Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Формирование иммунного ответа макроорганизма на введение белковолипополисахаридного комплекса Francisella tularensis разных подвидов

005054820

На правах рукописи

ВОЙТКОВА Валентина Владимировна

ФОРМИРОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА МАКРООРГАНИЗМА НА ВВЕДЕНИЕ БЕЛКОВОЛИПОПОЛИСАХАРИДНОГО КОМПЛЕКСА РЯАЖШЕЬЬА ТиЬАЯЕтШ РАЗНЫХ ПОДВИДОВ (экспериментальное исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 НОЯ 2012

Иркутск - 2012

005054820

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Дубровина Валентина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Попкова София Марковна

(ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и экологии человека» СО РАМН, заведующая лабораторией микроэкологии)

доктор медицинских наук, профессор Бодиенкова Галина Михайловна

(Ангарский филиал ФГБУ «Восточно-Сибирский научный центр экологии человека» СО РАМН — Научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека, заведующая лабораторией иммунологических исследований)

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится » 2012 г. в_часов на заседании дис-

сертационного совета Д 001.038.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан « ¿Э^» 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета уг"^у' Шолохов Леонид Федорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Несмотря на большие достижения в изучении патогенеза туляремии, механизмы вирулентности туляремийного микроба и его взаимодействия с макроорганизмом остаются не до конца выясненными (Дубровина В.И., 2002; Домарадский И.В., 2005; Татарников С. А., 2010; Dennis D.T. et al., 2001 ; Ellis J., 2002; McLendon M.K. et al., 2006). Для раскрытия этих процессов необходимо привлечение новых современных подходов, способных выявлять ранее неизвестные факторы участия липополисахарида (ЛПС) туляремийного микроба при формировании резистентности организма к туляремии.

В настоящее время большое внимание уделяется ЛПС Francisella tularensis как одному из факторов патогенности. Следует отметить, что цитотоксичность ЛПС S-форм туляремийного микроба более выражена, чем цитотоксичность ЛПС R-форм. Она проявляется деструктивным действием и отчетливой тенденцией к более резкому ингибированию функциональной активности макрофагов мышей (Сорокин В.М. и др., 1996). Имеются сведения о том, что ЛПС туляремийного микроба является эндотоксином, однако для реализации токсических свойств необходимо его представление in vivo живыми бактериальными клетками типичных природных штаммов возбудителя (Оноприенко H.H., Павлович Н.В., 2003).

Известно, что ЛПС возбудителя туляремии не обладает летальной токсичностью как для белых мышей (Сорокин В.М. и др., 1996; Shite S. et al., 2007), так и для кроликов (Nutter J.E., 1971), и является одним из основных индукторов специфического иммунитета (Домарадский И.В., 2005; Fulop M. et al., 1993). Такие свойства позволяют рассматривать ЛПС в качестве одного из возможных компонентов химической вакцины.

Способность многих патогенных бактерий к выживанию в фагоцитах играет важную роль в патогенезе инфекции. Так, сравнительно недавно было показано участие О-антигена ЛПС F. tularensis в рефляции резистентности к комплементу, что уменьшает эффективность фагоцитоза макрофагами (Clay C.D. et al., 2008). По имеющимся в литературе сведениям, О-полисахарид ЛПС F. tularensis subsp. tularensis необходим для внутриклеточного выживания, тогда как О-антиген F. tularensis subsp. novicida является решающим фактором в устойчивости к бактерицидному действию сыворотки и менее значимым для внутриклеточного выживания (Thomas R.M. et al., 2007; Mokrievich A.N. et al., 2010). Кроме того, способность стимулировать образование цитокинов у ЛПС F. tularensis subsp. novicida выражена сильнее, нежели у ЛПС других подвидов франциселл (Kieffer T.L. et al., 2003). Известно, что иммунизация мышей ЛПС вакцинного штамма F. tularensis (LVS) вызывает активацию редкой популяции антиген-специфических В-1а клеток, продуцирующих Т-независимые антитела, что защищает мышей от гибели при заражении летальной дозой F tularensis LVS (Cole L.E. et al., 2009).

Работы, касающиеся влияния ЛПС туляремийного микроба разных подвидов на функциональную способность иммунокомпетентных клеток, затрагивают в основном отдельные их субпопуляции (Cowley S.C. et al., 2005; Ben Nasr A. et al., 2006; Powell H.J. et al, 2008; Cole L.E. et al., 2009; Cowley S.C. et al., 2010). Между тем, функциональная активность этих клеток и их способность секретировать цитокины в ответ на введение ЛПС F. tularensis и закономерности этих реакций изучены в меньшей мере. В связи с этим изучение динамики субпопуляционного

состава клеток крови, экспрессии активационных маркеров (в частности CD25) на поверхности лимфоцитов, а также одного из ключевых факторов подавления иммунного ответа - апоптоза клеток иммунофагоцитарной системы под действием ЛПС F. tularensis - позволит получить новые данные об особенностях взаимоотношений «хозяин - паразит», что будет способствовать пониманию механизмов патогенеза F. tularensis и экспериментальному обоснованию факторов, обеспечивающих резистентность организма к возбудителю туляремии.

Цель работы: выявить закономерности формирования иммунного ответа экспериментальных животных на введение белковолипополисахаридного комплекса (БЛПСК) туляремийного микроба разных подвидов.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:

1. Изучить влияние БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов на кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных.

2. Выявить закономерности изменений цитокинпродуцирующей активности клеток иммунофагоцитарной системы под влиянием БЛПСК F. tularensis разных подвидов.

3. Дать сравнительную оценку действия БЛПСК F. tularensis разных подвидов на индукцию апоптоза клеток крови белых мышей в условиях in vivo.

4. Выяснить закономерности формирования субпопуляционного состава лимфоцитов крови белых мышей, иммунизированных БЛПСК F tularensis разных подвидов.

Научная новизна

Получены новые сведения о формировании резистентности организма экспериментальных животных (белых мышей и морских свинок) под действием БЛПСК возбудителя туляремии разных подвидов.

