Автореферат и диссертация по медицине (14.01.03) на тему:Патогенетические особенности поражения периферического отдела слухового анализатора под воздействием цисплатина

Кудеева Яна Юрьевна

Патогенетические особенности поражения периферического отдела слухового анализатора под воздействием цисплатина (клинико-экспериментальное исследование).

14.01.03 - Болезни уха, горла и носа

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 О Ш 2015

005570072

Москва - 2015 г.

005570072

Работа выполнена на кафедре оториноларингологии лечебного факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова» Минздрава РФ

Научные руководители:

Крюков Андрей Иванович - Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой оториноларингологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздрава РФ.

Темпов Андреи Александрович - доктор медицинских наук, руководитель лаборатории клеточных и физико-химических медицинских технологий ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского» ДЗМ.

Официальные оппоненты:

Карнеева Ольга Витальевна - доктор медицинских наук, заместитель директора по научной работе ФГУ «Научно-клинический центр оториноларингологии ФМБА России».

Никифорова Галина Николаевна - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры болезней уха, горла и носа ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ.

Ведущая организация - ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится 02 июля 2015 г. в 13.00 ч на заседании диссертационного совета Д 850.003.01 в ГБУЗ «Научно-исследовательский клинический институт оториноларингологии им. Л.И. Свержевского» Департамента здравоохранения города Москвы, по адресу: 117152, Москва, Загородное шоссе, д. 18а, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБУЗ «Научно-исследовательский клинический институт оториноларингологии им. Л.И. Свержевского» Департамента здравоохранения города^Мос

Автореферат разослан « » 2015 года. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В мире более 450 млн. человек страдает нейросенсорной тугоухостью (HCT), что составляет 70 - 90% всей патологии кохлеовестибулярного анализатора (Базаров 1982г.). В последние годы, по данным мировой статистики число больных с HCT стабильно растет: с 2-3% в 70-е годы XX века до 8-12% к началу XXI века (Овчинников Ю.М., 1996г., Чистякова В.Р. 1999г., Willott J.F., 1998г.). В России и зарубежных странах имеется тенденция к омоложению заболевания, оно все чаще встречается у пациентов трудоспособного возраста (Кунельская H.J1. 2014г., Ланцов A.A. 1993г.). Зачастую снижение слуха приводит не только к снижению социальной активности, качества жизни и изменениям в эмоциональном и психическом статусе пациентов (Григорьев Г.Н. 1978г., Thomas A.J. 1982г.), но и к стойкой инвалидизации. В России насчитывается свыше 240 тыс. инвалидов по слуху (Байраков В.И. 2006г., Лунев В.П. 2007г.).

Причины возникновения HCT - разнообразны (чаще всего этиология -сосудистая или вирусная), и не всегда возможна их идентификация. Достаточно часто причиной развития HCT является ототоксическое воздействие лекарственных препаратов. Снижение слуха на фоне их приема ожидаемо, поэтому, имея информацию о факторах риска, вероятности развития, патогенезе, точке приложения побочного действия, возможно, создание оптимальных условий для защиты внутреннего уха. Эта особенность позволяет токсической HCT, вызванной приемом лекарственных препаратов, занять особое место в структуре HCT. Ототоксичность лекарственных препаратов достаточно распространена (Астахова A.B. 1997г., Гамов В.П. 1999г., Дьяконова И.Н. 1997г., Сагалович Б.М. 1990г.).

К ототоксическим препаратам относятся аминогликозиды, цитостатики, нестероидные противовоспалительные средства, петлевые диуретики и др. (Астахова A.B. 1997г., Афанасьева Р. Ф. 2005г., Бабияк В.И. 2002г, Гамов В.П. 1999г, Журавский С. Г 2003г., Ишанова Ю.С. 2012г., Пальчун В.Т. 1992г.,

3

Пахомова О.Г. 1987г., Стаховская О. А. 2002г.). К сожалению, среди лекарственных препаратов, обладающих ототоксическим эффектом, встречаются те, которые назначаются по жизненным показаниям, несмотря на наличие и выраженность побочных эффектов (Борисов В.И. 1997г., Стаховская О. А. 2002г.). К этой группе препаратов относят химиотерапевтические средства, цитостатики, которые применяются для лечения при злокачественных новообразованиях и позволяют нередко сохраняет пациентам жизнь. (Борисов В.И. 1997г., Давыдов М.И. 2014г., Кондратьев В.Б., 2000г., Сдвижков A.M. 2008г.). Золотым стандартом в лечении новобразований различной локализации является препарат платины - цис-дихлородиамминплатина, известный в клинической практике под названием «Цисплатин» (Борисов В.И. 1997г., Давыдов М.И. 2014г., Кондратьев В.Б. 2000г.,'Тюляндин С.А. 1993г., Стаховская O.A. 2002г., Сдвижков 2008г.). Распространенность и широта его применения ограничивается выраженными побочными действиями, в том числе - ототоксичностью.

