстрой нормализации структурно-функциональной организации костного мозга. При миелосупрессии, вызванной 5-фторурацилом, О-глюкуроновая кислота способствовала активации деления прекурсоров грануломоноцитопоэза, что связано с увеличением концентрации гуморальных регуляторов гемопоэза в сыворотке крови.

Впервые дана интегральная оценка гемостимулирующему эффекту исследуемых препаратов (пантогематоген, глицирам, Г-КСФ и О-глюкуроновая кислота) в отношении гранулоцитопоэза, подавленного циклофосфаном либо 5-фторурацилом, с определением корреляционных взаимосвязей параметров.

Патогенетически обоснована эффективность применения Г-КСФ и Б-глюкурбновой кислоты при моделировании цитостатической болезни апкили-рующим агентом, пантогематогена и глицирама - в условиях введения фторпи-римидинового антиметаболита.

В работе впервые в сравнительном аспекте изучен гемостимулирующий эффект пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирую-щего фактора и Б-глюкуроновой кислоты при миелосупрессиях, вызванных различными цитостатическими препаратами. Установлено, что выраженность эффектов гемостимуляторов на модели цитостатической миелосупрессии, вы-

званной фторпиримидиновым антиметаболитом, в значительной степени уступает таковой при назначении циклофосфана, что связано с более глубокими деструктивными изменениями клеточных элементов гемопоэзиндуцирующего микроокружения, вызванными антиметаболитом.

Практическое значенне работы. Исследования, выполненные на моделях цитостатических миелосупрессий, обусловленных введением различных по механизмам действия препаратов, позволили разработать патогенетически обоснованные методы коррекции лейкопений, вызванных противоопухолевыми агентами. Детальное изучение механизмов регуляции кроветворения и действия на гемопоэз биологически активных веществ различной природы позволило предложить методологию применения гемостимуляторов для лечения лейкопений различного генеза.

Изданы «Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (МЗ РФ, Москва, 2002).

В настоящее время разрешены к клиническому применению и производству Министерством Здравоохранения Российской Федерации пантогематоген сухой (ОАО «Синтез», Курган), нейтростим (ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск), глицирам (ООО ФК «Здоровье», Харьков).

Получены патенты: РФ № 2088249 от 27.08.1997 г. на изобретение "Гемо-стимулятор", РФ № 2182007 от 10.06.2002 г. на "Средство, стимулирующее грануломоноцитопоэз при гипопластических состояниях кроветворения", РФ № 2270022 от 20.02.2006 г. на "Способ получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью", Рф № 2332667 от 27.08.2008 г. на "Способ оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ", РФ № 2399664 от 20.09.2010 г. на "Способ определения продукции факторов хоминга стволовых клеток". Получена приоритетная справка по заявке № 2010141630 от 04.07.2011 г. "Способ стимуляции in vitro полипотент-ных гемопоэтических стволовых клеток".

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VII, VIII, X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2000, 2001, 2003), на 1-м Международном симпозиуме по изучению и технологии производства продуктов пантового мараловодства (Канада, 2000), на 8-м минисимпозиуме по передовым научно-техническим технологиям (Япония, 2000), на конференциях молодых ученых СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск, 2000), на П-й объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (Новосибирск, 2002), на 2-м Съезде Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003), на 3-й международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2003), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002, 2005), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2005, 2006), на конференции «Актуальные проблемы фармакологии», посвященной 20-летию ГУ НИИФ ТНЦ

СО РАМН (Томск, 2004), на III Съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006), на Российской конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), на Российской конференции с международным участием «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы» (Екатеринбург, 2010), на Всероссийской конференции «Фармакологическая регуляция стволовых клеток» (Томск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 43 печатные работы, из них 23 — в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 353 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 79 таблицами (таблицы 56-79 размещены в приложении). Библиографический указатель включает 678 источников, из них 293 отечественных и 385 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 1340 мышах-самцах линии CBA/CaLac в возрасте 2-2,5 месяцев массой 18-20 г. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Циклофосфан (ЦФ) ("Биохимик", Саранск), 5-фторурацил (5-ФУ) (Украина, химфармобъединение «Дарница») вводили внутрибрюшинно однократно в максимально переносимой дозе (МПД), составившей по результатам про-бит-анализа соответственно 250 мг/кг и 228 мг/кг. Начиная со следующего дня после введения цитостатика мыши опытных групп получали официнальные лекарственные препараты: пантогематоген сухой (ГТГ) (ОАО «Синтез», Курган) per os семикратно по 50 мг/кг 1 раз в сут ежедневно; глицирам (ООО ФК «Здоровье», Харьков) per os пятикратно по 50 мг/кг 1 раз в сут ежедневно; препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) (ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск) подкожно в дозе 125 мкг/кг ежедневно в течение 5-ти дней; препарат D-глюкуроновой кислоты, (ГНЦЛС, Харьков) внутривенно трехкратно в дозе 50 мг/кг на 3,4 и 5-е сут после введения цитостатика.

Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора. Фоновые показатели получали при обследовании интактных животных. Мышей умерщвляли наЗ,4,5,6,8,10,12,14-еи 16-есут после введения цитостатика путем ингаляции со2.

Показатели периферической крови и костномозгового кроветворения определяли общепринятыми гематологическими методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Содержание коммитированных клеток-предшественников грануломоно-цитопоэза (КОЕ-ГМ, КлОЕ-ГМ) и эритропоэза (КОЕ-Э, КлОЕ-Э) в костном мозге изучали in vitro методом клонирования миелокариоцитов в полувязкой культуральной среде. Интенсивность созревания гранулоцито-макрофагальных и эритроидных прекурсоров определяли по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в той же лунке).

Исследование пролиферативной активности предшественников грануломоно-цито- и эритропоэза производили с помощью метода "клеточного самоубийства" путем поглощения гидроксимочевины в культуре ткани. Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативного выделения гемопоэтических островков (ГО) и последующей оценки их количественного и качественного состава. Колониестимулирующую (КСА) и эритропоэтическую (ЭПА) активности тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах. КСА и ЭПА выражали количеством выросших грануло-цито-макрофагальных и эритроидных колоний (на 105 интактных миелокарио-цитов) [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Изучение прямого действия препаратов на эффективность клонирования т vii.ro КОЕ-ГМ и КОЕ-Э из костного мозга интактных мышей осуществляли в метнлцеллюлозной среде. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический Меритерий Стыодента [Урбах В.Ю., 1975]. При больших отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараматрический кртерий Уилкоксона-Манна-Уитни [Урбах В.Ю, 1975]. Для оценки степени связи между признаками использовался двумерный корреляционный анализ [Лакин Г.Ф., 1990; Мендрина Г.И. и др., 2004]. Оценка влияния препаратов на показатели гранулоцитопоэза проводилась с помощью интегральных показателей [Новицкий В.В. и др., 1990].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что однократное введение ЦФ мышам линии СВА/СаЬас в МПД приводит к развитию гипоплазии костномозгового кроветворения. При этом имело место подавление практически всех ростков гемопоэза. Депрессия костномозгового кроветворения сопровождалась соответствующими изменениями в динамике содержания зрелых элементов изучаемых ростков в периферической крови.

Изучение механизмов постцитостатической регенерации гранулоцитопоэза показало, что восстановление миелопоэза после введения алкилирующего агента на ранних этапах обусловлено активацией созревания гемопоэтических предшественников в более зрелые элементы. При этом компенсаторные процессы в костномозговой ткани связаны с возрастанием секреторной активности прилипающих миелокариоцитов с 3-х по 12-е сут эксперимента. На это указывают вновь возникшие корреляты между динамикой накопления предшественников грануломоноцитопоэза и продукцией КСА клетками прилипающей фракции костномозговых нуклеаров (г=0,807) (рис. 1).

У мышей, получавших 5-ФУ, была обнаружена более глубокая и продолжительная ингибиция костномозгового кроветворения, чем в случае назначения ЦФ. Активация процессов регенерации гранулоцитарного ростка при моделировании гемодепрессии 5-ФУ наступает значительно позже (с 14-х сут), чем при введении ЦФ (с 5-х сут). При изучении механизмов повреждающего действия антиметаболита на кроветворную ткань было выявлено, что поздняя акти-

вация гранулоцитарного ростка при моделировании миелосупрессии 5-ФУ связана с нарушением нормального течения процессов созревания прекурсоров в ранние сроки (с 3-х по 6-е сут) и снижением продукции колониестимулирую-щей активности адгезирующими элементами микроокружения практически на протяжении всего периода наблюдения.

В настоящее время считается доказанным существование единой системы регуляции жизнедеятельности кроветворной ткани, включающей взаимосвязанные локальные (микроокружение) и дистантные (нейроэндокринные) контролирующие механизмы, направленные на обеспечение необходимого числа специализированных клеток крови как в физиологических условиях, так и в ответ на действие чрезвычайных раздражителей [Гольдберг Е.Д. и др., 1996, 1997]. Как известно, стрессреализующие гормоны, выделяющиеся в кровь при цитостатическом воздействии, осуществляют как прямое, так и опосредованное через элементы кроветворного микроокружения влияние на гемопоэтические клетки [Балицкий К.П., Шмалько Ю.П., 1987; Дыгай A.M., Клименко H.A., 1992; Гольдберг Е.Д. и др., 1999].

Чтобы исключить участие дальноранговых механизмов регуляции системы крови в процессах постцитостатической репарации, было проведено исследование прямого влияния цитостатиков на функциональную активность клеток различных фракций костного мозга in vitro. При этом удалось установить, что добавление непосредственно в культуру клеток костного мозга ЦФ стимулировало способность адгезирующих миелокариоцитов поддерживать рост ге-мопоэтических колоний in vitro. В то же время, обработка прилипающих костномозговых элементов 5-ФУ существенно угнетала фидерную активность указанных клеток в отношении интактных гранулоцитарно-макрофагальных и эритроидных прекурсоров. Преинкубация неприлипающих клеток костного мозга с цитостатическими препаратами не поддерживала рост КОЕ-Э и не влияла на выход гранулоцитарно-макрофагальных колоний из интактных миелокариоцитов при их совместном культивировании.

Результаты опытов, проведенных с цитостатиками in vitro, убедительно подтверждают полученные в других экспериментах данные о токсическом влиянии антиметаболита на функциональную активность фибробластов, моноцитов и макрофагов, и значительно менее выраженном в указанном отношении эффекте алкилирующего агента. Причины таких различий заключаются, по-видимому, в особенностях физиологии указанных клеток (высокая секреторная активность и низкий темп пролиферации) в совокупности с механизмом действия конкретного препарата [Гольдберг Е.Д. и др., 1999].

Подводя итог изложенному, можно заключить, что характер течения восстановительных процессов в кроветворной ткани после цитостатического воздействия определяется не только непосредственным влиянием противоопухолевых препаратов на гемопоэтические клетки, но и их действием на элементы кроветворного микроокружения. Причем течение процессов регенерации в костном мозге во многом определяется структурно-функциональным состоянием ГИМ: его организацией и секреторной активностью. Следовательно, различия в динамике восстановления кроветворения после применения 5-ФУ и ЦФ во мно-

гом обусловлены именно неодинаковым влиянием данных цитостатиков на функцию элементов ГИМ.

Дальнейшим шагом в нашем исследовании явилось проведение экспериментов, направленных на сравнительное изучение гранулоцитопоэзстимули-рующей активности препарата животного происхождения (пантогематоген), препаратов на основе производных глнкозаминогликанов (глицирам, Б-глюкуроновая кислота) и препарата рекомбинантного цитокина (Г-КСФ).

Выполненные эксперименты позволили установить, что активация процессов регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения под действием ПГ, глицирама, Г-КСФ либо В-глюкуроновой кислоты в условиях гипоплазии костного мозга, вызванной введением ЦФ либо 5-ФУ, имеет различный характер.