Экспериментально доказано, что препараты БЛПСК F. tularensis subsp. tularensis Schu, БЛПСК F. tularensis subsp. mediasiatica A-120, БЛПСК F. tularensis subsp. novi-cida Utah 112, БЛПСК F tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ и БЛПСК F tularensis subsp. holarctica И-250, полученные твин-экстракцией в дозе 10 мкг/106 фагоцитов, являются антигенным стимулом для активации кислородзависимого метаболизма. Показано, что БЛПСК F tularensis subsp. mediasiatica, в отличие от БЛПСК туляремийного микроба других подвидов, способствует повышению содержания неферментных катионных белков в фагоцитах.

Новыми являются сведения о стимулирующем действии БЛПСК F tularensis subsp. mediasiatica А-120 и БЛПСК F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ на фагоцитарную активность иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих запуск каскада иммунных реакций и, как следствие, завершенный фагоцитоз туляремийного микроба.

При проведении комплексного сравнительного исследования впервые установлено влияние БЛПСК F. tularensis разных подвидов на формирование субпопуляционного состава клеток крови беспородных белых мышей. Установлено, что БЛПСК туляремийного микроба является индуктором Т-лимфоцитов (CD3+CD4+h CD3+CD8+) и моноцитов, но, тем не менее, степень активации этих клеток зависит от подвидовой принадлежности F. tularensis.

Приоритетными являются данные о том, что повышение интенсивности В-клеточной активации на фоне увеличения процентных показателей

CD3+CD4+HJI-4+-iuieTOK (Т-хелперы 2-го типа) в ходе антигенной (БЛПСК) стимуляции свидетельствует о включении гуморального иммунного ответа. С применением проточной цитофлуориметрии установлена роль БЛПСК туляремийного микроба в механизмах пролиферации иммунокомпетентных клеток и модуляции апоптоза, регулирующего численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях формирования адаптивного иммунитета.

Предложена и научно обоснована концептуальная схема механизмов действия БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов на функциональное состояние клеток иммунной системы.

Теоретическое и практическое значение работы

На основании проведенных исследований показана роль БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов в реализации бактерицидных механизмов фагоцитоза (кислород-, нитроксидзависимых и кислороднезависимых) клеток иммунофагоци-тарной системы.

Получены новые данные о клеточных и гуморальных факторах врожденного иммунитета и функциональных изменениях, происходящих в клетках организма при формировании адаптивного иммунитета под действием БЛПСК F. tularensis разных подвидов, которые дополняют теоретические знания и определяют направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к туляремийному микробу.

Экспериментально показано, что иммунный ответ, степень активации лимфоцитов, а также апоптоз иммунокомпетентных клеток лабораторных животных в ответ на введение БЛПСК туляремийного микроба зависит от подвидовой принадлежности и способа получения этих препаратов.

Патогенетически обоснована возможность применения БЛПСК туляремийного микроба в качестве средства, повышающего резистентность организма экспериментальных животных в отношении F. tularensis.

Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении методических рекомендаций: «Определение функционального состояния фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Иркутск, 2008); «Оценка компенсаторно-восстановительных процессов организма животных, инфицированных туляремийным микробом по индексу нейтрофильного сдвига и патологической зернистости нейтрофилов» (Иркутск, 2009); «Выявление фосфати-дилсерина на лимфоцитах крови мышей с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCanto™ II» (Иркутск, 2010); «Определение активности НАДФН-диафоразы в фагоцитах экспериментальных животных» (Иркутск, 2011).

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (г. Иркутск), Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (г. Улан-Удэ), ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск), Сибирского института физиологии и биологии растений СО РАН (г. Иркутск).

Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Положения, выносимые на защиту

1. Фагоциты, стимулированные БЛПСК F. tularensis, продуцируют ИЛ-1а, способствующий повышению степени активации эффекторных функций клеток иммунофагоцитарной системы (микробицидность, цитотоксичность, продукция супероксидных и нитроксидных радикалов), которая зависит от способа получения БЛПСК F. tularensis и его подвидовой принадлежности.

2. В процессе иммуногенеза, вызванного БЛПСК туляремийного микроба, активируются пролиферация иммунокомпетентных клеток и модуляция апоптоза. Особенности формирования субпопуляционного состава и образование апоптотических клеток крови белых мышей, иммунизированных БЛПСК туляремийного микроба, зависят от подвидовой принадлежности, сроков взаимодействия БЛПСК с клетками макроорганизма.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на международных научных конференциях: «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2008-2010); «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008); Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010-2011); всероссийских научных конференциях: «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных инфекций» (Иркутск, 2009); конференциях молодых ученых и специалистов: «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008» (Санкт-Петербург, 2008); «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2009); «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009); «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010-2011); III ежегодный всероссийский конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2011); Межрегиональная научно-практическая конференция молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2010-2011); научных конференциях ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Иркутск, 2008-2011).

Диссертация оформлена на основе материалов плановой темы «Изучение бактерицидных механизмов фагоцитоза и морфо-функциональных изменений иммунокомпетентных клеток и органов экспериментальных животных при инфекционном процессе, вызванном Frartcisella tularensis разных подвидов» с № ГР 0120.0013859 (2006-2009 гг.) и результатов текущей НИР «Влияние липополисахарида туляремийного микроба разных подвидов на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток макроорганизма» с № ГР 0120.0807000 (2008-2012 гг.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, две - в иностранных журналах.

Личный вклад соискателя

Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 22 рисунками. Список литературных источников содержит 200 наименований, в том числе 163 - зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальными моделями в основных опытах (заражение, иммунизация, отбор проб крови, получение фагоцитов и т.д.) служили сертифицированные (НПО «Вектор», Новосибирск) морские свинки (массой 300-350 г) и беспородные белые мыши (18-20 г). Всего в опытах использовано 729 животных: 115 морских свинок, 614 белых мышей. Животных выводили из эксперимента воздушной эмболией сосудов сердца в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1977).

