Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Механизмы иммуномодулирующей активности хорионического гонадотропина

На правах рукописи

ЗАМОРИНА Светлана Анатольевна

МЕХАНИЗМЫ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология (биологические науки)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

16 МАЙ 2013 005058599

Челябинск - 2013

005058599

Работа выполнена в лаборатории иммунорегуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, г. Пермь

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией иммунорегуляции ФГБУН Института экологии генетики и микроорганизмов УрО РАН Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Челябинской государственной медицинской академии», кафедра биологической химии, заведующий кафедрой

доктор медицинских наук, доцент, заведующий лабораторией иммунологии воспаления ФГБУН Института иммунологии и физиологии УрО РАН доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова», лаборатория клинической иммунологии

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава России, г. Москва

Защита состоится «2-/-» Об 2013 г. в на заседании диссертационного

совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия»

Автореферат разослан « » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, доцент Шишкова Ю.С.

Сергей Викторович Ширшев

Цейликман Вадим Эдуардович

Гусев Евгений Юрьевич

Кудряшова Анна Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Известно, что плацентарный гормон хорионический гонадотропин (ХГ) обладает выраженными иммуномодулирующими эффектами [Magnie M. et al., 1990; Shufer A. et al., 1992; Ширшев C.B., 1998; Куклина E.M., Ширшев C.B., 2003, 2005, 2006], однако механизмы его действия изучены недостаточно. В то же время, интерес к этому гормону возрастает в плане изучения его регуляторного и терапевтического потенциала [Cole L., 2010, 2012].

Наиболее древним в филогенетическом аспекте звеном иммунной системы является врожденный иммунитет, в реализации функций которого принимают участие клетки моноцитарпо-макрофагального ряда. Иммуномодулиругащие эффекты ХГ реализуются в присутствии моноцитов, а также потомков моноцитов - макрофагов и дендритных клеток. Эти клетки кумулируются в децидуальной оболочке благодаря стероидному фону [Hunt J.S., 1989], принимают участие в имплантации и плацептации, участвуют в ремоделировапии тканей эндометрия [Nathan C.F., 1987], а в дальнейшем определяют вид иммунного реагирования, сдвигая ответ Т-лимфоцитов в сторону Th2. Кроме того, моноциты/макрофаги осуществляют клирепеную функцию, фагоцитируя патогены, клеточный детрит и апоптотические тельца, находясь под постоянным контролем ХГ. В то же время известно, что менструальный цикл формирует условия оптимальной фертилизации гамет, оплодотворения и успешной имплантации. Так, в различные фазы менструального цикла не только меняется локальное клеточное микроокружение подслизистого слоя урогенитального тракта, но и модулируются иммунные реакции па системном уровне [Кеворков H.H. с соавт., 1993]. Таким образом, можно предполагать различную степень выраженности и направленности модулирующих эффектов ХГ в гестациоиный период в целом.

Согласно концепции Acevedo H.F [2002], ХГ не имеет своего «истинного» рецептора, реализуя эффекты через гормональный ЛГ-рецептор за счет высокой степени гомологии с ЛГ (лютеинизирующий гормон). Вследствие этого возникло предположение о взаимодействии ХГ с клетками иммунной системы через «неклассические рецепторы» - в частности, То11-нодобные протеины (TLR) [Ширшев C.B., 2002]. Одной из экспрессируемых изоформ TLR являются TLR4, широко представленные на моноцитах и участвующие в связывании липополисахаридов (ЛПС). Известно, что введение ß-субъединицы ХГ (или синтетических олигопептидов, родственных по структуре) в критических состояниях, индуцированных присутствием большого количества ЛПС, способно останавливать воспалительные реакции [van den Berg et al., 2009, 2011]. Вероятнее всего, это происходит в силу способности гормона выступать как конформационный антагонист ЛПС. Таким образом, расшифровка молекулярного механизма действия ХГ, связанного с паттерн-распознающими рецепторами на уровне клеток иммунной системы, является фундаментальной задачей, связанной с изучением филогенетически древнего механизма реализации гормоп-модулирующей активности.

С позиции иммунологии репродукции, беременность представляет собой физиологически обусловленное состояние толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду. Одним из наиболее значимых механизмов формирования иммунологической толерантности является смещение акцента системных иммунных реакций в сторону гуморальных (феномен Th2-девиации) за счет преимущественной секреции противовоспалительных цитокинов [Wegmann T. et al., 1993]. Кроме того, огромное значение в этот период имеет поддержание баланса между Т-регуляторными лимфоцитами (Treg) и субпопуляциями ИЛ-17-продуцирующих лимфоцитов (Thl7) [Wang W.J. et al., 2010]. Для объяснения механизмов, обеспечивающих нормальное развитие беременности, предложена концепция - «Thl/Th2/Thl7/Treg» [Saito S. et al., 2010], суть которой заключается в том, что в период физиологически протекающей беременности в иммунной системе матери происходят изменения, сопровождающиеся доминированием Th2 и Treg над Thl- и ТЫ 7-лимфоцитами. Изменение соотношения этих клеточных подтипов, как правило, приводит к преждевременным родам или спонтанному аборту [Saito S. et al., 2010]. Известно, что во время беременности важную роль играют натуральные киллеры (NK-клетки) и Т-клетки с функциями натуральных киллеров (NKT-клетки), которые лизируют не только клетки-мишени, инфицированные внутриклеточными патогенами и неоплазмы, но также и клетки трофобласта [Baley J.E., Schacter B.Z., 1985; Cooper М.А. et al., 2001]. Посредством апоптоза плацента удаляет потенциально опасные клетки иммунной системы и тем самым формирует толерантность к феталыюму трансплантату [Kayisli U.A. et al., 2003]. Помимо этого, формирование периферической толерантности осуществляется благодаря экспрессии антигенпрезентирующими клетками фермента индоламии-2,3-диоксигеназы (IDO), что нарушает антифетальные клеточноопосредованные иммунные реакции матери [Mellor A.L., Munn D.II., 2001]. Изучение роли ХГ в процессах регуляции данного феномена является актуальным направлением репродуктивной иммунологии.

Известно, что одновременно с ХГ, трофобласт продуцирует целый спектр цитокинов, среди которых интерлейкин-2 (ИЛ-2) наиболее важен, поскольку необходим для формирования иммунного ответа. ИЛ-2 является основным аутокринным регулятором созревания Treg [Hoyer К.К. et al., 2008] и активатором NK-клеток [King A., Loke Y.W., 2006]. В то же время, спонтанные повторяющиеся аборты сопровождаются снижением уровня Treg [Saito S. et al., 2010], повышением концентрации ИЛ-2 и NK-клеток, но при этом показана сниженная ИЛ-2-иидуцируемая экспрессия STAT5 (транскрипционный фактор) в Treg [Fainboim L., Arruvito L., 2011]. В широком смысле, взаимоотношения ИЛ-2 и CD25/STAT5 внутри системы определяют функциональность Treg и NK-клеток, поэтому представлялось важным оценить эффекты ХГ на фоне ИЛ-2-активации клеток.

Целью работы являлось исследование молекулярных и клеточных механизмов иммуномодулирующей активности ХГ на уровне эффекторных и регуляторных клеток врожденного и адаптивного иммунитета.

Задачи:

1. Изучение влияния ХГ на фагоцитарную, окислительную и секреторную активность моноцитов женщин в зависимости от фаз менструального цикла;

2. Исследование молекулярных механизмов, связанных с вовлечением молекул TLR4 в реализацию эффектов ХГ в отношении функциональной активности моноцитов периферической крови женщин;

3. Анализ модулирующих эффектов ХГ на фоне активации моноцитов периферической крови женщин ИЛ-2;

4. Изучение модулирующего действия ХГ на уровне NK- и NKT-клеток периферической крови женщин;

5. Комплексная оценка роли ХГ в формировании иммунологической толерантности па уровне эффекторов периферической крови женщин (соотношение Thl/Th2 и Treg/Thl7, активность IDO);

6. Исследование модулирующих эффектов ХГ в отношении ключевых факторов иммунологической толерантности на фоне активации клеток периферической крови ИЛ-2.

Научная новнзна работы. Новыми являются данные о регуляции ХГ широкого спектра показателей функциональной и секреторной активности моноцитов периферической крови женщин. Разносторонне изучены эффекты гормона в отношении регуляции процессов фагоцитоза разных корпускулярных объектов. Выявлена зависимость моноцит-модулирующего действия ХГ от фаз менструального цикла и степени активации клеток. Впервые показано, что ХГ участвует в регуляции синтеза моноцитами белкового компонента липопротеидов АПО-А1, ИФН-а и эластазы, повышая их продукцию. Впервые исследована роль «медленных» Са2+-каналов L-типа в реализации эффектов ХГ на функциональную активность моноцитов. Установлено, что ХГ способствует стенотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической и цитокин-продуцирующей активности. Используемые экспериментальные подходы позволили продемонстрировать новый механизм действия ХГ на уровне моноцитов, связанный с вовлечением молекул TLR4, принадлежащих к паттерн-распознающим рецепторам. Существование «альтернативной» рецепции для ХГ существенно расширяет представления о фундаментальных основах взаимодействия гормон-рецептор. Экспериментально показано, что ХГ формирует толерогенные свойства мопопуклеаров человека, регулируя баланс Treg/Thl7 в сторону Treg, непосредственно увеличивая количество CD4+Foxp3+ и CD4 Foxp3 CTLA-4 -клеток и снижая количество CD4+ROR-yt+-, CD4+ROR-yt+IL-17Af- и CD4+IL-17А+ССК6+-лимфоцитов. Помимо этого, ХГ смещает баланс ИЛ-4/ИФН-у, способствуя переключению иммунного ответа по ТЬ2-типу. Впервые исследована ХГ-зависимая экспрессия IDO в моноцитах периферической крови женщин. Показана роль активации клеток ИЛ-2 в реализации эффектов ХГ на уровне моноцитов и лимфоцитов.

Предложен и запатентован новый метод оценки фагоцитарной активности клеток по поглощению бактерий генно-инженерного штамма E.coli lux*.

Теоретическая н практическая значимость. В теоретическом аспекте работа вносит вклад в расширение представления о взаимодействии иммунной и эндокринной систем, раскрывая новые аспекты механизмов иммуномодулирующей активности ХГ. Предложена гипотетическая схема действия гормона на моноциты человека с вовлечением «альтернативного» пути, связанного с TLR4. Управляемая модуляция ТЫМ-зависимого пути, в том числе при помощи ХГ и родственных гонадотропину олигопептидов имеет терапевтический потенциал. Установлена ключевая роль ХГ в формировании иммунологической толерантности в период беременности. Показаны иммуномодулиругощие эффекты ХГ па фоне ИЛ-2-активации клеток. Эти данные открывают новые перспективы в исследовании нейроэндокринного контроля иммунной системы, а также послужат основой для последующих фундаментальных исследований. Результаты исследований необходимо учитывать при анализе патологических состояний, сопровождаемых эктопическим синтезом гормона при онкологических заболеваниях, а также в гормональной терапии, применяемой в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Положения, выносимые на защиту:

1. В разные фазы менструального цикла особенности рецепции гормона, связанные с уровнем половых стероидов, формируют различную чувствительность моноцитов к хорионическому гонадотропину и определяют направленность его действия. В фолликулярную фазу цикла гормон преимущественно угнетает фагоцитоз и продукцию активных форм кислорода, одновременно стимулируя секреторную активность клеток. В лютеиновую фазу цикла гормон стимулирует фагоцитоз, одновременно угнетая продукцию активных форм кислорода, практически не влияя на секреторную активность клеток.

2. На уровне моноцитов продемонстрирован новый молекулярный механизм реализации эффектов хорионического гонадотропина, вовлекающий Toll-подобиые рецепторы 4 типа. Показано, что гормональная регуляция фагоцитоза и продукция моноцитами интерферона-а осуществляется через взаимодействие с То11-подобными рецепторами 4 типа.

3. Хорионичсский гонадотропин способствует фенотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической и цитокинпродуцирующей активности, повышая экспрессию этими клетками CD16/CD56. Хорионический гонадотропин ослабляет интерлейкин-2-стимулирующие эффекты на уровне NK-клеток, снижая, таким образом, генерацию лимфокин-активированных клеток.

4. Хорионический гонадотропин является одним из факторов, способствующих поддержанию периферической иммунологической толерантности при беременности. Так, гормон регулирует баланс Thl/Th2 и Thl7/Treg в сторону увеличения количества Treg и Th2, параллельно угнетая

Thl7. Одновременно хорионический гонадотропин ко-стимулирует индуцированную активность индолеамнн-2,3-диоксигеназы моноцитов. 5. Активация клеток интерлейкином-2 может как усиливать, так и отменять .эффект хорионического гонадотропина. Так, количество Treg, NK- NKT-клеток и активность индолеамин-2,3-диокеигеназы моноцитов увеличивается при совместном действии гормона и цитокина. Эффекты хорионического гонадотропина в отношении баланса Thl/Th2 на фоне активации клеток интерлейкином-2 меняют свою направленность, а также частично отменяются депрессивные эффекты на показатели фагоцитоза и уровень миелоиероксидазы.

Внедрение результатов. Полученные данные внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Пермского государственного национального исследовательского университета» в программе спецкурсов «Общая эндокринология» и «Иммунология репродукции».

Разработанный метод оценки фагоцитоза используется в работе Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН для научных исследований.

Апробация результатов исследований. Результаты представлены на V, VIII, XIII Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001, 2005, 2009 гг.»; II, VIII, IX конференции иммунологов Урала, 2002 г. (Пермь), 2010 г. (Сыктывкар), 2011 г. (Челябинск); 7-ой и 12-ой Международной научной конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», 2003 и 2008 гг.; Объединенном иммунологического форуме, 2004 г. (Екатеринбург) и 2008 г. (Санкт-Петербург); Международной научно-практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека»,

2008 г. Новосибирск; VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды. Адаптация. Иммунитет», 2008 г., Пермь - Н. Новгород -Пермь; 2-м Европейском конгрессе по иммунологии, 2009 г., Берлин (Германия); VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность»,

2009 г., Москва, ММА им. Сеченова; Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», 2011 г., Пущино; I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», 2011 г., Пермь; V Всероссийской конференции «Иммунология репродукции», 2012 г., Иваново; XII Конгрессе РААКИ, 2013 г., Москва.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав экспериментальной части, заключения и выводов. Работа содержит 45 рисунков и 24 таблицы. Список литературы содержит 353 источника, в том числе 72 отечественных, 281 зарубежных.

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 54 печатных работах, из них: 32 публикации (включая 20 статей) в журналах по перечню ВАК Мипобрнауки РФ, 7 статей в сборниках, 1 патент РФ на изобретение.

Работа выполнена в рамках плана НИР «Механизмы гормональной регуляции иммунной системы» № Государственной регистрации - 0120.0 809371. Работа поддержана грантом Фонда содействия отечественной науке «Выдающиеся ученые. Кандидаты и доктора наук» (2008-2009). Часть

g

исследований выполнена в рамках программ президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», «Изучение молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия гормонов репродукции» (2009-2011) и «Клеточные и молекулярные механизмы гормонального контроля функциональной активности иммунной системы в период гестации» (2012).