Изучение эффектов оригинального препарата животного происхождения - ПГ на модели миелосупрессии, вызванной введением ЦФ, показало, что увеличение числа морфологически идентифицируемых форм нейтрофильных гра-нулоцитов в костном мозге мышей опытной группы по сравнению с контролем наблюдалось только на 6-10-е сут эксперимента. Описанным изменениям в целом соответствовала и динамика содержания зрелых клеток в периферической крови животных. Максимальная разница по количеству сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов, моноцитов и циркулирующих лимфоцитов между группами была зафиксирована на 10-е сут. Число сегментоядерных нейтрофи-лов и моноцитов в периферической крови опытных животных было повышенным и на 6-е, 12-е сут эксперимента соответственно. При этом возрастанию клеточности гранулоцитарного ростка гемопоэза у мышей, получавших ПГ, предшествовало значительное увеличение числа прекурсоров грануломоноци-топоэза на 5-е сут опыта. В дальнейшем, на 10-е сут наблюдения содержание предшественников грануломоноцитопоэза в костном мозге мышей после применения гемостимулятора также превосходило описанное в контрольной группе. Как оказалось, указанные изменения были связаны с ускорением деления КОЕ-ГМ с 6-х сут по 12-е сут опыта. Стимуляция процессов дифференцировки отмечалась лишь на 10-е сут опыта.

Применение ПГ также приводило к быстрой репарации структурно-функциональной организации костного мозга. Увеличение числа клеточных ассоциаций, содержащих в своем составе стромальную клетку, и островков гранулоцитарного типа по сравнению с контрольной группой имело место, начиная с 6-х сут опыта и вплоть до окончания наблюдения. Наряду с этим, препарат усиливал секрецию КСА клетками прилипающей фракции микроокружения на 10-е и 12-е сут и повышал КСА сыворотки крови с 8-х по 12-е сут опыта. При этом ПГ не оказывал влияния на неприлипающие клетки ГИМ. Увеличение интегрального показателя (в 2 раза) для отделов морфологически распознаваемых клеток, а также для гемопоэтических прекурсоров в группе мышей, леченных ПГ, подтверждает влияние исследуемого препарата на динамику вышеперечисленных показателей (табл. 1). В структуре корреляционных связей прослеживалась организация дополнительных причинно-следственных связей между формированием гранулоцитарных ГО и количеством незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге после сочетанного введения ЦФ и ПГ

(рис. 1).

Таким образом, можно констатировать, что в основе активирующего влияния пантогематогена на кроветворение лежит возрастание функциональной активности стромальных элементов ГИМ и стимуляция процессов пролиферации клеток - предшественников гемопоэза. Об этом свидетельствует значительное возрастание интегрального показателя (ИП) для гемопоэтинов, продуцируемых прилипающими миелокариоцитами, а также для КОЕ-ГМ в S-фазе ми-тотического цикла (табл. 1). Кроме того после использования ПГ на фоне ЦФ наблюдалось появление прямой корреляции между уровнем КСА от адгези-рующих миелокариоцитов и процессами пролиферации прекурсоров грануло-моноцитопоэза (г=0,809). В пользу значения дистантных механизмов в реализации регуляторных влияний пантогематогена на гранулоцитопоэз свидетельствует высокая степень взаимосвязи «сегментоядерные нейтрофилы - КСА сыворотки», а локальных - «зрелые нейтрофильные гранулоциты - КСА от неадге-зирующих миелокариоцитов» (рис. 1).

Следует отметить, что в основе активации данным препаратом гемопоэза может лежать и модуляция функции центральных нейроэндокринных механизмов регуляции кроветворения [Гольдберг Е.Д. и др., 1997; Грибов A.C., 2000; Суслов Н.И., 2004].

Проведенные эксперименты позволили установить, что препарат из солодки голой (глицирам) оказывает стимулирующее влияние на процессы восстановления костномозгового кроветворения, подавленного ЦФ, за счет повышения количества незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов, а также лимфоидных клеток с развитием гиперплазии костного мозга на 8-10-е сут опыта. В то же время, глицирам вызывал развитие преходящей лейкопении (до 8-х сут) за счет уменьшения числа палочкоядерных форм лейкоцитов (6-е и 12-е сут) и циркулирующих лимфоцитов (6-8-е сут). С другой стороны, введение исследуемого препарата приводило к увеличению числа моноцитарно-макрофагальных элементов в периферической крови мышей по сравнению с таковым в контроле (6-8-е сут). Результатом описанных изменений явилось незначительное падение интегрального показателя для общего количества лейкоцитов, лимфоцитов на фоне его возрастания (незрелые и зрелые нейтрофильные гранулоциты, моноциты периферической крови) по сравнению с одним цито-статиком (табл. 1). В структуре корреляционных связей следует отметить отсутствие координации в отделе морфологически распознаваемых клеток по сравнению с циклофосфаном (рис. 1).

Изучение механизмов репарации кроветворной ткани под действием гли-цирама выявило постепенное накопление коммитированных клеток-предшественников после периода непродолжительной депрессии их числа. Так, на 10-е сут количество КОЕ-ГМ в 2,3 раза превышало таковое у мышей, получавших только цитостатик. При этом исследование пролиферативной активности гемопоэтических прекурсоров позволило обнаружить снижение доли предшественников в S-фазе митотического цикла практически на протяжении всего эксперимента по сравнению с контрольной группой. В то же время, имело место достоверное увеличение интенсивности созревания КОЕ-ГМ на 4-е и 10-е

сут наблюдения при параллельном повышении содержания макрофагнегатив-ных и гранулоцитарных ГО в костном мозге (4,5,8-е и 12-е сут). При этом после сочетанного применения глицирама и цитостатика в наибольшей степени возрастает ИП для клеточных ассоциаций, содержащих стромальную клетку, и коэффициента дифференцировки в 7 и 5 раз соответственно по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Указанные изменения связаны с возрастанием продукции КСА адгезирующими клетками ГИМ в ранние сроки наблюдения (4-е сут) и неадгезирующими - на 6 сут, о чем свидетельствует увеличение числа корреляционных взаимоотношений в отделах гемопоэтинов и гемопоэтических

прекурсоров (рис. 1).

Полученные в сериях экспериментов данные, свидетельствующие ob активации процессов костномозгового кроветворения и одновременно с этим -задержке выхода зрелых клеточных форм в периферическую кровь, согласуются с представлениями некоторых исследователей [Ястребов А.П. и др., 1988; Юшков Б.Г., 1994; Long W.F., Williamson F.B., 1983] о способности ГАГ стимулировать митозы ранних предшественников гемопоэза и тормозить дифферен-

цировку более поздних.

Анализ динамики постцитостатических репарационных процессов на фоне действия глицирама позволяет предположить, что гемостимулирующий эффект препарата реализуется на уровне элементов кроветворного микроокружения, и в частности, клеток адгезирующей фракции костного мозга, что влечет за собой активацию процессов дифференцировки клеток-предшественников.

Пятикратное введение Г-КСФ после цитостатика ускоряло на сутки восстановление общего количества циркулирующих лейкоцитов. При этом содержание в крови сегментоядерных нейтрофилов превысило контрольный уровень более чем в 10 раз. Наиболее выраженное увеличение (в 4 раза) общего числа клеток белой крови у мышей, леченных препаратом Г-КСФ, наблюдалось на 5-е сут. Стимулирующий эффект гемопоэтина в отношении указанного показателя регистрировался до 8-х сут исследования включительно. Анализ содержания отдельных морфологических форм лейкоцитов показал, что отмеченные изменения обусловлены увеличением числа палочкоядерных, сегментоядерных ней-трофильных гранулоцитов (5-8-е сут) и моноцитов (4-6-е сут).

Общая клеточность костного мозга мышей достоверно изменялась под действием препарата Г-КСФ только на 5-е сут исследования. В то же время, при анализе миелограмм было зарегистрировано существенное увеличение содержания в костном мозге как незрелых (на 5,6-е сут), так и зрелых нейтрофилов (с 4-х по 8-е сут исследования) (ИП=256,32% и 115,88% соответственно) (табл. 1). При этом количество последних восстанавливалось под влиянием Г-КСФ до фонового уровня на 2 сут раньше, чем в контроле (один цитостатик). Препарат гемопоэтина не оказывал стимулирующего действия на клеточность других ростков кроветворения. Напротив, наблюдалось кратковременное снижение числа костномозговых лимфоцитов, моноцитов и эритрокариоцитов, что однако не отражалось отрицательно на качественном составе периферической крови. Так, ИП для моноцитов в периферической крови составил 281,04% при 87 64% в контрольной группе, а для ОКЛ -115,56% при 69,98% в группе с од-

ним цитостатиком (табл. 1). Обнаруженные изменения содержания в крови клеток других ростков носят, по всей видимости, перераспределительный характер. При этом, если повышение числа циркулирующих моноцитов и лимфоцитов обусловлено ускоренным выходом из костного мозга, где их количество снижается, то в основе уменьшения клеточности эритроидной ткани лежат, вероятно, реципрокные взаимоотношения между гранулоцитарным и эритроид-ным ростками гемопоэза. Они заключаются в том, что резкое увеличение потребления ранних гемопоэтических прекурсоров вследствие их массового выхода в гранулоцитарную дифференцировку приводит к временному дефициту клеток, способных развиваться в направлении красного ростка кроветворения [de Haan G. Et al., 1992]. Кроме того, существуют данные о непосредственной способности Г-КСФ направлять развитие примитивных гемопоэтических предшественников в сторону миелоидного ростка кроветворения [Richards М.К. et al., 2003].

Проведенные исследования позволили установить, что введение препарата Г-КСФ препятствовало возрастанию содержания в костном мозге гранулоци-тарных прекурсоров, закономерно развивавшемуся после введения ЦФ. Анализ соотношения гранулоцитарно-макрофагальных кластеров и колоний позволил выявить достоверное увеличение индекса созревания КОЕ-ГМ на 5,6-е и 10-е сут после применения Г-КСФ. Более того, он вызывал повышение содержания в костном мозге мышей данной группы КОЕ-ГМ, находящихся в S-фазе митоти-ческого цикла, на 4-е и 6-е сут.

Результаты наших экспериментов свидетельствуют о том, что повышение пролиферативной активности КОЕ-ГМ играет важную роль в реализации фармакологического эффекта гемопоэтина в условиях цитостатической миелосу-прессии. Однако ускорение созревания клоногенных элементов под действием Г-КСФ является важнейшим механизмом реализации его гемостимулирующего действия в условиях отсутствия активации клеточной пролиферации (5-е сут опыта) и препятствует накоплению в костном мозге гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров. В пользу этого свидетельствовала и опережающая стимуляция формирования ГО, в особенности, макрофагнегативных (ИП=502,47), и, как следствие, резкое возрастание в костном мозге числа ГО гранулоцитарного типа (ИП= 142,09), в которых происходит созревание грану-лоцитарно-макрофагальных прекурсоров от коммитированных до зрелых форм [Дыгай A.M., Шахов В.П., 1989; Гольдберг Е.Д. и др., 1999] (табл. 1). Кроме того, появляющаяся положительная корреляционная цепочка «ГО - интенсивность дифференцировки (ИД) КОЕ-ГМ - отдел морфологически распознаваемых клеток», подтверждает предполагаемый механизм гемостимулирующего действия гемопоэтина (рис. 1). С другой стороны, Г-КСФ, как известно, вызывает мобилизацию КОЕ-ГМ в периферическую кровь, поскольку способность стимулировать выход стволовых клеток различных типов в циркуляцию является характерным его свойством [Hoglund М. et al., 1997].