В работе использовали препараты БЛПСК, выделенные водно-фенольным методом (Адаме Г.А., 1975) и твин-экстракцией (Николаев В.Б. и др., 2010) из Francisella tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ, F. tularensis subsp. tularensis Schu (Del для белых мышей - 1 КОЕ); F. tularensis subsp. holarctica И-250 (Del - 10 КОЕ); F. tularensis subsp. mediasiatica A-120 (Del - 10 КОЕ); F. tularensis subsp. novicida Utah 112 (авирулентен для белых мышей в дозе 1000 КОЕ). Электрофоретический анализ БЛПСКт и БЛПСКф показал характерную для ЛПС гетерогенность, проявляющуюся множественностью полос в виде «лестницы» при окраске геля ионами серебра. При взаимодействии с карбоциановым красителем «Stains all» препараты проявляли характерный для грамотрицательных бактерий метахроматический эффект. Содержание нуклеиновых кислот, белка, углеводов в исследуемых препаратах БЛПСК колебалось в пределах 0,4-0,9 %, 4,7-8,4 % и 11,4-17,8 % соответственно.

В качестве типичного ЛПС использовали коммерческий препарат ЛПС Salmonella enteritidis («Sigma»).

Для изучения действия препаратов в условиях in vivo вводили белым мышам подкожно БЛПСК туляремийного микроба в дозе 10 мкг/0,2 мл ЗФР. При изучении субпопуляционного состава объектом исследования служила кровь экспериментальных животных, которую брали из шейных сосудов до утреннего кормления в центрифужные пробирки с гепарином (10 ЕД/мл крови).

При изучении фагоцитарной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов использовали переживающую однослойную культуру (Фрейдлин И.С., 1984, 1986) перитонеальных макрофагов (ПМ) и полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ).

Клетки (106/мл ЗФР) примировали БЛПСКт в дозе 10 мкг в течение 60 мин при 37 °С. Интенсивность фагоцитоза оценивали по фагоцитарному индексу (ФИ), проценту активных фагоцитов (ПАФ), цитопатическому действию бактерий и индексу завершенности фагоцитоза (ИЗФ). Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) изучали по методу М.И. Прохоровой (1982), НАДФ Н-оксидазы (КФ 1.6.2.)- по методу R.L. Baehner, D.G. Nathan (1968) в модификации Е.П. Голубинского с соавт. (1995), NO-синтазы (NOS, КФ 1.14.13.39) - по методу S.J. Green с соавт. (1994) в нашей модификации (Дубровина В.И. и др., 2008), активность миелопероксидазы (МПО, КФ 1.11.1.7) и содержание неферментных катионных белков (НКБ)-спек-трофотометрически по методу Л.М. Сомовой (2005). Для оценки интенсивности образования в фагоцитирующих клетках метаболитов кислорода использовали НСТ-тест (Park В.Н. et al., 1968). ИЛ-10 выявляли в культуре макрофагов с помощью иммуноферментного метода (Bender MedSystems GmbH, Вена, Австрия). Анализ субпопуляционного состава клеток крови экспериментальных животных проводили методом проточной цитометрии на приборе BD FACSCanto™ II, собирая 10000 событий для каждой пробы. Оценивали общее количество популяций лейкоцитов и субпопуляций лимфоцитов (CD3~CD19+; CD3+CD19"; CD3+CD4+; CD3+CD8+), а также процентное содержание аннексии-V-положительных клеток (AnV+7-AAD~). При изучении активации лимфоцитов оценивали процент клеток, экспрессирующих маркер CD25+, регуляторных Т-лимфоцитов (CD3+CD4+CD25hi®h), атакже моноцитов, синтезирующих ИЛ-1а, и Т-хелперов 2-го типа, синтезирующих ИЛ-4. Количество активированных В- и Т-лимфоцитов определяли от общего числа лимфоцитов. Дополнительно вычислялись иммунорегуляторный индекс (CD4+/CD8+), лейко-Т-клеточный (лейкоциты/СОЗ+) и лейко-В-клеточный индекс (лейкоциты/СЭ19+).

Все полученные материалы обработаны статистически стандартными параметрическими методами с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрическим методом Манна-Уитни с применением пакета программ «Statistica» v. 6.0 (©StatSoft, Inc. 19842001, ИПЧИ 31415926535897). Для каждой выборки вычисляли средневы-борочные характеристики: М— среднее арифметическое, s — среднее квадратичное отклонение. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена (rs). Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки была меньше 0,05 (р < 0,05) по отношению к контролю.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Действие белковолипополисахаридного комплекса туляремийного

микроба разных подвидов на неспецифическую резистентность

организма экспериментального животного

Многоплановость и сложность решения затронутых проблем определила необходимость комплексного исследования с применением современных аналитических методов, а задача получения сопоставимых данных обусловила проведение экспериментов по единому научно-методическому плану. Подобную комплексность и сопоставимость в достаточной мере обеспечило исследование действия БЛПСК F tularensis практически на все стадии фагоцитарного процесса в отношении F. tularensis subsp. holarctica 15: поглощения микроба с последующим изучением активности ферментов «респираторного взрыва» и завершенности фагоцитоза. Параллельно 8

оценивали особенности бактерицидных механизмов (кислородзависимых и кисло-роднезависимых антимикробных систем) фагоцитов восприимчивых к туляремии экспериментальных животных - морской свинки и белой мыши.

Показано, что препараты БЛПСК в дозах 10, 50 и 100 мкг не токсичны для белых мышей, тем не менее, при введении экспериментальным животным 100 мкг БЛПСК имело место увеличение размеров селезенки и регионарных лимфатических узлов (в случае БЛПСК туляремийного микроба подвида tularensis - в 1,5-2,0 раза).

В эксперименте по изучению влияния БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов на неспецифическую резистентность организма в условиях in vitro было использовано 115 беспородных, но стандартных по условиям содержания и массе морских свинок и 75 белых мышей. В качестве экспериментальной модели служили ПМ и ПЯЛ. Объектом для исследования фагоцитарной способности клеток служил вакцинный штамм F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ.