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории иммунорегуляции ФГБУН Института экологии генетики и микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (зав. лаб. д.м.н., профессор Ширшев C.B.). Автор благодарит за помощь в проведении исследований к.б.н., с.н.с. Орлову Е.Г., к.б.н., н.с. Некрасову И.В., к.б.н,, м.н.с. Тимганову В.П. и зав. лабораторией экологической иммунологии, к.м.н., доцента Бахметьева Б.А.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объекты исследования. В работе использовали фракционированные моноциты и лимфоциты практически здоровых доноров, которыми являлись небеременные женщины репродуктивного возраста. Исследования проводили согласно Хельсинской Декларации BMA 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. Критериями включения явились добровольное согласие на обследование и отсутствие приема гормональных препаратов. У женщин (п=155) для верификации фазы менструального цикла оценивался гормональный статус по уровню эстрадиола, прогестерона, ЛГ и ФСГ иммуноферментным методом при помощи наборов фирм «Biomar Diagnostic» (Германия) и «Хема» (Россия).

Моноциты выделяли из гепаринизированиой периферической крови по методу, скомпилированному из стандартных методик выделения адгезивных клеток [Pertof Н., 1980; Эккерт Р., 1987] в нашей модификации. Мононуклеарные клетки центрифугировали в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3) («Sigma», США; «Спофа», Чехия, соответственно). Для работы с лимфоцитами использовали суспензию мононуклеаров или фракцию CD4+-клеток. Для выделения моноцитов полученную суспензию после двойной отмывки помещали на чашки Петри с 5% эмбриональной телячьей сывороткой («Sigma», США), инкубировали 45 мин при 37°С, затем адгезировавшие моноциты снимали механическим способом, дважды отмывали и повторно инкубировали 45 мин при 4°С. Жизнеспособность, определяемая по включению эозина (0,01%), была в пределах 93-98%. Чистота выделения, оцениваемая иммунофлуоресцентпым методом или на проточном цитофлуориметре, составила 78-85 %.

Биологически активные вещества. ХГ («Profasi», Италия) применяли в дозах 10 и 100 ME/мл, что соответствует его физиологическим концентрациям в разные сроки беременности [Wide L., 1962; Димитров Д., 1979; Cole L., 2012]. Рекомбинантный ИЛ-2 («Sigma», США) использовали в концентрации 100 ME/мл, соответствующей его уровню при формировании иммунного ответа [Kurosaka К., 2002] В ряде исследований применяли немеченые моноклональные антитела к TLR4 (abTLR4; «eBioscience», Канада; clone НТА125; CD 286) в

количестве 5 мкл на пробу, которые инкубировали с клетками перед внесением гормона. Для контроля самостоятельного эффекта антител применяли изотопический контроль («eBioscience», Канада; Mouse IgG2a, к). Дли блокады сигнала с TLR4 применяли ингибитор TRIF-комплекса (резвератрол, «Sigma», США, 50 мкмоль [Youn H.S. et al, 2005]), который вносили в культуру моноцитов за час до ХГ. Учитывая, что взаимодействие ХГ с ЛГ/ХГ-рецептором приводит к повышению внутриклеточного уровня цАМФ, активирующего протеинкиназу А (1IKA) [Rao Ch.V. et al, 2004], в исследовании применяли блокатор ПКА II-89 («ICN Ph», США) в концентрации 10 мкМ/мл [Parvathenani L.K. et al., 1998]. Для исследования Са2+-зависимых механизмов реализации эффектов ХГ в ряд проб вносили блокатор медленных потенциалзависимых Са2+-каналов L-типа изоптин («Knoll», Германия) в дозе 0,025 мг/мл [Ширшев С.В., Кеворков Н.Н., 1993].

Оценку фагоцитарной активности моноцитов проводили методом, основанным на снижении свечения биолюминесценции E.coli lux . Метод разработан и запатентован в Лаборатории иммунорегуляции [Ширшев С. В., Куклина К. М., Заморина С. А. и соавт. II Патент РФ. № 2292553. 2007]. Готовую суспензию бактерий (180 мкл, 5х10б/мл) вносили в лунки 96-луночного планшета для люминоскана, инкубировали при 37°С в течение 3-5 мин и снимали фоновый уровень свечения бактерии, затем после внесения клеточной культуры (соотношение клетка/бактерия составило 1/10), измерялась степень гашения биолюминесценции в течение 30 мин, сопровождающая поглощение E.coli lux фагоцитирующими клетками (рис.1). Рассчитывали индекс фагоцитарной активности клеток (ИФА), отражающий процент гашения биолюминесценции по сравнению с исходным уровнем по формуле: ИФА=((Х1-Х2)/Х1)*100, где Xi -интенсивность биолюминесценции контрольной пробы, Х2 - интенсивность биолюминесценции опытной пробы. Измерение производилось в динамике процесса на люмипоскане «Accent» (Финляндия).

а) б)

Рис.1. Изменение интенсивности биолюминесценции (а) и ИФА (б) в клеточной культуре моноцитов в результате поглощения E.coli lux .

Оценка фагоцитарной активности моноцитов также производилась методом, основанным на поглощении корпускулярных объектов. Для дифференцировки сайтов связывания частиц, предназначенных для фагоцитоза, использовали следующие объекты: формалинизировапные эритроциты барана (ФЭБ) [Каплин В.Н., 1996], ФЭБ с антигенной специфичностью к Yersinia enterocolitica (ФЭБИ) и частицы латекса (1.5 мкм, «ДиаМ», Россия).

Окислительную активность моноцитов оценивали по продукции активных форм кислорода (АФК) в реакции люминолзависимой хемилюминесценции (JI3XJT) [Dahigren С., Stendahl О., 1984]. Для этого в лунки 96-луночного плоскодонного планшета для люминоскана вносили 180 мкл раствора Хенкса без фенолового красного («Биолот», Россия), содержащего люминол (5x10"^). После инкубации в течение 3-5 мин. при 37°С и замера фонового свечения добавляли 20 мкл клеточной суспензии (5х106 кл/мл) и оценивали интенсивность спонтанной ЛЗХЛ, затем в кювету вносили 20 мкл суспензии штамма бактерии Е. coli К12, и фиксировали интенсивность стимулированной ЛЗХЛ в динамике на люминоскапе «Accent» (Финляндия), результаты представлены в отн. ед. свечения (RLU).

Активность миелопероксидазы (МПО) в супернатантах культур (секреторная МПО) моноцитов определяли спектрофотометрическим методом в тесте с ортофенилендиамином [Бакуев М.М. с соавт., 1991]. Интенсивность оптической плотности фиксировалась в многоканальном спектрофотометре «Anthos HMTL III» (Австрия) при длине волны 492 им.

Уровень эластазы и катепсина G в супернатантах кратковременных культур моноцитов определяли спектрофотометрическим методом, основанным на гидролитической активности этого фермента с использованием специфического субстрата ВАЕЕ («Sigma», США), растворенного в ацетопитриле и ВТЕЕ («Sigma», США), растворенного в метаноле, соответственно [O'Connor С.М., 1993; Митенькина Е.В., 2004]. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 340 нм («Anthos HMTL III», Австрия) в динамике. Уровень секреции АПО-А1 в клеточных супернатантах культур моноцитов определяли иммунотурбидиметрическим методом [Shchyogolev S.Y., 1999] при помощи коммерческих наборов «Spinreact» (Испания). Активность индоламин-2,3-диоксидазы (IDO) моноцитов определяли спектрофотометрически по изменению концентрации кинуренипа, как в спонтанном, так и стимулированном ЛПС (100 нг/мл)(«Sigma», США) варианте теста [Braun D., 2005].

Экспрессия CDllß, CD14, CD25, TLR4 на моноцитах оценивалась при помощи моноклональных антител («eBioscience», Канада) на проточном цитофлуриметре «BD Calibur» (США) согласно методике производителя антител.

Уровень цнтокннов (ФНО-а, ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-lß, ИЛ-1а, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-17) в супернатантах культур фракционированных моноцитов, С04+-лимфоцитов и мононуклеарных лейкоцитов оценивали иммунофермеитным методом с использованием коммерческих наборов («Цитокин», «Протеиновый контур», «Вектор-Бест», Россия, «IBL», Германия, «eBioscience», США) согласно методике производителя. Контролем служили пробы, в которые вместо гормона вносили равное количество полной питательной среды (ППС). В ряде

экспериментах на фракционированных моноцитах уровень цитокипов оценивался па пиках ЛПС-индуцированной (E.coli; 026:В6; «Sigma», США, 100 нг/мл) секреции.

Оценка фенотипа лимфоцитов. После суточной инкубации с ХГ и/или ИЛ-2 определяли следующие субпопуляции Т-клеток: Th-лимфоциты CD3+CD4+ (CD3-FITC/CD4-PE), цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) CD3+CD8+ (CD3-FITC/CD8-PE). При изучении экспрессии CD25 на Th-клетках оценивали количество активированных Th-лимфоцитов CD3+CD4+CD25dim (CD4-FITC/CD25-PE), и активированных цитотоксических Т-лимфоцитов CD3+CD8+CD25+ (CD8-FITC/CD25-PE). Экспрессию мембранного рецептора CD95 исследовали на Th-клетках CD3+CD4+CD95+ (CD95-FITC/CD4-PE) и ЦТЛ: CD3+CD8+CD95+ (CD95-FITC/CD8-PE). После суточной инкубации с ХГ и/или ИЛ-2 оценивали фенотип лимфоцитов, определяя содержание NK-клеток с фенотипом CD3"CD 16+CD56+ и NKT-клеток с фенотипом CD3+CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16,56-PE), согласно методике производителя антител («Beckman Coulter», США).

Апоптоз лимфоцитов оценивали путем окрашивания аинексином-V (AnV-FITC) и йодистым пропидием (PI). Данный метод позволяет идентифицировать клетки, находящиеся в ранней (AnV+/PI") и поздней стадии (AnV+/PI+) апоптоза [Сибиряк C.B. с соавт. 2008]. Для индукции апоптоза использовали anTH-CD3 мопоклональиые антитела (5 мкг/мл, «Мсдбиоспектр», Россия), которые вносили в культуры вместе с гормонами [Bijl M. et al., 2001]. Контролем служили пробы, в которые добавляли только индуктор апоптоза.

Для оценки уровня Treg МПК культивировали с ХГ (и/или блокатором ПКА Н-89) в ППС в течение суток в условиях 5% С02. Поскольку экспрессия транскрипционного фактора Foxp3 является основным маркером Treg, с помощью внутриклеточного окрашивания моноклопальными антителами в гейге лимфоцитов определяли уровень CD4+Foxp3+ (Treg) (CD4-PE/Foxp3-FITC; «Biolegend», США) клеток, оценивая не менее 30000 событий в пробе. Фиксацию и пермеабилизацию осуществляли при помощи буферов «Biolegend» (США) согласно методике. Количество Treg оценивали как процент CD4 CD25 Foxp3+ клеток в гейте CD4+CD25bri8ht лимфоцитов (CD4-P.Cy5/CD25-PE/Foxp3-Alexa Fluor®488; «Biolegend», США). В ряде экспериментов формирование Treg оценивали в 3-х сут. культуре СТ)4+-позитивных лимфоцитов, выделенных па магнитных бусах («Invitrogen», США) методом негативной селекции. Для индукции формирования Treg в культуры добавляли TGF-P (5 иг/мл, «GIBCO», США), магнитные частицы с an™-CD3/CD28 моноклопальными антителами ( «Invitrogen», США), и нейтрализующие анти-ИФН-у и анти-ИЛ-4 антитела (10 мкг/мл, «eBioscience», США). После 72 ч инкубации с гормоном удаляли магнитные частицы, и оценивали количество Treg как процент CD4+Foxp3+ клеток, параллельно исследуя экспрессию CD152 (CTLA-4) (CD4-FITC/Foxp3-P.Cy5/CD152-APC; «eBioscience», США) и уровень ИЛ-10 в супернатантах культур («Вектор-Кест», Россия). Для индукции дифферепцировкн Thl7 из С04-позитивных Т-лимфоцитов в культуры вносили ИЛ-1(1 (10 нг/мл, «eBioscience», США) и ИЛ-6 (10 нг/мл, «eBioscience», США). Количество Thl7

оценивали как процент С04+-лимфоцитов, экспрессирующих ROR-yt, ИЛ-17А и/или CCR6 (CD 196) (CD4-FITC/ROR-yt-PE/IL 17 А-Р.Су5; CD196-PE; все антитела «eBioscience», США). В супернатантах культур Thl7 иммуноферментным методом оценивали уровень ИЛ-17А («eBioscience», США).

Для оценки внутриклеточного синтеза цитокинов в CD3+CD4+- и С03+С08+-Лимфоцитах использовали РЕ-конъюгированные антитела к ИЛ-4 и ИФН-у («Caltag», США). В качестве активаторов для стимуляции внутриклеточного синтеза использовали форболмиристацетат (50 нг/мл, «Sigma», США) в комбинации с иономицином (50 мкг/мл, «Sigma», США), затем применяли брефелдин А (10 мкг/мл, «ICN Ph.», США). Фиксацию и пермеабилизацию осуществляли при помощи коммерческих буферов «Biolegend», США согласно методике. Результаты учитывались на проточном цитофлюориметре «BD facscalibur» (США).

Статистический анализ. Результаты представлены в виде средней М±т. О достоверности межгрупповых различий судили с помощью параметрического /критерия Стыодента, или непараметрического и-критерия Манна-Уитни в зависимости от нормальности распределения данных. Проверка статистических гипотез осуществлялась при критическом уровне значимости Р<0,05. В ряде случаев рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона (г).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

РОЛЬ ФАЗ МЕНСТРУАЛЬНОГО ЦИКЛА В РЕАЛИЗАЦИИ ЭФФЕКТОВ ХГ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

ЖЕНЩИН

Влияние ХГ на фагоцитарную активность моноцитов. Установлено, что гормон угнетал фагоцитарную активность моноцитов женщин в фолликулярной фазы в отношении E.coli lum+, причем депрессивный эффект ХГ в высокой концентрации был более выражен и затрагивал всю динамику процесса. В то же время, по отношению к моноцитам лютеиновой фазы, продемонстрирован стимулирующий эффект ХГ (100 ME/мл) на 15-30 минутах исследования (рис. 16). Возможно, стимуляция фагоцитарной активности моноцитов в лютеиновую (прогестерондоминантную) фазу цикла может служить необходимым фактором сохранения беременности, так как при помощи фагоцитоза утилизируются не только патогенные агенты и тканевой детрит, но и апоптотические клетки, избыточное накопление которых в фетоплацентарной зоне может иметь фатальные последствия для плода [Abrahams V.M. et ed., 2004].