Таблица 1. Величины интегрального показателя (% от исходного уровня), характеризующие влияние пантогематогена, Г-КСФ, глицирама и Б-глюкуроновой кислоты на систему крови мышей линии СВА/СаЬас после вве-

дения циклос. юсфана в МПД

Показатели Циклофосфан Папто-гематогеп Глицирам Г-КСФ Ц-глюкуро-новая кислота

Морфологически распознаваемые клетки перис )ерической крови

ОКЛ 80,64 ' 133,89 60,89 115,56 126,13

СНГ 133,75 197,45 142,69 202,86 198,55

Лимфоциты 54,00 68,02 39,25 60,54 73,83

Моноциты 101,80 233,22 136,94 281,04 369,27

Морфологически распознаваемые клетки костного мозга

ОКК 70,36 89,13 77,37 77,24 87,62

ННГ 202.46 254,85 216,60 256,32 539,43

ЗНГ 92,00 112,69 106,44 115,88 113,11

Лимфоциты 29,70 32,96 35,61 27,51 31,05

Моноциты 51,39 49,20 35,16 32,18 34,95

Пул кроветворных клеток-предшественников

КОЕ-ГМ 120,79 196,51 146,31 154,57 89,95

Б-КОЕ-ГМ 82,98 125,88 70,55 105,51 102,89

ИД-КОЕ-ГМ 93,33 91,90 145,51 135,20 167,50

Струкгурно-( ункциональная организация костного мозга

ГО 71,93 50,00 289,45 313,52 309,38

М(-)ГО 87,34 51,89 577,02 502,47 617,85

Г-ГО 77,32 81.93 128,79 142,09 160,95

Уровень гемопоэтинов в биологических жидкостях

КСА ад 402,56 2462,29 356,40 387,08 322,82

КСА неад 34,10 29,22 47,44 45,53 40,47

КСА сыв 190,00 1162,46 124,67 513,00 291,23

Примечание: <100% - ингибирующее действие препарата; >100% - стимулирующее влияние препарата

Под действием Г-КСФ наблюдалось увеличение подавленной ЦФ продукции колониестимулирующей активности клетками неадгезирующей фракции костного мозга (5-е и 10-е сут). При этом применение гемопоэтина на фоне цитостатика практически не изменяло динамику секреции цитокинов, составляющих КСА, адгезирующими элементами кроветворного микроокружения. В то же время было выявлено достоверное повышение КСА сыворотки с 5-х по 10-е сут опыта. Результатом описанных изменений явилось значительное увеличение (в 2,5 раза) ИП для КСА сыворотки с одновременным снижением данного показателя для КСА, еекретируемой прилипающими миелокариоцитами (табл. 1). Таким образом, вскрытое участие секреторных продуктов клеток микроокружения в активации процессов кроветворения под действием Г-КСФ свидетельствует о наличии опосредованного пути реализации гемостимулирующей активности препарата.

Увеличение клеточности костного мозга в группе мышей, получавших О-глюкуроновую кислоту после ЦФ, наблюдалось на 4-е сут и 8-е сут опыта. В остальные сроки исследования данный показатель также был повышен, но без

статистически значимых различий. В то же время содержание незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в кроветворной ткани увеличивалось на 4,5-е и 8-е сут и 4,8-е и 10-е сут соответственно. При этом содержание моноцитов в костном мозге под действием D-глюкуроновой кислоты достоверно снижалось на 4-е и 5-е сут. Отражением состояния костномозгового гранулоцитопоэза явилось развитие лейкоцитоза в периферической крови на 4-8-е сут эксперимента за счет увеличения числа полиморфноядерных лейкоцитов и моноцитов. В указанный период также отмечалось весьма активное восстановление количества гемопоэтических островков гранулоцитарного типа. Вычисление интегрального показателя подтверждает в целом положительную динамику показателей отделов морфологически распознаваемых клеток периферической крови и костного мозга (ИП=113-539%), а также гемопоэтических островков (ИП=160-617%) (табл. 1). Значительно возрастает функциональная взаимосвязь данных отделов кроветворения с появлением новых корреляций: «полиморфоя-дерные лейкоциты - гемопоэтические островки», «незрелые нейтрофильные гранулоциты - моноциты периферической крови» (рис. 1). При этом количество гранулоцитарно-макрофагальных прекурсоров в костном мозге мышей, леченных D-глюкуроновой кислотой, оказалось сниженным на протяжении большей части периода наблюдения с временным подъемом величины данного показателя на 8-е сут эксперимента, однако без статистически значимых различий (ИП=107,38% при 111,69% в контроле) (табл. 1). Указанные изменения, вероятно, были связаны с активацией процессов их созревания на 4-е и 10-е сут опыта и более низкими темпами пролиферации кроветворных предшественников на 4-е сут после введения ЦФ. При этом на 8-е сут эксперимента число ДНК-синтезирующих клеток предшественников гранулоцитопоэза в костном мозге опытных животных возрастало.

Введение D-глюкуроновой кислоты на фоне цитостатической миелосу-прессии не приводило к существенным изменениям уровней продукции костномозговыми нуклеарами гемопоэтически активных гуморальных факторов. Так, колониестимулирующая активность в кондиционных средах от неприли-пающих миелокариоцитов и в сыворотке крови изменялась только на 4-е сут и 5-е сут соответственно. Изменения ИП в структуре «прекурсоры - гемопоэти-ны» отражают описанные выше изменения в данных отделах ГИМ (табл. 1). Таким образом, при использовании D-глюкуроновой кислоты после введения ЦФ наблюдается выраженное ускорение дифференцировки гемопоэтических предшественников вследствие быстрой нормализации структурно-функциональной организации костного мозга, что согласуется с данными литературы [Науменко О.И., 1992; Корнилов Н.В. и др., 1994; Noorgdergraaf Е.М., 1981; Hardy C.L., Minguell J.J., 1993; Siczkowski M. et al„ 1993].

Учитывая все вышеизложенное, можно заключить, что в основе активирующего эффекта изученных препаратов в отношении костномозгового гранулоцитопоэза в условиях цитостатической миелосупрессии, вызванной введением ЦФ, лежат различные механизмы. Следует отметить, что действие ПГ и гли-цирама по сравнению с таковым Г-КСФ и D-глюкуроновой кислоты более отсрочено. Кроме того, используя данные интегрального анализа о влиянии изу-

чаемых стимуляторов на содержание зрелых нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови, поскольку данный показатель является результирующим, характеризующим функционирование гранулоцитопоэза в целом, данные препараты по убыванию эффективности стимуляции гранулоцитарного ростка, подавленного циклофосфаном, можно расположить в следующем порядке: Г-КСФ —» Б-глюкуроновая кислота —+ пантогематоген —> глицирам.

Изучение влияния описанных выше стимуляторов на восстановление кроветворения, подавленного 5-ФУ, позволило выявить увеличение ОКЛ в периферической крови у животных, получавших ПГ, на 6, 14-е и 16-е сут эксперимента по сравнению с контролем. Обнаруженные отличия оказались обусловленными более высоким содержанием в крови сегменто- и палочкоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов, выявленным при подсчете гемограмм. Увеличение числа палочкоядерных нейтрофилов отмечали на 12-16-е сут опыта. При этом максимальные различия в количестве указанных клеток были зафиксированы на 16-е сут. Содержание сегментоядерных нейтрофилов было достоверно повышено на 14,16-е сут эксперимента (ИП=143,34% при 68,39% в контроле) (табл. 2). Следует отметить, что после применения ПГ наблюдалось интенсивное восстановление числа моноцитов по сравнению с контролем, начиная с 12-х суток и до конца эксперимента, что, по-видимому, играет существенную роль в регенерации грануломоноцигопоэза, поскольку механизмы су-прессирующего эффекта 5-ФУ на гемопоэз связаны со снижением содержания в костном мозге клеток системы мононуклеарных фагоцитов и секреторной активности прилипающих элементов ГИМ [Гершанович М.Л., 1982; Гольдберг Е.Д. и др., 1997, 1999]. Подтверждением справедливости высказанного предположения явилось значительное увеличение ИП для данного показателя в периферической крови и костном мозге до 329,62% и 229,36% соответственно (табл. 2). Максимальное содержание моноцитов в крови (1262,96% от фонового уровня) было зарегистрировано на 16-е сут опыта. Введение ПГ приводило к повышению количества лимфоцитов на 6-е и 14-е сут эксперимента.

При изучении костномозгового кроветворения оказалось, что введение ПГ на фоне цитостатической миелосупрессии приводило к повышению общей клеточности костного мозга лишь на 5-е и 12-е сутки эксперимента за счет незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов. В остальные сроки наблюдения данные показатели были снижены или достоверно не изменялись по сравнению с контрольной группой. Стимулирующее влияние ПГ на лимфоидный росток кроветворения было незначительным. Наблюдаемые минимальные изменения ИП в отделе морфологически распознаваемых клеток костного мозга у опытных животных отражают отмеченное выше действие ПГ на гранулоцитарный и лимфоидный отделы костномозгового кроветворения (табл. 2). Применение ПГ приводило к значительному увеличению числа моноцитов в костном мозге с 10-х по 16-е сут по сравнению с контрольной группой. Анализ колониеобра-зующей способности костного мозга мышей после применения гемостимулято-ра на фоне однократного цитостатического воздействия позволил установить возрастание выхода КОЕ-ГМ на 12-16 сут опыта после применения пантогема-тогена (ИП=145,80%) по сравнению с контрольной группой (ИП=125,23%)

(табл. 2). При этом увеличение коэффициента дифференцировки и доли кроветворных предшественников в 8-фазе митотического цикла отмечалось только на 12-е и 16-е сут соответственно. Числовое значение ИП для данных показателей, полученное у мышей, леченных ПГ, вероятно, свидетельствует о незначительной роли указанных механизмов в регенерации гранулоцитопоэза. Дальнейшие исследования позволили установить, что гемостимулятор активирует функцию клеток, составляющих гемопоэзиндуцирующее микроокружение. Так, сочетанное применение 5-ФУ и ПГ приводило к стимуляции секреции КСА прилипающими (8-16-е сут) и неприлипающими (8 и 16-е сут) элементами костного мозга. Уровень КСА сыворотки также достоверно превышал величину такового в контроле на 10 и 12-е сут. Однако описанные изменения выражались в увеличении ИП для гемопоэтинов, продуцируемых прилипающими миелока-риоцитами (321,43%), по сравнению с контролем (121,87%) (табл. 2). При этом имело место ускорение образования макрофагнегативных островков на 12-14-е сут опыта. Анализ качественного состава ГО показал увеличение количества островков только смешанного типа на 10-е и 12-е сут эксперимента.

Таким образом, введение ПГ ускоряло процессы восстановления подавленного 5-ФУ грануло- и моноцитопоэза. В основе активирующего влияния препарата на процессы костномозгового кроветворения лежит накопление гра-нулоцитарно-макрофагальных предшественников в кроветворной ткани и возрастание функциональной активности ГИМ, о чем свидетельствует появление прямых корреляционных связей между показателями гранулоцитопоэза и параметрами, характеризующими данные отделы системы крови (рис. 2). Действие ПГ опосредуется преимущественно прилипающими элементами микроокружения, чем, вероятно, и обусловлено его позднее проявление.

Введение глицирама после инъекции 5-ФУ способствовало более раннему и интенсивному восстановлению костномозгового кроветворения, подавленного цитостатиком. Увеличение общей клеточности костного мозга у мышей при сочетанном применении 5-ФУ и глицирама отмечали на 4-е, 10-е и 12-е сут. При этом стимуляция регенерации гранулоцитопоэза наблюдалась лишь на 12-е сут эксперимента. Активация восстановления клеточности лимфоидно-го ростка гемопоэза была зафиксирована на 4-е и 12-е сут. Следует отметить, что стимулирующее влияние глицирама на содержание моноцитов в кроветворной ткани было незначительным. Несмотря на увеличение общего количества миелокариоцитов в костном мозге опытных животных, применение глицирама приводило к развитию более выраженной нейтро-, лимфо- и моноцитопе-нии в периферической крови. Необходимо отметить, что и восстановление указанных показателей отставало по срокам от такового в группе сравнения. Результатом описанных изменений явились незначительные колебания величин ИП для отделов морфологически распознаваемых клеток гранулоцитарного ростка по сравнению с цитостатическим контролем (табл. 2).

При исследовании пула кроветворных предшественников оказалось, что указанные изменения в отделе морфологически распознаваемых миелокариоцитов у мышей, леченных глицирамом, обусловлены стимуляцией накопления в костномозговой ткани грануломоноцитарных (5-е и 14-е сут) клеток-

предшественников, а также усилением их пролиферативнои активности на 5-6-е и 10-е сут эксперимента. Соответствующее повышение 11Г1 отмечено для гемо-поэтических прекурсоров и КОЕ-ГМ в Б-фазе митотического цикла (табл. 2). Индекс созревания гранулоцитарных прекурсоров увеличивался на 10-е сут опыта. Параллельно наблюдалось активное восстановление количества ГО, содержащих стромальную клетку (начиная с 10-х сут наблюдения).