Клиническими проявлениями поражения внутреннего уха под воздействием цисплатина являются снижение слуха по нейросенсорному типу и субъективный ушной шум. Распространенность данного явления вызывает дискуссию у современных авторов, как отечественных, так и зарубежных. Цифры, которые приводят различие исследователи, варьируют от 9 до 97% (Стаховская O.A. 2002г, Богомильский М. Р. 2001г., Иванов С.А. 2012г., Baum E.S. 1979г., Coradini Р.Р 2007г., Skinner R. 2004г.) Чаще всего поражение внутреннего уха сопровождается субъективным ушным шумом (от 2 до 36%)(Reddel R.R 1982г.), его характеристики - непостоянны, время его появления и продолжительность - различны. Тяжесть симптома снижения слуха варьирует от минимальной до тяжелой (Bertolini Р. 2004г., Roland P.S. 2004г.). И на вопрос - «в какой временной период следует ожидать снижения слуха» на данный момент нет однозначного ответа.

Выраженность разброса данных о клиническом проявлении цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости (НСТ) указывает на наличие комплекса факторов, влияющих на развитие этой патологии.

В настоящее время основными провоцирующими факторами развития симптомов цисплатин-индуцированной НСТ считают возраст пациента и суммарная доза препарата (Jongh F.E. 2003г., Li Y. 2004г.) Так, у детей и лиц пожилого возраста снижение слуха на фоне приема цисплатина - выше. Однако какой возраст детей и пожилых пациентов считать критическим? Данные разнятся: для детей - до 5 лет и до 21 года; для пожилых людей - старше 50 или 70 лет (Helson L. 1978г., Li Y. 2004г.). Наиболее доказанный фактор риска — это суммарная доза препарата (Bokemeyer С 1998г., Jongh F.E. 2003г., Li Y. 2004г.). Среди других факторов риска указываются наличие исходной НСТ, предшествующая лучевая терапия, железодефицитная анемия и др. (Chen W.C. 2006г., Bokemeyer С 1998г.).

Комплекс накопленных знаний не позволяет на настоящий момент четко спрогнозировать развитие цисплатиновой ототоксичности, определить ее выраженность и предсказать время ее проявления.

Неоднозначность клинических данных явилась предпосылкой создания экспериментальной модели для исследования изменений во внутреннем ухе на фоне приема цисплатина. Различными исследователями используются различные животные и варианты методик исследований. Основные объективные методы исследования слуховой функции, как у людей, так и у экспериментальных животных - это регистрация коротколатентных слуховых вызванных потенциалов (КСВП) и отоакустической эмиссии на частоте продукта искажения (ПИОАЭ) (Крюков А.И. 2011г., Ишанова Ю.И. 2012г., Левина Ю.В. 1999г., Пальчун 1999г., Рахманова И.В. 2014г., Кунельская Н.Л. 2006г.). Оптимальной моделью для изучения изменения слуха являются мыши линии BALB/C (Wimmer С 2004г.). Однако, статистические показатели нормальных критериев слуховой функции у мышей линии BALB/C и

закономерности снижения слуха под воздействием цисплатина по данным регистрации КСВП и ПИОАЭ на настоящий момент подробно не описаны.

Данные экспериментальных исследований по локализации повреждений внутреннего уха под воздействием цисплатина - неоднозначны. Некоторые исследования свидетельствуют о поражении наружных волосковых клеток, как при типичной HCT (Rybak L. 2009г.). Есть данные о повреждении внутреннего уха под воздействием препарата платины по типу аудиторной нейропатии, когда поражаются нейроны спирального ганглия (Wake M. 1995г.). К механизмам цитостатического действия цисплатина относят перекисное окисление мембран клеток, митохондриальную дисфункцию, повреждение целостности спирали ДНК клеток с образованием аддуктов (Sugiyama S. 1989г., Brady H.R. 1990г.). В настоящее время все большее внимание для понимания причин повреждения клеток уделяется процессу апоптоза. Развитие апоптоза происходит при снижение антапоптотической защиты в клетке, которая выражается в снижении антиапоптотических белков (семейство IAP белков, bcl-2 и др) и активации проапоптотических белков, таких как р53, Вах, AIF, эндонуклеаза G, цитохром С, каспаза-3,9 и др. (Gonzalez V.M. 2001г., Хубутия М.Ш. 2012г., Темнов A.A. 2012г.).

Все выше изложенное определило необходимость проведения настоящей работы, целью которой явилось усовершенствование методов профилактики развития цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости на основе выявления механизмов патологического действия цитостатиков на сенсоневральные структуры лабиринта.

Задачи исследования

1. Создать экспериментальную модель цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости и комплексно оценить состояние слуховой функции у животных до и после использования препарата платины.

2. Исследовать механизмы действия цисплатина на клетки Кортиева органа, сосудистой полоски и спирального ганглия в эксперименте.

3. Оценить частоту возникновения, степень и характер нарушения слуховой функции у пациентов, получающих цисплатин.

4. Выявить факторы, влияющие на нарушение слуховой функции у пациентов, пролеченных цисплатином, и разработать критерии для прогнозирования риска снижения слуха у этого контингента больных.