Показано, что внесение высокой концентрации ХГ (100 ME/мл) в культуры фракционированных моноцитов, полученных от женщин, находящихся в фолликулярной фазе менструального цикла, приводило к угнетению фагоцитарной активности, затрагивающей как количество фагоцитирующих клеток, так и их поглотительную способность (табл. 1). В то же время, при фагоцитозе ФЭБИ или латекса, депрессивный эффект гормона был менее выражен и затрагивал только процент фагоцитирующих клеток. В отношении моноцитов, полученных от женщин, находящихся в лютеиновой фазе цикла,

эффекты гормона были противоположными. Так, ХГ в концентрации 100 МЕ/мл достоверно стимулировал фагоцитоз ФЭБ и не оказывал модулирующего эффекта на фагоцитоз латекса и ФЭБИ (табл.1). Известно, что поглощение латекса обусловлено гидрофобными взаимодействиями, фагоцитоз ФЭБ осуществляется преимущественно scavenger- и маннозными рецепторами, а взаимодействие с ФЭБИ происходит через (Зринтегрины [Wiedemann A. et а/., 2001]. По-видимому, в разные фазы менструального цикла специфическое соотношение половых стероидных гормонов формирует структурно-функциональную основу, позволяющую ХГ в фолликулярную фазу угнетать, а в лютеиновую стимулировать силу активационных сигналов с маннозных- и scavenger- рецепторов. В то же время [Зринтегриновые рецепторы и мембранные структуры, ответственные за гидрофобные взаимодействия, в меньшей степени модулируются стероидным фоном.

- контроль -ХГ100 МЕ/мл

Рис.1. Влияние ХГ на фагоцитоз E.coli lum моноцитами периферической крови женщин в зависимости от фазы менструального цикла (п=8).

Примечание: *, **, # - достоверные (р<0,05) по t-критергио Стыодентаразличия с контролем. Ось х — время наблюдения, ось у — ИФА (индекс фагоцитарной активности), а — фолликулярная фаза, б) —лютеиновая фаза.

11ри оценке секреторной активности моноцитов установлено, что при внесении ХГ в ЛПС-стимулированные культуры моноцитов гормон статистически значимо повышает уровень ИЛ-6 и ИФП-а только моноцитами женщин фолликулярной фазы (табл. 2). Эффекты ХГ на продукцию ИФН-а зависели не только от фазы менструального цикла, но и от концентрации гормона. Так, гормон (100 МЕ/мл) повышал уровень ИФН-а в моноцитах фолликулярной фазы цикла, как в ранний пик секреции (1.5 ч), так и спустя сутки, когда происходит синтез de novo. В то же время, в низкой концентрации ХГ' повышал уровень ИФН-а (24.0 ч) в моноцитах лютеиновой фазы. Гормон не влиял на продукцию моноцитами Г-КСФ, ИЛ-1а и ФНО-а, однако под влиянием

низкой концентрации ХГ продукция Г-КСФ моноцитами лютеиновой фазы статистически значимо превышала таковую в фолликулярной фазе (табл. 2).

Таким образом, в фолликулярную фазу менструального цикла гонадотропин в концентрации, соответствующей его максимальному уровню в I триместре беременности (100 МЕ/мл) повышает синтез ИФН-а и ИЛ-6, а в лютеиновую фазу повышает уровень только ИФН-а в концентрации, экстраполированной с раннего гестационного срока и/или II - III триместров беременности (10 МЕ/мл). Продукция данных цитокинов крайне важна для благополучного развития беременности, поскольку ИЛ-6 является одним из индукторов эндокринной функции плаценты и поддерживает ТЬ2-поляризацию иммунного ответа интраэпителиальных лейкоцитов децидуальной оболочки [Ширшев C.B., 2002]. ИФН-а, в свою очередь, пролонгирует процессы имплантации и плацентации зиготы [Roberts R.M., 1989] и активирует ангиогенез и репарацию тканей матки при инвазивном росте плаценты [Strikantan L. et al., 1990].

а)

□ фолл фаза □ лют фаза

Контроль ХГЮМВмл ХГ ЮОМЕ/мл

6)

J_

Контроль ХПОМЕ/мл ХГЮОМЕ/мл

Рис. 2. Влияние ХГ на уровень АПО-А1 в супернатантах фракционированных моноцитов в зависимости от фазы менструального цикла (п=6). Примечание: *- достоверные (р<0,05) по (-критерию Стыодента различия с контролем. Ось х — экспериментальное воздействие, ось у - концентрация АПО-А1, а) -спонтанный вариант, б) - стимулированный ЛПС вариант.

Учитывая, что продукция моноцитами структурного компонента липопротеинов высокой плотности - АПО-А1 ведет к аутокринной блокаде синтеза провоспалительных цитокинов, в частности Ф1 Ю-а [Нука N. е/ а!., 2001], важно было оценить влияние ХГ на синтез этого фактора. Установлено, что вне зависимости от фаз цикла ХГ (100 МЕ/мл) стимулирует секрецию АПО-А1 интактными моноцитами. Однако, в условиях суточной активации моноцитов ЛПС, ХГ оказывает стимулирующий эффект на секрецию АПО-А1 только моноцитами лютеиновой фазы цикла (рис. 2). Таким образом, ХГ обладает самостоятельным, не зависимым от фаз цикла АПО-А1-стимулирующим действием на уровне интактных моноцитов, а у ЛПС-активированных моноцитов его эффект протектируется прогестероном.

Известно, что уровень моноцитарного АПО-А1 прямо регулируется MI IO, трансформирующей его в неактивный продукт [Zheng L. et. а!., 2004], поэтому следующим этапом исследования явилось изучение влияния ХГ на уровень секреторной МПО моноцитов. Показано, что ХГ снижал уровень спонтанной МПО в культуре моноцитов фолликулярной фазы цикла, в то время как зимозан-индуцированная МПО достоверно усиливалась высокой концентрацией ХГ (рис.За). В моноцитах лютеиновой фазы ХГ, напротив, снижал уровень МПО в спонтанном варианте теста и пе влиял на зимозан-индуцированную продукцию фермента (рис.Зб). По-видимому, депрессивный эффект ХГ на уровень МПО в лютеиновую фазу цикла обусловлен действием прогестерона, который доминирует на протяжении всей беременности.

0,25 0,2 1 0,15 ■ 0,1 0,05 0

□ фолл. фаза □ лют. фаза

Г*1

Контроль ХПОМЕ/мл ХПООМЕ/ил

б)

Контроль

ХГЮОМЕ/мл

Рис. 3. Влияние ХГ на уровень секреторной МПО в супернатантах фракционированных моноцитов в зависимости от фазы менструального цикла (п=6). Примечание: *- достоверные (р<0,05) по /-критерию СтыоОента различия с контролем. Ось х - экспериментальное воздействие, ось у — уровень МПО, а) — спонтанный вариант, б) — стимулированный зимозаном вариант.

Установлено, что по отношению к моноцитам фолликулярной фазы, ХГ оказывал депрессивные эффекты на продукцию АФК, фиксируемую в спонтанном варианте ЛЗХЛ (100 МЕ/мл) (рис.4а). Интересно, что ХГ параллельно угнетал секрецию МПО, однако корреляционный анализ не выявил достоверных связей. В тоже время, в латекс-индуцированном варианте ЛЗХЛ гормон (100 МЕ/мл) оказывал выраженное стимулирующее действие на окислительную активность моноцитов, которое сохранялось в динамике всего эксперимента (5-20 мин).

Эффекты, оказываемые ХГ на спонтанную окислительную активность моноцитов, полученных от женщин в лютеиновой фазе, были во многом аналогичны. Так, гормон (10 и 100 МЕ/мл) угнетал как ЛЗХЛ, так и активность МПО. Однако корреляционный анализ показал, что под действием гормона, в отличие от фолликулярной фазы, возникает достоверная обратная корреляционная зависимость между активностью МПО и спонтанной ЛЗХЛ: для ХГ (10 МЕ/мл) г=-0,7; для ХГ (100 МЕ/мл) г=-0,8. По-видимому, это связано с реципрокными механизмами регулирования НАДФ-оксидазного комплекса и

М1 (О в условиях ХГ-зависимой депрессии окислительного потенциала моноцитов лютеиновой фазы. В отношении индуцированного варианта ЛЗХЛ показано, что ХГ в высокой концентрации снижал окислительную активность латекс-стимулированных моноцитов только в ранний период инкубации (5 мин), в то время как в низкой - оказывал аналогичный эффект на протяжении всего периода наблюдения (рис.4б).

Рис. 4. Влияние ХГ на показатели ЛЗХЛ моноцитов женщин в зависимости от фазы менструального цикла (п=7). Примечание: *- достоверные (р<0,05) по t-критерию Сгпыодента различия с контролем. Ось х - время наблюдения, ось у - уровень ЛФК, а) — фолликулярная фаза, б) —лютеиновая фаза.

Известно, что CDllß входит в состав рецептора для компонента комплемента 3 (CR3 (CD18/CD11ß)), и опосредует фагоцитоз частиц, опсонизированных iC3b, и является молекулой межклеточной адгезии. Показано, что ХГ снижает экспрессию CDllß на моноцитах женщин, находящихся в фолликулярной фазе цикла (данные не приводятся), и не влияет на этот показатель, если фаза была лютеиновой. Известно, что продуктами секреции моноцитов являются сериновые протеиназы эластаза и катепсин G [Nathan N., 1987], которые участвуют в ремоделировании тканей в период инвазивного роста плаценты, а также в процессах воспаления. Установлено, что ХГ достоверно повышал активность эластазы в супернатантах культур моноцитов женщин только фолликулярной фазы цикла (табл. 8, стр. 29). Помимо этого, эластаза, наряду с катепсинами, необходима для миграции клеток и преодоления преград в виде базальных мембран. Однако, уровень катепсина G — катионного белка, родственный эластазе, не изменялся под действием гормона (данные не приводятся).

В заключение можно сказать, что ХГ разнонаправлено модулирует функциональную активность моноцитов женщин в зависимости от того, в какую фазу цикла были получены клетки. В разные фазы менструального цикла соотношение половых стероидных гормонов и/или уровень гипофизарных гормонов (ЛГ, ФСГ, пролактин) формируют разную чувствительность моноцитов

к XI и определяют направленность его действия. В лютеиновую фазу, когда доминирует прогестерон (8,03±2,86 мкг/л, п=51), ХГ стимулирует фагоцитарную активность моноцитов, угнетая базальную активность секреторной МПО и повышая продукцию Л110-Л1 и ИФН-а (рис. 5). В фолликулярную фазу, когда относительно высок уровень эстрадиола (70,54± 15,98 пг/мл, п=68), ХГ угнетает фагоцитоз, секрецию спонтанной секреторной МПО, экспрессию CD11[5 и спонтанную продукцию АФК. Одновременно XI" стимулирует индуцированную продукцию секреторной МПО, ИЛ-6, ИФП-а, АФК и спонтанную продукцию АПО-А1 и эластазы (рис. 5). Очевидно, что в фолликулярную фазу моноциты более чувствительны к действию ХГ, поэтому в дальнейшей работе исследовали клетки, полученные в эту фазу.

Таким образом, выявленные нами механизмы моноцит-регулирующего действия ХГ ставят данный гормон не только в ряд чрезвычайно важных регуляторов эндокринного зеркала беременной женщины, но и особо выделяют его как эффективного иммунного фетопротектора.

Фагоцитоз Frniiiur+ Фагоцитоз

' '"-х Е.соН 1их+

Ф'ЗБ

ФЭБ

ФЭБИ

АФК, МПО 4

лютепновая фаза

ИЛ-6, ИФН-а, АПО-А1, AIIO-A1 стим. Эластаза, £2 АФК стим., МПО стим.

т

фолликулярная фаза

Л ПО-VI

Рис. 5. Роль фаз менструального цикла в реализации модулирующего эффекта ХГ на функции моноцитов

Таблица 1

Влияние ХГ на дифференцированную фагоцитарную активность фракционированных моноцитов периферической крови женщин в зависимости от фазы менструального цикла

Л» Экспериментальное воздействие п Процент фагоцитоза, ФЭБ ФЧ, ФЭБ ФИ, ФЭБ Процент фагоцнтота, ФЭБИ ФЧ, ФЭБИ ФН, ФЭБИ Процент фагоцитоза, латекс ФЧ, латекс ФИ, латекс

Фолликулярная фаза

/ Контроль 6 42.37±4.85 0.806±0.137 1.820±0.144 54.66±3.77 2.49±0.34 0.58±0Л1 68.27±3.70 4.67±1Л6 1.63±0.41

2 ХГ (10 МЕ/мл) 6 38.46±3.70 0.654±0.075 1.695±0.100 57.73±6.81 2.34±0.23 0.69±0.22 69.88±3.50 5.51 ±1.01 1.94±0.51

3 ХГ (100 МЕ/мл) 6 29.96±2.4* 0.434±0.028 * 1.462±0.047 * 47.11±3.61* 7.35±1.03 0.46±0.09 49.89±6.77* 7.35±1.03 1.64±0.37

Лютсшюван фаза

4 Кошроль 6 33.33±2.22 0.636±0.018 1.935±0.084 49.54±5.62 2.79±0.21 0.61±0.11 69.36±3.53 5.94±1Л8 1.97±0.37

5 ХГ (10 МЕ/мл) 6 33.20±4.17 0.629±0.092 1,907±0.178 52.86±5.76 2.48±0Л7 0.60±0.10 55.57±6.33 7Л9±0.91 1.94±0.47

6 ХГ (100 МЕ/мл) 6 47.99±2.82* 0.867±0.067 * 1.813±0.106 52.56±6.64 2.63±0.20 0.65±0.15 49.05±9.25 5.56±1.27 1.39±0.49

Примечание: здесь и далее * - достоверные (<0,05) по I-критерию Стьюдентаразличия с контролем.

Таблица 2

Влияние ХГ на продукцию цитокинов моноцитами периферической крови женщин в зависимости от фазы менструального цикла

№ Экспериментальное Воздействие п ИЛ-1а иг/мл ифн-а ед/мл фно-а пг/мл 11л-6 иг/мл г-ксф м кг/мл 11ф11-а ед/мл

1.5 ч 1.5 ч 6.0 ч 24.0 ч 24.0 ч 24.0 ч

Фолликулярная фаза

1 Контроль 6 502.20±49.93 18.13±2.47 447.04±47.95 29.17±5.69 69.95±14.30 23.84±4.15

2 Контроль гормона + ЛПС (100 нг/мл) 6 693.10±85.43 # 19.30±4.82 1178.4±66.55 # 280.19±54.44 и 1256.3±127.4 # 69.98±22.72 #

3 ХГ (10 МЕ/мл) + ЛПС (100 нг/мл) 6 802.40±55.08 24.97±9.03 874.35±158.74 392.99±78.69* 1510.2±391.1 76.69±16.43

4 ХГ (100 МЕ/мл) + ЛПС (100 нг/мл) 6 685.60±73.51 81.36±3.97* 96б.25±130.86 432.53±89.19* 1587.8±401.9 94.29±22.61 *

Лютемновая фаза

5 Контроль 6 446.60±53.75 13.63±0.39 598.93±47.23 29.61±6.99 138.86±16.04 37.68±9.59

6 Контроль гормона + ЛПС (100 нг/мл) б 630.10±86.03# 31.62±9.38 1258.2±160.18# 314.94±76.95# 1897.8±298.4 # 65.45±16.69#

7 ХГ (10 МЕ/мл) + ЛПС (100 нг/мл) б 720.80±51.16 38.52±12.95 1029.0±62.58 330.22±67.25 2558.9±173.4* 120.7±28.48*

8 ХГ (100 МЕ/мл) + ЛПС (100 нг/мл) 6 535.60±68.12 67.22±12.21 1618.7±126.31 310.59±86.66 1283.0±163.2 58.68±13.29

Примечание: здесь и далее * - достоверные (<0,05) по г-критерию Стъюдентаразличия с контролем гормона; # - с контролем ЛПС.

МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ МОНОЦИТ-МОДУЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ ХГ 1. ХГ как эндогенный лиганд для TLR4 моноцитов.

Роль TRIF-комплекса и ПКА

Согласно концепции Acevedo H.F. (2002), ХГ не имеет своего «истинного» рецептора, реализуя эффекты через гормональный ЛГ-рецептор за счет высокой степени гомологии с ЛГ. Поэтому возникло предположение о взаимодействии ХГ с клетками иммунной системы через мембранные молекулы, которые не являются его «классическими рецепторами» - в частности, с рецепторами TLR [Ширшев C.B., 2002]. Известно, что внеклеточные домены как TLR [Hashimoto С. et al., 1988], так и ЛГ/ХГ-рецсптора [Rosemblit N. et al.; 1988; Bhowmick N. et al, 1996] содержат лейцин-богатые (leucin-rich) LRR-участки, что может служить структурной основой взаимодействия ХГ с TLR.

Одной из экспрессируемых изоформ TLR является TLR4, широко представленная на моноцитах и участвующая в связывании ЛПС. Помимо ЛПС, TLR могут распознавать ряд эндогенных продуктов, появление которых не связано с инфицированием (белки теплового шока, мочевая кислота, а также продукты некроза и апоптоза) [Tsan M.F. & Gao В., 2004]. Таким образом, ХГ может быть кандидатом на роль эндогенного лиганда для TLR.

Учитывая, что TLR4 рецептирует молекулы ЛПС в комплексе с CD14, ранее было исследовано влияние ХГ на детекцию этой молекулы. Часовая инкубация ХГ (10, 100 МЕ/мл) с фракционированными моноцитами практически вдвое снижает уровень детекции молекул CD 14, что является доказательством лигирования CD14 гормоном беременности [Ширшев C.B., Заморина С.А., 2004].

Как видно из рис. 6а, в присутствии высокой дозы ХГ снижался и уровень CD14+TLR4+-no3HTHBHi.ix клеток. Мы предполагаем, что в данном случае речь идет не о регуляции экспрессии, а об детекции этих молекул, так как ХГ, взаимодействуя с молекулами TLR4, экранирует их от антител. Помимо этого, нашими исследованиями установлено, что наиболее активно ХГ (100, 1000 МЕ/мл) взаимодействует с молекулами TLR4 в ранние сроки инкубации (1, 5, 10 мин; 37°С) (рис. 6 б). Таким образом, ХГ связывается с поверхностью моноцитов, взаимодействуя с молекулами TLR4.

Для изучения роли молекул TLR4 в реализации модулирующей активности ХГ применяли ингибиторный анализ: 1) TLR4 блокировали моноклональными антителами; 2) TRIF-комплекс, участвующий в каскадной передаче сигнала с TLR по Му088-независимому пути, блокировали препаратом резвератрол; 3) для «выключения» ЛГ/ХГ рецептора в исследовании применяли блокатор ПКА Н-89.

Так как нами установлено, что ХГ регулирует фагоцитоз, ЛЗХЛ, секрецию МПО, АПО-А1, ИЛ-6 и ИФН-а, изучали роль молекул TLR4 в реализации эффектов ХГ именно на эти показатели. Полученные нами результаты разделились на три группы: так, эффекты ХГ на процессы фагоцитоза и секреции ИФН-а зависели от блокады TLR4; эффекты ХГ в отношении секреции AÏIO-A1 и МПО зависели от активности ПКА. В то же время, большая часть исследуемых показателей зависела и от TLR4, и от ПКА.

а)

CD14

б)

80

■f 60

5

fi 40

a

<-> 20

0

Рис. 6. Влияние ХГ на детекцию СШ4+ТЫ*4+-клеток в системе in vitro.

а) Гистограммы, отражающие влияние ХГ па количество CD14*TLR4* -клеток а культуре па примере одного эксперимента. И правом верхнем кваорапте указан процент дублыюзитивных клеток в гейте .моноцитов (гейтировано по FSS/SS). По оси х - интенсивность флуоресценции по каналу FL1, FITC; по оси у - по каналу FL2, РЕ: .6) влияние ХГ па йетекцию CD14*TLR4'-клеток в оина.мике (п=4): ' - аостжерпые (р<0,05) по и-критерию Мапна-Уитни различии с контролем.

ТЫ*4-зависимые эффекты ХГ. Внесение гормона в культуры моноцитов приводило к угнетению их фагоцитарной активности в отношении E.coli tum (табл. 3). На фоне блокады TLR4 антителами эффекты высокой концентрации гормона не воспроизводились, что свидетельствует о вовлечении этих рецепторов в реализацию эффектов ХГ. Блокада TRIF-комплекса резвератролом отменяла гормональный эффект, а «выключение» ЛГ/ХГ-рецептора при помощи блокады ПКА не влияло на эффекты ХГ (табл. 3). Эги результаты воспроизводились также при оценке фагоцитоза методом, основанным на поглощении ФЭБ [Ширшев C.B., Заморина С.А., 2006]. Таким образом, филогенетически древняя функция, какой является фагоцитоз, регулируется гормоном с вовлечением То11-подобных рецепторов через Му088-независимый транедукционный путь.

F1

* t * il * * J- Ar1

контроль 1 мин 5 мин 10 мин 15 мин

О ХГ 100 МЕ/мл □ ХГ1000 МЕ/мл

Показано, что ХГ в высокой концентрации (100 МЕ/мл) достоверно повышает продукцию моноцитами ИФН-а, однако на фоне блокады ТЪК4 этот эффект полностью отменялся. На фоне «выключения» трансдукции с ЛГ/ХГ-рецсптора гормон оказывал стимулирующий эффект на синтез ИФН-а (табл. 4). По-видимому, ХГ связывается на поверхности моноцитов с молекулами ТЬЯ и активирует ТЮР-зависимый путь запуска синтеза ИФН-а.

ПКА-зависимые эффекты ХГ. Установлено, что ХГ угнетает уровень секреторной МПО. На фоне блокады ТЬЯ4 и/или ТМР-комплекса депрессивный эффект ХГ на продукцию секреторной МПО моноцитами полностью воспроизводился, что свидетельствует о вовлечении не связанных с ТЫ14 механизмов в реализацию гормонального эффекта. На фоне блокады ПКА депрессивный эффект гормона полностью отменялся (табл. 3), что подтверждает вовлечение ЛГ/ХГ-рецептора. Аналогичные результаты продемонстрированы в отношении секреции АПО-А1 моноцитами женщин. Применение антител к ТЬЯ4 не влияло на стимулирующий эффект гормона (100 МЕ/мл), однако на фоне «выключения» ЛГ/ХГ-рецептора этот эффект полностью отменялся. Установлено, что ХГ угнетал продукцию АФК в спонтанном варианте ЛЗХЛ, этот эффект воспроизводился на фоне блокады ТЬИ4 и ТЯШ-комплекса (табл. 3). На фоне блокады ПКА гормон не влиял на продукцию АФК моноцитами.

ТЬ114 и ПКА-зависимые эффекты ХГ. В отношении регуляции окислительной активности в стимулированной ЛЗХЛ показано, что ХГ вовлекает в реализацию своих эффектов как Му088-зависимый, так и цАМФ-зависимый путь трансдукции (табл.3). Таким образом, гормональная модуляция стимулированной ЛЗХЛ в большей степени связана с ТЫ14 и ТЯ1Р-комплексом. Известно, что ТЬЯ4/С014/М02 после активации непосредственно взаимодействует с дрейфующей в липидном рафте НАДФ-оксидазой, участвующей в синтезе АФК [МсОеИпск АЛ7., 2010].

Как видно из табл. 3, ХГ повышал уровень эластазы в супернатантах кратковременных культур моноцитов. Однако, стимулирующий эффект ХГ (100 МЕ/мл) па фоне блокады ТЬЯ4 был достоверно выше самостоятельных эффектов аЬТЫ14 и ХГ 100 МЕ/мл. Таким образом, блокада ТЫ14 способствовала реализации стимулирующего эффекта ХГ на продукцию эластазы, что связано, вероятно, с суммированием эффектов на уровне трансдукции гормонального сигнала. Однако, в случае «выключения» трансдукции с ЛГ/ХГ-рецептора, депрессивный эффект гормона отменялся, что свидетельствует о частичном вовлечении этого рецептора в реализацию сигнала.

Установлено, что гормон стимулирует ЛПС-индуцированный синтез моноцитами женщин ИЛ-6. На фоне блокады ТЫ14 антителами, а также на фоне блокады ЛГ/ХГ-рецептора, стимулирующий эффект гормона (100 МЕ/мл) полностью воспроизводился. Более того, на фоне «двойной блокады», ХГ реализовывал стимулирующий эффект. Важно отметить, что в условиях «выключенного» ЛГ/ХГ-рецептора гормон стимулировал продукцию ИЛ-6, которая была достоверно выше таковой в случае блокады ТЬЯ4 (табл.4). Вероятно, ХГ связывается и с ЛГ/ХГ-рецептором, и с ТЕЯ4, в зависимости от доступности рецепторов.

Таблица 3

Влияние ХГ на функциональную активность моноцитов. Роль ТЫ14, __ ТШР-комплекса и ПКА (п=10) _______

.р.

л « м л О -а о с. н с и ы ** о о Й Резвератрол (50 мкмоль) ХГ (100 МЕ/м.' +резвератрол (50 мкмоль) л -J н XI я ХГ (100 ME/vli +abiTLR4 Ц as н S J я О ? ь о а О ? 3 * + о\ 00 ХГ (100 МЕ/м. +Н-89

Фагоцитоз E.coli 1ит% ПФЛ, 20 мин. 70,99± 63,77± 81,90± 77,22± 76,99± 79,70± 76,81± 79,27± 61,44±

2,29 2,44* 1,45* 0,86 1,47* 3,05 1,18 0,36 1,53*

Спонтанная 0,072± 0,042± 0,063± 0,045± 0,066± 0,043± 0,050± 0,071± 0,072±

ЛЗХЛ (RLU) 0,005 0,005* 0,004 0,003* 0,003 0,004* 0,008* 0,005 0,005

Стим. Л!\Л, E.coli К12 (RLU), 20 мин 0,442± 0,038 0,215± 0,040* 0,3 80± 0,041 0,280± 0,042* 0,412± 0,132 0,334± 0,071 0,360± 0,076 0,411± 0,042 0,253± 0,023*

M1IO, секреторная (опг.ед) 0,3 82± 0,016 0,316± 0,025* 0,327± 0,016* 0,306± 0,006* 0,439± 0,022* 0,311± 0,015* 0,324± 0,014* 0,410± 0,017 0,439± 0,029

ЛПО-Л1, мг/дл 1,148± 2,088± 1,151± 1,885± 1,145± 2,101± 1,975± 1,188± 1,144±

0,372 0,243* 0,251 0,267* 0,298 0,239* 0,284* 0,245 0,263

"Зластаза, 0,490± 0,830± Н.д. Н.д. 0,799± 1,086± Н.д. 0,678± 0,944±

нМ/млн.кл/мин 0,051 0,081* 0,067* 0,108* 0,065* 0,078*

ПФП-а, ед/мл 63,33± 79,48± Н.д. Н.д. 65,70± 69,25± Н.д. 78,96± 81,15±

4,39 5,01* 5,91 4,54 4,99* 5,08*

НЛ-6, нг/мл 512,25 643,29 М.д. Н.д. 610,56 748,86 Н.д. 549,23 1190,9

±52,52 ±20,84 А ±17,16 ±29,69 * ±28,09 9±137, 9*

Примените: * - достоверные (р<0,05) различия с контролем по t-критерию (.'тыодеита.

I 2 3 4 5 6 7

экспериментальное воздействие

Рис. 7. Влияние ХГ на продукцию ИЛ-8 интактными моноцитами женщин. Роль ТЫ*4 и ПКА (п=12).

Примечание: 1 - контроль; 2 - ХГ 100 МЕ/мл; 3 - Н-89; 4 - Н-89+ХГ 100 МЕ/мл; 5 - контроль ичотипа; б - аЪТ1К.4; 7 - ХГ 100 МЕ/мл+аЬТШ4;8- ХГ 100 МЕ/мл+аЬТЬЯ4+Н-89;' -достоверные (р<0,05) различия с контролем по I-критерию Стьюдента.

В 2002 г. Kosaka К. с коллегами показали, что ХГ усиливает продукцию ИЛ-8 моноцитами небеременных женщин, при этом авторы обнаружили лишь следовые количества ДНК ЛГ/ХГ-рецептора в этих клетках. Авторы предполагают, что ХГ на поверхности моноцитов связывается с маннозными рецепторами (C-lectin). Предварительный контакт моноцитов с D-маннозой ослаблял стимулирующий эффект ХГ в отношении синтеза ИЛ-8, однако блокада ПКА не влияла на реализацию гормонального эффекта.

Мы в аналогичных условиях подтвердили, что стимулирующий эффект ХГ на уровень ИЛ-8 (в интактных 2 сут. культурах) воспроизводился на фоне блокады ПКА. Однако, принципиально важным моментом является то, что ИЛ-8-стимулирующий эффект ХГ воспроизводился и на фоне заблокированных антителами TLR4 (рис.7). В условиях двойной блокады, когда были «выключены» как ПКА, так и TLR4, стимулирующий эффект гормона полностью отменялся (рис.7). Таким образом, можно сделать вывод о том, что в зависимости от доступности рецепторов гормон может связываться и «работать» как через ЛГ/ХГ-рецептор, так и через молекулы TLR4, не исключая взаимодействия с маннозными рецепторами.

