Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Комплексное исследование провоспалительных иммуноцитокинов и функционального состояния лимфоцитов у новорожденных детей в норме и при патологии

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ИММУНОЦИТОКИНОВ

И ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЛИМФОЦИТОВ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ УДК 616-05331; 612.648; 612.017.1; 612.112.94

ДЕГТЯРЕВА Марина Васильевна

14.00.09 - педиатрия 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1995

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор, академик АМН РФ В.А.Таболин;

Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент АЕН РФ Л.В.Ковальчук.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Г. А. Самсыгина;

доктор медицинских наук, профессор Д.В.Стефани.

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт педиатрии РАМН.

Защита диссертации состоится .^ЯЯ-.. 1995 г.

в " часов на заседании специализированного совета

N Д-084.14.02 Российского государственного медицинского университета по адресу: 117869, г.Москва, ул.Островитянова,1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан " Я.^^УиЯ- 1995 года.

Ученый секретарь специализированного ученого совета, д.м.н., профессор

М.А.Фадеева.

Актуальность проблемы.

В последние годы все более приоритетным становится изучение адаптационных процессов в раннем неонатальном периоде (Володин H.H., 1988; Самсыгина Г.А., 1990). Одной из наиболее важных и сложных проблем современной неонатологии остается исследование закономерностей становления иммунной системы и ее влияния на состояние здоровья новорожденного ребенка, внедрение в клиническую практику новых информативных и доступных методов оценки функционирования неонатальной иммунной системы (Шабалов Н.П., Шаба-лова H.H. , 1987; Торубарова Н. А., Самохвалова A.B., 1987; Самсы-гин С.А. и соавт., 1988; Вельтищев Ю.Е., 1989; Исаков Ю.Ф. и со-авт.. 1989; Вельтищева Е.Ю., 1993; Austgulen R. et al. 1993; Bessler H. étal, 1987, 1993; Вгу К., 1994; Buck С., 1994).

В настоящее время предложен новый, патогенетический подход к оценке состояния иммунной системы человека, учитывающий динамическое развитие иммунного ответа через стадии распознавания и презентации антигена, активации, пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток и через иммунорегуляторное звено (Ко-вальчукЛ.В., Чередеев А.Н.. 1990). Предложен набор тестов, наиболее полно характеризующих каждую из стадий (там же; Федосеева В.Н. и соавт.. 1993). Иммунорегуляторное воздействие реализуется на всех этапах иммунного ответа через изменение соотношения им-мунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов и посредством выработки целого ряда иммуноцитокинов, среди которых ванными считаются ин-терлейкин-1-бета (ИЛ-1), фактор некроза опухолей - альфа (ФНО) и интерлейкин-2 (ИЛ-2). ИЛ-1 и ФНО являются секреторными продуктами моноцитов, запускающими развитие иммунного ответа. Помимо функций медиаторов иммунитета, они обладают еще и мощным и многоплановым действием на ЦНС, гипоталамус, гипофиз, надпочечники, печень, органы гемопоэза, костную и соединительную ткань, индуцируют секрецию ряда гормонов, белков острой фазы воспаления, влияют на клеточный состав крови и содержание в ней некоторых ферментов и микроэлементов, оказывают антимикробный и тумороцид-ный эффект (Абрамов В.В., 1988; Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., 1991; Кетлинский С.А. и соавт., 1992; Dlnarello С.A. et al, 1981; Aggarval В. В., Pocsik Е., 1992;- Foxwell B.M.J, et al, 1992). ИЛ-2 является секреторным продуктом лимфоцитов, Т-клеточ-

ным фактором роста, влияет на активацию и пролиферацию Т- и B-лимфоцитов, цитотоксичность, секрецию иммуноглобулинов и имму-ноцитокинов (Ярилин A.A., 1987: Кондратенко И.В. и соавт., 1992; McNamara J., Komp D.M., 1989; Punnonen J., 1989; Andersson U. et al, 1990).

Несмотря на бурное развитие клинической иммунологии, в современной литературе отсутствуют комплексные работы, анализирующие состояние активационно-пролиферативного звена иммунологического реагирования у здоровых новорожденных детей и в случаях осложненного течения неонатального периода. Немногочисленные работы в зарубежной литературе посвящены исследованию отдельных элементов системы иммуноцитокинов у новорожденных детей.

В то же время применение иммуноферментного анализа уровня ИЛ-1 и ФНО в сыворотке крови новорожденных детей для оценки состояния иммунитета и прогнозирования течения раннего периода адаптации представляется перспективным. Полученные данные позволят уточнить некоторые звенья патогенеза постгипоксического поражения ЦНС у доношенных новорожденных детей.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось комплексное изучение ряда наиболее важных этапов (продукция, отвечаемость, циркуляция) в системе провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО), их влияния на функциональное состояние лимфоцитов у новорожденных детей и разработка на основании полученных результатов прогностических критериев патологии неонатального периода.

Задачи:

1. Разработать методические подходы и оценить продукцию цитокинов и отвечаемость на них пролиферацией в культуре In vitro, а также определить циркулирующий пул цитокинов в сыворотке пупо-винной крови у здоровых доношенных новорожденных детей и при осложненном течении раннего неонатального периода.

2. Изучить динамику экспрессии маркеров активации (CD 25, CD 71) интактными и активированными фитогемагглютинином (ФГА) In vitro лимфоцитами пуповинной крови у здоровых новорожденных де-

тей и при осложненном течении раннего неонатального периода.

3. Определить уровни спонтанной и стимулированной ФГА пролиферации лимфоцитов пуповинной крови, продукции ими ИЛ-2 у здоровых новорожденных детей и при осложненном течении раннего неонатального периода.

4. Охарактеризовать фенотип лимфоцитов пуповинной крови у здоровых новорожденных детей и у детей с осложненным течением раннего неонатального периода.

5. Исследовать динамику концентраций ИЛ-1 в сыворотках периферической крови у детей с перинатальным поражением ЦНС и при инфекционных заболеваниях в течение первого месяца жизни.

Научная новизна работы.

Впервые апробирован новый методический подход к оценке функционального состояния иммунной системы новорожденных детей, основанный на последовательном и комплексном исследовании актива-ционно-пролиферативного звена иммунологического реагирования (продукция моноцитами ИЛ-1, ФНО, динамика количества лимфоцитов, экспрессирующих на клеточной, поверхности маркеры активации (CD 25, CD 71), спонтанная и стимулированная ФГА пролиферация лимфоцитов, их отвечаемость на ИЛ-1 и ИЛ-2 и продукция ими ИЛ-2, фенотип лимфоцитов пуповинной крови).