Установлено, что поглотительная способность ПМ, примированных БЛПСКт туляремийного микроба разных подвидов (в дозе 10 мкг/106 фагоцитов), в большей степени выражена в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250. ФЧ для этих препаратов варьировало в пределах от 1,9 ± 0,4 до 2,4 ± 0,6 у. е., тем не менее, завершенный фагоцитоз выявлен только в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 (+3,3 ± 0,9 и +1,5 ± 0,3 y. e. соответственно). Данное обстоятельство свидетельствует о способности этих препаратов повышать фагоцитарную активность ПМ.

Известно, что активные формы кислорода являются промежуточными продуктами, которые участвуют в защите хозяина от возбудителя туляремии (Hajjar А.М. et al., 2006). В ходе исследования установлено, что БЛПСКт туляремийного микроба стимулирует кислородзависимый метаболизм фагоцитов экспериментальных животных. Цитохимический показатель активности ПМ, примированных БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 (19,2 ± 3,0 у. е.), был достоверно выше (р < 0,05), чем в контроле (14,1 ± 1,1 у. е.), вместе с тем, у других препаратов БЛГТСКт F tularensis выявлена тенденция к повышению этого показателя (кроме БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15).

Общеизвестно, что осуществление фагоцитоза клетками системы мононукле-арных фагоцитов и ПЯЛ сопровождается увеличением потребления кислорода, повышением активности ферментов гексозомонофосфатного шунта, а также возрастающим образованием перекиси водорода и супероксиданиона в этих клетках (Фрейдлин И.С., 2001). Г6ФДГ является ключевым ферментом пентозомонофосфат-ного шунта, катализирующим начальную реакцию окисления глюкозо-6-фосфата, при которой акцептором водорода является НАДФ (Плехова Н.Г., 2006).

Анализ данных, полученных при изучении влияния БЛПСКт туляремийного микроба на активность Г6ФДГ, показал, что все использованные в эксперименте БЛПСКт F. tularensis, независимо от подвидовой принадлежности, достоверно (р < 0,05) стимулируют активность этого фермента по сравнению с контролем, что свидетельствует об усилении в фагоцитах окисления глюкозы в гексозомонофос-фатном шунте и о повышении скорости взаимопревращения НАДФ «-► НАДФ-Н. Связанная с этим активация КЗМ обеспечивает ПМ более высокий уровень бактерицидной способности. Наибольшее потребление глюкозы фагоцитами зарегистрировано в случае макрофагов, примированных БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica

15 (ИС в этом случае выше в 2,0-3,3 раза (р < 0,05), по сравнению с фагоцитами, стимулированными БЛПСКт К tularensis других подвидов).

Одним из медиаторов воспаления, который продуцируется при активации макрофагов, является N0, который играет существенную роль в подавлении бактериального роста и развитии экспериментального инфекционного процесса, вызванного F. tularensis (Ройт А. и др., 2000; Lindgren Н. et al., 2004). Так, в литературе имеются сведения о том, что ПМ крысы, инфицированные F. tularensis subsp. novicida в условиях in vitro, спонтанно высвобождают NOz~ в количествах, достаточных для подавления роста бактерий (Cowley S.C. et al., 1996). Кроме того, имеются сведения о том, что продукцию NO индуцирует ЛПС F. tularensis subsp. holarctica LVS (Ancuta P. et al., 1996).

Нами показано, что при взаимодействии БЛПСКт F. tularensis с фагоцитами происходит стимуляция NO-синтазы ПМ, тем не менее, достоверных различий по синтезу монооксида азота между БЛПСКт F. tularensis не выявлено. Полученные в ходе эксперимента данные указывают на способность БЛПСКт F. tularensis, независимо от подвидовой принадлежности, стимулировать NO-синтазу (рис. 1). На основании имеющихся в литературе данных об участии монооксида азота в бактерицидных механизмах фагоцитоза, логично предположить, что БЛПСК туляремийного микроба может способствовать усилению киллинга инфекционного агента в макроорганизме.

1 2 3 4 5 6

Рис. 1. Влияние БЛПСКтуляремийного микроба разных подвидов на синтез монооксида азота перитонеальными макрофагами морской свинки (М ±э): 1 - БЛПСКт Р. Магелв/э эиЬБр. ШагсЛса 15; 2- БЛПСКт Я Ш/агепБйБ иЬвр. 1по1агсНса И-250; 3 - БЛПСКт Г. (и/алепв/э эиЬвр. тесЧаз'1аНса\ 4 - БЛПСКт Г. ^/агепз/э эиЬзр. novicidа■í 5 - БЛПСКт Я7. Маселв/в эиЬБр. Йу/агелв/в; 6 - ЛПС Б. еп?ел/М/'з; «—» -контроль; * - р < 0,05 по сравнению с контролем.

Внутриклеточную антиокислительную защиту обеспечивают в основном СОД и каталаза. Считается, что СОД удаляет избыток токсических супероксидных радикалов и, тем самым, защищает биологические мембраны от окислительного повреждения. Активность этого фермента во многих случаях зависит от уровня супероксиданиона в клетках, который выступает по отношению к ферменту в качестве индуцирующего и активирующего фактора (Плехова Н.Г., 2006; Фрейдлин И.С., 2001). В ходе эксперимента выявлена тенденция БЛПСКт Р. 1и1агеп515 в дозе 10 мкг/106 фагоцитов к повышению продукции фагоцитами медиатора воспаления - супероксидцисмутазы - по сравнению с контролем в среднем в 1,5 раза, вместе с тем, выраженность этого процесса не зависит от подвидовой принадлежности БЛПСК туляремийного микроба и его вирулентности. 10

Известно, что миелопероксидаза является важной составной частью антимикробной активности фагоцитов, обеспечивающей врожденный неспецифический иммунитет (Фрейдлин И.С., 2001). В связи с этим наследующем этапе исследований нами изучено действие БЛПСКт туляремийного микроба на миелопероксидазну ю систему ПЯЛ в условиях in vitro. Активация МПО системы фагоцитов в отношении БЛПСКт F. lularensis не была достоверной по сравнению с контролем, однако относительно БЛПСКт F. lularensis subsp. mediasiatica, БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis и БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida выявлена тенденция к стимуляции этого фермента.

