Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы влияния компонентов этиологических агентов хронического остеомиелита на функциональную активность моноцитов in vitro

На правах рукописи

ТАТАРОК СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ

Механизмы влияния компонентов этиологических агентов хронического остеомиелита на функциональную активность моноцитов in vitro

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 2004

Работа выполнена в Луганском государственном медицинском университете

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Гайдаш Игорь Славович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Бордюшков Юрий Николаевич Доктор медицинских наук, профессор Васильева Галина Ивановна

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов

Защита состоится "30" О (о 2004 г. в /с-^асов на заседании диссертационного совета Д 208.082.03 при Ростовском государственном медицинском университете (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан ''0*5_2004 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доцент Лужецкая И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последние 20 лет появилась серия работ, в которых показан широкий спектр биологической активности бактериальных пептидогликанов и тейхоевых кислот (ТК), их участие в реализации специфических и неспецифических механизмов защиты организма от инфекций (Белобородова Н.В.. Бачинская Е.Н., 2000; Бухарин О.В., 1999). Пептидогликан и ТК активируют систему комплемента, осуществляют поликлоналъ-ную В-клеточную активацию, активацию нейтрофилов, индукцию воспалительных реакций кожи (Гостищев В.К. и соавт., 1996; Исаченко О.Г. и соавт., 1999; Capoluongo E. et al., 2000). Действие пептидогликана и ТК отличается от действия микробных липопо-лисахаридов и экзотоксинов, поскольку они проявляют умеренную токсическую активность, которая указывает на возникновение эффектов под действием пептидогликана и ТК in vivo через косвенные (иммунные) механизмы, а не через прямую природную токсичность (Coleman J.L. et al., 2001).

Считается общеизвестным, что цитокины (фактор некроза опухоли-a (ФНО-а), интерлейкин-1 р (ИЛ-1), ИЛ-6) являются основными провоспалительными медиаторами, которые индуцируются в организме человека бактериями и компонентами их клеточной стенки (Клименко Н.А., Шевченко А.Н., 1999).

Основная роль в защите от возбудителей бактериальных инфекций принадлежит фагоцитозу их лейкоцитами. Изучено взаимодействие пептидогликана с макрофагами, возможные механизмы действия полимера на эти клетки (Маянский А.Н.. Пику-за О.И., 1993). Активация макрофагов с помощью пептидогликана способствует повышению метаболической активности этих клеток. Пептидогликан захватывается макрофагами и преобразуется в биологически активные гликопептиды с низкой молекулярной массой, которые со временем выделяются из фагоцитов (Wang Z.M. et al., 2000). К тому же пептидогликан стимулирует выделение макрофагами группы очень сходных между собой монокинов (в частности, ИЛ-1, эндогенного м гррр^^щщ^р-н! в -

БИБЛИОТЕКА Í !

С.Петер6*рг;,„ J 1 ОЭ W0Y«r'

ного фактора медленного сна) (Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1995).

Пептидогликаны могут действовать иммуносупрессивно, в соответствующих условиях они угнетают специфические реакции с участием антиел (Гусев Е.Ю., Поносов В.Л., 1993). Адъювант-ные, иммуносупрессивные, митогенные и пирогенные свойства пептидногликана могут быть реализованы путем использования различных препаратов, дозировок, выбора времени и способов применения, что указывает на привлечение различных механизмов (Намазова Л.С. и соавт., 2000). Вот почему пептидогликан, являющийся убиквитарным компонентом бактериальных клеточных стенок, выполняет природную иммунорегуляторную функцию в качестве стимулятора иммунных реакций к микробным антигенам и выступает как природный регулятор развития иммунной системы (Осипов О.А. и соавт., 1991). В то же время не исключается, что пептид огликан может выполнять функцию фактора микробной вирулентности, угнетая иммунные реакции хозяина (Maffione A.B. et al, 2000).

Патогенность грамположительным бактериям обеспечивают также ТК (Акайзин Э.С., 2000). Вопрос об иммуногенности изолированных ТК окончательно не выяснен. Однако при определенных условиях ТК приобретают способность индуцировать синтез специфических антител. По-видимому, иммунный ответ на ТК может быть вызван только их комплексом с «носителем», роль которого в природных условиях играет пептидогликан, ковалент-но связанный с ТК (Cleveland M. G. et al., 1996).

Цель исследования: Изучить механизмы действия пепти-догликанов и тейхоевых кислот этиологических агентов хронического травматического остеомиелита на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов периферической крови человека in vitro.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на продукцию моноцитами интерлейкинов-1 (3 , 6 и фактора некроза опухоли-а in vitro.

2. Изучить влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на продукцию моноцитами периферической крови человека простагландина Е2.

3. Исследовать влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на содержание циклических нуклеотидов в моноцитах в эксперименте in vitro.

4. Изучить влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на фагоцитарную активность моноцитов.

5. Провести сравнительный анализ влияния пептидогликанов и тейхоевых кислот на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов.

Научная новизна полученных результатов. Установлено дозозависимое влияние пептидогликанов и ТК на продукцию моноцитами ИЛ-1 Р, 6, ФНО-а и ПГЕ2. С увеличением действующей концентрации пептидогликанов и ТК секреторная активность моноцитов возрастает преимущественно за счет продукции ИЛ-1 . Показано разнонаправленное и дозозависимое влияние пепти-догликанов и ТК на содержание циклических нуклеотидов в моноцитах. Низкие концентрации пептидогликанов и ТК вызывают внутриклеточное преобладание цГМФ над цАМФ, высокие - преобладание цАМФ над цГМФ. Показано стимулирующее влияние на фагоцитоз моноцитов малых доз пептидогликанов и ТК и ин-гибирующее влияние больших доз.

Практическое значение полученных результатов. Рекомендованы различные схемы лечения с использованием антибиотиков и иммуномодуляторов в зависимости от течения патологического процесса, получен патент на изобретение 63375 А от 15 января 2004 г. Полученные данные используются в учебном процессе 2-х медицинских вузов Украины: Луганского и Донецкого государственных медицинских университетов и в системе

последипломного образования (Харьковская медицинская академия последипломного образования).

Положения, выносимые на защиту:

1. Пептидогликаны и тейхоевые кислоты стафилококков, стрептококков, пептококка и пептострептококков - возбудителей хронического травматического остеомиелита - влияют на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов крови человека in vitro, причем эта способность более выражена у пептидогликанов.

2. Влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на функциональную активность моноцитов крови человека является до-зозависимым и видоспецифическим. По мере увеличения концентраций пептидогликанов и тейхоевых кислот влияние на моноциты возрастает.

3. Пептидогликаны и тейхоевые кислоты факультативно анаэробных микроорганизмов оказывают большее действие на моноциты, чем аналогичные структурные компоненты строго анаэробных бактерий.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: заседании 2-й научной конференции хирургов Северо-Запада России и 23-й - Республики Карелия совместно с Санкт-Петербургским НИИ скорой помощи им. проф. Джанелидзе (Петрозаводск, 24 - 26 мая 2000 г.), а также на заседаниях Луганского областного общества патофизиологов в 1999 -2003 гг.