Научная новизна

Впервые выявлена взаимосвязь механизмов повреждения сенсоневральных структур слухового анализатора (апоптоз) при токсическом воздействии цисплатина с нарушением слуховой функции у экспериментальных животных, в виде отсутствия регистрации ответа по данным отоакустической эмиссии на частоте продукта искажения и повышения порогов слуха по данным коротколатентных слуховых вызванных потенциалов.

Впервые выявлены последовательные изменения слуховой функции у пациентов с различной локализацией злокачественных новообразований, принимающих цисплатин, и выявлены комбинации факторов риска снижения слуха, на основании которых разработана шкала прогноза повреждения внутреннего уха у этого контингента больных.

Практическая значимость исследования

Разработанная шкала для прогнозирования вероятности снижения слуха под действием цисплатина, включающая возраст, суммарную дозу цисплатина, хронические заболевания, а так же комплекс аудиологических исследований будет способствовать профилактике развития цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости и может быть использован оториноларингологами и онкологами, как в стационаре, так и в амбулаторной практике.

Внедрение результатов в практику

Материалы научно-практической работы внедрены в практическую работу ГБУЗ «НИКИО им. Л.И. Свержевского» ДЗМ, химиотерапевтического отделения ГБУЗ «Онкологический клинический онкодиспансер № 1 ДЗМ.

Полученные результаты используются в педагогической работе кафедры

оториноларингологии лечебного факультета ГБОУ ВПО «Российский

7

национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.

Апробация диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены: на XI, XII, XIII Российских конгрессах оториноларингологов «Наука и практика в оториноларингологии» (Москва, 2012, 2013, 2014 гг.), на XI Научно-практической конференции «Фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии» (Москва, 2013г.), на VIII Международной Пироговской конференции студентов и молодых учёных (Москва, 2013 г.), на 62-ой научно-практической конференции «Молодые ученые — российской оториноларингологии» (Санкт-Петербург, 2015г.).

Апробация диссертации прошла на совместной научно-практической конференции сотрудников кафедры оториноларингологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ, научно-исследовательской лаборатории «Патологии JIOP-органов», ГБУЗ «НИКИО им. Л.И. Свержевского» ДЗМ 10 апреля 2015 года, протокол заседания №9.

Публикации материалов исследования.

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 121 странице .машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, который содержит 135 наименований: из них 44 -отечественных и 91 -зарубежных источников, иллюстрирована 31 рисунками и 14 таблицами.

Положения, выносимые на защиту.

1. Однократное введение цисплатина в дозировке 12 мг/кг интраперитониально мышам линии BALB/C вызывает стойкое снижение слуха, которое наиболее четко регистрируется на 30 сутки после введения препарата.

2. Цисплатин приводит к запуску механизма апоптоза в клетках спирального ганглия, сосудистой полоски и наружных волосковых клетках.

3. Риск развития цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости зависит от возраста, дозировки, наличия предшествующего шумового фактора и соматического состояния пациента, и может меняться в зависимости от комбинации факторов.

Содержание работы.

В соответствии с целями и задачами исследования вся работа была выполнена два этапа: экспериментальный и клинический.

Экспериментальный этап работы.

Материалы и методы исследования.

Условия содержания и все манипуляции на экспериментальных животных, в рамках экспериментального исследования, проведены в соответствии с требованиями к работе с экспериментальными животными (Приказ МЗ СССР №775 от 12.08.1987, федеральный закон « О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997г., Приказ МЗ РФ от 19.0б.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики»).

В экспериментальном исследовании участвовали 45 мышей линии BALB/C без признаков соматической патологии и воспаления среднего уха при отоскопии в возрасте 2-6 мес., весом 21-26г. Средний возраст животных составил 3,7мес.±2,1. Животным проводили объективные методы исследования слуха, включающие в себя регистрацию ПИОАЭ и КСВП, для формирования нормативов линии мышей BALB/C.

Регистрацию отоакустической эмиссии проводили на приборе для регистрации ПИОАЭ ILO 88/92 (Otodinamics ltd, Великобритания). В наружный слуховой проход устанавливали акустический зонд. Расположение акустического зонда контролировали специальным графиком на экране прибора. Длительность исследования составляла 5-7 минут. Использовали

метод постепенного срезания постороннего шума и артефактов, присутствующих в момент исследования. Полученные данные отображались в виде графика - DP граммы, зависимости амплитуды ответа на исследуемых частотах, которая характеризовала функциональность НВК. Положительный ответ НВК на подаваемый частотный стимул считали при регистрации амплитуды ответа свыше 4 дБ над порогом шума.

Регистрацию КСВП проводили в звукоизолированном помещении, защищенным от электрических помех, на электромиографе фирмы Viking Quest (США). При исследовании КСВП места под электроды тщательно выбривали, протирали спиртом для улучшения контакта. Положительный электрод располагали на вертексе, отрицательный - в заушной области, а заземляющий электрод устанавливался в области основания хвоста. Качество установки датчиков контролировали значениями импеданса, которые не превышали 10 Ом. Стимуляцию проводили короткими широкополосными акустическими щелчками интенсивностью с 90 дБ до 10 дБ с интервалом в 10 дБ. Оценивали результат после 1000 усреднений. Результат исследования представляет собой комплекс пяти пиков, которые оценивали по амплитуде, латентности, времени межпиковых интервалов и порогам регистрации.