Известно, что процессы секреции и фагоцитоза тесно связаны с функционированием Са2+-каналов, преимущественно L-типа [Striessnig J. et al. 1998]. Показано, что депрессивные эффекты ХГ на фагоцитарную активность моноцитов отменялись в присутствии ингибитора Са2+-каналов L-типа, что вполне закономерно в силу зависимости процессов фагоцитоза от уровня Са2+. Стимулирующие эффекты ХГ в отношении продукции ИФН-а, АПО-А1 и эластазы, как и депрессивные эффекты в отношении секреторной МПО отменялись на фоне блокады Са2+-каналов (данные не приводятся). Вероятно, стимулирующие эффекты ХГ ассоциированы с увеличением концентрации кальция в клетке, посредством как высвобождения из эндоплазматического ретикулума, так и поступления через мембранные потенциалзависимые Са2+-каналов L-типа [Korbonits М. et al., 2004; Anderson L. et al., 2005]. Блокада Ca2+-каналов L-типа, таким образом, принимает участие в регулировании как TLR4-, так и ПКА-зависимых эффектов ХГ.

Анализируя результаты по ИФН-а хочется отметить, что ХГ повышал продукцию этого цитокина, вовлекая TLR4, однако на фоне блокады Са2+'каналов изоптином этот эффект инвертировался, приобретая депрессивную направленность. В 2012 г. Chiang с коллегами показал, что каскад PLCy2-IP3-Са2+ инфлюкс необходим для эндоцитоза TLR4 и активации IRF3. В контексте этих сведений объяснимо, почему блокада Са2+-каналов отменяет эффект ХГ. Довольно интересен тот факт, что АПО-А1, продукция которого стимулируется гормоном, ослабляет пальмитат-опосредованную активацию TLR4 в эндотелиальных клетках, блокируя сигнал на уровне NF-kB, что предполагает дальнейшее его изучение в качестве противовоспалительного агента [Cheng A.W. et al., 2012].

n2o2 hoclJ.

ХГ

X4. UZ

rv лфк4 , гп14 ^

02*1 П1- I

t

TLR4

Антитела к TLR4

Гены провоспалитель

ФНО-а, ИЛ-1р, ИЛ-8Т

Рис. 8. Гипотетический механизм действия высокой дозы ХГ (100 МЕ/мл) на моноциты, связанный с вовлечением молекул TLR4.

Примечание: Ац — аденилатциклаза; АТФ— аденозинтрифосфат; цАМФ — циклический аденозинмонофосфат; I1KA — протеиикииаза А; ИКС — протеинкиназа С; IL-IR -рецептор для ИЛ-1, ассоциированный с TLR4 и CD14; МАРК—митоген-активированные киназы; NF-IL6 — ядерный фактор; MyD88 - адаптерный белок, коактиватор сигнала с TLR; NFkB - ядерный фактор kB; TRiF - адаптерный белок, участвующий в индукции IRF3; IRF-3 -транскрипционный фактор; TIRAP, TRAM, MD2 - белки, участвующие в трансдукции с TLR4, Н-89 — ингибитор РКА; Spl — ядерный фактор.

Таким образом, используемые экспериментальные подходы позволили установить, что на уровне моноцитов существует новый механизм действия ХГ, связанный с вовлечением молекул TLR4. Как видно из рисунка 8, гормон регулирует фагоцитарную активность моноцитов и секрецию ИФН-а, вовлекая молекулы TLR4, реализуя МуВ88-независимый трансдукционный путь. Гормональная модуляция секреции МПО и АПО-А1 не связана с TLR4 и TRIF-комплексом и реализуется через ПКА-зависимый путь (ЛГ/ХГ-рецептор). В отношении окислительной активности в стимулированной ЛЗХЛ, а также синтеза эластазы, ИЛ-6 и ИЛ-8 показано, что ХГ вовлекает в реализацию своих эффектов и TLR4-3aBHCHMbiH путь транедукции и ЛГ/ХГ-рецептор. Ранее показано [Ширшев C.B. и соавт., 2000], что ХГ индуцирует повышение цАМФ в моноцитах небеременных женщин. Однако, повышение цАМФ может быть обусловлено также и сигналом с TLR4 [Song J. et al., 2007]. Для объяснения взаимодействия между Gs-рецептором и TLR4 предложена парадигма кооперации [Rallabhandi P. et al., 2008]. Так, показана конкурентная активация Gs- рецептора и TLR, приводящая в результате к повышению NF-kB-опосредованной экспрессии генов, которую связывают с дрейфом TRIF-комплекса и его связыванием с G-рецептором. [Nhu Q.M. et al., 2012]. В контексте наших исследований это может объяснять факт ПКА-зависимой секреции провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8.

Можно предположить, что связывание ХГ с TLR4 является одним из фетопротективных механизмов в период беременности, поскольку теоретически способно ограничивать ЛПС-индуцированные патологические реакции, приводящие к самопроизвольным абортам. В пользу этого предположения служит тот факт, что введение ß-субъединицы ХГ (или родственных олигопептидов) в критических состояниях, индуцированных присутствием большого количества ЛПС, способно останавливать воспалительные реакции [van den Berg J.W. et al., 2009, 2011]. Показано, что ХГ-зависимые олигопептиды имеют терапевтический потенциал для ослабления угрожающего жизни воспаления и повреждения органов, ассоциированного с травмой и геморрагическим шоком и in vivo на мышиной модели супрессирует TLR-4-опосредовапное воспаление [van den Berg J.W., Dik W.A., 2011]. Вероятно, возможность подобного взаимодействия могла сложиться в процессе эволюции, так как ХГ и То11-подобные белки являются филогенетически древними молекулами [Acevedo H., 2002].

Суммируя информацию по рецепции ХГ, хочется отметить, что для гормона существует 4 варианта взаимодействия с клеткой-мишеныо: это классический гормональный ЛГ/ХГ-рецептор, молекулы TLR4, маннозные рецепторы и рецептор TGF-ß (рис. 9). Так, в 2009 г. показано, что на уровне децидуальных NK-клеток гормон регулирует их функции через маннозные рецепторы CD209 [Капе К. et al., 2009]. Аналогично, регуляция гормоном продукции ИЛ-8 моноцитами периферической крови, как уже было сказано выше, осуществляется с вовлечением маннозных рецепторов, относящимся к С-лектинам [Kosaka К. et al., 2008]. Что касается рецептора TGF-ß, то некоторые варианты молекулы ХГ могут выступать антагонистами этого рецептора [Cole L.,

2012]. В отношении взаимодействия цельной молекулы ХГ с TLR4 хотелось бы добавить, что активация этих рецепторов также ведет к повышению уровня цЛМФ внутри клетки, что снимает существующие противоречия [Song J. et al., 2007]. Данные, полученные в 2012 г Feng С. с коллегами, показывают, что сиаловые остатки (а молекула ХГ является высокосиализированной) модулируют ЛПС-сигналинг через TLR4.

Таким образом, предложенная нами концепция «альтернативной» рецепции ХГ находит все больше экспериментальных подтверждений. Феноменология наличия множественной рецепции для ключевого гормона беременности значительно расширяет существующие представления о фундаментальных основах взаимодействия гормон-рецептор.

С-лектины

хг

ЛГ/ХГ-рецепгор

Эффекты

Schumacher A. etai, 2009

Кошка К. etai, 2002 Капе К. etat., 2009

эффекты

ShirshevS., Zamorina S.. 2006

Рис. 9. Возможные варианты взаимодействия ХГ с клетками иммунной системы.

Примечание: Лц — аденшатциклаза; цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; ПКА — протеинкиназа A; MyD88 - адаптерный белок, коактиватор сигнала с TLR; TRIF-адаптерный белок, участвующий в индукции IRF3; TIRAP, TRAM, MD2 — белки, участвующие в транедукции с TLR4, TGFbR — рецептор для TGFb; smad3, smad2 — транскрипционные факторы; Syk, CARD9- белки, участвуюгцие в транедукции с CD209.

2. Эффекты, оказываемые ХГ на функциональную активность моноцитов на фоне активации клеток ШТ-2

Одновременно с ХГ, трофоблает начинает продуцировать целый спектр цитокинов, среди которых ИЛ-2 наиболее важен, поскольку необходим для формирования иммунного ответа. Известно, что присутствие ИЛ-2 определяет направленность эффекта ХГ на функциональную активность спленоцитов мыши в системе сингенного переноса [Ширшев C.B., 1994]. Таким образом, изучали эффекты ХГ на функциональную активность ИЛ-2-активированных моноцитов женщин.

Установлено, что гормон в исследуемых концентрациях угнетал фагоцитарную активность моноцитов в отношении E.coli lurrf (рис. 10а). Важно отметить, что депрессивный эффект высокой концентрации ХГ (100 МЕ/мл) был более выражен и затрагивал всю динамику процесса, в то время как низкая концентрация гормона угнетала только ранние этапы фагоцитоза.

Самостоятельный эффект ИЛ-2 заключался в подавлении фагоцитарной активности моноцитов на раннем этапе фагоцитарного процесса (рис. 106). При совместном внесении высокой концентрации гормона и ИЛ-2 угнетение фагоцитоза выявлено на ранних этапах — с 5-й по 15-ю мин. В то же время, низкая концентрация ХГ в присутствии ИЛ-2 оказывала угнетающее действие на поглотительную активность моноцитов лишь на 5 мин (рис. 10в). Таким образом, ХГ и ИЛ-2 оказывали однонаправленное действие на фагоцитарную активность моноцитов женщин. Однако, при совместном внесении ИЛ-2 и ХГ, по-видимому, запускают разные каскады внутриклеточных мессенджеров, что в итоге приводит к конкурентному нивелированию эффектов друг друга.

-контроль . - ИЛ-2 (100 МЕ/мл)

-контроль 10МЕА1Л +ИЛ-2

- ХГ 10ОМЕ/мл + ИЛ-2

О 5 10 15 20 25

Рис. 10. Влияние ХГ на фагоцитарную активность моноцитов женщин. Роль ИЛ-2-активации клеток (п=8). Примечание: *, **, #- достоверные (р<0,05) по I-критерию Стьюдента различия с контролем.

Таблица 8

Влияние ХГ на продукцию АФК, на уровень секреторной МПО, АПО-А1 и эластазы в супернатантах культур моноцитов. Роль ИЛ-2 (п=8)

Экспериментальное воздействие ЛЗХЛ МПО, секреторная (опт.ед) АРО-А1, мг/дл Эластаза, нМ/млн.кл/ мин

Споит. (ЯШ) ( [ им., 20 ИНН (КЫ1)

Контроль 0,083±0,004 0,451 ±0,056 0,402±0,011 1,148±0,372 1,490±0,014

ХГ (ММЕ/мл) 0,083±0,009 0,418±0,056 0,354±0,014* 1,754±0,230 1,734±0,046*

ХГ (ЮОМЕ/мл) 0,057±0,007* 0,358±0,057* 0,336±0,021 * 2,088±0,243* 1,992±0,030*

ИЛ-2 (100 МЕ/мл) 0,051 ±0,007* 0,230±0,034* 0,442±0,027 1,995±0,091* 1,935±0,028*

ХГ (10 МЕ/мл) +НЛ-2 0,068±0,010 0,391 ±0,056 0,374±0,009 1,866±0,110* 1,791±0,019*

ХГ (100 МЕ/мл) +Ш1-2 0,053±0,011* 0,290±0,029* 0,320±0,016* 2,009±0,095* 1,892±0,015*

Примечание: *- достоверные (р<0,05) отличия по /-критерию Стьюдеита с контролем

В отношении спонтанной ЛЗХЛ моноцитов показано, что ХГ (100 МЕ/мл), угнетает продукцию ЛФК, в то время как ХГ в низкой концентрации не влияет на этот показатель (табл. 8). На фоне ИЛ-2-активации эффекты гормона полностью воспроизводились, что, вероятно, свидетельствует о доминирующем действии ХГ. В отношении стимулированного варианта ЛЗХЛ показано, что ХГ (100 МЕ/мл) угнетал продукцию АФК моноцитами, также как и совместно ХГ+ИЛ-2. Таким образом, ХГ оказывает депрессивное действие на окислительную активность как интактных, так и ИЛ-2-активированных моноцитов.

Учитывая, что секреция МПО, а также продукция АФК являются важнейшими факторами бактсрицидности моноцитов, оценивали уровень секреторной МПО. Показано, что ХГ угнетал активность этого фермента, и статистически достоверной разницы в эффектах изучаемых доз гормона выявлено не было. В условиях активации клеток ИЛ-2 отменялся депрессивный эффект низкой концентрации ХГ (табл. 11).

Показано, что ХГ в высокой дозе (100 МЕ/мл) стимулирует секрецию АПО-А1, на фоне активации клеток ИЛ-2 стимулирующий эффект оказывает как низкая, так и высокая доза ХГ (табл. 12). В отношении продукции эластазы установлено, что активация клеток ИЛ-2 не влияет на реализацию стимулирующих эффектов ХГ (табл.12).

Резюмируя данные, можно сделать вывод, что на фоне активации клеток ИЛ-2 модулировался ТЫ14-зависимый эффект ХГ (фагоцитоз), в то время как ПКА-зависимые эффекты ХГ практически не зависели от цитокина (АПО-А1, МПО). Таким образом, активация клеток ИЛ-2 служит важным фактором, модулирующим эффекты ХГ в отношении функциональной активности моноцитов.

ВЛИЯНИЕ ХГ НА ЭКСПРЕССИЮ CD16/CD56 NK- И NKT-КЛЕТКАМИ

Для подтверждения роли TRIF-комплекеа в реализации гормонального сигнала ХГ в клетках иммунной системы, нами дополнительно были исследованы NK-клетки, которые не экспреесируют ЛГ/ХГ-Р. В этих клетках TLR-сигналинг, включающий TRIF-комплекс, приводит к экспрессии молекул CD16 [Pisegna S. et а!., 2004]. Установлено, что в концентрациях, характерных для беременности, ХГ достоверно увеличивает количество NK-клеток, экспрессирующих молекулу CD16 (табл. 9). Таким образом, гормон, по-видимому, активирует TRIF-комплекс в NK-клетках, что подтверждает существование альтернативной гормональной активации клеток иммунной системы через паттерн-распознающие рецепторные молекулы (рис. 11).

Одним из необходимых факторов активации NK-клеток является ИЛ-2, который усиливает их цитотоксичсский потенциал, трансформируя NK-клегки в лимфокинактивироваппые киллеры (LAK-клетки), способные лизировать трофобласты [King A., Loke Y.W., 2006]. Показано, что на уровне NK-клеток ХГ, сохраняя свое собственное стимулирующее действие на процессы экспрессии молекулы CD16, ослабляет ИЛ-2-стимулирующие эффекты (табл. 9). Данный механизм действия гормона является чрезвычайно важным, поскольку выявляет протективное действие ХГ в отношении трофобласта, снижая генерацию LAK-клеток, которые наиболее опасны для реализации цитолиза нативного трофобласта.