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 5 научных работах, получен патент на изобретение.

Объем и структура диссертации. Работа написана на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы. 3 глав собственных исследований, анализа и обобщения результатов исследования, выводов. Список литературы включает 248 источников отечественных и иностранных авторов, диссертация иллюстрирована 13 таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Материалы и методы исследования. Объектом исследования были 119 культур моноцитов периферической крови практически здоровых доноров-мужчин в возрасте 20-24 года. Забор крови в объеме 20 мл проводили из локтевой вены в утренние часы (7.00-8.00) до еды. Кровь вносили в стерильные стеклянные пробирки, которые содержали 0,2 мл гепарина, перемешивали и для получения плазмы отстаивали в течение 2 ч в термостате при 37 ' С. Полученная плазма крови в дальнейшем использовалась для выделения моноцитов.

Пептидогликаны и ТК стафилококков, стрептококков, пеп-тококка и пептострептококков получали из культур бактерий, выделенных от 139 больных хроническим травматическим остеомиелитом, которые находились на лечении в Луганском областном остеомиелитическом центре с января 2000 г. по сентябрь 2002 г. Установление родовой принадлежности культур и видовую идентификацию кокков проводили согласно приказу. Минздрава СССР № 535 от 22.04.1985 г. и "Определителя бактерий Берджи"

Выделение моноцитов из периферической крови доноров осуществляли по методике Boyum в градиенте плотности фиколл-верографин. Моноциты идентифицировали путем окраски по Ро-мановскому-Гимзе. Из полученной взвеси моноцитов готовили рабочую концентрацию 106 клеток/мл.

Пептидогликаны получали из клеточных стенок бактерий по методу Peterson P.K. et al. (1978). Использовали следующие его рабочие концентрации (мг/л): 0,01; 0,1; 1,0; 10,0; 100,0; 200,0. ТК экстрагировали из клеточных стенок 10 % трихлоруксусной кислотой (Okamoto M. et al., 2000). Экстракт очищали с помощью колонки с ДЕАЕ-целюллозой и софадекса J-50. Использовали следующие рабочие концентрации ТК (мг/л): 1,0; 5,0; 10,0.

Проводили определение фагоцитарной активности моноцитов (ФАМ) периферической крови чашечным методом. Подсчитывали фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ). С целью изучения влияния пептилогликанов и ТК на ФАМ

моноциты предварительно инкубировали с различными концентрациями указанных веществ каждого из видов бактерий. После этого стимулированные моноциты исследовали, используя при этом суспензии соответствующих видов кокков.

Определение ИЛ-1 ß, -6, ФИО-a проводили в супернатан-тах моноцитов с помощью коммерческих наборов для иммуно-ферментного анализа (Medgenix Diagnostics, Бельгия). Определение ПГЕ2, циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ) проводили радиоиммунным методом с использованием коммерческих тест-систем фирмы Amersham (Великобритания). Математическую обработку полученных данных осуществляли на «Intel P-3» с использованием стандартных пакетов прикладных программ.

Влияние пептндогликанов и ТК на продукцию моно-кинов моноцитами крови человека in vitro. В результате проведенного нами исследования установлено, что пептидогликаны бактерий - возбудителей хронического травматического остеомиелита - имеют выраженную биологическую активность, которая проявляется способностью при непосредственном контакте стимулировать продукцию моноцитами крови человека ИЛ-1 ß, -6, ФНО-х и ПГЕ2. Указанная способность носит дозозависимый и видоспецифический характер. По мере увеличения действующей концентрации пептидогликанов и ТК секреция ИЛ-1 ß, -6, ФНО-а и ПГЕ2 усиливается.

Установлено, что инкубация моноцитов крови человека при добавлении в среду культивирования пептидогликанов сопровождалась повышением секреторной активности моноцитов. Это проявлялось увеличением концентраций ИЛ-1 ß и -6 в культу-ральной среде, которые возрастали по мере увеличения стимулирующей дозы пептидогликанов, независимо от видовой принадлежности последних. Так, при наименьшей действующей на моноциты концентрации пептидогликанов (0,01 мг/л) кратность продукции ИЛ-1 ß увеличивалась в 1,14-1,47 раза по сравнению с референтной нормой для большинства видов тестированных пеп-тидогликанов. При использовании стимулирующей дозы пепти-

догликанов 0,1 мг/л степень интенсификации продукции ИЛ-1|3 составляла 1,44-2,7 раза для всех видов пептидогликанов без исключения. Увеличение содержания пептидогликанов в среде культивирования моноцитов до 1,0 мг/л сопровождалось повышением концентрации ИЛ-1 рв 2,0-6,1 раза Аналогичный стимулирующий эффект малых доз пептидогликанов (0,01-1,0 мг/л) отмечался и относительно продукции моноцитами крови человека ИЛ-6. Так, при действующей концентрации пептидогликанов 0,01 мг/л кратность увеличения синтеза ИЛ-6 возрастала в 1,13-1,67 раза, тогда как при 0,1 и 1,0 мг/л - в 2,9-5,5 и 6,1-17,4 раза соответственно.

Наибольшее увеличение продукции ИЛ моноцитами крови человека in vitro регистрировалось при использовании больших стимулирующих доз пептидогликанов. Так, при концентрации пептидогликанов указанных патогенов 10,0 мг/л уровень синтеза ИЛ-ф возрос в 27,6-118,3 раза в зависимости от видовой принадлежности действующего фактора. При стимулирующих дозах пептидогликанов 100,0 и 200,0 мг/л кратность увеличения продукции ИЛ-1 Р составила соответственно 44,3-259,5 и 77,6-463,3 раза. В то же время для ИЛ-6 степень повышения синтеза при 10 мг/л пептидогликанов составляла 7,2-31,0 раза, при 100 мг/л и 200 мг/л - 6,6-51,7 и 15,4-120,8 раза соответственно.

Стимуляция продукции ИЛ моноцитами периферической крови человека зависела от видовой принадлежности пептидогли-канов. Как оказалось, наибольшим стимулирующим действием на синтез и экскрецию моноцитами ИЛ-1 р и ИЛ-6 обладали пепти-догликаны пиогенного стрептококка Наименьший стимулирующий эффект был зарегистрирован для пептидогликанов P. niger. На втором месте по ИЛ-стимулирующему потенциалу оказались пептидогликаны золотистого стафилококка, на третьем и четвертом месте - пептидогликаны пневмококка и S. hyicus соответственно. Сопоставимо одинаково индуцировали продукцию ИЛ моноцитами крови человека пептидогликаны S. capitis и гемолитического стафилококка. Тем не менее, их потенциал был ниже анало-

гичного для S. hyicus. Стимуляция продукции ИЛ пептидоглика-нами наименее патогенного представителя стафилококков - сапрофитного стафилококка - была по ИЛ-1 Р и ИЛ-6 в 5,1 раза ниже, чем у пептидогликанов золотистого стафилококка. Среди анаэробных бактерий наибольшая ИЛ-стимулирующая способность была отмечена нами для пептидогликанов P. magnus. Вместе с тем, возможных различий в уровнях продукции ИЛ-1 р и ИЛ-6 у данного патогена по сравнению с P. nigerвыявлено не было.