После создания нормативной базы значений все животные были разделены на 2 группы: контрольная и опытпая.

I группа, контрольная - включала в себя 15 интактных, отологически здоровых животных (30 ушей).

II группа, опытная - включала в себя 30 животных (60 ушей), которые получали ототоксический препарат цисплатин интраперитониально в дозе 12 мг/кг однократно. Данная дозировка была выбрана как ЛД5030, т.е. 50% выживаемость в течение 30 дней.

После введения" препаратов животным П-ой группы проводили повторные исследования слуха методами ПИОАЭ (на 2,5,7, 14 и 30 сутки) и КСВП (на 30 сутки).

В качестве общей анестезии во всех исследованиях использовали комбинацию препаратов Золетил в дозировке 4-8 мг/100г и Ксила в дозировке 2-4 мг/кг в/м.

На 30 сутки животные 1-ой и И-ой группы в глубоком наркозе были выведены из эксперимента по всем правилам работы с животными для проведения морфологического исследования внутреннего уха.

Гистологическое и гистоиммунохимическое исследование проводили на кафедре патологической анатомии лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Гистологическую оценку препаратов внутреннего уха проводили на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 3-4 мкм по стандартной методике с использованием готовых к употреблению поликлональных кроличьих антител к В ах (проапоптотический белок) (Spring Bioscience) и моноклональных мышиных антител к bcl-2 (клон 124) (антиапоптотический белок) (Dako). Оценку экспрессии оценивали полуколичественным методом по степени интенсивности окрашивания.

Клинический этап работы.

Общая характеристика больных.

Было проведено обследование 117 пациентов, проходящих первый курс химиотерапии, включающий цисплатин, по поводу новообразований различной локализации, без патологии среднего и наружного уха. Химиотерапия состояла из комбинации двух цитостатиков, одним из которых у обследованных нами больных всегда являлся цисплатин. Курс химиотерапии включал однократное внутривенное капельное введение цисплатина и неоднократное парентеральное введение второго цитостатического препарата (в течение 3-5 дней в зависимости от вида препарата). Повторный курс лечения проводили после месячного перерыва.

Анамнестически и по данным истории болезни мы проводили оценку факторов, которые могут влиять на слуховую функцию. Мы учитывали следующие критерии: возраст, пол и суммарную дозу цисплатина, локализацию новообразований, исходный уровень слуховой функции, варианты комбинации со вторым химиопрепратом, сопутствующие заболевания (заболевания сердечно-сосудистой системы, дыхательной системы, эндокринной системы), наличие предшествующей химиотерапии препаратами других групп, лучевой терапии и хирургического лечения, длительное воздействие шумового фактора, комбинацию препаратов химиотерапии. Все изучаемые факторы мы распределили на две группы: неотъемлемые и вариабельные. К неотъемлемым факторам мы отнесли: возраст, пол, локализацию новообразований, исходный уровень слуховой функции, суммарную дозу цисплатина и комбинацию химиопрепаратов. Каждый данный фактор может иметь разные показатели, но неизменно присутствует у пациентов. К вариабельным мы отнесли факторы, наличие которых возможно, но не обязательно, такие как сопутствующие заболевания, предыдущий курс лучевой терапии и химиотерапии, не содержащий цисплатин, оперативное вмешательство.

Нами было обследовано 117 пациентов, среди них 44 женщины (38%) и 73 мужчины (62%) в возрасте от 31 до 69 лет, средний возраст которых составил 55 лет. Локализация новообразований у пациентов распределилась следующим образом: рак ротоглотки - 18 человек (15%), рак гортани- 14 (12%), рак легких - 38 (32%), рак верхнечелюстных пазух - 15 (13%), рак пищевода - 2 (2%), рак матки и придатков - 25 (22%), не выявленная локализация рака - 5 человек (4%). Диапазон курсов лечения составил от 2 до 6. Средняя суммарная доза цисплатина составила 315 мг. Сопутствующая патология пациентов и варианты предшествующего лечения химиотерапии представлены в таблице № 1

Таблица №1. Сопутствующая патология пациентов и варианты предшествующего лечения цисплатином

ССС Энд.пат ДН Шум ХТ лт Оп. Вмеш.

Число пациентов 54 27 24 33 36 12 30

Условные обознвчения: ССС - патология сердечно-сосудистой системы; энд пат. — патология эндокринной системы; ДН — патология дыхательной системы с дыхательной недостаточностью; Шум - наличие высокой шумовой нагрузке в анамнезе; ХТ - предшествующий курс химиотерапии, не содержащий цисплатин; J1T - лучевая терапия; Оп. Вмеш. - наличие оперативного вмешательства перед курсом химиотерапии содержащий цисплатин.