Рис. 11. Влияние ХГ на экспрессию CD16 NK-клетками. Роль активации клеток ИЛ-2

Показано наличие тесной корреляционной связи (г=0,76; р<0,05) между самостоятельным эффектом ХГ(100 ME/мл) и совместным действием ХГ (100 ME/мл) и ИЛ-2, а также обратной корреляции между эффектами ИЛ-2 и совместным действием ХГ (100 ME/мл) и ИЛ-2 (г=-0,84; р<0,05) подтверждает вывод, что нивелирующий эффект реализуется за счет гормона. Известно, что NK-клетки с фенотипом CD16+ являются наиболее зрелыми и обладают высокой цитолитической активностью [Mittag А. et al., 2007; Keskin D.B., 2007]. Таким образом, ХГ усиливает фенотипическое созревание NK-клеток, отменяя, по-видимому, ЛАК-трансформирующее действие ИЛ-2, что является возможным

CD 16

CD 16

TLR

механизмом гормонального контроля, протектирующсго плод от иммунной атаки матери. В 2009 г. Капе с коллегами показали, что взаимодействие ХГ с иЫК-клетками осуществляется через маннозный рецептор 03206, более того, на этих клетках почти не экснрессируется ЛГ/ХГ-рецеитор. Однако, ХГ модулирует активность этих клеток, что подтверждает существование альтернативной гормональной активации клеток иммунной системы через паттерн-раснознающие рсценторные молекулы.

Таблица 9

Влияние ХГ уровень 1ЧК- и 1\КТ-клеток (п=7)

Исследуемый показатель МК-клеткп С03"С016+С056+ МКТ-к.ички С03+С016+С056+

Контроль 7,63±1,10 1,44±0,26

ХГ (10 МЕ/мл) НОШ,33* 3,29±0,84*

ХГ (100 МЕ/мл) 13,84±1,15* 4,23±0,69*

ИЛ-2 (100 МЕ/мл) 17,22±2,78* 1,69±0,31

ХГ (10 МЕ/мл) +ИЛ-2 15,96±1,82* 5,61±0,56*л#

ХГ (100 МЕ/мл) +ИЛ-2 12,12±1,73*л 5,75±1,46*л

Примечание: *- достоверные (р<0,05) различия по I-критерию С'тыодента с контролем; Л - в сравнение с ИЛ-2; # - в сравнении с ХГ.

Во время беременности важную роль играют также ЫКТ-клетки. Они являются активными продуцентами цитокинов, индуцирующих иммунный ответ 2-го типа [Воувоп .1.Е., 2002; Со11исс! Р., 2003]. Одним из необходимых факторов активации ЫКТ-клсток является ИЛ-2, который усиливает их цитотоксический потенциал. Показано, что ХГ независимо от концентрации увеличивает процент СШ6+С056+МКТ-клеток, в то время как ИЛ-2 не оказывает самостоятельного эффекта в отношении этих клеток. При совместном действии цитокипа и ХГ, последний сохраняет свое стимулирующее действие (табл. 9). Важно отметить, что в случае совместного стимулирующего эффекта низкой концентрации ХГ (10 МЕ/мл) и ИЛ-2, цитокин выступает как костимулятор гормона, так как стимулирующий эффект гормона в этой концентрации достоверно выше, чем эффект самого ХГ (10 МЕ/мл). Таким образом, присутствие ИЛ-2 не изменяет направленность стимулирующего эффекта ХГ, а в случае низкой концентрации ХГ усиливает его ЫКТ-потснцирующее действие.

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что ХГ способствует фепотипическому созреванию ЫК- и ЫКТ-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической и цитокинпродуцирующей активности. На уровне МК-клеток ХГ является антагонистом ИЛ-2, отменяя ЬАК-активирующес действие цитокина. В то же время, на уровне МКТ-клеток ХГ и ИЛ-2 являются костимулирующими факторами фепотипического созревания этих клеток.

РОЛЬ ХГ В ФОРМИРОВАНИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ТОЛЕРАНТНОСТИ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ Влияние ХГ на уровень ИФН-у и ИЛ-4. Учитывая, что баланс ИФН-у и ИЛ-4, продуцируемых Т-лимфоцитами имеет большое значение для сохранения беременности, изучали влияние ХГ на их уровень. Установлено, что ХГ достоверно повышал уровень ИЛ-4 в условиях стимуляции клеток ЛПС, причем присутствие ИЛ-2 отменяло этот эффект. Кроме того, не выявлено эффектов гормона на продукцию ИЛ-4 в спонтанном варианте эксперимента. В отношении ИФН-у показано, что ХГ не влиял на продукцию данного цитокина как в спонтанном, так и стимулированном варианте, однако в присутствии ИЛ-2 гормон оказывал стимулирующий эффект на продукцию интерферона.

Таким образом, ХГ повышает продукцию ИЛ-4 лимфоцитами, способствуя, таким образом, переключению иммунного ответа по ТЬ2-типу. В то же время, совместно с ИЛ-2, гормон оказывал противоположные эффекты - отменял повышение продукцию ИЛ-4 и стимулировал продукцию ИФН-у.

Таблица 10

Влияние ХГ на уровень ИЛ-4 и ИФН-у в супернатантах суточных культур лимфоцитов женщин in vitro, роль ИЛ-2 (п=10)

Экспериментальное воздеиствне ИФН-у, пг/мл ИЛ-4, пг/мл

споит стнм споит стнм

Контроль 56,76± 11,34 305,25±10,94 15,42±1,46 23,31±2,44

ХГ (10 МЕ/мл) 65,33±9,13 395,66±52,66 14,79±1,51 29,66±1,02*

ХГ (100 МЕ/мл) 77,05±7,08 457,81±168,78 17,52±1,66 41,15±5,41*

ИЛ-2 (100 МЕ/мл) 142,83± 19,46* 374,45±17,69* 17,09±1,50 21,15±2,49

ХГ (10 МЕ/мл)+ИЛ-2 208,99±20,26*л 549,92±69,62* 19,29±1,58 25,54±2,90

ХГ (100 МЕ/мл)+ИЛ-2 238,23±26,32*А 621,84±28,09* 18,10±1,95 24,89±2,63

Примечание: здесь и далее в таблицах * -достоверные по критерию Стьюдента различия по отношению к контролю; л - по отношению к пробе с ИЛ-2.

Далее изучали способность СОЗ+СЭ4+ и СПЗ+СЕ>8+ Т-лимфоцитов продуцировать данные цитокины под влиянием ХГ на уровне внутриклеточного синтеза. Как видно из рис. 12, суточная инкубация ХГ (100 МЕ/мл) с МПК приводила к повышению процента ИЛ-4-позитивных СЭЗ+С04+Т-клеток. В то же время, гормон не оказывал влияния на внутриклеточную продукцию ИФН-у и ИЛ-4 в субпопуляции С[)3+С08+Т-лимфоцигов, равно как и на продукцию ИФН-у С03+С04+Т-клетками. Таким образом, в концентрации, характерной для I триместра беременности ХГ является одним из факторов, способствующим формированию иммунного ответа по ТЬ2-типу.

*

гг

гЬ = + г гЬ =

CD4+ HOH-g+ С04+ИЛ-4+ CD8+ ИФН-В+ С08+ИЛ-4+ □ контроль В XT 10 МЕ/мл □ ХГ 100 МЕ/мл Рис. 12. Влияние ХГ на уровень внутриклеточных цитокинов (ИЛ-4 и ИФН-у) в лимфоцитах периферической крови женщин in vitro (n=9).

Примечание: здесь и далее - *достоверные различия по t-критерию Стъюдента.

ХГ как модулятор экспрессии мембранных молекул лимфоцитов женщин. Показано, что ХГ в высокой концентрации снижает уровень CD25+L('D], однако на фоне активации клеток ИЛ-2 этот эффект отменялся. Как видно из таблицы 11, ХГ в дозах, характерных для беременности, не влияет на процент активированных (CD4+CD25d,m) Т-лимфоцитов. Однако, при исследовании регуляторного действия ХГ в отношении количества Treg выявлено, что гормон в высокой дозе достоверно увеличивает число С04*С025Ьп81" клеток. Активация клеток ИЛ-2 оказывала самостоятельный стимулирующий эффект как на уровень CD4+CD25dim Т-лимфоци тов, так и на уровень CD4+CD25bnght клеток. В то же время, ХГ на фоне ИЛ-2-активации также повышал уровень CD4 CD25bnght, причем выявленный стимулирующий эффект был достоверно выше, чем самостоятельный эффект ХГ.

Таблица 11

Влияние ХГ на экспрессию мембранных молекул лимфоцитов женщин (п=7)

Экспериментальное воздействие CD3+CD4+ CD25dim CD3+CD4+ CD25bright CD3+CD8+ CD25+

Контроль 6,68±0,79 0,448±0,253 13,80±1,89

ХГ (10 МЕ/мл) 7,56±0,87 0,668±0,102 14,71±1,87

ХГ (100 МЕ/мл) 6,59±1,79 1,60±0,53* 9,07±2,66*

ИЛ-2 (100 МЕ/мл) 10,58±2,22* 2,10±0,45* 19,09±4,34

XI 10 (МЕ/мл) +ИЛ-2 6,22±0,46л 0,946±0,261 *л 13,96±2,98

ХГ 100 (МЕ/мл)+ИЛ-2 6,62± 1,11л 1,086±0,219*л 15,05±3,96

Для детализации эффектов ХГ' в отношении Treg изучали экспрессию Foxp3 в этих клетках. Установлено, что суточная инкубация лимфоцитов с ХГ (10 и 100 МЕ/мл) достоверно повышает процент CD4+CD25bnsh,Foxp3+ клеток в культуре (рис. 11). Так как результат оценивался после суточной инкубации, а для пролиферации естественных Treg требуется от 4 до 7 суток [De Rosa V. et al, 2007], полученный стимулирующий эффект можно интерпретировать, как способность гормона увеличивать долю адаптивных Treg.

Известно, что во время беременности происходит увеличение пула Treg периферической крови как за счет пролиферации естественных Treg, так и за счет индукции адаптивных Treg [Heikkinen J. et al., 2007]. Не исключено, что повышение относительного количества Treg в периферической крови женщин на ранних сроках беременности связано именно с действием ХГ". 1 [одтверждением этого служит тот факт, что у женщин, проходящих подготовку в цикле ЭКО, и принимающих ХГ по принятым схемам, в периферической крови повышается уровень Treg [Koldehoff М. et al, 2011].

Принимая во внимание тот факт, что молекулярный механизм действия ХГ опосредован генерацией цАМФ, который активирует ПКА, исследовали участие данной протеинкиназы в реализации гормонального сигнала высокой концентрации гормона на уровне CD4+Foxp3H-клеток. Установлено, что блокада ПКА приводит к снижению содержания Treg в суточной культуре (рис.11). Это говорит о том, что клетки, входящие в пул мононуклеаров, способны поддерживать определенный уровень РохрЗ+-лимфонитов посредством стимуляции базалыгой активности ПКА. Вероятно, этот эффект достигается за счет простагландинов, синтезируемых моноцитами, которые индуцируют экспрессию Foxp3 у С04+С025"-клеток, усиливая генерацию Treg гп vivo [Sharma S. et al., 2005]. Под действием ингибитора ПКА стимулирующий эффект ХГ также отменяется, что свидетельствует о вовлечении аденилатциклазной системы в реализацию гормонального сигнала (рис. 12).

я

и

а

V

ХГ 10 ХГ 100 МЕ/мл + МЕ/мл ■ H-89 Н-89

Рис. 12. Влияние ХГ на уровень экспрессии Foxp3 в гейте CD4+CD25b"sht лимфоцитов периферической крови женщин in vitro. Роль ПКА (п=9).

Примечание: *- достоверные различия по t-критерию Стьюдента в сравнении с контролем; # -в сравнении с ХГ в соответствующей дозе.

Одним из наиболее значимых механизмов формирования иммунологической толерантности является поддержание баланса между Treg и субпопуляцнями IL-17-п роду пирующих лимфоцитов (Thl7) [Wang W.J. et al., 2010]. В то же время, плацента, наряду с ХГ, продуцирует высокие уровни TGF-(31 [Ширшев C.B., 2009], дифференцирующего антигенпримированпые CD4+CD25* наивные Т-клетки в направлении регуляторного (Treg) и энергичного Т-клеточного фенотипа [Walker M.R. et al., 2003]. Показано, что 72 ч инкубация ХГ с CD4+ Т-клетками на фоне индуктора транскрипции Foxp3 TGF-(31, вне зависимости от концентрации гормона, приводит к достоверному повышению количества Treg (CD4+Foxp3+). Одновременно, ХГ увеличивает уровень Treg, экспрессирующих CTLA-4 (CD4+CD152+Foxp3+) и продукцию ИЛ-10 в супернатантах культур этих клеток (табл.12).

Таблица 12

Влияние ХГ на баланс Treg /Thl7 лимфоцитов периферической крови женщин в системе in vitro (n=8)

Экспериментальное воздействие CD4+ Foxp3+, % CD4+ Foxp3+ CTLA-4\ % НЛ-10, пг/мл CD4+ RORyt4, % CD4+ RORyt+ IL17A+, % С 1)4" IL17A+ CCR^, % ИЛ-17А, пг/мл

Контроль 6,60 +1,31 4,76 ±0,97 823,0 ±62,8 2,24 ±0,09 0,542 ±0,091 1,610 ±0,227 247,09 ±15,89

ХГ (10 МЕ/мл) 12,07 +1,96* 7,88 ±0,98* 1081,4 ±72,0* 1,26 ±0,09* 0,319 ±0,041* 0,880 ±0,051* 178,68 ±20,45*

ХГ (100 МЕ/мл) 11,89 ±1,77* 8,63 ±1,42* 1090,0 ±51,7* 1,23 +0,16* 0,343 +0,056* 0,930 ±0,081* 196,43 ±13,04*

Таким образом, установлено, что ХГ увеличивает как количество Treg, так и их функциональную активность, связанную с экспрессией CTLA-4 и продукцией ИЛ-10 на фоне индукции клеток TGF-pi. Известно, что благодаря CTLA-4 Treg способны индуцировать экспрессию IDO в АПК, взаимодействуя с костимулирующими молекулами CD80/86, что является одним из механизмов периферической толерантности [Finger Е.В., Bluestone J.A., 2002]. В отношении Thl7 установлено, что ХГ снижает количество С04+-лимфоцитов, экспрессирующих мастср-регулятор Thl7 ROR-yt. Кроме того, ХГ достоверно снижает уровень дубль-позитивных R0R-yt+IL-17A+-.nH\^0HHT0B. Оценка уровня IL-17A в супернатантах фракционированных С04+-клетках подтвердила угнетающий эффект ХГ на процессы дифференцировки Th в Thl7. Помимо этого, гормон достоверно снижает экспрессию хсмокинового рецептора CCR6, необходимого для направленной миграции Thl7 в очаг воспаления [Maddur M.S. et al., 2012]. Следовательно, ХГ не только препятствует дифференцировке Th в Thl7, по и существенно угнетает функциональную активность данных эффекторов. Важно отметить, что ХГ реализует данные эффекты вне зависимости от исследованных концентраций, т.е. па протяжении всего периода физиологически протекающей беременности (табл. 12).

Известно, что при спонтанных абортах пропорция ТЬ17/Тге§ повышается в сторону ТЬ17, что сопровождается повышеним уровня ИЛ-17 в периферической крови [8ако 8. е/ а/., 2010]. Кроме того, при клиническом применении ХГ в курсе подготовки к циклу ЭКО у женщин снижается уровень ИЛ-17 в сыворотке, при параллельном повышении количества Тге§ [КоМеЬоА" М. е/ а1, 2011], что подчеркивает ключевую роль гормона в регуляции активности этих клеток.