Впервые определены количественные характеристики продукции цитокинов и отвечаемости на них в культуре in vitro, циркулирующего пула провоспалительных цитокинов. процент лимфоцитов пуповинной крови, экспрессирующих активационные молекулы, у здоровых доношенных новорожденных детей и изменения этих показателей при осложненном течении раннего периода адаптации.

Установлено, что среди определяемых параметров концентрации ИЛ-1 и ФНО являются высоко информативными, имеют прогностическое значение по отношению к возникновению перинатального поражения ЦНС и коррелируют с его тяжестью, что указывает на участие этих иммуноцитокинов в патогенезе перинатального поражения ЦНС.

Впервые установлено, что на первом месяце жизни динамика содержания ИЛ-1 в сыворотке периферической крови новорожденных детей с инфекционной и неинфекционной патологией различна и свидетельствует о максимальной выраженности воспалительных реакций

в различные сроки.

Практическая значимость.

Разработан и осуществлен новый методический подход к оценке иммунного статуса новорожденных детей, позволяющий на этапе родильного дома из каждой пробы пуповинной крови одновременно получить количественные параметры, последовательно отражающие состояние активационно-пролиферативного звена иммунологического реагирования. Полученные количественные показатели могут быть использованы в дальнейшей научно-исследовательской и практической работе в данном направлении.

Установлено, что результаты определения продукции ИЛ-1 и ФИО в культуре клеток in vitro сопоставимы с результатами определения концентраций данных цитокинов в сыворотках крови.

Определены более низкие концентрации ИЛ-1 и ФНО в сыворотках пуповинной крови большой группы здоровых доношенных новорожденных детей по сравнению со здоровыми взрослыми донорами.

Зарегистрировано повышение уровней ИЛ-1 и ФНО в сыворотках пуповинной крови новорожденных детей, у которых впоследствии в раннем неонатальном периоде были констатированы синдром повышения нервно-рефлекторной возбудимости или синдром угнетения ЦНС; при этом концентрации данных иммуноцитокинов были выше у детей с тяжелым перинатальным поражением ЦНС.

Результаты настоящей работы позволяют рекомендовать использование твердофазного иммуноферментного метода определения сывороточных концентраций ИЛ-1 и ФНО-альфа в родильных домах и отделениях патологии новорожденных детей с целью улучшения ранней диагностики и прогнозирования осложнений неонатального периода как информативного, экономичного, относительно простого в исполнении и не требующего больших объёмов крови, что будет способствовать уточнению терапевтической тактики.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на совместной научно-практической конференции кафедры детских болезней N 2 педиатрического факультета РГМУ и городских'врачей ДКБ N 13 имени Н.Ф.Филатова (сентябрь 1991 г.), на 1-ом Всероссийском съезде акушеров-гинекологов и - педиатров (Челябинск, 1992), на 1-ом съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), на

совместной конференции кафедры детских болезней N 2 педиатрического факультета, кафедры неонатологии факультета усовершенствования врачей и кафедры иммунологии медико-биологического факультета РГМУ (январь 1995 года).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на ... страницах машинописного текста и состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", 3 глав по результатам собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 3 рисунками, 25 таблицами и 14 графиками, выписками из истории родов и развития новорожденных, историй болезни. Библиография включает 299 источников, из которых 85 работ отечественных и 214 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Этапы исследования.

Основная часть исследований проведена за период с февраля 1990 года по март 1992 года.

I этап - исследование особенностей иммунорегуляторной роли моно-

цитов новорожденных детей посредством продукции ИЛ-1 и ФНО и их влияния на активацию, пролиферативный ответ лимфоцитов на митогены (ФГА) и экзогенные рекомбинант-ные ИЛ-1 и ИЛ-2 и продукцию лимфоцитами ИЛ-2, феноти-пирование лимфоцитов проводили на выделенных общепринятым методом по Воушп (1968) мононуклеарных клетках (моноцитах и лимфоцитах) (МНК) пуповинной крови 64 здоровых доношенных новорожденных детей в условиях физиологического родильного дома и сопоставляли с показателями 17 взрослых доноров.

II этап- с целью изучения возможности использования показателей

продукции моноцитами ИЛ-1 и ФНО в клинико-диагностической практике исследовали, возможно ли определять концентрации ИЛ-1 и ФНО в сыворотке пуповинной крови имму-ноферментным методом и будут ли они сопоставимы с уров-

нями продукции их выделенными моноцитами. Объектом исследования служили сыворотки пуповинной крови 84 доношенных новорожденных детей в аналогичных условиях.

I и II этапы работы проводились на базе родильного дома N3 Гагаринского района г.Москвы (гл. врач - А.М.Перцева) за период с февраля 1990 г. по май 1991 года.

III этап- с целью дальнейшего изучения возможной роли ИЛ-1 в патогенезе ряда осложнений неонатального периода исследовали сыворотки периферической крови 36 новорожденных детей в течение первого месяца жизни на базе отделения патологии новорожденных Детской Клинической Больницы N13 им.Н.Ф.Филатова (главный врач - к.м.н. Г.И.Лукин; зав. отделением - М.В.Кыштымов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Тщательно анализировался анамнез матери с учетом ее соматического статуса, акушерско-гинекологического анамнеза, течения данной беременности и родов, на основании чего все роды были оценены по шкале определения степени риска для состояния здоровья ребенка, разработанной Ф.Ариас (1989). Оценивали состояние ребенка в первые минуты и в первые сутки после рождения. При ежедневном осмотре новорожденных оценивалась динамика общего состояния по поведению ребенка, неврологическому статусу, состоянию всех органов и систем.

Объектом исследования иммунологических показателей служила пуповинная и периферическая кровь. Всего обследовано 17 здоровых доноров и 184 новорожденных ребенка.

ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК (МНК) осуществляли центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографина (d=1.077 г/сш по стандартному методу Boyum (1968).

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ МНК: МНК разделяли на прилипающие (ПК) и неприлипающие (НПК) к стеклу клетки (Заречнева Н.В., 1989). По морфологической идентификации окрашенных азур-эозином мазков среди ПК моноциты составляли около 90%, в суспензии НПК содержались лимфоциты и выявлялось менее 1% моноцитов. Жизнеспособность МНК, ПК и НПК составляла 96-97%.

ПОЛУЧЕНИЕ СУПЕРНАТАНТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ИЛ-1 и ФНО: Готовили суспензию ПК с концентрацией 200 тыс. клеток в 1,0 мл или сус-

пензию МНК 1 млн клеток/мл полной среды (с 50 мкг/мл гентамици-на, 2 мМ L-глутамина, буфером HEPES, 10% ЭТС) без и с добавлением липополисахарида (ЛПС) в конечной концентрации 10 мкг/кг, культивировали в пенициллиновых флаконах при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО?, в течение 24 часов, затем собирали супернатант и хранили при -20°С до тестирования (не более 2 недель).