Методы исследования Всем пациентам было произведено стандартное клиническое обследование: выяснение жалоб, сбор анамнеза заболевания и жизни и анализ данных по истории болезни. Всем пациентам проводили осмотр J10P-органов. Исследование функции слухового анализатора проводили в динамике: до приема цисплатина и после каждого последующего курса химиотерапии. Для исключения патологии среднего уха проводили исследование методом акустической импедансометрии, включающий стандартную тимпанометрию и рефлексометрию на 4 частотах 500, 1000, 2000, 4000 Гц, на приборе МА1СО 24 (Германия). Далее в звукоизолированной камере всем больным проводили тональную пороговую аудиометрию с помощью аудиометра MAICO 53 (Германия), калиброванного по стандарту FNSI-1989, в диапазоне частот от Г25 до 16000 Гц по воздушной проводимости и от 250 до 6000 Гц - по костной проводимости.

Статистические методы обработки материала

Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной (математической) статистики с применением программы «Statgraphics Centurion XV». Для каждого исследуемого признака определяли показатель среднего арифметического (М) и стандартной ошибки среднего арифметического (т). При условии соответствия нормальности распределения

достоверность полученных различий сопоставляемых величин оценивали с использованием t - критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при /><0,05. Статистический анализ проводился с использованием статистических непараметрических критериев, не зависящих от характера распределения -точного критерия Фишера и критерия хи-квадрат, позволяющий проводить точное сравнение и выявить достоверные критерии групп дынных. Построение графиков осуществляли в программе «Microsoft Ecxel 2010».

Результаты исследования Результаты экспериментального этапа исследования По данным ПИОАЭ и КСВП была составлена нормативные показатели слуховой функции мышей линии BALB/C. Отоакустический ответ был зарегистрирован у всех животных. По данным ПИОАЭ во всех случаях соотношение сигнал/шум превышало 4 дБ. В 39 % (35 ушей) случаев получена горизонтальная форма кривой (форма плато), в 61% случаев (55 ушей) - восходящий. Среднее значение амплитуды ответа на частотах представлено в таблице №2

Таблица №2 Среднее значение соотношения сигнал/шум на частотах с 818 до 5200 Гц у мышей линии BALB/C

Среднее значение амплитуды ответа ПИОАЭ у мышей BALB/C N=45 (90ушен)

Частота fl (Гц) 818 1038 1306 1636 2063 2600 3284 4126 5200

Среднее значение амплитуды ответа (дБ) (М+ш) 4,49+2,33 8,46+2,04 15,63+1,04 15,8+2,14 17,8+2,13 17,73+2,02 19.28+2,03 19,32+4.03 13,22+5,03

При оценке порогов слышимости методом КСВП у мышей было выявлено появление первых пиков ггри интенсивности, в среднем, 32,47+2,02 дБ. Анализируя результаты исследования, было выявлено, что I волна регистрируется в 100% случаев, возникает на 1,86+0,03 и имеет максимально

высокую амплитуду и стабильную форму. V волна регистрируются в 70% исследований, четко дифференцируются только при высокой интенсивности стимула. Следует отметить увеличение амплитуды пиков, особенно I и III по отношению к таковым у человека.

По нашим данным под воздействием цисплатина снижение амплитуды ответа ПИАОЭ появилось на 7 сутки и достигло минимальных значений на 30 сутки. Следует отметить, что на 30 сутки ПИОАЭ в 77% случаев (23 ушей) зарегистрировано не было (полученный ответ не превышал 4 дБ ни на одной частоте) (Рис. №1).

Рис. №1 Изменение слуховой функции по данным ПИОАЭ во времени у мышей линии BALB/C при воздействие цисплатина

—норма -2 cyTKf -Ъ CyTW

-14сутни »30 сутки

818 1038 1306 1636 2063 2600 3284 4126 5200

По данным исследования КСВП на 30 сутки после инъекции цисплатина во всех случаях произошло достоверное повышение порогов слуха и увеличение значений латентности волн (р<0,05). Среднее значение порогов слуха у мышей, пролеченных цисплатином, составило 64,92+0,06 дБ.

Регистрация I пика была так же зафиксирована в 100 % случаев, однако его латентность достоверно увеличилась и составила 1,94+0,01 мс. Процент встречаемости остальных пиков (И, III, IV и V волны) уменьшился. II пик регистрировался в 73% случаев. Регистрация III пика снизилась до 58%. IV пик, самый редкий, выявлялся в 35 % случаев. V пик, второй по

распространенности в данной группе, дифференцировался в 85% исследований.

Средние значения латентности пиков и межпиковых интервалов по сравнению с выявленной нормой достоверно увеличилось, что представлено в таблице №3

Таблица№3 Среднее значение латентности волн у здоровых мышей и мышей II группы.