Итак, гормон (10 и 100 МЕ/мл) усиливает экспрессию РохрЗ в интактных Т-лимфоцитах (рис. 12). Установлено, что блокада ПКА приводит к отмене ХГ-индуцируемой экспрессии РохрЗ, что свидетельствует о вовлечении аденилатциклазной системы в реализацию гормонального сигнала. ХГ совместно с ИЛ-2 повышал уровень Тге§, причем выявленный стимулирующий эффект был достоверно выше, чем самостоятельный эффект ХГ. В присутствии ТСГ-р (фактор дифференцировки Тл^) и магнитных частиц, активирующих комплекс С028/ТСЯ, гормон также стимулировал экспрессию РохрЗ. Таким образом, ХГ является непосредственным эффективным индуктором для Treg, как самостоятельно, так и в присутствии дополнительных активаторов.

Известно, что РохрЗ имеет минимум четыре изоформы молекулы, одна из которых является полномасштабной, а три другие формируются в результате сплайсинга отдельных экзонов [1сЫуаша К. еI а!., 2008]. В контексте наших исследований можно предполагать, что ХГ самостоятельно и/или совместно с ТвР-Р (или ИЛ-2) приводит к экспрессии молекулы РохрЗ, содержащей домен (кодируемый экзопом 2), ответственный за связывание транскрипционных факторов семейства ЯСЖ (рис. 13). Это, по-видимому, и создает условия поляризации СВ4* Т-клеток в Тгч^, одновременно блокируя процессы дифференцировки в ТИ17.

aHTiiCD3/CD28 ХГ ИЛ-2 TGF-P мкЛТ

Рис. 13. ХГ-зависнмая регуляция баланса Treg/Thl7.

Примечание: STAT5, Smad3, NFAT - транскрипционные факторы.

Влиянне ХГ на апоптоз лимфоцитов. Установлено, что гормон (100 МЕ/мл) снижает количество лимфоцитов, находящихся в стадии раннего апоптоза (AnV"/PI+), но не влияет на показатели позднего апоптоза (AnV+/PI+) (табл. 13). ХГ в низкой концентрации на фоне активации клеток ИЛ-2 снижает количество лимфоцитов, находящихся в стадии раннего апоптоза, в то же время, показатели позднего апоптоза не модулировались гормоном (табл. 13). Таким образом, ИЛ-2-активация лимфоцитов способствует проявлению антиапоптотичсского эффекта низкой концентрации ХГ на показатели раннего апоптоза.

Таблица 13

Влияние ХГ на экспрессию мембранного маркера CD95 н апоптоз лимфоцитов женщин в системе in vitro (n=7)

Экспериментальное Лп\'7Р1,% АпУ7рГ,% cd3+cd4+ cd3+cd8*

воздействие cd95\% cd95+,%

Контроль 24,55 ± 4,26 62,89±6,62 18,78±3,02 27,14±5,63

ХГ (10 МЕ/мл) 14,64 ±6,54 72,78±13,21 25,04±3,78 17,45±3,43*

ХГ (100 МЕ/мл) 15,14 ±4,23* 70,69±12,81 32,52±6,64* 19,34±2,69*

ИЛ-2 (100 МЕ/мл) 26,51±5,79 51,24±3,91* 27,39±6,90 22,82±5,06

ХГ 10 (МЕ/мл) +ИЛ-2 17,28±3,92* 60,37±7,75 22,42±4,49 13,67±1,20*

ХГ 100 (МЕ/мл) +I1JI-2 15,68±3,77* 63,69±5,47 24,95±5,29 11,02±2,38*

Установлено, что ХГ снижает количество ЦТЛ, экспрессирующих маркер CD95 (CD3+CD8+CD95+), воспроизводя свои эффекты в условиях ИЛ-2-активации. В то же время, ХГ в высокой концентрации повышает количество Th-лимфоцитов, несущих маркер CD95+ (CD3+CD4+CD95+), а индукция клеток ИЛ-2 отменяет этот эффект (табл. 13). В целом, ХГ (100 МЕ/мл) снижает количество лимфоцитов, находящихся в стадии раннего апоптоза (AnV+/PI") и угнетает количество С095+ЦТЛ, эти эффекты не зависят от активации клеток ИЛ-2.

Влияние ХГ на уровень IDO. Реализуемый IDO альтернативный путь биологической трансформации L-триптофапа с формированием "кинурепиновых" метаболитов играет немаловажную роль в подавлении иммунного воспаления. Установлено, что ХГ не влияет на спонтанный уровень продукции кинуренина, однако на фоне ИЛ-2-активации моноцитов реализуется стимулирующий эффект высокой концентрации гормона (табл. 14).

Установлено, что ХГ (100 МЕ/мл) достоверно усиливал активность IDO в ЛПС-стимулированных моноцитах, и этот эффект зависел от активности ПКА. ХГ (100 МЕ/мл) на фоне ИЛ-2-активации также стимулировал ЛПС-индуцированную активность IDO.

Таблица 14

Модуляция активности IDO под влиянием ХГ, роль ИЛ-2 и ПК А (п=12)

Экспериментальное воздействие Концентрация кинуреннна, мкМ

Спонтанный вариант Стимулятор ЛПС

Контроль 4,75±0,93 7,52-0,54

ХГ (10 МЕ/мл) 4,78±0,54 8,11±0,59

ХГ (100 МЕ/мл) 5,56±0,78 9,30+0,42*

ИЛ-2 (100 IМЕ/мл) 5,13+0,54 6,76±0,64

ХГ (10 МЕ/мл)+ИЛ-2 5,82+0,36 7,91 ±0,64

ХГ (100 МЕ/мл)+ПЛ-2 8,29±0,63* 11,38±1,02*А

11-89 5,23+0,77 7,31±0,92

ХГ (10 МЕ/мл) + Н-89 5,48±0,34 7,62±0,87

ХГ (100 МЕ/мл) + Н-89 6,47±0,52 7,29±1,12

Примечание: *- достоверные (р<0,05) различия по t-критерию Стьюдента в сравнении с контролем; л - в сравнении с ХГ в соответствующей дозе.

Известно, что ПГЕ2, который так же, как и ХГ, повышает уровень цАМФ с последующей активацией ПКА, индуцирует экспрессию мРНК IDO, а ЛПС через сигналинг с То11-подобных рецепторов превращает неактивную IDO в биологически активный фермент [Braun D. et al., 2005]. Возможно, присутствие ИЛ-2 оказывает аналогичное действие, усиливая активность IDO. Таким образом, для инициации фермента необходимы два сигнала, от гормона и от активатора. В то же время, можно предполагать, что ХГ принимает участие и в качестве дополнительного агента, усиливающего экспрессию данного фермента опосредованно через повышение уровня CTLA-4+Treg.

На рис. 14 представлена гипотетическая схема, суммирующая полученные результаты по влиянию ХГ на основные факторы иммунологической толерантности. Итак, гормон избирательно активирует синтез ИЛ-4 Т-клетками, настраивая их функциональную активность по ТЬ2-цитокииовому типу. ХГ увеличивает количество Treg, одновременно снижая активность Thl7. Одновременно с этим, ХГ усиливает ЛПС-индуцируемую экспрессию IDO в моноцитах. В то же время, можно предполагать, что ХГ принимает участие и в качестве дополнительного агента, усиливающего экспрессию данного фермента опосредованно через CTLA-4+Treg. Известно, что при контакте молекул CTLA-4 с лигандами CD80/CD86, которые экспонированы АПК, происходит усиление экспрессии IDO в последних [Fallarino F. et al, 2003]. В свою очередь клетки, экспрессирующие повышенные уровни IDO, способствуют генерации адаптивных Treg из CD4+CD25" лимфоцитов [Chen W. et al., 2008]. Активация IDO может приводить к гибели ЦТЛ вследствие дефицита необходимой для их

активности аминокислоты и выделения токсичных продуктов ее деградации, таких как кинуренин [Munn D.H. étal., 1999].

В период беременности изменяется соотношение регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов в сторону супрессии: увеличивается количество ЦТЛ и уменьшается количество Th-лимфоцитов [Ширшев C.B., 2002]. Возможно, ХГ вносит свой вклад в повышение уровня ЦТЛ, препятствуя их апоптозу, одновременно снижая уровень активированных (CD25+) ЦТЛ. Помимо этого, ХГ способствует фепотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической и цитокин-продуцирующей активности. Важно отметить, что наиболее выраженными иммуномодулирующими эффектами обладает концентрация ХГ (100 МЕ/мл), которая наблюдается в I триместре беременности, т.е. в период экспрессии антигенов МНС I класса на клеточной поверхности эмбриона, распознавание которых может привести к его отторжению. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ХГ является одним из факторов, способствующих поддержанию иммунологической толерантности при беременности и протестирует реакции, направленные на сохранение плода.

Установлено, что активация клеток ИЛ-2 служит важным фактором, модулирующим эффекты ХГ в отношении монопуклеаров. Так, ИЛ-2-активация способствует реализации стимулирующего эффекта ХГ в отношении продукции IFN-y, одновременно отменяя стимулирующий эффект в отношении продукции ИЛ-4. Вероятно, в присутствии ИЛ-2 гормон может переключать иммунный ответ на ТЫ, что может иметь неблагоприятные последствия для исхода беременности. Известно, что повышение уровня Th-1 цитокинов (IFN-y, ИЛ-2, ФНО-а) характерно для женщин со спонтанными повторяющимися абортами в анамнезе [Rezaei A., Dabbaqh А., 2002]. Кроме того, на фоне ИЛ-2-активации повышается количество ХГ-индуцированных Treg (CD3+CD4+CD25bnght). ИЛ-2-активация моноцитов способствовала реализации стимулирующего эффекта ХГ в отношении продукции IDO как в спонтанном, так и ИФН-у-стимулированном варианте теста. Известно, что спонтанные повторяющиеся аборты сопровождаются снижением уровня Treg [Saito S. et al., 2010], но повышением концентрации ИЛ-2, при этом показана сниженная ИЛ-2-индуцируемая экспрессия STAT5 в Treg [Fainboim L. & Arruvito L., 2011]. Возможно, повышение Treg/IDO на фоне ИЛ-2-активации клеток может быть нефункциональным, и не оказывать необходимых супрессивных эффектов. На уровне NK-клеток ХГ является антагонистом ИЛ-2, отменяя ЛАК-активирующее действие цитокипа. Таким образом, ИЛ-2 активация клеток может способствовать отмене ряда толсрогенных эффектов ХГ.

В широком смысле, выявленные нами механизмы моиоцит-регулирующего действия ХГ не только ставят данный гормон в ряд чрезвычайно важных регуляторов эндокринного зеркала беременной женщины, но и выделяют его как эффективный иммунный фетопротектор.

Рис. 14. Роль ХГ в формировании иммунологической толерантности при физиологически протекающей беременности

ВЫВОДЫ

1. Модулирующие эффекты хорионического иа функциональную активность моноцитов периферической крови фертильиых женщин зависят от фазы менструального цикла и концентрации гормона. В фолликулярную фазу менструального цикла гормон угнетает процессы фагоцитоза и продукцию активных форм кислорода моноцитами, одновременно стимулируя секрецию ими интерлейкина-6, иптерферона-а, белкового компонента липопротеидов аполипопротеина-Л1, эластазы и секреторной миелопероксидазы. В лютеиновую фазу цикла гормон стимулирует фагоцитоз, одновременно угнетая продукцию активных форм кислорода моноцитами и практически не влияя на секреторную активность клеток.

2. Хорионический гонадотропин регулирует фагоцитарную активность моноцитов и синтез ими интерферона-а, вовлекая молекулы То11-подобных протеинов 4 типа. Гормональная модуляция спонтанной продукции активных форм кислорода, секреция миелопероксидазы и аполипопротеина-А1 зависит от активности протеинкиназы Л. В отношении регуляции стимулированной продукции активных форм кислорода, а также синтеза эластазы, иптерлейкина-6 и интерлейкина-8 показано, что гормон вовлекает как молекулы То11-подобных протеинов 4 типа., так и протеиикиназу Д. Реализация эффектов гормона зависит от активности Са2+-капалов, блокада которых отменяет депрессивные эффекты гормона на фагоцитарную активность моноцитов, секрецию миелопероксидазы, и стимулирующие эффекты в отношении секреции эластазы, аполипопротеина-Л1 и интерферона-а.

3. Активация моноцитов интерлейкином-2 способствует частичной отмене депрессивного эффекта хорионического гонадотропина иа показатели фагоцитоза и секрецию миелопероксидазы, а также повышению секреции аполипопротеина-Л1 под воздействием низкой концентрации гормона. В то же время, активация моноцитов интерлейкином-2 не влияет на эффекты гормона в отношении секреции моноцитами эластазы и продукции активных форм кислорода.

4. Хорионический гонадотропин усиливает экспрессию CD16/CD56 NK- и NKT-клетками. Гормон ослабляет интерлейкип-2-етимулиругощие эффекты на уровне NK-клеток, снижая, таким образом, генерацию лимфокин-активированных-клеток.

5. Хорионический гонадотропин в физиологических концентрациях, соответствующих таковым в период беременности, в системах in vitro дозозависимо увеличивает количество Т-регуляторных лимфоцитов, снижает уровень интсрлейкин-17-продуцирующих Т-лимфоцитов, стимулирует продукцию интерлейкииа-4 Т-лимфоцитами и оказывает антиапоптотический эффект на лимфоциты. Гормон повышает активность липополисахарид-индуцировапной индоламин-2,3-диоксигеназы моноцитов.

6. Иптерлсйкин-2 выступает как синсргист гормона в отношении уровня Т-регуляторных лимфоцитов и продукции индоламин-2,3-диоксигеназы моноцитами, в то же время, изменяя направленность гормонального эффекта в отношении баланса интсрлейкин-4/интерферон-у.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Заморииа, С.А. Изучение влияния хорионического гонадотропина на фагоцитарную и секреторную активность моноцитов периферической крови женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Тез. I конференции иммунологов Урала, Екатеринбург (4-6 декабря), Иммунология Урала.-2001.-№1.- С.10-11.

2. Заморина, С.А. Хорионический гонадотропин как регулятор фагоцитарной активности моноцитов / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Медицинская иммунология.-2001.-Т.З, №2.-С.260.

3. Заморина, С.А. Участие «медленных» Са2+ каналов в модуляции секреторной и фагоцитарной активности моноцитов периферической крови женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Тез. II конференции иммунологов Урала, Пермь (9-12 сентября), Иммунология Урала.-2002.- №2.-С.79-80.

4. Заморина, С.А. Изучение влияния хорионического гонадотропина иа секреторную активность моноцитов периферической крови женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Медицинская иммунология.- 2002, №1(3).-С.274.