Изучение механизмов гемостимулирующего эффекта глицирама показало, что он существенно не влиял на продукцию костномозговыми нуклеарами колониестимулирующей активности. Возрастание её секреции отмечалось только со стороны адгезирующих миелокариоцитов на 10-е сут наблюдения. При этом наблюдалось снижение уровня КСА в сыворотке периферической крови в группе с глицирамом на 4-е, 6-10-е и 16-е сут эксперимента. Обнаружена высокая степень координации между увеличением темпов деления предшественников и секреторной активностью адгезирующих (г=0,880) клеток костного мозга (рис. 2). Также обращает на себя внимание возникновение коррелятов между показателями гуморальной составляющей системы локальной регуляции и отделом морфологически распознаваемых клеток (рис. 2).

Анализ динамики репарационных процессов на фоне действия глицирама после введения 5-ФУ позволяет предположить, что его гемостимулирующий эффект реализуется на уровне элементов кроветворного микроокружения, и в частности, клеток адгезирующей фракции костного мозга, что влечет за собой активацию процессов пролиферации клеток-предшественников грануломоно-цитопоэза.

Проведенные эксперименты позволили установить, что введение Г-КСФ после цитостатического воздействия повышало содержание незрелых (4-6-е сут) и зрелых (5-е, 8-12-е сут) форм нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге опытных животных. При анализе миелограмм было зарегистрировано также существенное увеличение числа моноцитов на 5-е, 10-14-е сут и лимфо-идных клеток (с 4-х по 5-е сут наблюдения).

Сравнительное изучение периферической крови мышей обеих групп выявило существенно больший подъем количества палочкоядерных нейтрофильных гранулоцитов у мышей, получавших 5-ФУ совместно с Г-КСФ, с 10-х по 16-е сут включительно, а также моноцитарно-макрофагальных клеток - на 1216-е сут наблюдения. ■

Следует отметить, что введение гемопоэтина практически не оказывало стимулирующего влияния на выход сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов в периферическую кровь на протяжении всего периода наблюдения. При этом изучение ИП, характеризующего влияние исследуемого препарата на динамику морфологически распознаваемых клеток, выявило его изменение только для моноцитов костного мозга и периферической крови (табл. 2).

Применение Г-КСФ вызывало значительное увеличение содержания в костном мозге гранулоцитарных прекурсоров. Количество КОЕ-ГМ в кроветворной ткани опытных животных существенно превышало аналогичный показатель у мышей контрольной группы на 4, 8, 14-е и 16-е сут эксперимента. Досто-

верное ускорение созревания КОЕ-ГМ после применения цитокина наблюдали на 4, 8,12-е и 16-е сут, а увеличение пролиферативной активности - на 4-е и 14-е сут опыта.

Таблица 2. Величины интегрального показателя (% от исходного уровня), характеризующие влияние пантогематогена, Г-КСФ, глицирама и Б-глюкуроновой кислоты на систему крови мышей линии СВА/СаЬас после вве-

Показатели 5-фторурацил Панто-гематоген Глицирам Г-КСФ Ц-глюкуро-новая кислота

Морфологически распознаваемые клетки перш ¡ерической крови

ОКЛ 64,62 111,37 57,31 74,85 94,03

СНГ 68,39 143,34 81,13 70,08 89,48

Лимфоциты 73,81 92,60 63,43 74,6 90,39

Моноциты 71,29 329,62 20,37 114,35 122,22

Морфологически распознаваемые клетки костного мозга

ОКК 45,38 40,65 54,195 35,16 28,93

ННГ 73,74 31,22 86,78 33,889 27,81

ЗНГ 39,99 52,84 46,40 54,13 42,27

Лимфоциты 54,09 58,78 71,26 49,54 20,32

Моноциты 80,56 229,36 79,86 131,25 89,51

Пул кроветворных клеток-предшественников

КОЕ-ГМ 125,23 145,80 140,31 152,15 153,27

Б-КОЕ-ГМ 88,53 82,05 171,85 63,07 158,66

ИД-КОЕ-ГМ 92,43 97,65 91,25 110,15 61,51

Структурное ункциональная организация костного мозга

ГО 103,43 64,29 93,86 54,60 87,03

М(-)ГО 80,75 66,71 87,20 54,60 89,68

Г-ГО 149,21 105,34 126,01 78,46 137,78

Уровень гемопоэтинов в биологических жидкостях

КСА ад 121,87 321,43 90,37 162,50 96,87

КСА неад 618,75 457,14 690,81 587,5 675,00

КСА сыв 55,95 61,71 39,88 48,58 55,27

Примечание: <100% - ингибирующее действие препарата; >100% - стимулирующее влияние препарата

Активация гранулоцитопоэза происходила на фоне некоторого усиления продукции колониестимулирующей активности адгезирующими и неприли-пающими кариоцитами на 4-е и 16-е сут наблюдения соответственно в группе мышей, получавших Г-КСФ после однократного применения цитостатика. При этом регистрируемые изменения ИП (162,50 и 587,50%) по данным показателям в группе леченных препаратом были незначительными по сравнению с цито-статическим контролем (121,87 и 618,75% соответственно) (табл. 2). Уровень КСА сыворотки достоверно превышал величину такового в контроле только на 6-е сут после применения Г-КСФ.

Более существенный вклад в стимуляцию восстановления гранулоцитопоэза вносило активное образование в костном мозге ГО с центрально расположенной макрофагнегативной клеткой в результате применения гемопоэтина,

наблюдавшееся после периода угнетения данного показателя (4-8-е сут), и регистрировавшееся, начиная с 10-х сут и до конца эксперимента. Аналогичной была динамика изменения количества гранулоцитарных островков при изучении их качественного состава. Проведенный интегральный и корреляционный анализ подтвердил важную роль описанных выше взаимодействий всех отделов кроветворения в восстановлении подавленного цитостатиком гранулоцитопо-эза, а именно, сопряжения процессов пролиферации с накоплением гемопоэти-ческих прекурсоров и их дифференцировкой в зрелые миелокариоциты с количеством ГО (табл. 2, рис. 2).

Таким образом, введение Г-КСФ на фоне миелосупрессии, вызванной введением 5-ФУ, стимулирует, как и при применении пантогематогена, восстановление гранулоцитарного и моноцитарного ростков гемопоэза. При этом эффект Г-КСФ закономерно обусловлен в первую очередь активацией колониеоб-разующей способности, непосредственной стимуляцией дифференцировки ге-мопоэтических предшественников и морфологически дифференцируемых мие-локариоцитов. Нарушение функционирования ГИМ (вследствие мощного деструктивного действия 5-ФУ) не позволяет реализовать Г-КСФ свою гемостиму-лирующую активность в полной мере [Гольдберг Е.Д. и др., 1999.]. Этим во многом обусловлено нарушение нормального выхода зрелых клеток, в первую очередь, гранулоцитов, из костного мозга в периферическую кровь.

Изучение динамики показателей костномозгового кроветворения у мышей после курсового применения Б-глюкуроновой кислоты на фоне 5-ФУ показало снижение общего количества миелокариоцитов (ОКК) по сравнению с контрольными животными на 4-е, с 8-х по 16-е сут (включительно). Однако при подсчете миелограмм было выявлено увеличение числа незрелых (4-6 сут) и зрелых (5-е и 12-е сут) нейтрофильных гранулоцитов по сравнению с контрольной группой. Абсолютное количество лимфоидных клеток в костном мозге опытных животных было снижено на протяжении всего периода наблюдения. Повышение содержания моноцитов наблюдалось только на 14-16-е сут исследования. Наблюдаемое на 6-е, 8-е и 12-16-е сут увеличение ОКЛ в группе мышей, леченных Г)-глюкуроновой кислотой, обусловлено в основном увеличением числа циркулирующих лимфоцитов, и лишь к 16-м суткам эксперимента -повышением содержания в периферической крови моноцитов и палочкоядер-ных нейтрофильных гранулоцитов. Следует отметить, что вычисление ИП для отдела морфологически распознаваемых клеток показало стимулирующее влияние О-глюкуроновой кислоты только на динамику количества костномозговых моноцитов (табл. 2).

Указанные изменения сопровождались повышением содержания в костном мозге прекурсоров грануломоноцитопоэза на 4-е, 14-е и 16-е сут опыта у животных, получавших Б-глюкуроновую кислоту, что связано, вероятно, с более высокими темпами пролиферации кроветворных предшественников на 4-е и 6-е сут и снижением интенсивности созревания КОЕ-ГМ во все сроки исследования, что подтверждает увеличение ИП для гемопоэтических прекурсоров (153,27% при 125,23% в контроле) и КОЕ-ГМ в 5-фазе клеточного цикла (158,66% при 88,53% в контроле) (табл. 2).

Б-глюкуроновая кислота практически не изменяла продукцию гуморальных активностей прилипающими элементами костного мозга, но вызывала подъем уровня КСА в супернатантах от неприлипающих миелокариоцитов на 4-5-е и 16-е сут эксперимента. Результатом описанных изменений явилось увеличение ИП для гемопоэтинов, продуцируемых неадгезирующими клетками костного мозга, до 675% при контрольных 618,75% (табл. 2). Влияние препарата на КСА периферической крови выражалось в возрастании уровня исследуемого показателя на 5-е и 12-14-е сут по сравнению с аналогичной величиной в группе с применением одного цитостатика. Корреляционное взаимодействие, возникающее между костномозговыми нуклеарами, клеточными элементами грануломоноцитарного ростка в периферической крови и продукцией сывороточной КСА, свидетельствует о важной роли дистантных факторов в регуляции кроветворения в данных условиях.

Увеличение общего количества гемопоэтических островков в кроветворной ткани мышей, леченных О-глюкуроновой кислотой, за счет выхода структурно-функциональных ассоциаций, содержащих в своем составе стромальную клетку, отмечалось на 10-е и 16-е сут эксперимента. Изучение качественного состава ГО выявило усиленное образование гранулоцитарных и смешанных ГО в эти же сроки исследования. Появление новых корреляционных связей между морфологически распознаваемыми клетками грануломоноцитарного отдела ге-мопоэза и усилением формирования ГО доказывает зависимость увеличения числа миелокариоцитов в костном мозге и полиморфоядерных лейкоцитов, моноцитов в периферической крови от восстановления Б-глюкуроновой кислотой структурно-функциональной целостности костного мозга мышей, перенесших

введение 5-ФУ (рис. 2)

Полученные данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии Б-глюкуроновой кислоты преимущественно на гранулоцитопоэз в условиях гемо-депрессии, вызванной введением антиметаболита, за счет повышения пролифе-ративной активности прекурсоров грануломоноцитопоэза и усиления продукции гуморальных регуляторов кроветворения (КСА от неприлипающих миелокариоцитов и КСА сыворотки).

Таким образом, приведенные выше результаты свидетельствуют о стимулирующим влиянии исследуемых лекарственных средств на гранулоцитопоэз, подавленный 5-ФУ, а данные, полученные при вычислении интегрального показателя для сегментоядерных нейтрофильных гранулоцитов, позволяют указанные препараты по убыванию гемостимулирующего эффекта расположить следующим образом: пантогематоген -» Б-глюкуроновая кислота глицирам

-> Г-КСФ.

Важным является то обстоятельство, что корреляционный анализ влияния ЦФ и 5-ФУ на процессы костномозгового гранулоцитопоэза показал в обоих случаях увеличение количества сигнальных связей между отдельными компар-тментами гранулоцитарного ростка кроветворения, что отражает повышение «напряжения» регуляторных систем кроветворения, и, по-нашему мнению, свидетельствует о дизрегуляции кроветворения при цитостатическом воздействии (рис. 1, 2). В то же время, изучение структуры корреляционных связей по-

еле применения исследуемых препаратов на фоне алкилирующего агента выявило уменьшение числа корреляций по сравнению с одним цитостатиком. При этом уменьшение взаимосвязей отмечается в основном в наиболее поврежденных цитостатиком отделах гемопоэза. Указанные изменения, по-видимому, свидетельствуют о регулирующем (нормализующем) влиянии гемостимулято-ров на костномозговой гранулоцитопоэз, в условиях действия ЦФ (рис. 1).