ПОЛУЧЕНИЕ СУПЕРНАТАНТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ИЛ-2: НПК В концентрации 106/мл полной среды 199 с добавлением 10 мкг/мл ФГА-Р (Dlfco, США) культивировали в течение 24 часов, после чего ФГА отмывали и культивировали еще 48 часов при 37°С, затем собирали супернатанты и хранили при -20°С не более 2 недель.

ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЕ проводили методом проточной цитофлюо-риметрии при окрашивании моноклональными антителами (МонАТ), ко-ньюгированными с флюоресцеинизотиоцианатом или фикоэритрином, на цитофлюориметре FACScan фирмы "Becton Dickinson" (США). Для выявления Т-лимфоцитов (CD3+) использовали МонАТ Antl-Leu4, Т-хел-перов/индукторов (CD4+) - Antl-Leu3a, Т-супрессоров/вдтотокси-ческих (CD8+) - Antl-Leu2a, Т-индукторов супрессоров (неприми-рованных, не участвовавших ранее в иммунном ответе) (CD45RA+) -Anti-Leul8, Т-лимфоцитов с поздними маркерами активации (CD3+/DR+) - Antl-Leu4/HLA-DR, B-лимфоцитов (CD19+) Antl-Leul2, естественных киллерных клеток (CD56+) - Antl-Leul9. Для выявления маркеров активации в динамике использовали МонАТ против рецептора к ИЛ-2 (CD25+) - Antl-IL-2R, антитела против рецептора к трансферрину (CD71+) - Anti-TfR.

ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ К АКТИВАЦИИ. МНК в концентрации 10б/мл полной среды культивировали без и с добавлением ФГА в конечной концентрации 5 мкг/мл, определяя через 24, 48 и 72 часа содержание клеток, несущих маркеры активации (CD25, CD71), по адаптированной методике (Monoclonal Antibody Source Book, Becton Dickinson, 1988; БедаМ.В., 1994).

ОЦЕНКУ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ И ОТВЕЧАЕМОСТИ ИХ НА ИЛ1 И ИЛ-2 проводили методом, основанном на реакции бласт-трансформации лимфоцитов (РБТЛ). МНК и НПК в концентрации 10 кл/мл полной среды инкубировали триплетами 72 часа в 96-луночных микроплатах, добавляя ФГА в конечной концентрации 10 мкг/мл в лунки "опыт". В качестве экзогенных ИЛ1 и ИЛ2 использовали ре-комбинантный ИЛ-1-бета с удельной активностью 10?единиц на 1 мг

белка (лаб. белковой инженерии ВНИИ генетики сельхозмикроорга-низмов (ст.н.с. В.Г. Богуш)), и рекомбинантный ИЛ-2 с удельной активностью 1 (/единиц на 1 мг белка (Ин-т органического синтеза АН Латвийской республики, г.Рига) в дозах, вызывающих в наших экспериментах максимальный пролиферативный ответ НПК: рекомби-нантный ИЛ-1-бета - в конечной концентрации 20 Ед/мл по тимоци-тарному тесту, рекомбинантный ИЛ-2 - в конечной концентрации 20 Ед/мл. Пролиферативный ответ оценивали по включению Н5-тимидина в ДНК клеток в последние 6 часов культивирования. Подсчет радиоактивности проб проводили после осаждения клеток "харвестером" на стекловолоконные фильтры с помощью бета-счетчика (Beckman).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ ИЛ-1 и ФНО в супернатантах и сыворотках крови определяли методом иммуноферментного анализа в системе бидетерминантного определения антигена, разработанной в лаб. иммунологии ВНИИ генетики сельхозмикроорганизмов (зав. лаб.

д.б.н. В.Л.Юрин). МонАТ к рекомбинантному человеческому ИЛ1-бета и ФНО-альфа получены к.м.н. Н.В.Гороховец и Л.А.Евдони-ной. Оптическую плотность реакционной смеси в лунках измеряли на спектрофотометре "Multiscan" ("Titertek") при длине волны 492 нм. Концентрации ИЛ-1 и ФНО в исследуемых образцах определяли по калибровочной кривой, построенной на показателях оптической плотности разведений стандартных образцов рекомбинантного ИЛ-1-бета, любезно предоставленного ст.н.с. лаб. белковой инженерии ВНИИ генетики В.Г.Богушем, и ФНО-альфа (ВНИИПЭ, Вильнюс).

ТЕСТИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ИЛ-2 в супернатантах НПК проводили на клетках ИЛ-2-зависимой линии CTLL на базе Института биоорганической химии им.Шемякина (Свирщевская Е. В., 1990). Оценку результатов проводили аналогично описанной выше РБТЛ.

Статистическую обработку материала проводили общепринятыми методами. Достоверность различий между сравниваемыми величинами определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование основных компонентов развития иммунного ответа у здоровых новорожденных детей и здоровых доноров.

На I этапе работы представлялось важным установить особенности указанных звеньев иммунного ответа у здоровых доношенных

новорожденных детей по сравнению со взрослыми донорами.

Под нашим наблюдением находилось 64 новорожденных ребенка с гестационным возрастом 38-41 нед., массой тела при рождении 2700-4450 г, длиной тела от 47 до 55 см. Мальчиков было 39, девочек - 25. 42 ребенка (65,6%) родились от матерей с отягощенным акушерско-гинекологическим и соматическим анамнезом.

Средняя оценка по шкале Апгар составила на 1-ой минуте жизни 8-9 баллов у 46 детей (71,8%), 6-7 баллов - у 18 детей (28,2%). На 5-ой минуте жизни оценку по шкале Апгар, равную 8-10 баллам, имели 63 ребенка, 1 ребенок имел оценку 7 баллов.

Несмотря на нормализацию оценки по Апгар к 5-ой минуте жизни, на 1-е сутки жизни состояние расценено как удовлетворительное только у 21 ребенка (32,8%), среднетяжелое - у 43 детей (67,2%). Тяжесть состояния была обусловлена синдромом повышенной нервно-рефлекторной возбудимости у 36 детей из 43. синдромом угнетения ЦНС гипоксически-травматического генеза - у 7 детей.

Всём детям с отклонениями в неврологическом статусе создавался охранительный режим, проводилась гемостатическая терапия и витаминотерапия. В зависимости от степени выраженности синдрома повышенной нервно-рефлекторной возбудимости назначали седативную терапию.

На фоне проводимой терапии отмечалось улучшение состояния, устранение неврологических нарушений в течение первых 7-10 дней жизни. Это позволило нам расценить отмеченные нарушения как транзиторные и объединить данных детей в общую клиническую группу здоровых новорожденных детей.