5. Заморииа, С.А. Влияние хорионического гонадотропина иа фагоцитоз разных корпускулярных объектов моноцитами периферической крови женщин фолликулярной и лютеиновой фаз менструального цикла / С.А. Заморина, C.B. Ширшев, O.A. Крапивина // Тез. III конференции иммунологов Урала, Челябинск (16-17 октября), Иммунология Урала.-2003.- С.87-88.

6. Заморина, С.А. Влияние хорионического гонадотропина на секрецию провоспалительных цитокинов моноцитами женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев, O.A. Крапивина // Медицинская иммуиология.-2003.- Т.5, № 3-4.- С.334-335.

7. Заморина, С.А. Влияние хорионического гонадотропина на продукцию 1L-6, G-CSF и INF-a моноцитами периферической крови женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев, O.A. Крапивина // Медицинская иммунология.- 2004.- Т.6, № 3-5.- С.263.

8. Ширшев, C.B. Роль С014-ассоциированных молекул в иммуномодулирующей активности хорионического гонадотропина / C.B. Ширшев, С.А. Заморина // Доклады академии наук. -2004.- Т.395, №2.-С.277-279.

9. Ширшев, C.B. Роль хорионического гонадотропина в регуляции цитокиновой продукции и фагоцитарной активности моноцитов / С.В Ширшев, С.А. Заморина, O.A. Крапивина // Вестник Уральской Медицинской Академической Науки. - 2004, №2.- С.82-86.

10. Заморина, С.А. Некоторые аспекты моноцит-модулирующего действия хорионического гонадотропина / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Вестник Пермского Университета, серия биология, Вып. 2.- 2004,- С.169-173.

11. Ширшев, C.B. Влияние хорионического гонадотропина на синтез АПО-А1 моноцитами периферической крови. Роль женских половых гормонов и Саг+-каналов L-типа / C.B. Ширшев, С.А. Заморина // Доклады академии наук.- 2005.- Т.З, №1.- С.126-128.

12. Заморина, С.А. Влияние хорионического гонадотропина на

цитокнновую продукцию и фагоцитарную активность моноцитов женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев, O.A. Крапивина // Russian Journal of immunology.- 2005.- V.9, Suppl. 2.- C.162.

13. Заморина, С.А, Влияние хорионического гонадотропина на окислительную и фагоцитарную активность моноцитов периферической крови женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Медицинская иммунология,- 2005.- Т.7, № 2-3.- С.112-113.

14. Заморина, С.А. Хорионический гонадотронин как регулятор функций моноцитов периферической крови женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Материалы IV конференции иммунологов Урала, Уфа (17-19 октября), Иммунология Урала.-2005,- №1(4).-С.12-13.

15. Заморина, С.А. Влияние хорионического гонадотропина на продукцию миелопероксидазы моноцитами женщин. Роль фаз менструального цикла. / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Тез. докл. 9-ой научной конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино.- 2005.- С.143-144.

16. Заморина, С.А. Роль опсонизации в реализации эффектов хорионического гонадотропина па фагоцитарную активность моноцитов / С.А. Заморина, C.B. Ширшев, O.A. Крапивина / Тез.докладов IV Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН, «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике»,- 2005.- С.63-64.

17. Ширшев, C.B. Хорионический гонадотропин как модулятор окислительной и фагоцитарной активности моноцитов женщин. Роль фаз менструального цикла / C.B. Ширшев, С.А. Заморина // Проблемы эндокринологии.- 2006, №5.- С.31-34.

18. Ширшев, C.B. Влияние гормонов репродукции на активность миелопероксидазы нейтрофилов / C.B. Ширшев, И.В. Некрасова, С.А. Заморина // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2006.-№3-1(14).- С. 162-164.

19. Ширшев, C.B. Роль фаз менструального цикла в модулирующем действии хорионического гонадотропина на функциональную активность моноцитов периферической крови / С.В Ширшев, С.А. Заморина, O.A. Крапивина // Физиология человека. 2006.- Т.32, №4.-С.102-109.

20. Ширшев, C.B. Роль ТоП-подобных протеинов в реализации эффектов хорионического гонадотропина на функциональную активность моноцитов / C.B. Ширшев, С.А. Заморина //Доклады академии паук.-2006.-Т.409, №5.- С.699-701.

21. Заморина, С.А. Влияние хорионического гонадотропина на синтез АПО-А1 моноцитами периферической крови женщин. Роль ТоП-подобных рецепторов / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека. Материалы конференции, посвященной 25-летию ЦПИЛ Челябинской государственной медицинской академии,- Челябинск,- 2006,- С.96-98.

22. Заморина, С.А. Хорионический гонадотропин как модулятор синтеза АПО-А1 моноцитами периферической крови женщин. Роль протеинкиназы А /

С.А. Заморина, C.B. Ширшев, О.С. Федотова // Тез. докл. 10-ой научной конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино.-2006,-С.142.

23. Заморина, С.А. Эффекты, оказываемые хорионическим гонадотропином на фагоцитарную активность эозинофилов женщин. Роль Са2+-акцентирующих белков / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Вестник Пермского Университета, серия биология, Вып. 2.- 2006,- С. 172-176.

24. Заморина, С.А. Вовлечение То11-подобных протеинов в реализацию эффектов хорионического гонадотропина на фагоцитарную активность моноцитов женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Russian Journal of Immunology.- 2006.- V.9, Suppl.3.- C.161-162.

25. Ширшев, C.B. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции / C.B. Ширшев, Е.М. Куклина, С.А. Заморина, Н.М. Никитина // Патент на изобретение РФ № 2292553 от 27. 01.2007. Приоритет от 10. 06. 2005. Бюлл. №3 С.139-140.

26. Заморина, С.А. Хорионическнй гонадотропин как эндогенный лиганд для То11-подобных протеинов / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Российский иммунологический журнал.- 2008.- Т. 2 (11), №2-3.- С. 148.

27. Заморина, С.А. Вовлечение То11-подобных рецепторов в реализацию моноцит-модулирующего действия хорионнческого гонадотропина / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Аллергология и иммунология.- 2008.- Т.9, №3.-С.258-259.

28. Заморина, С.А. Влияние хорионического гонадотропина на секрецию моноцитами эластазы и катепсина G. Роль То11-подобных рецепторов / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Вестник Пермского Университета, серия биология, Вып. 9(25) - 2008,- С.77-80.

29. Заморина, С.А. Возможная роль То11-подобных рецепторов в реализации эффектов хорионического гонадотропина на функции моноцитов женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев / Материалы международной научно-практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека», Новосибирск.-2008,- С.66-67.

30. Заморина, С.А. Молекулярные механизмы моноцит-модулирующего действия хорионического гонадотропина / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Тезисы докладов VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды. Адаптация. Иммунитет», 2008.-Пермь-Н. Новгород-Пермь.-С. 69.

31. Заморина, С.А. Новый механизм моноцит-модулирующего действия хорионического гонадотропина, связанный с То11-нротеинами / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Сборник материалов 12-й Международной Пущинекой школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», Пущипо.-2008.-С.131.

32. Заморина, С.А. Изучение совместных эффектов хорионического гонадотропина и интерлейкина-2 на фагоцитарную активность моноцитов женщин / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2009.- Т.24, №2/1.- С.33-34.

33. Ширшев, С.В. Модулирующие эффекты интерлейкина-2 на функциональную активность мононуклеаров человека in vitro/ С.В Ширшев, С.А. Заморина, Е.Г. Орлова, В.П. Тимганова // Доклады академии наук.- 2009.- Т.429, №4.- С.558-560.

34. Заморина, С.А. Изучение совместных эффектов хорионического гонадотропина и рекомбинантного IL-2 на функциональную активность моноцитов / С.А. Заморина, С.В. Ширшев // Медицинская иммунология.-

2009.- Т.11, №4-5.- С.315-316.

35. Заморина, С.А. То11-подобные рецепторы как мишень для хорионического гонадотропина / С.А. Заморина, С.В. Ширшев // Сборник материалов VI Международной научной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», 2009.- Москва,- С.95-96.

36. Zamorina, S. Chorionic gonadotropin as endogenous ligand for Toll-like proteins / S. Zamorina, S. Shirshev // EurJ.Immunol.-2009.- V.39, № SI.- P.S62.

37. Заморина, С.А. Хорионический гонадотропии как регулятор фенотипического созревания интактных и интерлейкин-2-активированных NK-и NKT- клеток / С.А. Заморина, OJI. Горбунова, С.В. Ширшев // Вестник Пермского Университета, серия биология, Вын. 1(1). - 2010.- С.77-80.

38. Заморина, С.А. Хорионический гонадотропии как фактор иммунологической толерантности при беременности / С.А. Заморина // Российский иммунологический журнал.- 2010.- Т.4(13).- С.394.

39. Заморина, С.А. Хорионический гонадотропии как модулятор экспрессии мембранных молекул Т-лимфоцитов женщин / С.А. Заморина, С.В. Ширшев // Вестник Уральской медицинской академической науки,-

2010.- Т.29, №2/1.- С.33-34.

40. Заморина, С.А. Регуляция фенотипического созревания интактных и интерлейкин-2-актнвирован11ых NK- и NKT- клеток хорионическим гонадотропином / С.А Заморина, С.В. Ширшев, О.Л. Горбунова // Доклады академии наук.- 2010.- Т. 435, №3.- С.411-413.

41. Заморина, С.А. Регуляция хорионическим гонадотропином экспрессии мембранных молекул лимфоцитов женщин in vitro / С.А. Заморина, И.В. Некрасова, С.В. Ширшев // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск,- 2010,- С.113-114.

42. Заморина, С.А. Модуляция хорионическим гонадотропином экспрессии индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) моноцитов женщин. Роль протеинкипазы А / С.А. Заморина, К.С. Попкова // Тез. докладов IX Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН, «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике», Сыктывкар.-2010.- С.172-175.

43. Zamorina, S. Effect of chorionic gonadotropin on the expression of phenotypic markers of phenotypic markers of regulatory T-lymphocytes (Aug. 23-27) / S. Zamorina, I. Nekrasova, S. Shirshev // International Immunology (14th International Congress of Immunology).-2010.- V.22, №1.-P.182.

44. Заморина, С.А. Молекулярные механизмы действия хорионического гонадотропина, связанные с вовлечением То11-подобных рецепторов / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2011.- Т.35, №2/1.- С.30-31.

45. Заморина, С.А. Хорионический гонадотропин как фактор иммунологической толерантности при беременности. Роль протеинкиназы А / С.А. Заморина // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2011.- Т.35, №2/1.- С.31-32.

46. Ширшев, C.B. Влияние гормонов репродукции на индукцию CD4+CD25+brig,bFoxp3+ Т-регуляторных лимфоцитов / C.B. Ширшев, Е.Г. Орлова, С.А. Заморина, И.В. Некрасова // Доклады академии наук.- 2011.Т. 440, №1.- С.132-135.

47. Ширшев, C.B. Роль хорионического гонадотропина в формировании иммунологической толерантности при беременности / С.В Ширшев, С.А. Заморина // Проблемы эндокрннологин.-2011, №5.- С.52-56.

48. Заморина, С.А. Совместные эффекты хорионического гонадотропина и рекомбинантного ИЛ-2 на апоптоз лимфоцитов / С.А. Заморина // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2011.-Т.38, №4/1.- С.133-134.

49. Заморина, С.А. Хорионический гонадотропин как эндогенный лиганд для То11-подобных рецепторов моноцитов. Роль TRIF-комилекса и протеинкиназы А / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Сборник статей международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», Пущино.-2011,- ТОМ.1.-С.258-262.

50. Заморина, С.А. Роль хорионического гонадотропина в регуляции баланса Treg/Thl7 в системе in vitro / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Российский иммунологический журнал.- 2012.- Т.6(14), № 2(1).- С.65-66.

51. Заморина, С.А. Роль IL-2 в реализации толерогенных свойств хорионического гонадотропина / С.А. Заморина // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2012,- Т.41, № 4.- С.38-39.

52. Ширшев, C.B. Гормональная регуляция продукции IFN-y и IL-4 тимоцитами / C.B. Ширшев, Е.Г. Орлова, С.А. Заморина, И.В. Некрасова // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2012.- Т.41, № 4.-С.76-77.

53. Ширшев, C.B. Гормональная регуляция тимического этапа дифференцировки инвариантных NKT-клеток / C.B. Ширшев, Е.Г. Орлова, С.А. Заморина, И.В. Некрасова // Доклады академии наук.- 2012,- Т.446, №5.- С.587-589.

54. Заморина, С.А. Влияние хорионического гонадотропина на продукцию интерлейкина-8 интактными моноцитами. Роль ТоП-подобных рецепторов / С.А. Заморина, C.B. Ширшев // Вестник Пермского университета, 2012. - Вып. 3.-С.71-75.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А1ТО-А1 - аполинопротеин А1

АЦ - адепилатциклаза

АФК - активные формы кислорода

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЛГ/ХГ-Р- рецептор для лютеинизирующего гормона и хориоиического гонадотропина

ЛЗХЛ - люминол-зависимая хемилюминесценция

МПО - миелопероксидаза

ПКА - нротеинкипаза А

ПКС - протеипкиназа С

Ф! Ю-а - фактор некроза опухолей альфа

ФЭБ - формалинизированные эритроциты барана

ФЭБИ - формалинизированные эритроциты барана с сорбированным антигеном У. enterocolitika

ХГ - хорионический гонадотропин

CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) - маркер Treg Foxp3 - (forkhead box РЗ), транскрипционный фактор Treg IDO — индоламин-2,3-диоксигеиаза

IRF-3 (Interferon regulatory factor 3) - транскрипционный фактор LAK — лимфокин-активированные клетки МАРК - митоген-активированные киназы

MyD88 (Myeloid differentiation Marker 88) - адапгерный белок, коактиватор

сигнала с TLR;

NFkB - ядерный фактор кВ

NK (Natural killer) - клетки естественные киллеры

NKT - Т-клетки с функциями натуральных киллеров

ROR-yt - (RAR-related orphan receptor gamma), транскрипционный фактор

TCR-T-клсточный рецептор

Thl7 - ИЛ-17-продупирующих Т-хелперы

Thl, Th2 - Т-хелперы 1 и 2 типов

TGF-|3-трансформирующий фактор роста (3

Thl7 - интерлейкии-17-иродуцирующие хелперы

TIRAP, TRAM, MD2 - белки, участвующие в трапедукции с TLR4

TLR4 - толл-подобные рецепторы 4

Treg - Т-регуляторные лимфоциты

TRIF - адапгерный белок, участвующий в индукции IRF3

На правах рукописи

ЗАМОРИНА Светлана Анатольевна

МЕХАНИЗМЫ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология (биологические науки)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Челябинск - 2013

Подписано в печать . .2013. Формат 60x90/16.Тираж 120 экз. Усл. печ. л. 1,0 Набор компьютерный. Отпечатано в ФГБУН ИЭГМ УрО РАН 614081, Пермь, ул. Голева, 13