Потенциал ТК оказался существенно ниже такового для пептидогликанов (рис. 1). Наиболее интенсивную секрецию указанных монокинов вызывали пептидогликаны и ТК пиогенного стрептококка и золотистого стафилококка, наименее активную -пептидогликаны и ТК сапрофитного стафилококка, P. niger и Р. magnus.

Рис. 1. Сравнительное влияние пептидогликанов и тейхоевыч кислот в концентрации 10 мг/л на продукцию ИЛ-6 моноцитами крови человека in vitro

Влияние пептидогликанов и ТК на систему циклических нуклеотидов в моноцитах крови человека in vitro. Влияние пептидогликанов и ТК на состояние системы циклических

нуклеотидов в моноцитах крови человека в условиях in vitro выражалось в увеличении внутриклеточного содержания цАМФ, снижении цГМФ, а также в повышении коэффициента цАМФ/цГМФ. Указанные изменения были наиболее выраженными при использовании в эксперименте больших концентраций пептидогликанов и ТК. Так, если при отсутствии пептидоглика-нов в среде культивирования моноцитов уровень внутриклеточного содержания цАМФ составлял 2,5±0,2 пкмоль/106 клеток (референтная норма), то при внесении в культуральную среду пептидогликанов в дозе 0,01 мг/л уровень внутриклеточного цАМФ возрастал по сравнению с референтной нормой в 1,12-1,36 раза в зависимости от видовой принадлежности пептидогликанов. При использовании пептидогликанов в концентрации 0,1 мг/л содержание цАМФ в моноцитах повышалось до 3,3±0,16-4,5±0,27 пкмоль/106 клеток (кратность увеличения против референтной нормы -1,3 и 1,8 раза соответственно, р<0,05). В 1,5-2,2 раза внутриклеточный уровень цАМФ возрастал при действующей дозе пептидогликанов 1,0 мг/л, в 1,8-2,7 раз - при дозе 10,0 мг/л. Наибольшее увеличение цАМФ в моноцитах (в 2,5-5,4 раза) регистрировалось при внесении в среду культивирования пептидоглика-нов в концентрации 200 мг/л.

Влияние пептидогликанов и ТК на внутриклеточное содержание циклических нуклеотидов носило видоспецифический характер (рис. 2). Наиболее значительный дисбаланс в системе циклических нуклеотидов моноцитов крови человека вызывали пептидогликаны и ТК золотистого стафилококка и пиогенного стрептококка. Влияние пептидогликанов других коагулазонега-тивных видов стафилококков на содержание цАМФ в моноцитах оказалось менее значительным. Активность пептидогликанов коа-гулазонегативных стафилококков убывала в таком порядке: 5. warneri, сапрофитный стафилококк, S. capitis, эпидермальный стафилококк. Так, в частности, если при концентрации пептидог-ликанов 200,0 мг/л кратность увеличения цАМФ в моноцитах для S. warned составила 2.8 раз. то для других видов - 2,6,2,5 и 2,3 со-

ответственно. Активность пептидогликанов пневмококка была сопоставима с таковой для S. warned. Влияние пептидогликанов P. nigerи P. magnus на внутриклеточное содержание цАМФ в моноцитах было сопоставимо с таковым для коагулазонегативных стафилококков.

Малые действующие концентрации пептидогликанов (преимущественно 0,01 и 0,1 мг/л) повышали внутриклеточное

Рис 2 Сравнительная характеристика влияния пептилогликанов и тейхоевых кислот в концентрации 10 мг/л на коэффициент цАМФ/цГМ Ф в моноцитах крови человека in vitro

содержание цГМФ. При действующей дозе 1,0 мг/л стимулирующее влияние пептидогликанов на уровень цГМФ нами не выявлено, тогда как высокие концентрации указанного вещества (100,0 и 200,0 мг/л) вызывали в моноцитах снижение уровня цГМФ. Степень выраженности отмеченных изменений цГМФ под влиянием пептидогликанов была неодинаковой в зависимости от их видовой принадлежности. Как оказалось, наибольшее

увеличение цГМФ при действующей концентрации 0,01 мг/л имело место при использовании пептидогликанов пиогенного стрептококка и золотистого стафилококка (кратность увеличения в сравнении с референтной нормой - 1,38 и 1,32 раза соответственно, р<0,05). В то же время, при внесении в среду культивирования моноцитов пептидогликанов данных видов бактерий в дозе 0,1 мг/л уровень цГМФ в моноцитах был ниже предыдущих, хотя и достоверно превышал показатель референтной нормы (в 1,14 раза). При действующей концентрации пептидогликанов 1,0 мг/л внутриклеточное содержание цАМФ в моноцитах также не отличалось от нормативных показателей (р>0,05).

Повышение доз пептидогликанов пиогенного стрептококка и золотистого стафилококка до 10,0 мг/л сопровождалось снижением цГМФ в моноцитах, в среднем, в 1,4 раза. Наименьшее внутриклеточное содержание цГМФ регистрировалось при действующей дозе пептидогликанов 200,0 мг/л. В отношении пепти-догликанов пиогенного стрептококка оно снижалось против референтной нормы в 2,8 раза, относительно пептидогликанов золотистого стафилококка - в 3,09 раза.

Направленность изменений уровней цГМФ в моноцитах крови человека под влиянием пептидогликанов других стафилококков и стрептококков была аналогичной описанным выше, но менее выраженной. Предварительная инкубация моноцитов крови человека с ТК сопровождалась изменением содержания в них циклических нуклеотидов. Это выражалось в увеличении внутриклеточной концентрации цАМФ и снижении цГМФ, вследствие чего коэффициент цАМФ/цГМФ достоверно возрастал. Содержание циклических нуклеотидов прогрессивно возрастало по мере увеличения действующей на моноциты концентрации ТК. Наибольший дисбаланс в системе циклических нуклеотидов регистрировался при концентрации ТК 10,0 мг/л. Кроме того, выраженность изменений внутриклеточного содержания цАМФ и цГМФ зависела также от видовой принадлежности ТК.

и

Сравнительный анализ влияния пептидогликанов и ТК на циклические нуклеотиды в моноцитах крови человека показал, что более активными в данном отношении являются пептидогли-каны. Пептидогликаны пиогенного стрептококка в концентрации 1,0 мг/л вызывали увеличение цАМФ в моноцитах в 1,56 раза больше, чем ТК при одинаковых условиях. При использовании пептидогликанов в дозе 10,0 мг/л кратность увеличения цАМФ относительно аналогичного показателя для ТК составила 1,5 раза (р<0,05). Статистически достоверные различия были также между показателями коэффициента цАМФ/цГМФ, установленные для ТК и пептидогликанов. Не отмечено достоверных различий во влиянии указанных субстанций на внутриклеточное содержание цГМФ.

Отмеченное более значительное влияние пептидогликанов над ТК пиогенного стрептококка на систему циклических нуклео-тидов в моноцитах крови человека in vitro имело место и для других видов грамположительных бактерий. Однако это влияние было менее значительным по сравнению с таковым для пептидогли-канов и ТК пиогенного стрептококка. Наибольшие различия в активности пептидогликанов и ТК были отмечены у P. niger и Р. magnus.