Полученные уровни ИЛ1 и ФНО приведены в таблицах 1 и 2.

У здоровых доношенных новорожденных детей спонтанная и стимулированная ЛПС продукция ИЛ-1 и ФНО моноцитами пуповинной крови In vitro достоверно ниже, чем у взрослых доноров. Индометацин не увеличивает, а несколько подавляет продукцию ИЛ-1 и ФНО.

- и -

Таблица 1.ПОКАЗАТЕЛИ ПРОДУКЦИИ ИЛ-1 МОНОЦИТАМИ ЗДОРОВЫХ ВЗРОСЛЫХ ДОНОРОВ И НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ ОБЩЕЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ГРУППЫ, (нг/мл на 1 млн кл.; М ± т). Порог чувствительности = 0,05 нг/мл.

Условия Здоровые Общая клиническая группа Достовер-

продукции. взрослые здоровых новорожденных ность доноры (н=17). детей (п=64). различий.

МНК спонт. 0,734+0, 09 0,487 + 0, 095

МНК+ЛПС 0,88 ±0,057 0,518 ±0,101 р<0.01

МНК+ЛПС+ИНД. 0,871±0,068 0,429 ± 0,097 р<0,001

ПК спонт. 4,962+1,793 0,584 ±0,133 р<0.05

ПК +ЛПС 3,357+1,16 0,855+0,191 р<0,05

ПК +ЛПС+ИНД. 3,031+1,015 0,701+0,169 р<0,05

Сыворотка 0,912+0,127 0,087 ± 0,017 р<0,001

крови._

Таблица 2. ПОКАЗАТЕЛИ ПРОДУКЦИИ ФНО-АЛЬФА МОНОЦИТАМИ ЗДОРОВЫХ ВЗРОСЛЫХ ДОНОРОВ И НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ ОБЩЕЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ГРУППЫ, (нг/мл на 1 млн кл.; М ± ш). Порог чувствительности = О,1 нг/мл.

Условия Здоровые Общая клиническая группа Достовер-

продукции. взрослые здоровых новорожденных ность доноры (п=17). детей (п=64). различий.

МНК спонт. 1,23 ±0,239 0,652 ± 0,195

МНК+ЛПС 1,253±0,239 0,677 ±0,199

МНК+ЛПС+ИНД. 1,158±0,235 0,644 ±0,199

ПК СПОНТ. 7,283±1,889 0,85 ± 0,274 р<0,01

ПК +ЛПС 7,409±2,816 0,764 ±0,196 р<0,05

ПК +ЛПС+ИНД. 5,626±1,316 0,513 ± 0,166 р<0,01

Сыворотка 3,032±1,133 0,581 ±0,123 р<0,05

крови._

ИЛ-1 и ФНО можно определять иммуноферментным методом и в

сыворотках пуповинной и периферической крови. По-видимому, уровень продукции ИЛ-1 и ФНО в культуре выделенных клеток In vitro в большей мере отражает потенциальные возможности моноцитов по их выработке, в то время как сывороточные концентрации монокинов отражают реальное количество биологически активных ИЛ-1 и ФНО, имеющееся в циркуляции в организме в момент забора крови in vivo. Концентрации ИЛ-1 и ФНО в сыворотках пуповинной крови здоровых новорожденных детей достоверно ниже, чем в сыворотках периферической крови взрослых доноров, что совпадает с данными по продукции ИЛ-1 и ФНО в культурах выделенных моноцитов.

Таблица 3.

ПОКАЗАТЕЛИ АКТИВАЦИИ ПО УРОВНЮ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ К ИЛ-2 НА ЛИМФОЦИТАХ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ ИЗ ОБЩЕЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ГРУППЫ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ МНК С ФГА. (СБ 25; %; М+т).

Время. Условия. Здоровые взрослые доноры (п=17). Общая клиническая группа здоровых новорожденных детей (п=64). Достоверность различии.

О сут. 24 час. 48 час. 72 час. МНК сп. + ФГА + ФГА + ФГА 7,8 + 1,1 42,8 ±5,8 62,2 ±5,8 67,8 ±6,9 3.8 ± 0, 5 9.9 + 1,1 18,5 + 2,4 35,9 ±5,5 р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,01

Таблица 4.

ПОКАЗАТЕЛИ АКТИВАЦИИ ПО УРОВНЮ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРОВ К ТРАНСФЕР-РИНУ НА ЛИМФОЦИТАХ ВЗРОСЛЫХ ДОНОРОВ И НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ ИЗ ОБЩЕЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ГРУППЫ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ С ФГА. (СБ 71; %; М+т).

Время. Условия. Здоровые взрослые доноры (п=17). Общая клиническая группа здоровых новорожденных детей (п=б4). Достоверность различий.

0 сут. 24 час. 48 час. 72 час. МНК сп. + ФГА + ФГА + ФГА 3,2 ± 0,5 23.6 + 4,5 47.7 ±3,7 73,2 + 7,8 49.3 ±3,6 51,1 + 3,6 53, 4 ± 5.1 78.4 +3,7 р<0,001 р<0,001

Из таблицы 3 видно, что спонтанная и стимулированная ФГА экспрессия рецепторов к ИЛ-2 на лимфоцитах пуповинной крови здоровых новорожденных детей достоверно ниже, чем таковая у взрослых доноров, как в день забора крови, так и в динамике через 24, 48 и 72 часа. Более низкий уровень активации лимфоцитов здоровых новорожденных детей можно объяснить низкой продукцией ИЛ-1 их моноцитами как необходимого сигнала для активации лимфоцитов.

Из таблицы 4 видно, что спонтанная экспрессия рецепторов к трансферрину (РТФ) на лимфоцитах пуповинной крови здоровых новорожденных детей, как и через 24 часа после стимуляции ФГА, достоверно выше, чем у взрослых доноров. В последующие двое суток темпы прироста количества рецепторов к трансферрину на лимфоцитах пуповинной крови невелики и разница с данным показателем у взрослых становится недостоверной. Разнонаправленные изменения в экспрессии рецепторов к ИЛ-2 и трансферрину можно объяснить, если принять во внимание тот факт, что рецептор к ИЛ-2 появляется

на поверхности лимфоцита после воздействия антигена раньше по времени, чем РТФ (при выходе лимфоцитов из G0 в раннюю Gla стадию клеточного цикла) (Le Thl В.-Т., 1987; Zeher М. et al. 1990). Как только РТФ экспрессируется на клеточной мембране Т-лимфоцита, необходимость в присутствии функционального рецептора к ИЛ-2 отпадает (Leckers L.M., 1983). Если нарушается экспрессия РТФ, возникает дефицит запасов внутриклеточного железа, которое расходуется для синтеза ДНК, лимфоциты задерживаются в G1 и не вступают в дальнейшие стадии клеточного цикла (Taetle R., 1990; Wolth W. et al., 1993). Вероятно, в нашей работе забор крови совпадает именно с таким более поздним этапом активации лимфоцитов.