При исследовании кислороднезависимых бактерицидных механизмов фагоцитов мы уделили особое внимание неферментным катионным белкам, поскольку НКБ обладают электростатическим механизмом воздействия на клеточные структуры бактерий.

Данные, полученные при изучении влияния БЛПСКт туляремийного микроба разных подвидов, указывают на то, что у ПЯЛ, примированных БЛПСКт F. tularensis, наблюдается повышение показателей содержания НКБ, свидетельствующее о способности этих препаратов активировать кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов по сравнению с контролем (10,9± 3,4 у. е.). Однако достоверные различия выявлены только в случае БЛПСКт F. lularensis subsp. mediasiatica (19,2 ± 2,7 у. е.).

Полученные в ходе исследований данные свидетельствуют о стимулирующем воздействии БЛПСКт туляремийного микроба на выработку ИЛ-10 ПМ белых мышей независимо от подвидовой принадлежности (рис. 2).

*

1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Влияние БЛПСК туляремийного микроба на продукцию фагоцитами ИЛ-10 (М ± э): 1 — БЛПСКт Р. Магелз/г зиЬэр. Ло/агсйса 15; 2 - БЛПСКт Я Ги/алепэ/з эиЬэр. ^ о!агсИса И-250; 3 - БЛПСКт Р. Ги/агелз/'з зиЬэр. тесЛаэ/айса; 4 - БЛПСКт Р. МагепвШ эиЬэр. novicidа^, 5- БЛПСКтЯ {и/агелв/'з зиЬэр. йу/агелз/з; 6-ЛПС 5. ел* - р < 0,05 по сравнению с ЛПС Б. еШепМ/е.

Установлено, что БЛПСКт Р. tularensis эиЬзр. tularensis, БЛПСКт F. Ыагеп51$ зиЬэр. Ио1агс11са 15, БЛПСКт Р. ш1агеп$1з зиЬБр. ко!агсИса И-250 и БЛПСКт/7". 1и1а-геп515 зиЬэр. mediasiatica стимулируют ПМ к продукции ИЛ-10 в большей степени, чем БЛПСКт Р. Шагеп$1$ зиЬБр. novicida. Тем не менее, БЛПСКт F. Шагеп$15 БиЬзр.

оказывает достоверно максимальный эффект на секрецию этого цитокина, концентрация которого превышает контрольные значения в 7,1 раза (р <0,001). Вместе с тем, достоверных различий относительно БЛПСКт Р. Ш1агеп51з зиЬэр. 1и1агет'и и БЛПСКт Р. /и/алешм виЬвр. Ио1агсИса И-250 не выявлено.

Таким образом, БЛПСКт F. lularensis in vitro стимулирует неспецифическую резистентность организма при участии кислородзависимых и кислороднезависимых бактерицидных систем фагоцитов экспериментальных животных, усиливая тем самым бактерицидный потенциал фагоцитов. Характер изменения активности N0-синтазы и СОД ПМ морских свинок при взаимодействии с БЛПСКт туляремийного микроба не зависит от подвидовой принадлежности. Статистически значимых различий в активации миелопероксидазной системы фагоцитов при взаимодействии БЛПСКт F. lularensis разных подвидов с ПЯЛ морских свинок не выявлено.

Функциональная способность клеток крови при взаимодействии с белковолипосахаридным комплексом F. tularensis в условиях in vitro

Имеющиеся в настоящее время в литературе сведения из-за их разрозненности и недостаточности сравнительных данных не позволяют пока определить роль ЛПС F. tularensis в активации иммунокомпетентных клеток, в частности, их способность синтезировать цитокины и экспрессировать CD25 (Воробьев A.A., Быковская С.Н., 2006; Ben Nasr А. et al., 2006; Powell H.J. et al., 2008; Cole L.E. et al.. 2009; Cowley S.C. et al., 2010). Для решения данной проблемы необходимость комплексного сравнительного исследования является очевидной. В связи с этим следующим этапом наших исследований стало изучение действия БЛПСК туляремийного микроба на активацию лимфоцитов и моноцитов крови белых мышей в условиях in vitro. В качестве объекта использовали препараты БЛПСК туляремийного микроба, выделенные методом твин-экстракции и водно-фенольным методом.

Установлено, что БЛПСКт/ф F. tularensis независимо от подвидовой принадлежности способствует увеличению экспрессии CD25 Т-клеток (CD3+CD25+) в среднем в 3,1 раза (р < 0,001) по сравнению с контролем, тем не менее, в случае БЛПСКт выявлена тенденция к активации СОЗ+-клеток в большей степени (рис. 3).

БЛПСКт F. tularensis

90 '

**

Üiii

90

БЛПСКф F. tularensis

** ** £ i i Ä i

1 2 3 4 5 6 7 Рис. 3. Влияние БЛПСК Р. ?и/агелэ/э разных подвидов на содержание (%) общей популяции активированныхТ-клеток (С03+С025+) (М ± э): 1 - БЛПСК Г. Ги/агелв/'з зиЬэр. 1ю1агсНса И-250; 2 - БЛПСК F. Ш/агелз/ззиЬзр. novicida■, 3 - БЛПСК Р. Ги-/агепа/эзиЬэр. ^/агелз/з; 4 - БЛПСК Р. ^и/алелз/эзиЬзр. тесЧаз1аИса\ 5 - БЛПСК Р. Ьу/агелз/з эиЬэр. Ьо!агсНса 15; 6 - ЛПС Э. еШегШсИз-, 7 - контроль; * - р < 0,05; ** - р < 0,001 по сравнению с контролем.

Показано увеличение экспрессии раннего маркера активации С025 на СБЗ+С04+ (р < 0,01) и С03+С08+ лимфоцитах {р < 0,05) в среднем в 2,0 раза по сравнению с

контролем, свидетельствующее об участии в иммунном ответе как Т-хелперов, так и цитотоксических Т-лимфоцитов.