Исследуемые (мс) Среднее значение латентности волн

I II III IV V 1-111 Ш-У 1-У

Здоровые мыши (90 ушей) 1,86+0,03 2,57+0,25 3,23+0,23 4,48+0.48 5.77+0,47 1,45+0,01 2.57+0.01 4,09+0,01

Мыши [I группы (30 ушей) 1.94±0,01 2,83±0.02 3.3б±0.02 4,6+0,04 5.87±0,02 1,51+0,01 2.65±0,02 4,12+0,02

При микроскопическом исследовании препаратов внутреннего уха, окрашенных гематоксилином и эозином, установлены изменения спирального ганглия, Кортиева органа и сосудистой полоски. В клетках спирального ганглия животных, подвергшихся действию цисплатина, визуализировали выраженную вакуолизацию цитоплазмы клеток, снижение базофильности ядер по сравнению с клетками интактного спирального ганглия (Рис. № 2). Подобные изменения прослеживаются и в клетках сосудистой полоски. Наблюдается увеличение объема наружных волосковых клеток, что обусловлено их отеком, а также снижение базофильности клеточных ядер (Рис. 3). При иммуногистохимическом исследовании в цитоплазме клеток сосудистой полоски у животных опытной группы выявлено повышение уровня экспрессии проапоптотического белка Ьах (Рис. 4). Одновременно у животных опытной группы отмечено снижение содержания Ьс1-2-протеина, принадлежащего семейству антиапоптотических

белков, в клетках Кортиева органа и сосудистой полоски, что характеризует возможность вступления клеток в апоптоз (Рис. 5 и 6).

Рис №2: Изменения в спиральном ганглии мышей, вызванные цисплатином.

Норма Цисплатин

Рис№3 Изменения в Кортиевом органе мышей, вызванные цисплатином.

Норма Цисплатин

Рис№4: Изменения в сосудистой полоске мышей, вызванные цисплатином. Иммуногистохимическое исследование с использованием антител к белку Ьах.

Рис№5: Изменения в Кортиевом органе мышей, вызванные цисплатином. Иммуногистохимическое исследование с использованием антител к белку Ьс1-2.

Норма » Цисплатин

¡Г

/ л

^ хЖИ

^^ V V

Рис№6: Изменения в сосудистой полоске мышей, вызванные цисплатином. Иммуногистохимическое исследование с использованием антител к белку Ьс1-2.

Норма

Результаты клинического этапа исследования

Результаты клинического исследования выявили достоверное снижение слуха у 33 пациентов. В связи с этим все пациенты были

разделены на 2 группы. 1-ю группу составили 33 пациента (28%) с высокочастотной (4-8 кГц) цисплатин-индуцированной HCT. Во 2-ю группу были включены 84 пациента (72%) без динамики слуховой функции на фоне приема цисплатина. Следует отметить, что наиболее уязвимым для воздействия цисплатина оказался расширенный частотный диапазон от 10 000 до 16 000 Гц. У пациентов 1-ой группы в 100 % случаев было зарегистрировано повышение порогов восприятия на частотах от 12 000 Гц до 16 000 Гц.

Анализ качественного состава химиотерапии двух групп показал, что Фторуроцил, как второй препарат химиотерапии чаще встречался у пациентов 2-ой группы (в 18 и 33% случаев, соответственно), тогда как Этапозит и Паклитаксел - в 45 и 30% случаев и в 36 и 26% случаев, соответственно. У больных 1-ой группы суммарная доза цисплатина составила 355 мг, а средний возраст - 58 лет, тогда как у больных 2-ой группы - 245 мг и 54 года.

Таким образом, оценка результатов по неотъемлемым факторам риска (изолированно по одному критерию) показала основную зависимость снижения слуха от возраста пациентов и суммарной дозы препарата. Так, пациенты в возрасте старше 60 лет, чаще страдали от токсического эффекта цисплатина. Он регистрировался в 41% случаев в этой возрастной группе. При кумулятивной дозе цислатина свыше 300 мг поражение внутреннего уха регистрировалось в 48% случаев. Наиболее опасная для слуховой функции химиотерапия в сочетании цисплатина с фторуроцилом и этапозидом, при которой развитие цисплатин-индуцированной HCT соответствует 33% и 38%. Сочетание цисплатина с паклитакселом привело к снижению слуха у 20% пациентов. У пациентов, принимающих вторым препаратом докситаксел, алимту, гемзар и циклофосфан, снижение слуха зарегистрировано не было. Другие исследуемые факторы, такие как гистологическая классификация опухоли (высокодифференцированная, малодифференцированная,

среднедифференцированная), пол, исходный уровень слуха пациентов, не

показали достоверной зависимости со снижением слуха. Рассматривая локализацию новообразований, можно сделать следующий вывод, что у пациентов с новообразованиями легких, матки и придатков наиболее часто развивалось снижение слуха (в 57 и 60% случаев, соответственно). Однако известно, что локализация новообразований коррелирует с суммарной дозой химиопрепартов, и при заболеваниях легких и матки с придатками суммарная доза цисплатина превышает 300 мг в 72% случаев.

Анализ вариабельных факторов показал, что у пациентов 1-ой группы, по сравнению с 2-ой группой, чаще встречалась патология сердечно-сосудистой системы (в 55% и 43% случаев соответственно) и дыхательной системы (в 27% и 14% случаев соответственно), наличие предшествующей линии химиотерапии, не содержащий цисплатин (в 36% и 18%). Так же у пациентов 1-ой группы, чаще чем у пациентов 2-ой группы регистрировали высокий процент избыточной шумовой нагрузки в анамнезе (в 45% и 21% случаев соответственно).