В данной работе мы продемонстрировали, что фенотип иммуно-компетентных клеток пуповинной крови отличается от такового у взрослых выраженными супрессорными характеристиками и признаками незрелости лимфоцитов. К признакам фенотипической незрелости лимфоцитов пуповинной крови относили достоверно сниженное количество Т-лимфоцитов с маркером CD3+ (59,6±2,3% против 69,0±1,2% у взрослых, р<0,001), увеличение содержания В-лимфоцитов (CD19) (13,9+0.9% против 11,7+0,6% у взрослых, р<0,05), характерное для недоношенных детей (Милер И., 1983; Serles I.M. et al. 1994).

К супрессорным характеристикам относятся снижение количества Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+DR+ (0,8±0,1% против 7,2±1,8% у взрослых, р<0,001) и преобладание непримированных Т-лимфоцитов, индукторов супрессоров, продуцирующих преимущественно ИЛ-2 (54,8±1, 6% у взрослых и 84,3+1,7% в пуповинной крови, р<0,001), что совпадает с данными Bertotto А., 1986; Чернышова В.П., 1993.

В таблице 5 обращает на себя внимание достоверное повышение пролиферативной активности лимфоцитов пуповинной крови в суспензии МНК по сравнению с таковой у взрослых. В пуповинной крови здоровых новорожденных детей достоверно повышен пролиферативный ответ лимфоцитов на добавление ИЛ-2, в то время как отвечаемость на ИЛ-1-бета не отличается от таковой у взрослых доноров.

Таблица 5.

ПОКАЗАТЕЛИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В РБТЛ ЛИМФОЦИТОВ В СУСПЕНЗИИ МНК ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ВЗРОСЛЫХ И ПУПОВИННОЙ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ ИЗ ОБЩЕЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ГРУППЫ (М±ш; имп/мин).

Условия.

Здоровые взрослые доноры (11=17).

Общая клиническая группа новорожденных детей (п-64).

Достоверность различий.

спонт. МНК+ФГА МНК+инд. МНК+ФГА+ИНД. МНК+ИЛ1 МНК+ФГА+ИЛ1 МНК+ИЛ2 МНК+ФГА+ИЛ2 ИС МНК

193.2 ± 18,5 1870,1 ± 297.1 150,2 ± 26,3 3212,9 +1475.3 182,9 ± 25,8 3428,8 ±1298,9 289,0 ± 28,5 2704.3 ± 488,4 11.1 ± 1.9

816,5 + 106.8 7026, 5 + 759, 8

967.7 ± 152.8 8087,2 ±1090,6

504,7 + 147,2 5466, 4 +2444,8

2365,6 + 673.2

7227,1 + 674,3

10.9 ± 1,0

р<0.001 р<0,001 р<0,001 р<0.05

р<0,01 р<0,001

Достоверно более высокий, чем у взрослых, уровень спонтанной пролиферации лимфоцитов пуповинной крови, с нашей точки зрения, подтверждает предположение о преактивации лимфоцитов новорожденных детей в ходе событий, предшествующих рождению ребенка. При этом отношение стимулированной ФГА пролиферации к спонтанной (индекс стимуляции, ИС) у взрослых доноров и новорожденных детей в нашей работе не различается (табл.5).

Таблица 6 показывает, что пролиферация лимфоцитов пуповинной крови после удаления моноцитов также достоверно превышает таковую у взрослых доноров. Интересно, что при удалении моноцитов пролиферативный ответ лимфоцитов новорожденных детей на ИЛ-1 становится тоже достоверно более высоким, чем у взрослых, как и при добавлении ИЛ-2. По-видимому, рецепторы к ИЛ-1 и ИЛ-2 на лимфоцитах новорожденных детей имеют высокое сродство к данным интерлейкинам. и их взаимодействие с этими цитокинами способно приводить к выраженному усилению пролиферации лимфоцитов.

Таблица 6. ПОКАЗАТЕЛИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ВЗРОСЛЫХ И ПУПОВИННОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ ПРИ УДАЛЕНИИ МОНОЦИТОВ В РБТЛ. (имп/мин; М±ш).

Условия. Здоровые Общая клиническая Достовер-

взрослые группа новорожден- ность доноры (п=17). ных детей (п=64). различий.

НПК спонт. 223,1 + 25,0 792,0 ± 142,5 р<0,001

НПК+ФГА 849,4 + 158,3 5912,3 + 743,7 р<0,001

НПК+ИЛ1 265,8 ± 31,3 4191,3 +1186,0 р<0,01

НПК+ФГА+ИЛ1 819,6 ± 132,5 7505,4 ±1237,5 р<0,001

НПК+ИЛ2 388,9 ± 39,1 1494, 4 ± 277,1 р<0,001

НПК+ФГА+ИЛ2 1314,2 ± 173,9 4996, 6 ± 469,3 р<0,001

ИС НПК 6,1 ± 2,1 10,5 ± 1,4

Способность лимфоцитов пуповинной крови здоровых новорожденных детей к продукции ИЛ-2 (35,9 ± 2,3 Ед/мл) достоверно не отличается от таковой у взрослых доноров (28,0 + 5,9 Ед/мл), что совпадает с выводами других авторов (Fairfax С.А., 1988; Bessler Н. et al, 1993; Hayrard А., 1994).

Таким образом, при сравнительном исследовании показателей клеточного иммунитета можно сделать заключение, что в пуповинной крови здоровых доношенных новорожденных детей имеет место угнетение начальных этапов развития иммунного ответа (продукции ИЛ1, ФНО, экспрессии рецептора к ИЛ-2 (CD25)) и усиление последующих этапов развития иммунного ответа (экспрессии рецептора к транс-феррину (CD71), спонтанной и стимулированной пролиферации лимфоцитов и их отвечаемости на экзогенные ИЛ-1-бета и ИЛ-2) по сравнению со взрослыми донорами при одинаковом уровне продукции ИЛ-2. Полученные результаты могут служить ориентиром при дальнейшем изучении иммунитета новорожденных и при разработке данного метода для более широкого применения в клинической практике.

В результате анализа клинических и анамнестических данных все наблюдавшиеся новорожденные дети были разбиты на 2 группы.

1 группа (контрольная)- здоровые новорожденные дети с физиоло-

гическим течением раннего периода адаптации, у матерей которых соматический и акушерско-гинекологический анамнез не был отягощен; течение настоящей беременности и родов было физиологическим (21 новорожденный ребенок).