Влияние пептидогликанов и ТК на ФАМ крови человека in vitro. При изучении антифагоцитарного потенциала нами установлено, что небольшие концентрации пептидогликанов (0,01-0,1 мг/л) в условиях in vitro стимулировали ФАМ периферической крови человека. Напротив, высокие дозы (от 10,0 до 200,0 мг/л, в зависимости от вида бактерий) вызывали угнетение ФАМ, проявляющееся уменьшением показателей ФИ и ФЧ.

Так, внесение в среду культивирования моноцитов пепти-догликанов золотистого стафилококка в действующей концентрации 0,01 мг/л сопровождалось увеличением ФИ и ФЧ в 1,57 и 1,7 раза против референтной нормы. При инкубации моноцитов крови человека с пептидогликаном золотистого стафилококка в дозе 0,1 мг/л достоверных различий фагоцитарной активности (срав-

нительно с нормативными показателями) выявлено не было (р>0,05). Снижение количества фагоцитирующих клеток в 2,0 раза и ФЧ в 3,0 раза было зарегистрировано нами при использовании дозы концентрации пептидогликана золотистого стафилококка 1,0 мг/л. При концентрации 10,0 мг/л показатель ФИ моноцитов оказался ниже референтной нормы в 4,4 раза, а ФЧ - в 4,7 раза, тогда как при 100,0 и 200,0 мг/л степень снижения ФИ и ФЧ составила 22,0, 8,3 и 47,7, 22,0 раза соответственно. Аналогичные изменения ФАМ крови человека in vitro имели место при тестировании пептидогликанов пиогенного стрептококка. Среди коагула-зонегативных видов стафилококков наибольшее угнетение ФАМ крови человека вызывали пептидогликаны S. capitis, наименьшее -пептидогликаны сапрофитного стафилококка. Пептидогликаны Р. nigerи P. magnus обладали наименьшим угнетающим фагоцитоз потенциалом в среди всех тестированных нами пептидогликанов.

Как и пептидогликаны, ТК угнетали ФАМ крови человека in vitro. При этом выраженность угнетения фагоцитоза зависела как от действующей на. моноциты концентрации ТК, так и (в меньшей степени) от их видовой принадлежности. По мере увеличения действующей на моноциты дозы ТК угнетение показателей фагоцитоза прогрессивно возрастало. Наименьшие изменения ФИ и ФЧ регистрировались при использовании концентрации ТК 1,0 мг/л, наибольшие - при дозе 10,0 мг/л. Отмеченная особенность была характерной для всех ТК независимо от их видовой принадлежности. При внесении в среду культивирования моноцитов ТК в концентрации 1,0 мг/л кратность снижения показателя ФИ составляла (с учетом видовой принадлежности стимула) 1,051,4 раза, ФЧ - 1,02-1,65 раза Наиболее выраженное антифагоцитарное действие на моноциты оказывали ТК золотистого стафилококка и пиогенного стрептококка; менее выраженное угнетение фагоцитоза вызывали ТК пневмококка, гемолитического стафилококка, а также другие стафилококки. Из общего числа грампо-ложительных бактерий, использованных в нашем исследовании,

наименее отрицательно влияли на фагоцитоз моноцитов крови человека ТК P. nigerи P. magnus.

При сравнительном анализе антифагоцитарного действия пептидогликанов и ТК установлено, что антифагоцитарная активность ТК грамположительных бактерий или не уступала такой для пептидогликанов одной видовой принадлежности, или была достоверно ниже ее. Так, значимых различий не выявлено при сопоставлении антифагоцитарной активности пептидогликанов и ТК пневмококка, S. hyicus и P. niger (p>0,05), что свидетельствовало о равном антифагоцитарном потенциале указанных субстанций. Вместе с тем, для таких патогенов, как гемолитический стафилококк, S. warneri и P. magnus различие антифагоцитарного действия ТК в сравнении с пептидогликанами выражались в статистически менее значимом влиянии на ФИ или ФЧ моноцитов крови человека В то же время, антифагоцитарное действие ТК золотистого, эпидермального и сапрофитного стафилококков, S. capitis и пиогенного стрептококка было существенно ниже как по влиянию на ФИ, так и на ФЧ моноцитов крови человека сравнительно с таковым для пептидогликанов.

ВЫВОДЫ

1. Пептидогликаны и тейхоевые кислоты этиологических агентов хронического травматического остеомиелита существенно влияют на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов крови человека in vitro. Способность влиять на данные функции моноцитов более выражена у пеп-тидогликанов, чем у тейхоевых кислот.

2. Влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на функциональную активность моноцитов крови человека является до-зозависимым и видоспецифическим. По мере увеличения концентраций пептидогликанов и тейхоевых кислот влияние на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов возрастает. Наиболее выраженные изменения функциональной активности моноцитов вызывают пептидог-

ликаны и тейхоевые кислоты золотистого стафилококка и пиогенного стрептококка, умеренные - гемолитического, сапрофитного и эпидермального стафилококков, S. hyicus, S. capitis, S. warned, пневмококка, наименьшие - P. niger и P. magnus.

3. Влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот этиологических агентов хронического травматического остеомиелита на секреторную активность моноцитов крови человека in vitro проявляется усилением продукции интерлейкина-1 р, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли-а и простагландина Е2- Малые концентрации пептидогликанов и тейхоевых кислот вызывают преобладающую продукцию моноцитами интерлейкина-6, высокие -интерлейкина-1 р.

4. Влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот этиологических агентов хронического травматического остеомиелита на метаболизм моноцитов периферической крови человека in vitro выражается в изменении внутриклеточного содержания циклических нуклеотидов - цАМФ, цГМФ, а также их соотношения -цАМФ/цГМФ. Невысокие концентрации пептидогликанов (0,01-0,1 мг/л) и тейхоевых кислот (1,0 мг/л) вызывают, как правило, увеличение цАМФ и цГМФ при сохранении соотношения между ними в границах физиологической нормы. Большие концентрации тейхоевых кислот (5,0-10,0 мг/л) и пептидогликанов (1,0-200,0 мг/л) вызывают увеличение внутриклеточного содержания цАМФ при снижении цГМФ и соотношения цАМФ/цГМФ.

5. Пептидогликаны грампозитивных бактерий в малых концентрациях (0,01-0,1 мг/л) стимулируют фагоцитарную активность моноцитов крови человека in vitro, что сопровождается увеличением фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса. Высокие концентрации пептидогликанов (1,0-200,0 мг/л) угнетают фагоцитоз моноцитов, что проявляется снижением фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа.

6. Тейхоевые кислоты этиологических агентов хронического травматического остеомиелита в концентрации 1,0-10,0 мг/л угнетают фагоцитарную активность моноцитов периферической крови человека in vitro. С увеличением концентрации тейхоевых кислот фагоцитарный индекс и фагоцитарное число моноцитов прогрессивно снижаются.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Татаров СВ. Сравнительный ретроспективный анализ результатов лечения больных хроническим травматическим остеомиелитом костей голени // Украинский медицинский альманах -2002. - № 4, - С. 134-136.