Высокая сопряженность гранулоцитопоэзстимулирующей деятельности различных регуляторных систем, наблюдаемая после использования гемости-муляторов на фоне антиметаболита, вероятно, связана с мощным деструктивным эффектом цитостатика на элементы кроветворного микроокружения. Как следствие, под действием изучаемых препаратов наблюдается компенсаторное возрастание функции разрушенных цитостатиком отделов гемопоэза либо увеличение координированной деятельности неповрежденных элементов (рис. 2).

Кроме того, обращает на себя внимание зависимость структуры корреляционных связей между отдельными звеньями костномозгового гранулоцитопо-эза от механизма действия гемостимуляторов. Так, при применении пантогема-тогена и глицирама, действующих опосредованно через гемопоэзиндуцирую-щее микроокружение, плотность корреляционных связей была значительно повышена в отделах показателей системы локальной регуляции и пула коммутированных прекурсоров. При использовании стимуляторов гемопоэза, оказывающих непосредственное действие на кроветворные клетки (Г-КСФ, Б-глюкуроновая кислота), появление новых коррелятов отмечалось в отделе ге-мопоэтических островков и морфологически распознаваемых клеток (рис. 1,2).

Таким образом, установленный в описательном порядке гемостимули-рующий эффект исследуемых препаратов (пантогематоген, глицирам, Г-КСФ и Б-глюкуроновая кислота) в отношении гранулоцитопоэза, подавленного ЦФ либо 5-ФУ, находит свое количественное (величины ИП) и качественное (корреляционные связи) статистическое подтверждение.

Учитывая результаты представленных экспериментальных исследований и их математическую оценку, можно заключить, что различные характер и темпы восстановления клеточности гранулоцитарного ростка после применения гемостимуляторов на фоне цитостатического воздействия (ЦФ, 5-ФУ) обусловлены неодинаковой чувствительностью коммутированных предшественников и элементов ГИМ к действию противоопухолевых препаратов. В частности, установлено, что ЦФ обладает выраженным токсическим эффектом на Т-клетки, тогда как для 5-ФУ характерно нарушение функциональной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов при относительной сохранности системы Т-лимфоцитов. Поэтому при прочих равных условиях восстановление кроветворения при использовании препаратов, которые стимулируют поврежденное 5-ФУ микроокружение, протекает лучше, чем при применении средств, обладающих непосредственным действием на кроветворные клетки.

А

Б

В

г-го ^ / ннг \

( мвГо\________У _______<4 знг

/ КСА

мон Ч

( М(-)ГО \

У"

КСА \

ч / ЭГ-ГО V

г-го 4 ! ннг

'ч и, ^ ^ ->~" V

/

г-го V! ( М(-)ГО --

ч ( ЭГ-ГО 4

! ннг

{ КСА^ \

V /

КСА \/ ч Ч, КОЕ-ГМ".

" / ИД- У Э-КОЕ- ' ;

'ч КОЕ-ГМ { гм !-. _

- , л ,/

"7 ЛИМ

.......

КСА '1 \ ; КОЕ-ГМ

" / ид- Ч

У\ КОЕ-ГМ .( N.______

7'кСЛ \/^"^Ч ->------. ( КОЕ-шЧ

! - I ид- у*и».\ I

\ .1 кон-гм ) 3'К0Е 1 -

гм -----

ч

д

( мон

КСА \/" Ч х......./ КОЕ-ГМ ■

" / ИД- -/шхЛ

ч КОЕ-ГМ } ш К, _ У

Ч. „У

( г-го М

— I 1

/ \ -; эг-го \/

( М(-)ГО \

Л

ннг

У"

( КСА

7— ___^ знг

у

: МОН ЛИМ \

ч

у ид-

Л .! ^ к.

КОЕ-ГМ \

у

„у Ч

! М(-)ГО >.....

ннг N _

-'"V_____„/'"от"

>

/ ! МС

- /

"ч / ! ЛИМ \

КСА Ч ' "-Л ч/'кОЕ-ГМ 4

" I ИД' V 5-КОЕ- I

у \ КОЕ-ГМ ш _ у

у\ у

Рис. 1. Структура корреляционных связей костномозгового гранулоцитопоэза у интактных мышей линии СВА/СаЬас (А), у мышей после однократного введения циклофосфана в дозе 250 мг/кг (Б), либо курсового применения пантогематогена (В), глицирама (Г), Г-КСФ (Д) или Б-глюкуроновой кислоты (Е) на фоне циклофосфана. Сплошная линия - прямые корреля-

А Б В

Рис. 2. Структура корреляционных связей костномозгового гранулоцитопоэза у интактных мышей линии CBA/CaLac (А), у мышей после однократного введения 5-фторурацила в дозе 250 мг/кг (Б), либо курсового применения пантогематогена (В), глицирама (Г), Г-КСФ (Д) или D-глюкуроновой кислоты (Е) на фоне 5-фторурацила. Сплошная линия - прямые корреляции.

В связи с этим были проведены эксперименты по изучению влияния исследуемых гемостимуляторов на элементы гемопоэзиндуцирующего микроокружения in vitro. В результате было показано, что пантогематоген и глицирам не обладают способностью к прямой стимуляции роста кроветворных клеток предшественников, а Г-КСФ и D-глюкуроновая кислота оказывают непосредственное влияние на эффективность колониеобразаования. Кроме того, как было отмечено выше, стимулирующее действие пантогематогена и глицирама на модели миелосупрессии связано с модуляцией продукции гуморальных регуляторов кроветворения клетками ГИМ (КСА от адгезирующих миелокариоцитов). Основной же мишенью для гемопоэтина и D-глюкуроновой кислоты явился пул коммитированных прекурсоров, а именно, изменение его функциональной активности. Таким образом, сопоставляя имеющиеся факты об особенностях механизмов гемостимулирующего действия сравниваемых препаратов и учитывая характер восстановления гранулоцитопоэза после введения цитостатиков, мы пришли к выводу, что при моделировании цитостатической болезни алкили-рующим агентом наиболее эффективными окажутся средства, обладающие способностью активировать процессы в отделе гранулоцитарных предшественников - Г-КСФ и D-глюкуроновая кислота, а в условиях введения антиметаболита - препараты с преимущественным стимулирующим влиянием на кроветворное микроокружение (пантогематоген, глицирам).

Для того, чтобы нивелировать различный уровень изменений величин по казателей, характеризующих гранулоцитопоэз при цитостатических воздействиях, мы нормировали полученные при введении гемостимуляторов результаты по контролю, определяя кратность стимуляции (отношение величин показате лей у мышей, которым вводили цитостатик со стимулятором, к таковым у жи вотных, получавших только цитостатик). Таким образом, производили оценку эффективности каждого конкретного лекарственного средства в отношени гранулоцитарного ростка кроветворения, подавленного различными по меха низму действия цитостатиками (ЦФ либо 5-ФУ).

Поскольку согласно методическим рекомендациям по изучению гемо стимулирующей активности фармакологических веществ [Дыгай A.M. и др. 2002], соединениями, избирательно стимулирующими гранулоцитопоэз, следу ет считать вещества, достоверно увеличивающие абсолютное содержание по лиморфоядерных нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови экс периментальных животных в период интенсивного восстановления кроветворе ния, мы провели сравнительную оценку гемостимулирующих свойств изучае мых препаратов именно по изменению величины данного показателя.

Анализ стимулирующего эффекта ПГ на модели цитостатической миело супрессии, вызванной введением ЦФ, выявил повышение кратности стимуля ции числа сегментоядерных нейтрофилов с 6-х по 10-е сут по сравнению с дан ным показателем на фоне действия антиметаболита, когда величина данног показателя снизилась до нуля. В то же время, к концу эксперимента (14-16-сут) эффект от применения препарата оказался более выраженным у мышей получавших 5-ФУ (рис. 3). В целом же интегральный показатель кратност стимуляции по нормированному среднему для сегментоядерных нейтрофиль

ных гранулоцитов свидетельствует о том, что пантогематоген более эффективен при моделировании цитостатической болезни алкилирующим агентом (табл. 3).

Таблица 3. Величины интегрального показателя (вычисленные по кратности стимуляции), характеризующие влияние пантогематогена, глицирама, Г-КСФ и Б-глюкуроновой кислоты на содержание сегментоядерных нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови мышей линии СВА/СаЬас после введе-

Цитостатики Пантогематоген Глицирам Г-КСФ П-глюкуроновая кислота

Циклофосфан 105,71 162,37 304,75 326,25

5-фторурацил 72,43 60,63 38,63 71,13

В условиях однократного введения алкилирующего агента глицирам по способности увеличивать содержание сегментоядерных лейкоцитов в периферической крови (согласно данным, полученным при вычислении интегрального показателя кратности стимуляции), также превосходил таковую при его применении на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной 5-ФУ (табл. 3), что иллюстрирует повышение кратности стимуляции с 5-х по 12-е сут на фоне действия ЦФ по сравнению со 2-й группой, получавшей антиметаболит (рис. 3). При этом на 14-16-е сут стимулирующий эффект препарата в отношении клеток гранулоцитарного ростка кроветворения был более выражен в условиях гипоплазии, вызванной фторпиримидиновым антиметаболитом (рис. 3).

При обработке данных, нормированных по контролю (кратность стимуляции), характеризующих влияние Г-КСФ на содержание сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови, оказалось, что стимулирующий эффект препарата на фоне действия ЦФ выше такового после его совместного введения с антиметаболитом, на протяжении всего периода наблюдения (рис. 3). Подтверждением этому служит высокое значение ИП для сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов после применения гемопоэтина на фоне ЦФ (табл. 3).

Сравнение изменений кратности стимуляции после применения О-глюкуроновой кислоты на фоне действия ЦФ, либо 5-ФУ, выявило возрастание степени увеличения содержания сегментоядерных гранулоцитов в крови мышей, получавших алкилирующий агент, с 4-х по 10-е сут исследования (рис. 3). Максимальные различия по величине стимуляции отмечались при этом на 4-е сут эксперимента, когда они составили десятикратную разницу с таковой в группе сравнения. На 12-е сут стимулирующий эффект данного препарата был в большей степени выражен при его сочетанном применении с антиметаболитом (в 1,8 раза больше аналогичного показателя в группе с ЦФ) (рис. 3). Вычисление ИП по кратности стимуляции для сегментоядерных нейтрофильных гранулоцитов подтвердило более выраженный стимулирующий эффект препарата в отношении числа указанных клеток крови на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной введением ЦФ (табл. 3).

2,5 т 2

1,5 1

0,5 0

3 ч

2,5 -2 1.5 1

0.5 О

0 5 б 8 10 12 14 16

О 4 5 6 8 10 12 14 16

1,5

1 -

0,5

9 -I

6 -

3 -

ш.

ддщ

0 4 5 6 8 10 12 14 16

О 4 5 6 8 10 12 14

Рис 3 Содержание сегментоядеркых нейтрофильных гранулоцитов в периферической I мышей линии СВА/СаЬас. нормированное по контролю (кратность стимуляции), после к Того применения пантогемагогена (А), глицирама (Б), Г-КСФ (В) либо 0-глюкУроновои ^ ты (Г) на фоне циклофосфана (1) либо 5-фторурацила (2). I

По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - содержание клеток в не, рической крови, нормированное по контролю (кратность стимуляции).

Представленный в настоящем разделе материал об изменениях характеру восстановления картины периферической крови под действием исследуемых препаратов свидетельствует о том, что выраженность эффектов гемостимулято-, ров на модели цитостатической болезни, вызванной фторпиримидиновым антиметаболитом, в значительной степени уступает таковой при назначении ЦФ. что связано с более глубокими деструктивными изменениями клеточных эле ментов кроветворного микроокружения (табл. 3).

В совокупности вышеприведенные данные легли в основу предложенных

нами схем регуляторного влияния стимуляторов гранулоцнтопоэза на кроветворную ткань при цитостатических воздействиях (рис. 4, 5).