Известно, что в регуляции иммунного ответа на внедрение патогена существенная роль отводится популяции Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD4+CD25hlgh (Shevach Е.М. et al., 2001), поэтому следующим разделом нашей работы стала идентификация этой популяции в образцах клеток крови, примированных БЛПСКт/ф F. tularensis разных подвидов. Выявлены статистически значимые (р < 0,01) различия содержания С03+С04+С025Ы8Ь Т-лимфоцитов по сравнению с контролем, которые характеризовались увеличением популяции регуляторных клеток. В ходе эксперимента выявлена тенденция БЛПСКт F. tularensis стимулировать образование регуляторных Т-лимфоцитов в большей степени, чем у БЛПСКф F. tularensis, однако достоверное отличие содержания этой популяции лимфоцитов было отмечено только в случае БЛПСК F. tularensis subsp. tularensis (р < 0,05).

При изучении влияния БЛПСК туляремийного микроба на моноциты выявлено увеличение экспрессии CD25 в 1,3-1,7 раза по сравнению с контролем (р < 0,05), что свидетельствует о стимулирующем эффекте БЛЙСК F. tularensis на активацию этих клеток.

В литературе имеются сведения о том, что медиаторы воспалительного ответа, в том числе и цитокины, являются мощным иммунорегуляторными, про- и антивоспалительными агентами, стимуляторами образования и высвобождения других биологически активных веществ (Фрейдлин И.С., 2001). Цитокины регулируют реакции врожденного и адаптивного иммунного ответа при многих инфекционных болезнях, в том числе и туляремии (Татарников С.А., 2010; Telepnev М. et al., 2003; Gavrilin М.А. et al. 2006). ИЛ-1а выступает в качестве одного из главных медиаторов, ответственных за развитие неспецифических форм защиты, формирование местной воспалительной реакции и острофазного ответа на уровне организма при инфекционном поражении (Johansson А. et al., 2000). Важная роль в детоксикации ЛПС принадлежит гуморальным факторам иммунитета с участием ИЛ-4 (Preston А., Maskell D.J., 2002; Raetz C.R., Whitfield С., 2002; Ray H.J. et al., 2009).

БЛПСКт Я tularensis БЛПСКф F. tularensis

3,3 - 3,3

ШМоноциты, синтезирующие ИЛ-1а ИТ-хелперы,синтезирующие ИЛ-4

Рис. 4. Показатели синтеза ИЛ-1а и ИЛ-4 клетками крови белых мышей, примированных БЛПСКт Я ¡и/агепв/з разных подвидов (М ± э): 1 - БЛПСК Я Ыалепэ/з эиЬэр. Ьо!агсНса 15; 2 - БЛПСК Г. Ги/агелэ/'з зиЬэр. 1ю/агсНса И-250; 3 - БЛПСК Я. 1и1агепв'13 эиЬБр, тей/ав/айса; 4 - БЛПСК Я. (и/агелв/э зиЬэр. лои/с/с/а; 5 -БЛПСК Я. Ги/агелз/э виЬзр. Магелэ/в; 6 - ЛПС Б. enterШd¡s\ 7 - контроль; * -р < 0,05 по сравнению ЛПС Э. егйегШсИа.

Нами показано, что в случае примирования клеток БЛПСКт/ф F tularensis разных подвидов, кроме БЛПСКф F. tularensis subsp. holarctica 15, имело место достоверное увеличение (р < 0,05) содержания CD3+CD4+KJI-4+ Т-хелперов по сравнению с контролем. Следует отметить, что БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica стимулирует синтез ИЛ-1а моноцитами в большей степени, чем БЛПСК туляремийного микроба других подвидов (рис. 4).

Таким образом, БЛПСК туляремийного микроба является индуктором как CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-клеток, так и моноцитов, но, тем не менее, степень активации этих клеток зависит не только от подвидовой принадлежности и вирулентности F. tularensis, но и от способа выделения БЛПСК.

Выявленные в ходе эксперимента различия в активации синтеза ИЛ-1а моноцитами в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica могут свидетельствовать о влиянии данного препарата на процесс пролиферации, дифференцировки и индукцию апоптоза клеток в большей степени, чем другие исследованные препараты. Данное обстоятельство, а также полученные нами данные о протективных свойствах БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica, могут свидетельствовать о плейотропном эффекте цитокинов, синтезированных под действием БЛПСК, на клетки, что, в свою очередь, способствует поддержанию тканевого гомеостаза путем формирования защитных реакций организма.

Влияние белковолнпополисахаридного комплекса F. tularensis

разных подвидов на активацию апоптоза клеток крови

Необходимым механизмом регулирования иммунного ответа при воспалительном процессе является апоптотическая гибель иммунокомпетентных клеток, которая играет важную роль в установлении баланса между уровнем циркулирующих эффек-торных клеток и их своевременным удалением. Известно, что F. tularensis вызывает апоптоз макрофагов и В-лимфоцитов мыши и человека (Grünov К., Spletstoesser W., 2000; Lai Х.Н. et al., 2001). Однако участие в реализации программы апоптоза БЛПСК F. tularensis до настоящего времени не подтверждено. Нами впервые в модельной системе in vivo с применением проточной цитофлуориметрии получены данные о влиянии БЛПСКт/ф туляремийного микроба на развитие апоптоза лейкоцитов крови белых мышей.

При изучении интенсивности апоптоза клеток крови экспериментальных животных, иммунизированных БЛПСКт/ф F. tularensis разных подвидов, показано, что процент апоптотических моноцитов и лимфоцитов в крови белых мышей во все сроки наблюдения выше, чем в контроле (рис. 5). Так, показано, что способность клеток крови фиксировать на своей поверхности AnV в Са2+-зависимой среде достоверно повышалась к 3-м суткам {р < 0,05), по сравнению с контролем, что может свидетельствовать об усилении межклеточных взаимодействий при иммунном ответе, вызванном БЛПСК туляремийного микроба.