2 группа - новорожденные дети с транзиторными нарушениями гемо-

ликвородинамики в раннем периоде адаптации (43 ребёнка).

I

h-

c

Комплексная схемд ььшенныл особенностей сеновныл компонентов разьмтш иммунного сгеегд в пупсвннной кроьи ¿дорсььм доисыенныл ноаэро.кдённыл летеи по срд&нению сс взрослыми здорсйыми аонор/\ми :

- пскА.мтедм жилых бьрослмх доиорой ; - изменения индлогичкыл плРАнетрсв в пупо&иннсй к рад.

Все новорожденные дети 2 группы были разделены на 2 подгруппы в зависимости от наличия или отсутствия в анамнезе матерей прена/гальных факторов риска для плода. Были выделены 2"А" (низкий ршк) и 2"Б" (высокий риск) подгруппы.

2"А" группа- 16 новорожденных детей, имевших в раннем периоде адаптации транзиторные нарушения гемоликвородинамики легкой и средней степени в связи с отклонениями от нормального течения родов (НМК за счет острой гипоксии в родах).

2"Б" группа- 27 новорожденных детей с транзиторными нарушениями гемоликвородинамики средней степени в раннем периоде адаптации от матерей с отягощенным акушерско-гинекологи-ческим и соматическим анамнезом (высокой вероятностью хронической фетоплацентарной недостаточности).

Нами установлено, что у новорожденных 2 группы моноциты пу-повинной крови спонтанно продуцировали достоверно больше ИЛ-1, чем у детей 1 группы (0,746±0,182 нг/мл против 0,259+0,093 нг/мл; р<0,05), и достоверно больше ФНО (1,301±0,362 нг/мл претив .О, 128±0, 049 нг/мл, соответственно; р<0,01). Однако эти различия не влияли на уровень активации лимфоцитов.

Среди показателей пролиферации лимфоцитов выявили достоверную разницу только по уровню пролиферативного ответа лимфоцитов (НПК) на добавление ИЛ-1. У новорожденных 2 группы отвечаемость НПК на ИЛ-1 была достоверно ниже, чем у детей 1 группы (2100,8+988,6 имп/мин против 6978,5±1911,9, соответственно; р<0,05). Вероятно, это можно объяснить компенсаторным снижением экспрессии и аффинности рецепторов к ИЛ-1 на клеточной мембране лимфоцитов и расценить как регуляторный механизм обратной связи, предотвращающий избыточный запуск иммунологических реакций при осложненном течении раннего периода адаптации.

Об этом же свидетельствует достоверно повышенное содержание Т-индукторов супрессоров (СБ45ЕА+) у новорожденных детей 2 группы по сравнению с детьми 1 группы (90,4±1,7% против 84,3+1,7%, соответственно; р<0,05). Возможно, повышенное содержание Т-ин-дукторов супрессоров у новорожденных детей с транзиторными нарушениями гемоликвородинамики в раннем периоде адаптации уравновешивает мощное активирующее воздействие на иммунную систему ребенка, обусловленное высокой продукцией ИЛ-1 и ФНО, и препятствует развитию аутоиммунных реакций.

Вероятно, в связи с необходимостью защищать организм новорожденного ребенка от воздействия большого количества антигенов на фоне повышенного супрессорного потенциала лимфоцитов пуповинной крови функцию первой линии защиты, для которой не требуется предварительной переработки и представления антигена, берут на себя естественные киллерные клетки (CD56+), содержание которых среди лимфоцитов пуповинной крови новорожденных детей 2 группы достоверно повышено по сравнению с таковым у детей 1 группы (17,3+2,2% против 9,62+1,7% соответственно; р<0,05).

Уровень продукции ИЛ-2 лимфоцитами пуповинной крови In vitro у новорожденных детей 1 и 2 групп не различался.

При сопоставлении иммунологических характеристик детей 2"Б" и 2"А" подгрупп удалось установить достоверное снижение пролиферации МНК с ФГА (5014,5±б77,9 имп/мин против 12525,5±2234,6 соответственно; р<0,01); с ФГА и индометацином (5282,5+780,3 имп/мин против 17281,2+2591,8 соответственно; р<0,001); индекса стимуляции МНК (9,3+1,7 против 15,1+2.1 соответственно; р<0,05) и пролиферативного ответа НПК на добавление ИЛ-1 в присутствии ФГА у новорожденных детей 2"Б" группы по сравнению с детьми 2"А" группы (2070,3+1134.9 имп/мин против 7901,8+1696,1. соответственно; р<0, 05).

Таким образом, хроническая фетоплацентарная недостаточность влияет на степень восприятия лимфоцитами ИЛ-1 и снижает уровень пролиферативного ответа на него в присутствии митогена, а в клинике может снижать пролиферацию лимфоцитов при развитии иммунного ответа ребенка на экзогенные антигены.

Результаты исследования концентраций ИЛ-1-бета и ФНО-альфа в сыворотках пуповинной крови.

На II этапе работы решили проверить, сохраняются ли установленные при исследовании клеточной продукции данных цитокинов In vitro закономерности, если объектом исследования станет более доступная в клинических условиях сыворотка крови.

Под нашим наблюдением находилось 84 доношенных новорожденных ребенка. Масса детей при рождении составляла 2300-4650 г.

длина - 44-55 см. Мальчиков было 45, девочек - 39. Клинико-анам-нестическая характеристика и принципы разделения на группы были аналогичны таковым на I этапе работы и подробно приведены в диссертации. Цифры в скобках справа от номера группы, обозначают II этап работы. Результаты исследования концентраций ИЛ-1 и ФНО в сыворотках пуповинной крови представлены в таблице 7.

таблица 7. КОНЦЕНТРАЦИИ ИЛ-1 И ФНО В СЫВОРОТКЕ ПУПОВИННОЙ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ. (М+т; НГ/МЛ).

Исследуемые показатели. Новорожденные 1(2) гр. (п=28) Новорожденные 2(2) гр. (11=56) Достоверность различий.

ИЛ-1-бета. ФНО-альфа. 0, 075 ± 0.015 0,442 ± 0,087 0.135 ± 0,025 1,323 + 0,285 р<0,05 р<0,05

Таким образом, концентрации ИЛ-1 и ФНО достоверно выше в сыворотке пуповинной крови новорожденных, у которых в периоде ранней адаптации имеются клинические симптомы нарушения гемолик-вородинамики (см. таблицу 7).