Так, гемостимулнрующий эффект пантогематогена в условиях введения алкилирующего агента обусловлен возрастанием функциональной активности стромальных элементов ГИМ и стимуляцией процессов пролиферации клеток-предшественников грануломоноцитопоэза. Вполне вероятно, что в основе активации данным препаратом гемопоэза может лежать и модуляция функции центральных нейроэндокринных механизмов регуляции кроветворения. Ускорение процессов дифференцировки коммитированных предшественников и как следствие - более раннее восстановление кроветворной ткани после введения гли-цирама на фоне ЦФ связаны с активацией адгезирующих элементов кроветворного микроокружения и стимуляцией формирования в костном мозге гемопо-этических островков (макрофагнегативных, гранулоцитарных) (рис. 4).

Гемостимулирующее действие Г-КСФ и О-глюкуроновой кислоты обусловлено непосредственным их эффектом в отношении кроветворных клеток -предшественников. При этом ускоренный выход гранулоцитомакрофагальных прекурсоров в дифференцировку либо увеличение их пролиферативной активности после применения Г-КСФ обусловлены, в том числе, повышением секре-орной активности неприлипающих миелокариоцитов и опережающим восстановлением структурно-функциональной целостности костного мозга. Быстрая нормализация структурно - функциональной организации костного мозга после применения Б-глюкуроновой кислоты также ускоряет дифференцировку гранулоцитомакрофагальных клеток-предшественников (рис. 4).

В условиях введения фторпиримидинового антиметаболита применение пантогематогена способствует восстановлению грануло- и моноцитопоэза, что связано с накоплением в кроветворной ткани гранулоцитомакрофагальных прекурсоров, а также увеличением функциональной активности клеток адгези-рующей фракции ГИМ, в частности, элементов системы мононуклеарных фагоцитов.

В основе активации регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения глицирамом лежит ускорение процессов пролиферации клеток-предшественников грануломоноцитопоэза вследствие повышения уровня гуморальных регуляторов кроветворения (КСА от адгезирующих миелокариоцитов) (рис. 5).

Гемостимулирующая активность гемопоэтина связана с активацией коло-ниеобразующей способности и непосредственной стимуляцией дифференцировки прекурсоров грануломоноцитопоэза. Введение Б-глюкуроновой кислоты на фоне миелосупрессии, вызванной 5-ФУ, способствует активации деления грануломоноцитарных клеток-предшественников за счет увеличения концентрации гуморальных регуляторов гемопоэза в сыворотке крови (рис. 5).

Рис. 4. Механизмы действия стимуляторов гранулоцитопоэза при гемодепрессии, в) ной введением алкилирующего агента (циклофосфан). Широкие стрелки - активирующее действие препаратов.

Нейро - эндокринная система

СМФ

КСФ

ГЛИЦИРАМ

о-ганжуро

КИСЛОТА

Шъ (Л1 Периферическая ^N¡¡7 кровь

Рис. 5. Механизмы действия стимуляторов гранулоцитопоэза при гемодепрессии, вызванной введением фторпиримидинового антиметаболита (5-фторурацил). Широкие стрелки - активирующее действие препаратов.

Таким образом, различный характер стимулирующего влияния сравниваемых препаратов на подавленный гранулоцитопоэз, а также вскрытые особенности механизмов их действия, указывают на необходимость дифференцированного подхода к терапии цитостатических миелосупресссий в клинике. Учитывая все вышеизложенное, мы предположили, что более перспективными для лечения цитостатических лейкопений, возникающих после проведения химиотерапии по схеме, включающей цитостатитики, малотокскчные в отношении клеток кроветворного микроокружения (алкилирующие агенты, антрацик-линовые антибиотики, производные платины), являются препараты, оказывающие непосредственное действие на кроветворные клетки. Фармакологическую коррекцию нарушений гемопоэза, сопровождающихся повреждением элементов ГИМ после включения в программу цитостатического лечения антиметаболитов либо таксанов, целесообразно проводить лекарственными средствами, гемостимулирующее действие которых связано с повышением функциональной активности гемопоэзиндуцирующего микроокружения.

ВЫВОДЫ

1. Характер течения восстановительных процессов в кроветворной ткани по еле цитостатического воздействия во многом определяется влиянием анти бластомных агентов на элементы гемопоэзиндуцирующего микроокруже ния.

2. Восстановление гранулоцитопоэза после введения циклофосфана обуслов лено преимущественно активацией дифференцировки кроветворны предшественников в более зрелые элементы и возрастанием секреторно" активности прилипающих клеток костного мозга.

3. Поздняя активация гранулоцитарного ростка при моделировании миелосу прессии 5-фторурацилом связана с нарушением нормального течения про цессов созревания прекурсоров в ранние сроки и снижением продукци колониестимулирующей активности адгезирующими элементами микро окружения.

4. Различный характер активирующего влияния пантогематогена, глицирама гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и В-глюкуроново" кислоты на подавленный гранулоцитопоэз обусловлен их неодинаковы действием на регуляторные системы, контролирующие процессы крове творения.

5. Введение пантогематогена ускоряет процессы восстановления гранулоци топоэза, подавленного как циклофосфаном, так и 5-фторурацилом, в позд ние сроки исследования. В основе активирующего влияния пангогематоге на лежит увеличение числа гранулоцитомакрофагальных прекурсоров костном мозге и возрастание функциональной активности адгезирующи элементов кроветворного микроокружения. Стимуляция пантогематогено процессов регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения, подав

ленного антиметаболитом, связана со значительным увеличением костномозгового пула мононуклеарных фагоцитов.

6. Гемостимулирующий эффект глицирама реализуется на уровне адгези-рующих элементов кроветворного микроокружения, что на фоне введения циклофосфана ведет к активации процессов дифференцировки грануломо-ноцитарных клеток-предшественников, а на модели миелосупрессии, вызванной введением 5-фторурацила, - к активации их пролиферации.

7. Активация подавленного циклофосфаном гранулоцитопоэза под действием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора обусловлена ускорением пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников, а также усилением секреции цитокинов неприлипающими клетками костного мозга. При применении препарата на фоне 5-фторурацила мощный деструктивный эффект последнего в отношении микроокружения (угнетение секреции гуморальных активностей и формирования гемопоэтических островков), а также нарушение выхода зрелых нейтрофилов в периферическую кровь, не позволяют цитокину полностью реализовать свою гемо-стимулирующую активность.

8. Ведущим механизмом стимуляции Б-глюкуроновой кислотой восстановления кроветворения в условиях введения циклофосфана, является ускорение дифференцировки гранулоцитомакрофагальных предшественников вследствие быстрой нормализации структурно-функциональной организации костного мозга. Эффект Б-глюкуроновой кислоты при миелосупрессии, вызванной 5-фторурацилом, обусловлен повышением пролифератив-ной активности прекурсоров гранулоцитопоэза, в том числе, за счет увеличения концентрации гуморальных регуляторов гемопоэза в сыворотке крови.

9. Стимуляторы гемопоэза, оказывающие непосредственное действие на кроветворные клетки (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, Б-глюкуроновая кислота), более эффективны на модели миелосупрессии, вызванной введением циклофосфана, а действующие опосредованно, через гемопоэзиндуцирующее микроокружение (пантогематоген, глицирам), - в условиях введения 5-фторурацила.

10. Выраженность эффектов гемостимуляторов на фоне действия 5-фторурацила значительно уступает таковой при назначении циклофосфана, что связано с более глубокими структурно-функциональными изменениями кроветворного микроокружения в первом случае.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Методические документы МЗ РФ

1. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. -2002.-№1.~ С. 29-32 (соавторы Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др.).

Публикации

2. Новые данные о механизмах развития цитостатической болезни // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов (Материалы конференции, посвященной 15-летию НИИ фармакологии). -Т. 10. - Томск, 1999. - С. 35-42 (соавторы В.В. Жданов, М.Ю. Минакова, Е.В. Симанина и др.).

3. Новые стимуляторы гранулоцитопоэза // Тез. докл. VI Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 1999. - С. 399 (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов и др.).

4. Гемостимулирующие свойства рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и пантогематогена в условиях цитостатической миелосупрессии // Проблемы современной онкологии (Материалы юбилейной конференции института онкологии ТНЦ СО РАМН). - Томск, 29-30 июня, 1999. - С. 120-121 (соавторы В.В. Жданов, Е.В. Симанина, Н.С. Поженько и

ДР-)-

5. Влияние рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и пантогематогена на гемопоэз в условиях цитостатической миелосупрессии // Актуальные вопросы экспериментальной морфологии. -Томск, 1999. - С. 10-12 (соавторы Е.В. Удут, Е.Ю. Хричкова, В.Е. Гольдберг и

др.)-

6. Новые препараты - стимуляторы грануломоноцитопоэза // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины (Материалы молодежной научной конференции СО РАМН). - Новосибирск, 2000. - С. 35-36 (соавторы Н.С. Поженько, Т.Ю. Хричкова).

7. Новые подходы в создании гемостимуляторов для клинической практики // Тез. докл. VII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2000. - С. 494 (соавторы A.M. Дыгай, Е.Д. Гольдберг, В.В. Жданов и др.).

8. Гемостимулирующие свойства пантогематогена в условиях цитостатической миелосупрессии // Проблемы эксперим. и клин, фармакологии (Сборник научных работ молодых ученых). - Томск, 2000. - С. 15-16.

9. Новые препараты - стимуляторы грануломоноцитопоэза // Бюллетень СО РАМН. - 2000. - № 2. - С. 53-58 (соавторы Н.С. Поженько, Т.Ю. Хричкова).

10. Механизмы стимуляции миелопоэза при цитостатических миелоде-прессиях пантогематогеном и гранулоцитарным колониестимулирующим фак-

тором // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2000. - Т. 130. - № 11. - С. 512-515 (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов и др.).

11. Участие костномозговых фибробластов в восстановлении грануло-цитопоэза при цитостатических миелосупрессиях // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2000. - Т. 129. - № 5. - С. 528-532 (соавторы A.M. Дыгай, В.В. Жданов, Н.С. Поженько, Е.Д. Гольдберг).

12. Гемостимулирующие свойства пантогематогена в условиях миело-супрессии, вызванной цитостатиками // Эксперим. и клин, фармакология. -2000. - Т. 63. - № 6. - С. 34-36 (соавторы A.M. Дыгай, В.В. Жданов, Н.С. Поженько и др.).

13. Новые препараты - стимуляторы грануломоноцитопоэза // Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности (Материалы международной научной конференции). - Томск, 27 - 29 июня 2000. - С. 148-150 (соавторы В.В. Жданов, Е.В. Симанина, Н.С. Поженько и др.).

14. Миелотоксичность цитостатического препарата растительного происхождения - этопозида // Эксперим. и клин, фармакология. - 2001. - Т. 64. - № 5. - С. 31-33 (соавторы A.M. Дыгай, Е.В. Удут, В.В. Жданов и др.).

15. Роль гемопоэтических ростовых факторов в регенерации кроветворения при миелосупрессии, вызванной введением этопозида // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. -2001. -Т. 131. -№ 5. - С. 512-516 (соавторы Е.В. Удут, В.В. Жданов, А.М.Дыгай и др.).

16. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции кроветворения на модели цитостатической миелосупрессии // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2001. - Т. 132. - № 8. - С. 156-160 (соавторы В.В. Жданов, Е.В. Удут, М.Г. Данилец и др.).

17. Новые лекарственные формы рекомбинантных цитокинов для лечения анемий и лейкопений различного генеза // Тез. докл. VIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2001. - С. 295 (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов и др.).

18. Влияние пантогематогена на восстановление подавленного цито-статиком грануломоноцитопоэза // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2001. - С.55-57 (соавторы Е.В. Симанина).

19. Активирующие эффекты пантогематогена и гранулоцитарного ко-лониестимулирующего фактора в отношении подавленного цитостатиком гра-нулоцитопоэза // Общие вопросы патологии (Юбилейный сборник, посвященный 75-летию профессора A.C. Зиновьева). - Омск, 2001. - С.24-29 (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов, Н.С. Поженько).

20. Гемостимулирующие свойства кропанола при цитостатической миелосупрессии // Эксперим. и клин, фармакология. - 2002. - Т. 65. - № 6. - С. 37-40 (соавторы В.В. Жданов, В.Е. Гольдберг, Т.Ю. Хричкова и др.).