2. Ивченко В.К., Татаров В.Г., Татаров С.В., Тесля С.Н., Татаров А.В. Лечение посттравматического остеомиелита костей голени // Вестник ортопедии, травматологии и протезирования. - 2002. -№2. -С 78-79.

3. Татаров СВ. Влияние пептид огликанов стрептококков на продукцию моноцитами фактора некроза опухоли-« //Украинский медицинский альманах. -2002. - № 5. - С. 143-145.

4. Белкина ГЛ., Татаров СВ. Видовой состав возбудителей хронического травматического остеомиелита // Вестник морской медицины.-2003.-№4.-С. 104-106.

5. Татаров СВ. Влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот этиологических агентов хронического остеомиелита на систему циклических нуклеотидов и фагоцитарную активность моноцитов in vitro // Украинский медицинский альманах. - 2003. - № 6. -С 215-218.

6. Флегонтова В.В., Гайдаш И.С, Татаров СВ., Татаров А.В., Суг-лобов Е.В. Способ лечения гнойных ран // Декларационный патент 63375 А, МПК 7 А61К31/74. - № 2003043118. Заявлен 08.04.2003 г.; напечатан 15.01.2004 г. Промышленная собственность. Официальный бюллетень № 1.

Подписано в печать -¿■о Об 2004 г. Формат 60.9(У16.Бумага писчая. Условн. печ. лист. 0.8. Тираж 120 экз. Заказ №29, ЧП Гакааш И.С, Украина.91007, Луганск, ул Привозная, 47а

11109 00

Актуальность темы. В последние 15-20 лет появилась серия работ, в которых показан широкий спектр биологической активности бактериальных пеп-тидогликанов, их участие в реализации специфических и неспецифических механизмов защиты организма от инфекций [1,9, 11, 15, 74, 158]. Пептидогликан -основной полимер клеточной стенки грамположительных бактерий - возглавляет список наиболее важных биологических иммуномодуляторов [55]. Накоплено достаточное количество экспериментальных данных (как in vivo, так и in vitro), касающихся иммунобиологической активности пептидогликана [14]. Внутри-кожное введение людям пептидогликана или его структурных элементов способствует продукции антител в организме и вызывает как у здоровых, так и у больных людей определенные патологические изменения со сходными чертами -отек, эритему и преобладающую нейтрофильную инфильтрацию. Отмечено, что пептидогликан активирует систему комплемента, В-клетки, нейтрофилы, уменьшает продукцию эндогенных медиаторов [14, 23, 34, 113], причём его токсическое действие менее выражено, чем у микробных эндо- и экзотоксинов [101, 121].

Считается общеизвестным, что цитокины (фактор некроза опухоли (ФНО-а), интерлейкин-lp (ИЛ-10), ИЛ-6), индуцируемые в организме человека бактериями и компонентами их клеточной стенки, являются медиаторами межклеточных реакций, участвующими в иммунном ответе, гемопоэзе, развитии воспаления и т.д.; они так же обеспечивают взаимодействие иммунной системы с другими системами организма, [41, 47, 142]. Без микробной стимуляции цито-киновая сеть функционирует на минимальном уровне, при этом моноциты выделяют небольшое количество цитокинов и практически не реагируют на них. Кроме того, нормально функционирующие механизмы иммунной системы препятствуют бесконтрольному выделению цитокинов и других воспалительных медиаторов, обеспечивая адекватную реакцию организма на воспаление. В начале воспалительной реакции (ответ на первичное поступление микробов и их токсинов из гнойного очага) в крови начинают одновременно появляться как про-, так и противовоспалительные цитокины. Без дальнейшего поступления микрофлоры из первичного очага, цитокины данных групп уравновешивают (нейтрализуют) активность друг друга. Это определяет благоприятное течение воспалительного процесса и способствует отграничению очага воспаления [36]. На уровне всего организма провоспалительные факторы призваны мобилизовать действие всех органов и систем на борьбу с инфекцией путем активации продукции неспецифических противоинфекционных веществ, повышения концентрации энергоносителей, создания условий для улучшения кровотока в зоне воспаления. При умеренном и однократном внедрении инфекционного начала в ткани организма, а также при адекватной реакции иммунной системы в ответ на воспалительный процесс воспалительная реакция через определенное время сменяется активацией противовоспалительной системы, создающей функциональное равновесие. Воспалительной активности при этом бывает достаточно для привлечения в очаг инфицирования нужного количества иммунных сил, а компенсаторная активация противовоспалительного ответа достаточна для предотвращения дальнейшей генерализации инфекционно-воспалительного процесса и защиты органов и систем организма от повреждающего действия про-воспалительных агентов [34].

Было проведено изучение уровня экспрессии 600 генов, активированных пептидогликаном, эндотоксином золотистого стафилококка и у-интерфероном в моноцитах человека [50]. Эти стимуляторы вызывали экспрессию более 120 генов. Наиболее сильно экспрессируемые гены, ответственные за синтез провоспа-лительных цитокинов (активация была вызвана пептидогликаном и эндотоксином) были гены хемокинов (ИЛ-8 и макрофагальный провоспалительный белок), в то время как гены цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1(3 и ИЛ-6) индуцировались менее интенсивно. Гены других хемокинов (хемоаттракционный протеин-1 моноцитов) также сильнее индуцировались пептидогликаном, чем золотистым стафилококком или экзотоксином [65]. Небактериальный стимулятор - у-интерферон - вызывал активацию абсолютно других генов [32, 119].

При изучении взаимодействия пептидогликана с макрофагами отмечено, что активация макрофагов с помощью пептидогликана способствует повышению их метаболической активности, выявленному в ряде различных систем [4]. Более того, пептидогликан влияет на хемотаксис макрофагов и ингибирует их перемещение и фагоцитарную реакцию [53, 233]. Макрофаги способны захватывать и преобразовывать пептидогликан в биологически активные гликопептиды с низкой молекулярной массой, которые со временем выделяются из фагоцитов [233]. Кроме того, пептидогликан стимулирует выделение макрофагами ИЛ-1 [36]. Адыовантная активность пептидогликана изучалась in vitro и in vivo [61]. Были определены клетки-мишени для адъювантной активности пептидогликана. Одна из мишеней - макрофаг [158]. Предполагается, что механизм этого адъювантного действия опосредуется ИЛ-1, который влияет на Т-клетки, принимающие участие в кооперации при иммунном ответе [162]. Пептидогликаны могут действовать иммуносупрессивно. В определенных условиях они угнетают специфические реакции с участием антител [25, 69]. Адъювантные, иммуносупресивные, митогенные и пирогенные свойства пептидогликана могут быть реализованы путем использования различных препаратов, дозировок, выбора времени и способов применения, что указывает на участие в этом различных механизмов [61]. Вот почему, пептидогликан, как убиквитарный компонент бактериальных клеточных стенок, выполняет природную иммунорегуляторную функцию в качестве стимулятора иммунных реакций к микробным антигенам и выступает как естественный регулятор функционирования иммунной системы [64, 214]. В то же время не исключается, что пептидогликан может выполнять функцию фактора микробной вирулентности, угнетая иммунные реакции хозяина [175]. Доказано, что растворимый пептидогликан золотистого стафилококка является поликло-нальным активатором В-лимфоцитов и проявляет митогенный эффект по отношению к Т-лимфоцитам [166]. Известно, что растворимый пептидогликан фекального стрептококка стимулирует моноцит-макрофаг-воспалительные реакции, включая повышенную продукцию ИЛ-1, колонне стимулирующего фактора и угнетает продукцию активатора плазминогена [46]. Таким образом, пептидогликан способен опосредовать воспалительную реакцию, включая много подобных механизмов. В сыворотке крови здоровых людей практически всегда присутствуют специфические противомикробные антитела к пептидогликану золотистого стафилококка [56].