Нами было отмечено, что пациенты 1-ой группы чаще имели несколько сопутствующих заболеваний, нежели пациенты 2-ой группы. Так, комбинация из 5 различных вариабельных факторов встречалась только у пациентов 1-ой группы (10%), а из 4 факторов - в 19 и 10% случаев, соответственно, из 3 факторов - в 33% и 45% случаев соответственно, из 2 факторов - в 29 и 30% случаев, соответственно, 1 фактор - в 10 и 15% случаев, соответственно. Эти данные позволили предположить потенцирование ототоксического эффекта цисплатина воздействием нескольких факторов.

Так, комбинация патологии сердечно-сосудистой системы с кумулятивной дозой препарата платины свыше 300мг прогностически наименее благоприятна, при этом снижение слуха возникало в 72% случаев. Также достаточно высок риск развития цисплатин-индуцированной НСТ(58%) при комбинации суммарной дозы препарата выше 300 мг с предшествующей шумовой нагрузкой. Возраст пациентов старше 60 лет в сочетании с патологией

сердечно-сосудистой системой или предшествующей шумовой нагрузкой увеличивает процент снижения слуха до 30%.

Таким образом, нами была составлена таблица вероятности развития цисплатин-индуцированной НСТ в зависимости не только от единичного фактора, но и - от комбинации двух возможных факторов риска. На основании полученных данных была рассчитана и сформирована бальная шкала риска, по которой можно прогнозировать процент риска развития побочного эффекта препарата (Таблица №4).

Таблица №4 Бальная шкала прогноза развития цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости.

Параметры Баллы

сочетания с препаратом паклитаксел 3

сочетания с препаратом фторуроцил 4

Доза цисплатина 200-300 мг. 5

Возраст старше 60 лет 6

сочетания с препаратом этапозит 6

Другие хронические заболевания 8

Патология дыхательной системы 10

Химиотерапия в анамнезе 10

Патология Сердечно-сосудистной системы 12

шум 12

Доза цисплатина больше 300 мг 24

1. При сумме баллов меньше 50 - вероятность снижения слуха составляет менее 50%.

2. При сумме баллов от 50 до 75 - вероятность снижения слуха составляет 50-75%.

3. При сумме баллов более 75 - вероятность снижения более 75%.

выводы

1. Ототоксический эффект цисплатина может быть смоделирован у мышей линии ВАЬВ/С с помощью введения цисплатина в дозе 12 мг/кг однократно интраперитонеально, что подтверждает прогрессирующее снижение амплитуды ответа при регистрации отоакустической эмиссии на частоте продукта искажения на 7 сутки с полным его выпадением - на 30 сутки и повышение порогов слуха от 32,47дБ до 64,92дБ по данным регистрации коротколатентных слуховых вызванных потенциалов.

2. Цисплатин приводит к активации внутриклеточных процессов апоптоза и снижению антиапоптотической защиты в клетках сосудистой полоски, спирального ганглия и Кортиева органа, при этом цитотоксический эффект цисплатина имеет морфологическое подтверждение в 100% случаев.

3. Цисплатин-индуцированная двусторонняя высокочастотная (4-8 кГц) нейросенсорная тугоухость у взрослых встречается в 28% случаев, у которых повышение порогов слуха в сверхвысоком диапазоне частот (12 кГц-16кГц) регистрируется в 100% случаев.

4. Суммарная доза цисплатина свыше 300 мг, возраст старше 60 лет, предшествующая шумовая нагрузка являются основными факторами риска в развитии снижения слуха под воздействием цисплатина, которое потенцируется их сочетанием, а также - сопутствующей патологией сердечно-сосудистой и дыхательной систем.

Практические рекомендации:

1. Полученная экспериментальная модель нейросенсорной тугоухости у мышей линии ВАЬВ/С при однократном интраперитонеальном введение цисплатина в дозе 12 мг/кг может быть использована для поиска и изучения препаратов, защищающих структуры «внутреннего уха» от токсического воздействия препаратов платины.

2. Комплексный мониторинг слуховой функции пациентов с новообразованиями различной локализации, принимающих в качестве

химиотерапии цисплатин, необходимо проводить с помощью стандартной тонально-пороговой аудиометрии в том числе и в расширенном диапазоне частот, для определения наличия и степени ототоксичности.

3. Для прогнозирования риска развития нейросенсорной тугоухости при использовании иисплатина необходимо оценивать наличие сопутствующих заболеваний со стороны сердечно-сосудистой и дыхательной системы, а так же других факторов риска: возраст, суммарная доза иисплатина, наличие предшествующего шумового воздействия, основываясь на разработанной бальной шкале.

4. Пациентам, с высоким риском развития цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости (возраст - старше 60 лет, суммарная доза иисплатина - выше 300 мг, наличие заболеваний сердечно-сосудистой и дыхательной системы, наличие предшествующего шумового воздействия), при возможности может быть рекомендована химиотерапия, не содержащая цисплатин.