Установлено, что по содержанию циркулирующих АпУ+-моноцитов во все сроки наблюдения между группами экспериментальных животных, иммунизированных препаратами БЛПСКт/ф F. tularensis, статистически значимых различий не выявлено. Тем не менее, в случае БЛПСКт/ф F. tularensis subsp. tularensis и БЛПСКф F. tularensis subsp. mediasiatica на 9-е сутки отмечалось повышение апоптоза моноцитов в 1,3-2,8 раза (р < 0,05), по сравнению с 3-ми и 6-ми сутками наблюдения.

Лимфоциты

БЛПСКт Я (и/агепая

Моноциты БЛПСКт Я Ш1агепз15

3 6 9

Сро№1 наблюдения, сут. БЛПСКфР. (и/агелаэ

3 6 9

Сроки наблюдения, сут.

БППСКф Е Шагепэгэ

3 6 9 3 6 9

Сроки наблюдения, сут. Сроки наблюдения, сут.

01 02 ИЗ 04 О 5 Пб — 7 Рис. 5. Показатели апоптоза клеток крови мышей, иммунизированных БЛПСК Р. Ю/агепБ/э разных подвидов (М ± э): 1 - БЛПСК Г. ^/агепв/'в эиЬзр. Ло/агсйса 15; 2 - БЛПСК Р. (Ыагелвю эиЬэр. Ь о1агсНса И-250; 3 - БЛПСК Р. Ги/агелз/э эиЬэр. теЛаэ/аГ/са; 4 - БЛПСК Г. Шагепэ'я зиЬэр. поу/ас1а; 5 - БЛПСК Я Магелв/'з эиЬэр. Ги/агелв/э; 6 - ЛПС б. е^епЬсЛэ] 7 - Контроль; * - р < 0,05 по сравнению Л ПС Б. еШегШсИз.

Полученные в ходе эксперимента данные о достоверном увеличении (р < 0,05) на 3-й сутки процентного содержания апоптотических Т-хелперов в 1,2-2,3 раза при иммунизации мышей БЛПСКт/ф К ш/яле/ш'.? зиЬвр. Ио1агсИса И-250, БЛПСКт Р. Ш1агепз1з зиЬэр. Ио1агсйса 15 и БЛПСКт/ф Г. Ш1агет1$ зиЬэр. тесИа51аНса, по сравнению с препаратами БЛПСКт/ф туляремийного микроба других подвидов, свидетельствуют о повышенной готовности клеток к апоптозу. Тем не менее, при определении количества АпУ-положительных Т-хелперов на 6-е сутки наблюдения достоверных различий между опытными группами не установлено. Апоптоз зрелых Т-хелперов является средством регуляции интенсивности и продолжительности иммунного ответа, что подтверждается высоким содержанием СОЗ+СЭ4+ на 9-е сутки по сравнению с другими субпопуляциями лимфоцитов.

Наличие АпУ+В-лимфоцитов на 3-й сутки у экспериментальных животных, иммунизированных БЛПСКт Е ш1агепз1з, может указывать на элиминацию ауто-реактивных В-клеток, избежавших делеции во время раннего развития. В связи

с тем, что на 6-9-е сутки увеличивается селекция В-клеточных клонов с высокой антиген-связывающей способностью (Ройт А. и др., 2000), повышение содержания апоптотических CD3'CD19+b эти сроки наблюдения может свидетельствовать о гибели низкоаффинных клонов В-лимфоцитов.

Таким образом, анализ полученных в ходе экспериментов данных указывает на то, что БЛПСК F. tularensis разных подвидов, выделенных с помощью твин-экстракции и водно-фенольным методом, не вызывает апоптотический дисбаланс клеточного иммунитета, тем не менее, интенсивность апоптоза клеток крови экспериментальных животных в условиях in vivo зависит от способа получения БЛПСК, его подвидовой принадлежности и сроков наблюдения.

Изменение субпопуляционного состава лимфоцитов крови

в условиях in vivo

В связи с тем, что препараты БЛПСКф F. tularensis и БЛПСКт F. tularensis являются индукторами иммунного ответа, в следующей серии опытов по исследованию действия БЛПСК F tularensis на формирование субпопуляционного состава клеток крови беспородных белых мышей в модельной системе in vivo работу проводили с использованием только БЛПСКт.

Воздействие БЛПСК F. tularensis на экспериментальных животных проявлялось качественными и количественными сдвигами популяций мононуклеарных клеток крови. Так, анализ параметров иммунного статуса у экспериментальных животных, иммунизированных препаратами БЛПСК F. tularensis, выявил, что количественное соотношение клеток крови находилось в пределах физиологической нормы (рис. 6).

1 2 3 4 5 6 7

ШЗ сутки Вбсутхи П39 сутки

Рис. 6. Абсолютное содержание лейкоцитов в крови у экспериментальных животных, иммунизированных БЛПСК Г. ^/агелзю (М ±в): 1 - БЛПСКт Р. Ы/агепв/Б зиЪэр. 1ю1агсНса 15; 2 - БЛПСКт Р. (и/агелз/Б эиЬэр. 1по1агсиса И-250; 3 - БЛПСКт Р. /агелэ/'ззиЬзр. тейаз/айса; 4 - БЛПСКт Г. Пу/агелз/'ззиЬзр. ломс/'с/а; 5 - БЛПСКт Р. Ги/агелэ/з виЬзр. Ш/агелв/з; 6 - ЛПС Э. елГег/'Ш/з; 7 - контроль; * - р < 0,05 по сравнению с контролем.

Тем не менее, относительно БЛПСКт Р. т1агеп515 вчЬвр. Ыагею'и и БЛПСКт Р. Шагет'и зиЬБр. Ио/агсНса И-250 отмечалось существенное снижение показателей содержания лейкоцитов, что, возможно, связано с миграцией клеток к очагу воспаления, а в случае БЛПСКт Р Ш1агет1$ БиЬзр. novicida - увеличение этих показателей, что указывает на развитие воспалительного процесса, сопровождающееся

мобилизацией резервов, демаргинацией (мобилизации клеток маргинального пула в циркуляцию) или увеличением времени циркуляции клеток.