Антитела к пептидогликанам выступают как опсонины [160]. Показано, что пептидогликаны микроорганизмов эффективно взаимодействуют с нейтро-филами человека, подвергаясь опсопизации «нормальными» антителами, которые содержатся в ^О-фракции сыворотки крови здоровых людей [81, 93, 173]. Таким образом, основным фактором опсонирующего действия нормальной сыворотки крови, обеспечивающим эффективный фагоцитоз и деструкцию микроорганизмов, персистирующих в макроорганизме, являются цитофильные ^О, специфичные к пептидогликану [173].

Патогенность грамположительным бактериям обеспечивают также ТК [2, 82, 219]. Вопрос об иммуногенности изолированных ТК окончательно не выяснен, однако при определенных условиях они становятся способными индуцировать синтез специфических антител. По-видимому, иммунный ответ на ТК может быть вызван только их комплексом с «носителем», роль которого в природных условиях играет пеитидогликан, ковалентно связанный с ними [30, 120].

В патогенезе воспалительных процессов важная роль принадлежит мем-бранодеструктивным процессам, связанным с пероксидацией липидов [3]. Влияние бактериального фактора и нарушение кровообращения в тканях создают условия для усиления перекисного окисления липидов в клеточных мембранах, активации эндогенных фосфолипаз, угнетения ферментов системы антиоксидант-ной защиты [42]. В результате этого происходит накопление в тканях токсичных продуктов, повреждающих клеточные мембраны и нарушающих функцию клеток [3]. Активация свободно-радикального окисления липидов инициирует каскад преобразований арахидоновой кислоты по циклооксигеназному и липокси-геназному пути [42]. Продуктами ее метаболизма являются эйкозаноиды (про-стагландины (ПГ) и лейкотриены), способные влиять на иммунокомпетентные клетки.

Во время активного функционирования иммунной системы при развитии воспалительного процесса значительная роль отводится апоптозу [94]. Такие физиологические иммунологические феномены, как элиминация аутореактив-ных Т-лимфоцитов, прекращение иммунных реакций клеточного и гуморального типов, удаление потенциально опасных для организма клеток, воспалительного экссудата, в основе своей имеют апоптоз [45, 146, 165, 195]. В доступной литературе нами не были найдены данные о комплексном изучении влияния структурных компонентов грамположительных или грамотрицательных бактерий и продуктов их жизнедеятельности на функциональную активность моноцитов человека в условиях in vitro, что и было целью нашего исследования.

Связь работы с научными программами, темами. Диссертация является фрагментом плановой научной работы кафедры патологической физиологии Луганского государственного медицинского университета «Воспаление как результат действия бактерий» (номер государственной регистрации 01980005713). Автор является исполнителем комплексной темы.

Цель исследования: Изучить механизмы действия пептидогликанов и тейхоевых кислот этиологических агентов хронического травматического остеомиелита на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов периферической крови человека in vitro.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на продукцию моноцитами интерлейкинов-ф , 6 и фактора некроза опухоли-а in vitro.

2. Изучить влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на продукцию моноцитами периферической крови человека простагландина Е2.

3. Исследовать влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на содержание циклических нуклеотидов в моноцитах в эксперименте in vitro.

4. Изучить влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на фагоцитарную активность моноцитов.

5. Провести сравнительный анализ влияния пептидогликанов и тейхоевых кислот на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов.

Научная нопнзпа полученных результатов. Установлено дозозависимое влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на продукцию моноцитами ИЛ-1р,

6, ФНО-а и ПГЕг- С увеличением действующей концентрации пептидогликанов и ТК секреторная активность моноцитов возрастает преимущественно за счет продукции ИЛ-ip. Показано разнонаправленное и дозозависимое влияние пептидогликанов и ТК на содержание циклических нуклеотидов в моноцитах. Низкие концентрации пептидогликанов и ТК вызывают внутриклеточное преобладание цГМФ над цАМФ, высокие - преобладание цАМФ над цГМФ. Показано стимулирующее влияние на фагоцитоз моноцитов малых доз пептидогликанов и ТК и ингибирующее влияние больших доз.

Практическое значение полученных результатов. Рекомендованы различные схемы лечения с использованием антибиотиков и иммуномодуляторов в зависимости от течения патологического процесса, получен патент на изобретение 63375 А от 15 января 2004 г. Полученные данные используются в учебном процессе 2-х медицинских вузов Украины: Луганского и Донецкого государственных медицинских университетов и в системе последипломного образования (Харьковская медицинская академия последипломного образования).

Положения, выносимые па защиту:

1. Пептидогликаны и тейхоевые кислоты стафилококков, стрептококков, пепто-кокка и пептострептококков - возбудителей хронического травматического остеомиелита - влияют на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов крови человека in vitro, причем эта способность более выражена у пептидогликанов.

2. Влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на функциональную активность моноцитов крови человека является дозозависимым и видоспецифиче-ским. По мере увеличения концентраций пептидогликанов и тейхоевых кислот влияние на моноциты возрастает.

3. Пептидогликаны и тейхоевые кислоты факультативно анаэробных микроорганизмов оказывают большее действие на моноциты, чем аналогичные структурные компоненты строго анаэробных бактерий.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: заседании 2-й научной конференции хирургов Северо-Запада России и 23-й - Республики Карелия совместно с Санкт-Петербургским НИИ скорой помощи им. проф. Джанелидзе (Петрозаводск, 24 - 26 мая 2000 г.), а также на заседаниях Луганского областного общества патофизиологов в 1999 - 2003 гг.

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 5 научных работах (3 - единоличные), получен патент на изобретение.

выводы

1. Пептидогликаны и тейхоевые кислоты этиологических агентов хронического остеомиелита существенно влияют на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов крови человека in vitro. Способность влиять на данные функции моноцитов больше выражена у пептидогликанов, чем у тейхоевых кислот.

2. Влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот на функциональную активность моноцитов крови человека является дозозависимым и видоспецифиче-ским. По мере увеличения концентраций пептидогликанов и тейхоевых кислот влияние на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов возрастает. Наиболее выраженные изменения функциональной активности моноцитов вызывают пептидогликаны и тейхоевые кислоты золотистого стафилококка и пиогенного стрептококка, умеренные - гемолитического, сапрофитного и эпидермального стафилококков, S. hyicus, S. capitis, S. warneri, пневмококка, наименьшие - P. niger и P. magnus.

3. Влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот этиологических агентов хронического остеомиелита на секреторную активность моноцитов крови человека in vitro проявляется усилением продукции интерлейкина-ip , интерлей-кина-6, фактора некроза опухоли-а и простагландина Е2. Малые концентрации пептидогликанов и тейхоевых кислот вызывают преобладающую продукцию моноцитами интерлейкина-6, высокие - интерлейкина-ip.

4. Влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот этиологических агентов хронического остеомиелита на метаболизм моноцитов периферической крови человека in vitro выражается в изменении внутриклеточного содержания циклических нуклеотидов - цАМФ, цГМФ, а также их соотношения -цАМФ/цГМФ. Невысокие концентрации пептидогликанов (0,01-0,1 мг/л) и тейхоевых кислот (1,0 мг/л) вызывают, как правило, увеличение цАМФ и цГМФ при сохранении соотношения между ними в границах физиологической нормы. Большие концентрации тейхоевых кислот (5,0-10,0 мг/л) и пентидогликанов (1,0-200,0 мг/л) вызывают увеличение внутриклеточного содержания цАМФ при снижении цГМФ и соотношения цАМФ/цГМФ.

5. Пептидогликаны этиологических агентов хронического остеомиелита в малых концентрациях (0,01-0,1 мг/л) стимулируют фагоцитарную активность моноцитов крови человека in vitro, что сопровождается увеличением фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса. Высокие концентрации пепти-догликанов (1,0-200,0 мг/л) угнетают фагоцитоз моноцитов, что проявляется снижением фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа.

6. Тейхоевые кислоты этиологических агентов хронического остеомиелита в концентрации 1,0-10,0 мг/л угнетают фагоцитарную активность моноцитов периферической крови человека in vitro. С увеличением концентрации тей-хоевых кислот фагоцитарный индекс и фагоцитарное число моноцитов прогрессивно снижаются.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследовательская работа, результаты которой обобщены в данной диссертации, ставила перед собой целыо изучение механизмов действия пептидог-ликанов и ТК грампозитивных коков на секреторную и фагоцитарную активность моноцитов периферической крови человека в эксперименте.

Известно, что многие инфекционные заболевания, такие, как отит, синусит стафилококковой и стрептококковой этиологии в 60-70 % случаев склонны к полному самоизлечению без использования антибиотиков [28, 81]. С другой стороны, при бактериемии, сепсисе, септическом шоке, которые также вызывают стафилококки и стрептококки, несмотря на использование антибиотиков, заболевания в 30-40 % случаев заканчиваются летальным исходом [8, 9, 20, 26, 62, 72]. Несомненно, что два диаметрально противоположных исхода инфекционного заболевания, вызванного одними и теми же микроорганизмами, определяются состоянием иммунной системы макроорганизма.

Проведенное нами исследование влияния пептидогликанов и ТК на функциональное состояние моноцитов крови человека in vitro показало, что указанные субстанции существенно влияли на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность мононуклеаров. Объектом исследования были 119 культур моноцитов периферической крови практически здоровых доноров. Пептидогликаны и ТК получали из культур стафилококков, стрептококков, пептококков и пептострептококков, выделенных от 139 больных хроническим травматическим остеомиелитом, находившихся на стационарном лечении в Луганском областном остеомиелитическом центре.

В настоящее время доказано, что ИЛ-1 является ключевым монокином в запуске любого иммунного ответа [27, 36, 46, 65]. Он продуцируется многими клетками, но его основным источником являются макрофаги и моноциты. ИЛ-1 стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов путем индукции экспрессии рецепторов к ИЛ-2 и продукции данного лимфокина; усиливает пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов; активирует функциональную активность макрофагов, индуцируя синтез ими других регуляторных молекул (ФНО-а , ИЛ-6, ПГЕ2 и др.) [37, 43]. ИЛ-ip и ФНО-а стимулируют метаболизм арахидо-новой кислоты с образованием ПГЕ2 и простациклина. Оба цитокина активируют фосфолииазу А и тем самым запускают первый этап — освобождение ара-хидоновой кислоты из фосфолипидов клеточной мембраны. Далее ИЛ-ip и ФНО-а активируют фермент циклооксигеназу, направляя метаболизм по пути образования ПГЕ2 и простациклина. Многие функции ИЛ-ip опосредует через эти метаболиты, в то же время ПГЕ2 выполняет роль фактора отрицательной обратной связи, блокируя экспрессию гена ИЛ-ip и его синтез [47, 50].

ИЛ-6 имеет широкий спектр биологических активностей (почти как ИЛ-1); он регулирует синтез белков острой фазы гепатоцитами [98]; стимулирует конечные стадии созревания В-лимфоцитов; индуцирует активацию, рост и дифференциацию Т-лимфоцитов; имеет пирогенное действие [112]. ИЛ-6 наделен противовирусной и противоопухолевой активностями [100]. В настоящее время доказано, что многие воспалительные эффекты, которые ранее приписывались ИЛ-1, в действительности опосредуются ИЛ-6 [178, 232].

ФНО-а является продуктом активированных макрофагов [135]. Он непосредственно цитотоксичен в отношении раковых клеток и стимулирует противоопухолевый ответ клеток иммунной системы, активацию В-клеток, моноцитов и нейтрофилов [108]; повышает способность моноцитов к выработке других провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-ip), обладает противовирусными свойствами, стимулирует экспрессию антигенов главного комплекса гистосов-местимости I и II классов [227]. ФНО-а является мощным медиатором воспаления, секретируемым моноцитами и макрофагами во время воспалительного процесса, существенно повышает адгезию золотистого стафилококка к культивированным эндотелиоцитам пупочной вены человека in vitro. Стимулирующий эффект ФНО-а является дозозависимым и бимодальным [118].

Нами установлено, что под влиянием пептидогликанов и ТК стафилококков, стрептококков, пептококка и пептострептококков наблюдалось усиление секреции моноцитами крови человека монокинов - ИЛ-ip , ИЛ-6, ФНО-а и

ПГЕг. При этом стимуляция секреторной активности моноцитов в присутствии ТК и пептидогликанов носила дозозависимый и видоспецифический характер. По мере увеличения действующих концентрации пептидогликанов и ТК продукция моноцитами указанных монокинов прогрессивно повышалась, достигая наибольших уровней при максимальных концентрациях пептидогликанов (200,0 мг/л) и ТК (10,0 мг/л). Установлено, что малые концентрации ТК и пептидогликанов грампозитивных коков вызывают преобладающую продукцию ИЛ-6, тогда как высокие концентрации - преобладающий синтез и экскрецию ИЛ-lp. В видовом отношении наиболее активно на секреторную функцию моноцитов крови человека in vitro влияли пептидогликаны и ТК золотистого стафилококка и пиогенного стрептококка, умеренно влияли компоненты клеточной стенки гемолитическго, эпидерм ал ьного, сапрофитного стафилококка, S. hyicus, S. capitis, S. warneri. Наименьшую активность проявляли пептидогликаны и ТК P. niger и P. magnus.