21. Механизмы гемостимулирующего эффекта кропанола при цитостатических миелосупрессиях // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. -

приложение № 1. - С. 78-81 (соавторы В.В.Жданов, В.Е. Гольдберг, Т.Ю. Хрич-коваидр.).

22. Пантогематоген - стимулятор грануломоноцитопоэза // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2002. -Т.2. - С. 55-56.

23. Влияние этопозида на структурно-функциональную организацию костного мозга // Эксперим. и клин, фармакол. - 2002. - Т. 65. - № 6. - С. 151152 (соавторы A.M. Дыгай, В.В. Жданов, Е.В. Симанина и др.).

24. Механизмы гемостимулирующего действия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора // Актуальные проблемы фармакологии (Тез. докл. научной конференции, посвященной 50-летию Алтайского государственного медицинского университета). - Барнаул, 2003. - С. 12 (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов и др.).

25. Роль гуморальных факторов в регуляции эритропоэза пр цитостатической миелосупрессии // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2003. - Т. 135. - № 6. - С. 642-646 (соавторы A.M. Дыгай, В.В. Жданов, Е.В Симанина и др.).

26. Влияние Г-КСФ на кинетику клеток-предшественников гранулоци топоэза // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные экологич. и клинич. аспекты (Материалы Всероссийской конференции). - Но восибирск, 2004. - С. 21-22 (соавторы В.В. Жданов, В.Е. Гольдберг, Е.В. Сима нина и др.).

27. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора н кинетику гемопоэтических предшественников регенерирующего костног мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - № 1. - С. 56 59 (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов и др.).

28. Механизмы действия Г-КСФ на гемопоэз // Бюлл. эксперим. биоло гии и медицины. - 2005. - приложение № 1. - С. 5-13 (соавторы Е.Д. Гольдберг

A.M. Дыгай, В .В. Жданов и др.).

29. Функционирование стволовых кроветворных клеток в условия цитостатической миелосупрессии и при применении гемостимуляторов / Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - № 4. - С. 230-23 (соавторы В.В. Жданов, Е.В. Удут, Т.Ю. Хричкова и др.).

30. Механизмы регуляции системы крови под влияние гемостимуляторов на фоне цитостатической миелосупрессии // Сибирски онкологический журнал. - 2005. - № 3. - С.39-43. (соавторы В.В. Жданов, Е.В

Симанина, Е.В. Удут и др.)

31. Механизмы действия стимуляторов гранулоцитопоэза в условия

цитостатической миелосупрессии // Эксперим. и клин, фармакол. - 2006. -69. -№ 2. - С. 44-47 (соавторы В.В. Жданов, Е.В. Удут, Е.В Симанина и др.).

32. Чувствительность различных классов гемопоэтических предшест венников к действию циклофосфана // Вестник уральской медицинской акаде мической науки. - 2006. - № 3-2 (15). - С. 37-38 .

33. Механизмы регуляции кроветворения при моделировании цитоста тической миелосупрессии карбоплатином // Бюлл. эксперим. биологии и меди

ны. - 2007. - № 5. - С. 515-518 (соавторы A.M. Дыгай, В.В. Жданов, Г.Н. озьков и др.).

34. Механизмы регуляции кроветворения при моделировании тостатической миелосупрессии карбоплатином // Бюлл. эксперим. биологии медицины. - 2007. - Т. 143. - № 5. - С. 515-518 (соавторы Е.Д. Гольдберг, .М. Дыгай, В.В. Жданов и др.).

35. Создание экспериментальных моделей и изучение на их основе генераторных возможностей стволовых клеток // Бюлл. эксперим. биологии и едицины. - 2007. - Приложение № 1. - С. 5-13 (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M.

ыгай, В.В. Жданов и др.).

36. Фармакологическая регуляция стволовых клеток // сихофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7. - С. 1662-1663 оавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов и др.).

37. Фармакологическая стимуляция регенераторных возможностей воловых клеток // Создание новых лекарственных препаратов: Материалы нференции. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2007. - С. 5-7 (соавторы Е.Д. льдберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов и др.).

38. Эффективность филграстима в лечении цитостатических миелосу-ессий у больных раком молочной железы // Сибирский онкологический жур-

[. - 2008. - Т. 25. - № 1. - С. 5-11 (соавторы В.Е. Гольдберг, В.В. Жданов,

Ю. Хричкова и др.).

39. Механизмы стимуляции гранулоцитопоэза под действием нейпоге-в условиях химиотерапии у больных раком молочной железы // Бюлл. экспе-м. биологии и медицины. - 2008. - Т. 145. - № 4. - С. 449-453 (соавторы Т.Ю.

ричкова, В.Е. Гольдберг, В.В.Жданов и др.).

40. Теория регуляции кроветворения и создание на ее основе новых епаратов для терапии патологии системы крови // Бюлл. эксперим. биологии медицины. - 2008. - Приложение № 2. - С. 6-13 (соавторы Е.Д. Гольдберг,

.М. Дыгай, В.В. Жданов и др.).

41. Механизмы гемостимулирующих эффектов гранулоцитарного КСФ пантогематогена в условиях цитостатической миелосупрессии // Бюл. экспе-м. биол. и медицины. - 2010. - Т. 150. - № 12. - С. 645-649. (соавторы В.В. данов, Г.Н. Зюзьков, Е.В. Симанина и др.).

42. Теоретические основы дифференцированного применения гемо-имуляторов при анемиях // Вестник уральской медицинской академической уки. - 2010. - Т.32. - № 4. - С. 101-103. (соавторы Е.В. Удут, Г.Н. Зюзьков,

.В. Чайковский и др.).

43. The compared investigation of hemopoiesis stimulating activity of pan-gematogen (PG) and recombinant granulocyte-colony stimulating factor // Abstr. of e 1st International Symposium on Antler Science and Product Technology, Banff, anada, 2000. - P.42 (with Dygai A.M., Zhdanov V.V., Pozhen'ko N.S. et al.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГАГ - гликозаминогликаны

Г-ГО - гранулоцитарный гемопоэтический островок

ГИМ - гемопоэзиндуцирующее микроокружение

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГО - гемопоэтический островок

ЗНГ - зрелые нейтрофильные гранулоциты

ИД-КОЕ-ГМ - интенсивность дифферениировки КОЕ-ГМ

ИП - интегральный показатель

КлОЕ-ГМ - кластерообразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная

КлОЕ-Э - кластерообразующая единица эритроидная

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроидная

КСАад - колониестимулирующая активность (в супернатантах адгези-

рующих миелокариоцитов)

КСАнеад - колониестимулирующая активность (в супернатантах неадге-

зирующих миелокариоцитов)

КС Асы в - колониестимулирующая активность (в сыворотке крови)

ЛИМ - лимфоциты

М(-)ГО - макрофагнегативный гемопоэтический островок

МОН - моноциты

МПД - максимально переносимая доза

ННГ - незрелые нейтрофильные гранулоциты

ОКК - общее количество миелокариоцитов

ОКЛ - общее количество лейкоцитов

ПГ - пантогематоген

СНГ - сегментоядерный нейтрофильный гранулоцит

цф - циклофосфан

ЭГ-ГО - эритроидно-гранулоцитарный гемопоэтический островок

5-ФУ - 5-фторурацил

Б-КОЕ-ГМ - КОЕ-ГМ в Я-фазе клеточного цикла

Подписано к печати 05.12.2011. Тираж 100 экз. Кол-ео стр. 38. Заказ №56-11 Бумага офсетная. Формат А-5. Печать RISO Отпечатано в типографии ООО «РауШ мбх» Лицензия Серия ПД № 12-0092 от 03.05.2001г. 634034, г. Томск, ул. Усова 7, ком. 046 тел. (3822) 56-44-54

Актуальность. Как известно, токсическое действие противоопухолевых препаратов на гемопоэз является наиболее частым побочным эффектом, возникающим при лечении больных злокачественными новообразованиями. В большинстве случаев глубокая миелодепрессия проявляется в ранние сроки развитием в периферической крови лейкопении, затем тромбоцитопении и в последнюю очередь - анемии. Многочисленные исследования доказывают, что индуцированная химиотерапией нейтропения - распространённый фактор риска развития тяжелых инфекционных осложнений, которые являются частыми причинами смерти онкологических больных [236, 239, 362, 488, 490, 599, 6291. Несмотря на современное лечение, продолжают погибать от 3 до 10% пациентов с фебрильной нейтропенией. Особенно следует учитывать, что в их число входят педиатрические пациенты с гематологическими злокачественными заболеваниями, а также потенциально излечимые больные [394, 434, 469]. В период нейтропении источником инфекции становится эндогенная и экзогенная флора, резко возрастает роль внутрибольничной инфекции [498, 504, 599]. К факторам, усиливающим риск развития инфекции, относятся глубина и длительность нейтропении, иммуносупрессия, изменения микрофлоры.

В связи с этим, изыскание новых способов профилактики и лечения нейтропений, возникающих при проведении противоопухолевой терапии злокачественных заболеваний, приобретает все большее значение.

Весьма перспективной в этом направлении является разработка патогенетически обоснованных методов коррекции патологии системы крови, основанных на принципе подражания естественным регуляторным системам организма [60, 106]. Согласно современным представлениям о механизмах регуляции кроветворения, решающая роль в поддержании адекватного плацдарма гемопоэза принадлежит гемопоэзиндуцирующиму микроокружению. При этом элементы микроокружения определяют пролиферативный и дифференцировочный статус кроветворных клеток-предшественников посредством продукции гуморальных регуляторов (цитокинов) и межклеточных взаимодействий (в частности, комплекс гликозаминогликанов и экстра-целлюлярных белков обеспечивает концентрацию гемопоэтических ростовых факторов и модуляцию их функции). Кроме того, пусковым звеном, определяющим адаптивный ответ кроветворной ткани, являются центральные нейроэндокринные механизмы, реализующие свое влияние посредством универсальных стресс-реализующих (вегетативной, гипофизадреналовой) и стресс-лимитирующих систем (гамкергической и др.) [32, 55, 62, 65,12].

Учитывая центральные и локальные механизмы регуляции кроветворения, представляется целесообразным подход к коррекции возникающих нарушений в системе крови, заключающийся в модуляции функций гемопоэ-зиндуцирующего микроокружения (ГИМ), центральных нейроэндокринных механизмов регуляции кроветворения и изменении уровней цитокинов путем введения их извне. С патогенетических позиций наиболее перспективными в этом направлении могут быть препараты на основе производных гликозаминогликанов (ГАГ), рекомбинантных форм цитокинов (колониестимулирую-щие факторы), а также препараты с ноотропным типом действия. Считается, что различные типы ГАГ тесно связаны с тем или иным ростком кроветворения. Кроме того, показано, что ГАГ являются составной частью клеточной мембраны, входят в состав гемопоэтинов, основного вещества соединительной ткани костного мозга и играют определенную роль в процессах пролиферации и дифференцировки клеток гемопоэтической ткани [139, 199, 290, 369, 428, 447]. Все это свидетельствует о возможном использовании препаратов на основе ГАГ для компенсации повреждений в системе крови при экстремальных воздействиях. Многие отечественные и зарубежные авторы указывают на способность препаратов на основе рекомбинантных форм цитокинов, в частности Г-КСФ, целенаправленно стимулировать процессы пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников гранулоцитопоэза, что позволило предложить их использование в качестве одного из методов рациональной терапии нейтропений [105, 224, 318, 330, 484, 533, 555, 5761. Кроме того, данные о влиянии нейроэндокринной системы на кроветворение свидетельствуют о возможности применения в гематологической практике ноотропных препаратов, способных оптимизировать течение самых разнообразных физиологических процессов, в том числе, процессов клеточной пролиферации и дифференцировки через центральную нервную систему [62, 67, 72].

Наблюдаемый в последнее время значительный рост частоты лейкопений различного генеза в клинической практике диктует необходимость разработки дифференцированных подходов к терапии нейтропений в зависимости от механизмов их развития, что обусловлено неодинаковыми повреждениями отдельных звеньев системы крови различными факторами. С другой стороны, предполагаемые и уже известные закономерности действия гемо-стимуляторов дают основания ожидать существенные различия в эффективности их применения в зависимости от патогенеза лейкопении. В то же время, многочисленные исследования показали, что удобными моделями для изучения механизмов развития миелосупрессивного синдрома и разработки методов стимуляции подавленного кроветворения являются цитостатические миелодепрессии.