5. При невозможности избежать приема иисплатина, для оценки ототоксическиого эффекта у пациентов с высоким риском развития цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости рекомендовано проводить ежемесячное исследование динамики слуховой функции с применением тонально-пороговой аудиометрии в расширенном диапазоне частот.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ототоксическое действие цисплатина на кохлеарные структуры внутреннего уха в эксперименте. /Темнов A.A., Щеголев А.И., Левина Ю.В., Иванец И.В, Кудеева Я.Ю., Дубова Е.А., Вагабов A.B., Лебедев М.П.// Материалы XI Российского конгресса оториноларингологов. 2012г. С. 118-119.

2. Особенности гистологических изменений при токсической нейросенсорной тугоухости/ Кудеева Я.Ю., Левина Ю.В.,.Темнов А.А , Щеголев A.W.II Материалы Первой всероссийской научной конференции

молодых ученых медиков «инновационные технологии в медицине XXI века».2012г. С. 211-213.

3. Электрофизиологические особенности слуховой функции у мышей линии BALB\C./ Крюков А.И., Кунельская H.JL, Абрамов В.Ю., Темнов A.A., Левина Ю.В., Кудеева Я.Ю. Байбакова Е.В., Чугунова М.А.//Материалы XII Российского конгресса оториноларингологов. 2013г. С.72-73.

4. Патологическое действие цисплатина на внутреннее ухо./ Верулашвили Е.Л., Кудеева Я.Ю.,Темнов А.А, Щеголев А.И.// Материалы VIII Международная Пироговская конференция студентов и молодых учёных 2013г. С.122-123.

5. Анализ изменений внутреннего уха при цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости./ Крюков А.И., Кунельская Н.Л., Темнов A.A.,. Щеголев А.И,. Левина Ю.В., Кудеева Я.Ю., Дубова Е.А, Вагабов А.В// Материалы I Междисциплинарного конгресса по заболеваниям органов головы и шеи. 2013г. С. 86-87.

6. Цисплатин-индуцированная нейросенсорная тугоухость в эксперименте./ Крюков А.И., Кунельская Н.Л.,Абрамов В.А.,.Темнов А.А, Щеголев А.И., Левина Ю.В., Кудеева Я.Ю., Дубова Е.А.// XI Научно-практической конференции: фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии. 2013г С. 31-32.

7. Патогенетические особенности цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости. /Крюков А.И., Кунельская Н.Л.,Абрамов В.А.,.Темнов А.А, Щеголев А.И., Левина Ю.В., Кудеева Я.Ю., Дубова Е.А.// Материалы 5-го национального конгресса аудиологов 9-го международного симпозиума» современные проблемы физиологии и патологии слуха» 2013г. С. 163-165.

8. Ототоксическое воздействие циплатина на внутреннее ухо./ Крюков А.И., Кунельская Н.Л.,Абрамов В.А.,.Темнов А.И., Левина Ю.В., Кудеева Я.Ю.,

Чугунова М.А., Байбакова Е.В// Материалы III Петербуржского форума оториноларингологов России 2014г. С. 163-164.

9. Функция и морфология внутреннего уха под воздействием цисплатина./ Крюков А.И., Кунельская H.JL, Абрамов В.А., Темнов А.И., Щеголев А.И., Левина Ю.В., Кудеева Я.Ю., Байбакова Е.В., Чугунова М.А.// Материалы XII научно-практической конференции Фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии. 2014г. С. 22-23.

10. Физиологические особенности слуха у мышей./ Крюков А.И., Кунельская Н.Л.,Абрамов В.А.,.Темнов А.И., Левина Ю.В., Кудеева Я.Ю., Чугунова М.А., Байбакова Е.В // Проблемы медицины в современных условиях. 2014г.С. 51-56.

11. Изучение слуховой функции при экспериментальных исследованиях. / Крюков А.И., Кунельская Н.Л., Абрамов В.А.,.Темнов А.И., Левина Ю.В., Кудеева Я.Ю., Чугунова М.А., Байбакова Е.В // Folia otorhinolaryngologiae et pathologiae respiratoriae. 2014 №20 том 3 С. 39-41.

12. Поражение слуховой функции при моделировании цисплатин-индуцированной нейросенсорной тугоухости. / Крюков А.И., Кунельская Н.Л.,Абрамов В.А.,.Темнов А.И., Левина Ю.В., Кудеева Я.Ю., Чугунова М.А., Байбакова Е.В // Материалы XIII Российского конгресса оториноларингологов. «Наука и практика в оториноларингологии» 2014г. С. 76-77.

13.- Ототоксическое воздействие цисплатина на внутреннее ухоJ Крюков А.И., Кунельская Н.Л.,Абрамов В.А.,.Темнов А.И., Левина Ю.В., Кудеева Я.Ю., Чугунова М.А., Байбакова Е.В// Вестннк оториноларингологии 2015г. №1 Том 80 С. 21-25.

14. Токсическое паражение внутреннего уха под воздействием цисплатина. Экспериментальное исследование./ Кудеева Я.Ю., Байбакова Е.В., Чугунова М.А., Резакова Н.В.// Российская оториноларингология 2015г. №2 С. 43-47.

Подписано в печать 07.05.2015 г.

Усл.пл. — 1.5 Заказ №26295 Тираж: 100 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 vvvvw.chertez.ru