Рисунок 1. Влияние пептидогликанов (0,1 мг/л) и тейхоевых кислот (10 мг/л) этиологических агентов хронического остеомиелита на продукцию простагландина

Е2 моноцитами

HIS. aureus

S.haemo lytic us

S. hyicus

S.epidermidis aS. capitis

S. warneri ■ S. pyogenes

S.pneumoniae

P. niger P. magnus

Пептидогликан

Тейхоевые кислоты

Согласно современным представлениям, адекватный иммунный ответ возможен только при условии согласованного взаимодействия макрофагов и различных субпопуляций лимфоцитов [10]. Высказываются предположения о том, что функциональная настройка этих субпопуляций осуществляется сигналами, которые подаются взаимодействующими в процессе иммунного ответа клетками [51]. Активация лимфоидных клеток пептидными гормонами тимуса, как и действие других регуляторных пептидов, осуществляется путем образования в цитоплазме вторичных мессенджеров: цАМФ и ионов кальция с последующей генерацией сигнала на различные индукторы [51]. Пептидные гормоны тимуса, кроме изменения продукции цАМФ, вызывают стимуляцию синтеза вторичных медиаторов - ПГЕ, действие которых реализуется через цГМФ [10]. Циклические нуклеотиды, в частности цГМФ, участвуют в регуляции целого ряда биологических процессов, таких как энергетическое обеспечение клеток,

У 4- ^ проницаемость мембран, транспорт ионов, в том числе и ионов Са ; цГМФ играет одну из основных регуляторных ролей в работе глутаматных рецепторов головного мозга [84].

В клетках после связывания рецепторами ПГ изменяется содержание цАМФ и цГМФ, что сопровождается определенными реакциями. Так, ТхАг уменьшает продукцию цАМФ, следствием чего является выраженное сокращение гладкой мускулатуры и повышение сосудистого тонуса. ПГРг« и ПГ02 уве

2+ личивают продукцию цГМФ, что ведет к увеличению выхода Са из сарко-плазматического ретикулума [10].

Диффузия вторичных мессенджеров обеспечивает быстрое распространение сигнала по всей клетке [10, 51, 84]. При фагоцитозе золотистого стафилококка моноцитами человека установлено снижение активности аденилатцикла-зы (что наиболее выражено через 10 мин) и повышение активности фосфодиэ-стеразы, что свидетельствовало об участии циклического аденозин-5,5-монофосфата в фагоцитозе стафилококка моноцитами [84].

Изменение уровня внутриклеточных цАМФ и цГМФ может вызывать модуляцию различных реакций иммунокомпетентных клеток - активацию или, наоборот, угнетение функций. Иммуномодулирующее действие циклических нуклеотидов определяется дозой действующего стимула, в том числе дозой метаболитов бактерий и их структурных компонентов [29, 59]. Малые действующие дозы указанных факторов вызывают адекватные изменения функции клетки-мишени, высокие - гипер- или гипостимуляцию.

Нами установлено, что влияние пептидогликанов и ТК грампозитивных коков на метаболизм моноцитов крови человека выражалось в изменении внутриклеточного содержания циклических нуклеотидов - цАМФ и цГМФ, а также соотношения между ними - цАМФ/цГМФ. Нами установлено, что действие пептидогликанов и ТК стафилококков, стрептококков, пептококков и пептост-рептококков на моноциты сопровождается увеличением внутриклеточного содержания цАМФ и снижением цГМФ, вследствие чего коэффициент цАМФ/цГМФ увеличивается. Указанные изменения усиливались по мере увеличения действующих на моноциты концентраций пептидогликанов и ТК. Наибольшие изменения в системе циклических нуклеотидов моноцитов крови человека регистрировались нами при использовании высоких действующих доз пептидогликанов (200,0 мг/л) и ТК (10,0 мг/л). Особо значительные изменения циклических нуклеотидов регистрировались при использовании в эксперименте пептидогликанов и ТК золотистого стафилококка и пиогенного стрептококка.

В настоящее время выделяют ряд компонентов микробной клетки, которые способны непосредственно, направленно, вызывать образование так называемых провоспалительных цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а и других [4, 69, 110, 176, 220, 230]. К их числу относятся ЛПС, порины, поверхностные белки, белки ворсинок, липопротеины, гликопротеины, а также пептидогликаны и ТК [21, 46]. Концентрация последних во внутренней среде макроорганизма способна существенно повлиять на состояние иммунокомпетентных клеток и, прежде всего, на моноциты (макрофаги) - ключевые клетки иммунной системы [29].

Нами установлено, что действие пептидогликанов и ТК грампозитивных коков на фагоцитарную активность моноцитов периферической крови человека проявлялось ее ингибированием. На это указывало существенное уменьшение ФИ - процента фагоцитирующих мононуклеаров и ФЧ - числа бактерий, фагоцитированных одним моноцитом (рис, 2). По мере увеличения действующей на моноциты дозы пептидогликанов и ТК показатели фагоцитоза моноцитов прогрессирующе снижались. Наибольшие изменения ФАМ крови человека регистрировались нами при добавлении к клеточной взвеси максимальных концентраций пептидогликанов и ТК. При этом максимальный антифагоцитарный эффект вызывали пептидогликаны и ТК золотистого стафилококка и пиогенного стрептококка, минимальный - P. niger и P. magnus.

Таким образом, влияние пептидогликанов и ТК стафилококков, стрептококков, пептококка и пептострептококков на секреторную, метаболическую и фагоцитарную активность моноцитов крови человека in vitro является дозоза-висимым, видоспеци фи чески м и более выраженным у пептидогликанов, чем у

Рисунок 2. Сравнительная характеристика антифагоцитарного потенциала пептидогликанов и тейхоевых кислот грампозитивных кокков в концентрации

30Y □ S. aureus □ S.haemolyticus □ S.hyicus □ S.epidermidis EIS. capitis □ S. warnen ■ S.pyogenes □ S. pneumoniae □ P. niger □ P. magnus

25-'

20-/

5-: I 11 Т ю-' 1 И

II | J 1 !lLj-Mi':lYM\ /ШШШ?

Пептидогликан, Тейхоевые Пептидогликан, Тейхоевые ФИ, % кислоты, ФИ, % ФЧ, у.е. кислоты, ФЧ, у.е.

ТК той же видовой принадлежности. Полученные данные объясняют различный исход инфекционного процесса в зависимости от этиологического фактора и инфицирующей дозы. Наименее патогенные возбудители оказывают минимальное отрицательное влияние на иммунную систему макроорганизма, в частности на моноциты, тогда как наиболее патогенные - золотистый стафилококк и пиогенный стрептококк - способны вызывать глубокие нарушения иммуногенеза, что клинически может проявляться чрезвычайно тяжелым течением и исходом инфекционного заболевания. Избыточная продукция вазоактивных моно-кинов - ИЛ, ПГ, ФНО - способна индуцировать развитие инфекционно-токсического шока.

Полученные нами данные согласуются с результатами исследований других авторов, которые также отмечают влияние пептидогликанов, ТК и других структурных компонентов и продуктов жизнедеятельности бактерий (ЛПС, эндотоксинов) на функциональное состояние моноцитов, макрофагов, Т- и В-лимфоцитов [34, 39, 55, 64, 70, 244].