Цель исследования. Изучить общие закономерности и особенности действия отдельных гемостимуляторов на гранулоцитарный росток кроветворения после введения различных по механизму действия цитостатических препаратов. Разработать патогенетически обоснованные подходы к коррекции лейкопений при цитостатических миелосупрессиях.

Задачи исследования:

1. Изучить механизмы восстановления гранулоцитопоэза, подавленного циклофосфаном либо 5-фторурацилом.

2. Оценить эффективность стимуляции процессов восстановления гранулоцитопоэза с помощью пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и О-глюкуроновой кислоты при миелосу-прессиях, вызванных различными цитостатиками.

3. Исследовать механизмы реализации стимулирующего действия пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и О-глюкуроновой кислоты в отношении гранулоцитопоэза, регенерирующего после введения циклофосфана либо 5-фторурацила.

4. Патогенетически обосновать дифференцированное применение ге-мостимуляторов в зависимости от механизмов, лежащих в основе изменений, развивающихся в кроветворной ткани при применении различных цитоста-тических препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Основной причиной различных темпов и характера восстановления подавленного цитостатическими агентами гранулоцитарного ростка кроветворения при введении пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и Б-глюкуроновой кислоты является неодинаковая чувствительность кроветворных элементов грануломоноцито-поэза и гемопоэзиндуцирующего микроокружения к действию цитостатиков и гемостимуляторов.

2. Более выраженный стимулирующий эффект изучаемых препаратов в отношении кроветворения, подавленного алкилирующим агентом, связан с менее токсичным действием циклофосфана на клеточные элементы кроветворного микроокружения по сравнению с антиметаболитом 5-фторурацилом.

3. В основе активирующего действия пантогематогена и глицирама на костномозговой гранулоцитопоэз в условиях цитостатических миелосупрес-сий лежит стимуляция продукции гуморальных регуляторов кроветворения клетками ГИМ и нормализация структурно-функциональной организации костного мозга. Вместе с тем, ускорение процессов регенерации кроветворной ткани под действием Г-КСФ и Б-глюкуроновой кислоты при назначении антибластомных препаратов связано с непосредственным влиянием на функциональную активность пула коммитированных прекурсоров.

4. В условиях введения алкилирующего агента наиболее предпочтительными корректорами нарушений, возникающих со стороны гранулоцитар-ного ростка, являются Г-КСФ и О-глюкуроновая кислота, в случае назначения фторпиримидинового антиметаболита значительная стимуляция подавленного гранулоцитопоэза наблюдается под влиянием пантогематогена и глицирама.

Научная новизна. В работе впервые расшифрован ряд тонких, специфичных для каждого из гемостимуляторов (пантогематоген, глицирам, Г-КСФ и Б-глюкуроновая кислота) механизмов активации гранулоцитарного ростка кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. При этом прослежен различный уровень изменений показателей, характеризующих механизмы регуляции гранулоцитопоэза, в ответ на введение исследуемых препаратов на фоне различных по механизму действия цитостатиков (циклофосфан, 5-фторурацил).

Гемостимулирующий эффект пантогематогена обусловлен возрастанием функциональной активности стромальных элементов ГИМ и накоплением в кроветворной ткани прекурсоров грануломоноцитопоэза. В основе активации регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения глицирамом лежит ускорение процессов дифференцировки (в условиях введения циклофосфана) либо пролиферации (на фоне 5-фторурацила) прекурсоров грануломоноцитопоэза вследствие повышения уровня гуморальных регуляторов кроветворения (КСА от адгезирующих миелокариоцитов).

Гемостимулирующая активность Г-КСФ и Б-глюкуроновой кислоты связана с непосредственным их эффектом в отношении кроветворных клеток-предшественников, а именно, повышением их функциональной активности. Г-КСФ ускорял выход гранулоцитомакрофагальных прекурсоров в диф-ференцировку либо увеличивал их пролиферативную активность, в том числе, благодаря повышению секреторной активности неприлипающих миелокариоцитов. Б-глюкуроновая кислота в условиях введения циклофосфана ускоряла дифференцировку гранулоцитомакрофагальных клеток-предшественников за счет быстрой нормализации структурно-функциональной организации костного мозга. При миелосупрессии, вызванной 5-фторурацилом, Б-глюкуроновая кислота способствовала активации деления прекурсоров грануломоноцитопоэза, что связано с увеличением концентрации гуморальных регуляторов гемопоэза в сыворотке крови.

Впервые дана интегральная оценка гемостимулирующему эффекту исследуемых препаратов (пантогематоген, глицирам, Г-КСФ и Б-глюкуроновая кислота) в отношении гранулоцитопоэза, подавленного циклофосфаном либо 5-фторурацилом, с определением корреляционных взаимосвязей параметров.

Патогенетически обоснована эффективность применения Г-КСФ и Э-глюкуроновой кислоты при моделировании цитостатической болезни алки-лирующим агентом, пантогематогена и глицирама - в условиях введения фторпиримидинового антиметаболита.

В работе впервые в сравнительном аспекте изучен гемостимулирую-щий эффект пантогематогена, глицирама, гранулоцитарного колониестиму-лирующего фактора и Э-глюкуроновой кислоты при миелосупрессиях, вызванных различными цитостатическими препаратами. Установлено, что выраженность эффектов гемостимуляторов на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной фторпиримидиновым антиметаболитом, в значительной степени уступает таковой при назначении циклофосфана, что связано с более глубокими деструктивными изменениями клеточных элементов гемо-поэзиндуцирующего микроокружения, вызванными антиметаболитом.

Практическое значение работы. Исследования, выполненные на моделях цитостатических миелосупрессий, обусловленных введением различных по механизмам действия препаратов, позволили разработать патогенетически обоснованные методы коррекции лейкопений, вызванных противоопухолевыми агентами. Детальное изучение механизмов регуляции кроветворения и действия на гемопоэз биологически активных веществ различной природы позволило предложить методологию применения гемостимуляторов для лечения лейкопений различного генеза.

Изданы «Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (МЗ РФ, Москва, 2002).

В настоящее время разрешены к клиническому применению и производству Министерством Здравоохранения Российской Федерации пантогема-тоген сухой (ОАО «Синтез», Курган), нейтростим (ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск), глицирам (ООО ФК «Здоровье», Харьков).

Получены патенты: РФ № 2088249 от 27.08.1997 г. на изобретение "Гемостимулятор", РФ № 2182007 от 10.06.2002 г. на "Средство, стимулирующее грануломоноцитопоэз при гипопластических состояниях кроветворения", РФ № 2270022 от 20.02.2006 г. на "Способ получения кондиционной среды, обладающей колониестимулирующей активностью", РФ № 2332667 от 27.08.2008 г. на "Способ оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ", РФ № 2399664 от 20.09.2010 г. на "Способ определения продукции факторов хоминга стволовых клеток". Получена приоритетная справка по заявке № 2010141630 от 04.07.2011 г. "Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток".

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на VII, VIII, X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2000, 2001, 2003), на 1-м Международном симпозиуме по изучению и технологии производства продуктов пантового мараловодства (Канада, 2000), на 8-м минисимпозиуме по передовым научно-техническим технологиям (Япония, 2000), на конференциях молодых ученых СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск, 2000), на П-й объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (Новосибирск, 2002), на 2-м Съезде Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003), на 3-й международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2003), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002, 2005), на конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2005, 2006), на конференции «Актуальные проблемы фармакологии», посвященной 20-летию ГУ НИИФ ТНЦ СО РАМН (Томск, 2004), на III Съезде физиологов Урала (Екатеринбург, 2006), на Российской конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), на Российской конференции с международным участием «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы» (Екатеринбург, 2010), на Всероссийской конференции «Фармакологическая регуляция стволовых клеток» (Томск, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 43 печатные работы, из них 23 - в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 353 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 15 ри

Результаты исследования эффектов D-глюкуроновой кислоты в отношении кроветворных клеток in vitro свидетельствуют о том, что она обладает способностью к прямой стимуляции роста коммитированных предшественников грануломоноцитопоэза.

1 'У

1.3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выраженная миелотоксичность большинства известных противоопухолевых препаратов является основным лимитирующим фактором применения их в онкологической практике. Следует отметить, что токсическая миелоде-прессия проявляется в большинстве случаев в ранние сроки лейкопенией, затем тромбоцитопенией и только в последнюю очередь - анемией. В этой связи актуальным является поиск и разработка новых лекарственных средств, избирательно стимулирующих гранулоцитопоэз. При этом следует учитывать, что угнетение кроветворения при действии на организм различных ци-тостатических препаратов обусловлено не только непосредственным токсическим их влиянием на гемопоэтические клетки, но и дизрегуляцией гемопо-эза на разных уровнях организации контролирующих его систем.

В настоящее время все механизмы, контролирующие гемопоэз, можно разделить на «локальные» и «дистантные». Роль локальной регуляторной системы выполняет комплекс клеточных, экстрацеллюлярных и гуморальных факторов, расположенных в непосредственной близости от гемопоэтических элементов и получивших название гемопоэзиндуцирующее микроокружение. Дистантные механизмы реализуются через действие нейромедиаторных систем гипоталамуса, коры надпочечников и симпатико-адреналовой системы. При этом известно, что стрессреализующие гормоны осуществляют как прямое, так и опосредованное через элементы кроветворного микроокружения влияние на гемопоэтические клетки. Элементы ГИМ осуществляют контроль за процессами кроветворения, как через продуцируемые гуморальные факторы, так и благодаря прямым межклеточным контактам с кроветворными элементами.

В связи с этим представляется, что коррекцию возникающих в системе крови нарушений можно проводить за счет модуляции функции гемопоэзин-дуцирующего микроокружения, центральных нейроэндокринных механизмов регуляции кроветворения, либо посредством изменения уровней цитокинов путем введения их извне. Подтверждением этому служат литературные данные, указывающие на бесспорно важную роль ГАГ в регуляции процессов кроветворения, а также на способность ноотропных средств и препаратов, представляющих собой рекомбинантные формы цитокинов, стимулировать гемопоэз. Таким образом, представляется целесообразным использование ге-мостимуляторов различной природы для лечения цитостатических гемоде-прессий в зависимости от степени и характера повреждений отдельных ростков кроветворения, клеток кроветворного микроокружения и особенностей постцитостатической регенерации костного мозга.

В исследованиях, проведенных ранее в указанном направлении, гемо-стимулирующая активность, затрагивающая в первую очередь гранулоцитар-ный росток, была обнаружена у препаратов на основе производных гликоза-миногликанов (глицирам, Б-глюкуроновая кислота), рекомбинантных форм цитокинов (Г-КСФ), а также препаратов с ноотропным типом действия (пан-тогематоген). Принимая во внимание различные механизмы угнетения кроветворения под действием цитостатиков из разных фармакологических групп, логично предположить и неодинаковую эффективность гемостимуля-торов после цитостатического воздействия.

В связи с вышесказанным, вскрытие тонких механизмов участия потенциальных стимуляторов в регуляции гранулоцитопоэза при миелоингиби-рующих воздействиях, будет способствовать разработке патогенетически обоснованных методов коррекции гипопластических состояний кроветворения, в частности дифференцированного применения различных гемостиму-ляторов и их комбинаций в лечении цитостатических, лучевых и иного генеза миелосупрессий.

74

ГЛАВА 2

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материал исследования

Эксперименты проведены на 1340 мышах-самцах линии СВА/СаЬас в возрасте 2-2,5 месяцев, массой 18-20 г. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

До начала исследования экспериментальных животных выдерживали в течение недели на обычном пищевом режиме по 15-20 особей в пластиковых клетках. С целью исключения сезонных колебаний изучаемых показателей все эксперименты были проведены в осенне-зимний период.

Распределение животных по сериям экспериментов в соответствии с поставленными задачами, сроки забора материала для исследований в каждой серии представлено в таблице 1.