Полученные нами данные свидетельствуют, что концентрация ИЛ-1 в сыворотке пуповинной крови новорожденных детей зависит не только от характера течения периода ранней адаптации, но и от группы риска. Наличие в анамнезе пренатальных факторов высокого риска, расценивающееся как высокая вероятность хронической фе-топлацентарной недостаточности, во 2Б группе новорожденных детей приводит к достоверному снижению концентрации ИЛ-1, но не ФНО, в сыворотке пуповинной крови по сравнению с детьми 2А группы (без хронической фетоплацентарной недостаточности) (0,068+0,017 нг/мл против 0,166+0,034 нг/мл, соответственно; р<0.05).

Причинно-следственная связь между высокой концентрацией ИЛ1 и ФНО в сыворотке пуповинной крови новорожденных детей и последующими осложнениями течения раннего периода адаптации в виде симптомов нарушения гемодиквородинамики остается не до конца ясной. Вероятно, высокий сывороточный уровень ИЛ1 указывает на интенсивность иммунологических реакций в организме ребенка и может являться прогностическим критерием, в частности, по развитию неврологических нарушений в раннем периоде адаптации. Видимо, антигенная нагрузка больше у новорожденных детей с патологией ЦНС. Высокие концентрации ИЛ1 запускают иммунный ответ на возможное в условиях острой гипоксии в родах повышение проницаемое-

Основные компоненты РАЗВИТИЯ ИММУННОГО

отьетл.

Продукция

Т~т

ИОНОЦйТДМи

ЛКТИШЦЯ АиМФОЩЖЖ|(|;

АИ№ОЦИТОЬ

Имшдо <

Условия исследомния.

0 с_>

1 сг

^ 5<г;

з: I х ^ ^ ^ з; г- г:! <= <=

; <^1

О!

с_>

^ ЪсГ' ^ -1- +

з; ГГ| зс ¡¿г

£ Сс

МНК+ФГА

-о-' оо сч^

^ Г-*-

МНК+ФГА

а

2Е> ^ •ЗГ

ГО ЛО | £

г е-

-л:

и;

* е-

^ т ы ^ з: х I з: 2:. г з: г

е-.

'<тчг ■ - г

-ЧТ

1_

©-

Р<0,001-

(><0,01 •

р<0(0£-Поклмтедм

НОВОРСЖлёнВД легеи.

0-<? 9-3 Ф

у

----!

9

9 9

¡><ор1 ¡хо.оа -

I

м

0

1

Схемд выяьленных особенностей рдз»ития иммунного от&та метками пупоьнинси крови доношенных новорождённых детей с осложнённым течением рдннего неондшьного петм (в®в) и , в частности, из группы высокого рмскл(' ?»)

по сравнению со здоровыми новорождёнными летьми с физиологическим течением рдннего неондгАЛбного периодА (V.»

ти гематоэнцефалического барьера и попадание в циркуляцию мозговых аутоантигенов, что может играть важную роль в патогенезе перинатального поражения ЦНС.

Вместе с тем активация моноцитов может происходить за счет других, не мозговых, антигенов. Высокий уровень ИЛ-1 может являться пусковым фактором воспалительных деструктивных реакций, приводящих к нарушению проницаемости гематоэнцефалического барьера и предшествующих появлению неврологической симптоматики в раннем периоде адаптации. Однако обе гипотезы нуждаются в тщательной иммунологической разработке и проверке в клинической практике. •

Результаты исследования в динамике концентраций ИЛ-1 в сыворотке периферической крови новорожденных детей, у которых неонатальный период осложнился постгипоксическим поражением ЦНС и развитием бактериальной инфекции.

На III этапе работы под нашим наблюдением находилось 36 новорожденных детей. Все дети родились от матерей с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, осложненным течением беременности и родов. Период ранней адаптации у всех детей осложнился нарушением мозгового кровообращения гипоксического и гипокси-чески-травматического генеза. У 16 из них на первой неделе жизни отмечалось развитие бактериальной инфекции. Подробная клини-ко-анамнестическая характеристика обследованных детей представлена в диссертации.

Все дети были разделены на две группы: 1-ю составили 16 детей с ранней неонатальной инфекцией, 2-ю - 20 новорожденных детей с постгипоксическим поражением ЦНС, у которых не было выявлено признаков инфекции. Всем детям с первых часов жизни проводилась интенсивная посиндромная и антибактериальная терапия. В результате терапии быстрая положительная динамика .была достигнута в 21 случае. У 15 детей выраженные нарушения функции ЦНС сохранялись на протяжении всего 1-ого месяца жизни, в том числе у 8 детей с ранней неонатальной инфекцией. Полученные данные приводятся в таблице 8.

Таблица 8. ДИНАМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИЛ-1 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ С ПОСТГИПОКСИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ЦНС, ОСЛОЖНЕННЫМ НЕОНАТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ (1(3) ГР.), И БЕЗ ИНФЕКЦИИ (2(3) ГР.). (нг/мл; М±ш).

Возраст детей в неделях. Концентрации ИЛ-1-бета 1(3)гр. (п=16) 2(3)гр. (П=20) Достоверность различий.

1-я нед.жизни. 2-я нед. жизни. 3-я нед.жизни. 4-6 нед.жизни. 52,1 ± 29,4 43,9 + 28,3 3,2 ± 1,2 17,6 ± 6,3* 1,1 ± 0,3 50,4 ± 18, 0# 77,2 ± 28,4! 20,1 ± 11,7 р<0,05

*)-достоверность различия при сравнении 3 и 4 нед. жизни. #)-при сравнении 1 и 2 нед. жизни; !)- 1 и 3 нед. жизни.

У новорожденных детей с перинатальным поражением ЦНС концентрация ИЛ-1 в сыворотке периферической крови была невелика на 1-ой неделе жизни и достоверно повышалась ко 2-ой и 3-ей неделям жизни параллельно нарастанию со 2-ой недели жизни аффинности ау-тоантител к основному белку миелина, выявленному в тех же пробах сывороток (Грудень М.А. и соавт., 1993). В последующие недели жизни сывороточный уровень ИЛ-1 постепенно снижался, что соответствовало выраженности клинической симптоматики перинатального поражения ЦНС.

При раннем присоединении бактериальной инфекции концентрация ИЛ-1 в сыворотке крови была высокой уже на первой неделе жизни с последующим снижением к 3-4-ой неделям жизни. Это свидетельствует о пике воспалительных реакций в ответ на экзогенные антигены у детей с ранней бактериальной инфекцией - на 1-2-ой неделях жизни, а в ответ на аутоантигены головного мозга - на 3-ей неделе жизни.

Степень повышения концентрации ИЛ-1 в сыворотке крови новорожденных детей с перинатальным поражением ЦНС совпадала с тяжестью состояния ребенка и была достоверно выше на 3-ей неделе жизни у новорожденных детей с тяжелым и среднетяжелым поражением ЦНС, чем у детей с легким поражением ЦНС (табл. 9).

Таблица 9.

ДИНАМИЧЕСКОЕ ИЗМЕНЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИЛ-1 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ С ЛЕГКИМ (2(3)"А" гр.) И СРЕДНЕТЯЖЕЛЫМ И ТЯЖЕЛЫМ (2(3)"Б" гр.) ПЕРИНАТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ЦНС. (НГ/МЛ; М+Ш).

Возраст детей в неделях. Концентрации ИЛ-1-бета 2(3)"А"гр.(п=7) 2(3)"Б"гр.(п=15) Достоверност: различий.

1-я нед.жизни. 2-я нед.жизни. 3-я нед.жизни. 4-6 нед.жизни. 0,5 ± 0,05 24,9 + 10,5 9.9 + 6,6 19,9 ± 16.1 58,4 ± 23,3 100,1 ± 35,6* 17,6 + 10, 3# р<0,05

*)-достоверность различия при сравнении 1 и 3 нед. жизни;

#)-при сравнении 3 и 4 недель жизни.

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли ИЛг1 в патогенезе осложнении неонатального периода и вдохновляют^на дальнейшие, новые исследования в области неокатальной иммунологии с целью улучшения методов диагностики, прогноза, профилактики и лечения заболеваний новорожденных детей.

ВЫВОДЫ.

1. У здоровых доношенных новорожденных детей в пуповинной крови имеется особое состояние активационно-пролиферативного звена иммунологического реагирования, заключающееся в угнетении ранних этапов (уровни продукции моноцитами ИЛ-1-бета и ФНО-аль-фа, количество лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ИЛ-2 (С025)) и повышении последующих этапов (количество лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к трансферрину. показатели спонтанной и стимулированной пролиферации лимфоцитов и отвечаемости их на ИЛ-1 и ИЛ-2) при сходном со взрослыми донорами уровне продукции лимфоцитами ИЛ-2. При этом фенотип иммунокомпетентных клеток пуповинной крови отражает повышенную супрессорную направленность функционирования иммунной системы.

2. Важным информативным показателем состояния иммунной системы новорожденного ребенка в раннем периоде адаптации является уровень продукции моноцитами пуповинной крови ИЛ-1-бета и ФНО-альфа. Увеличение концентрации ИЛ-1 и ФНО в пуповинной крови может служить ранним диагностическим признаком гипоксических изменений в организме новорожденного ребенка и свидетельствует об

участии данных иммуноцитокинов в патогенезе транзиторных нарушений гемоликвородинамики в раннем периоде адаптации.

3. Сывороточные концентрации ИЛ-1 и ФНО в пуповинной крови однонаправленны с уровнями клеточной продукции данных монокинов In vitro.

4. Динамика концентраций ИЛ-1 в сыворотке периферической крови новорожденных детей с бактериальной инфекцией свидетельствует о максимальной интенсивности воспалительных реакций в первую и вторую недели жизни, что совпадает с выраженностью клинических проявлений.

5. Динамика концентраций ИЛ-1 в сыворотке периферической крови новорожденных детей с перинатальным поражением ЦНС свидетельствует о постепенном нарастании интенсивности воспалительных реакций к 3 неделе жизни и связано с тяжестью неврологических нарушений.

6. Метод твердофазного иммуноферментного анализа ИЛ-1-бета является высоко информативным, специфичным, экономичным и может быть применен в клинической практике в качестве раннего диагностического признака перинатального поражения ЦНС и косвенного показателя степени тяжести церебральных нарушений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Малые 'количества сыворотки крови (250 мкл),необходимые для иммуноферментного определения концентрации данных иммуноцитокинов, а также высокая специфичность метода позволяют рекомендовать исследование уровня ИЛ-1-бета в качестве оперативного, скринингового теста для выделения групп новорожденных детей, имеющих высокий риск по развитию осложнений раннего периода адаптации и неонатального периода в целом, а также в качестве оперативного контроля за эффективностью лечебных и реабилитационных мероприятий.

2. Наряду с клинико-инструментальными и общепринятыми лабораторными методами исследования целесообразно использовать имму-ноферментное определение уровней ИЛ-1-бета, дающего ценную информацию о тяжести и закономерностях течения перинатальных поражений ЦНС и бактериальных инфекций у новорожденных детей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Особенности пролиферативного ответа лимфоцитов у новорожденных детей и их матерей (в соавт. с Л. В.Ковальчуком, В. А. Таболиным, А.С.Павлюком, Н.Н.Володиным, Н. В.Заречневой, Д.Н.Дегтяревым, А.Н.Шипулиным, 0.В.Пьянковой). //В кн.: Актуальные вопросы науки и практики Орловского здравоохранения. Орел, 1991, стр.282-285.

2. Влияние интерлейкинов-1 и -2 на пролиферацию иммуноком-петентных клеток у новорожденных детей и их матерей (в соавт. с Л. В. Ковальчуком, В.А.Таболиным, А.С.Павлюком, Н.Н.Володиным, Н.В.Заречневой, Д.Н.Дегтяревым, 0.В.Пьянковой). //В кн.: Актуальные вопросы науки и практики Орловского здравоохранения. Орел, 1991, стр.286-288.

3. Иммунорегуляторная роль интерлейкина-1-бета и фактора некроза опухолей - альфа в раннем периоде адаптации новорожденных детей (в соавт. с Н.Я.Аксеновой, Д.Н.Дегтяревым, А.С.Павлюком, Н.Н.Володиным, Л.В.Ковальчуком). //В кн.: Тезисы докладов 1 съезда иммунологов России. Новосибирск, 1992, стр.212.

4. Взаимосвязь между концентрациями интерлейкина-1-бета и фактора некроза опухолей - альфа пуповинной крови и нарушениями неврологического статуса новорожденных детей (в соавт. с Д.Н.Дегтяревым, Н.Н.Володиным). //В кн.: Медико-социальные аспекты перинатологии и современные технологии родоразрешения. Тезисы докладов 1 Всероссийского съезда акушеров-гинекологов и педиатров. Челябинск, 1992, стр.215.

5. Определение концентраций интерлейкина-1-бета и фактора некроза опухолей - альфа в сыворотке пуповинной крови (в соавт. с В.А.Таболиным, Л.В.Ковальчуком, Н.Н.Володиным, А.С.Павлюком, Д.Н.Дегтяревым, Н.В.Гороховец). // Педиатрия, 1993, N5, стр.17-21.

6. Изменение концентрации ИЛ-1 в сыворотке крови у новорожденных детей с инфекционной и неинфекционной патологией. Взаимосвязь с образованием антимозговых антител (в соавт. с Д.Н.Дегтяревым, М.П. Варванцевой, Н.Н.Володиным). //В кн.: Актуальные вопросы клинической педиатрии, акушерства и гинекологии. Киров, 1993.