Сравнительный анализ полученных данных показал, что препараты БЛПСКт F. tularensis не оказывали влияние на относительное количество Т-лимфоцитов (СОЗ+-клеток), свидетельствующее об отсутствии Т-клеточного дефицита. Тем не менее, при оценке содержания Т-лимфоцитов выявлено увеличение ИРИ, превышающее верхнюю границу физиологической нормы до 1,8 раза за счет снижения содержания цитотоксических Т-лимфоцитов и увеличения Т-хелперов (CD3+CD4+), что является подтверждением усиленной работы иммунной системы. Следует отметить, что соотношение CD4 : CD8 зависит от подвидовой принадлежности БЛПСКт туляремийного микроба и сроков наблюдения.

Статистически значимое (р < 0,01) снижение процентного содержания В-лимфоцитов, свидетельствующие об уменьшении доли С019+-клеток, выявлены в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica и могут быть связаны со снижением количества Т-лимфоцитов, продуцирующих В-клеточный ростовой фактор (ИЛ-4). Достоверное увеличение В-лимфоцитов у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250, БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida и F. tularensis subsp. tularensis на 3-й сутки (p < 0,05 по сравнению с контролем), на наш взгляд, может быть связано с тем, что БЛПСК относят к тимуснеза-висимым антигенам (Никулин Б.А., 2008; Хаитов P.M. и др., 2011; Cole L.E. et al., 2009).

Анализ полученных данных о повышении содержания числа CD3+CD25+ и С03+С04+С025+-клеток в большей степени при инокуляции мышам БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 и БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida во все сроки наблюдения может указывать на особенности структуры О-антигена (Phillips N.J. et al., 2004; Soni S., 2010). Обращает на себя внимание достоверное увеличение на 3-й сутки количества Т-хелперов и В-лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации - С025-антиген, у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica (р < 0,05), что обеспечивает быстрое размножение и последующую дифференцировку наивных клеток до зрелых форм. Выявленное в ходе эксперимента достоверное увеличение активированных Т-лимфоцитов у животных, иннокулированных БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis, по сравнению с контролем, на 9-е сутки (р < 0,05), возможно, свидетельствует об активации этих клеток путем опосредованного действия фагоцитов и В-лимфоцитов (Хаитов P.M. и др., 2011). В случае БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis, БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 достоверное повышение количества активированных В-лимфоцитов зарегистрировано к 6-м суткам.

Таким образом, увеличение экспрессии CD25 на иммунокомпетентных клетках характеризует повышение их функциональной активности в условиях антигенной стимуляции. Сравнительный анализ полученных данных между группами обследованных экспериментальных животных в зависимости от использованного для исследования in vivo препарата показал, что высокое содержание в крови мышей, получивших БЛПСКт туляремийного микроба разных подвидов, основных субпопуляций Т-лимфоцитов, положительных по CD25, по-видимому, можно объяснить продолжительной антиген-специфической или неспецифической активацией Т-лимфоцитов. Данные настоящего исследования подтверждают существенную роль БЛПСК F. tularensis в иммуногенезе туляремии с участием моноцитов, Т-хелперов и В-лимфоцитов.

Важная роль провоспалительных цитокинов в формировании резистентности организма к бактериальным патогенам послужила основанием для исследования влияния БЛПСКт Г. шЬгежя на активацию Т-хелперов 2-го типа.

У мышей, иммунизированных БЛПСКт К 1и1агепя1з, высокое содержание С03+С04+ИЛ-4+-клеток (рис. 7) сопровождалось снижением количества моноцитов, синтезирующих ИЛ-1 а (рис. 8), что, возможно, связано с ингибирующим действием ИЛ-4 на синтез этого провоспалительного цитокина (Никулин Б. А., 2008; Роит А. и др., 2000).

40--—---

3 6 9

Сроки наблюдения, сут.

ЕЗЭ. еп(ел'(йе 0Р- Магетев зий^Р. Магй'са 15

□Р. (ийгеляз зиЬэр. Магсйса И-250 ШР. Ыагепэв яиЬдэ. теаа$1аИса НДР. (ийлелз/я мЬвр. поисйа ПР. Ыагепь'е эиЬзр. Ма/ел.5й

Рис. 7. Влияние БЛПСК Р. Ыагепэ/'з разных подвидов на секрецию ИЛ-4Т-хелперами (М ± э): * - р < 0,05 по сравнению с контролем.

1 2 3 4 5 6

ШЗ-и сутки ЕЭб-е сутки И9-е сутки

Рис. 8. Влияние БЛПСК Г. Ги/агелз/в разных подвидов на продукцию ИЛ-1 а моноцитами (М ± в): 1 - ЛПС Э. елГегШю; 2 - БЛПСКт Р. Ги/агелэ/з виЬзр. Гю1агсНса 15; 3 - БЛПСКт Р. Малелз/'э виЬзр. ЬоШгсНса И-250; 4 - БЛПСКт Р. ?и/агелз/з виЬвр тесЧаз^аИса-, 5 - БЛПСКт Р. Магепэя эиЬэр. лон'с/'с/а; 6 - БЛПСКт Р. Ги/агелв/э эиЬэр. Ги/агелв/з); * - р < 0,01 по сравнению с ЛПС Б. ел

Известно, что функционально ИЛ-1 обусловливает пролиферацию лимфоцитов при развитии иммунного ответа и выступает в качестве одного из главных медиаторов, ответственных за развитие неспецифических форм защиты - формирование местной воспалительной реакции и острофазного ответа на уровне организма при антигенной стимуляции (Никулин Б.А., 2008; Хаитов Р.М. и др., 2011).

Как показал детальный анализ полученных результатов, БЛПСКт К 1и1агет15 БиЬэр. тесИаз'шйса и БЛПСКт К 1и1агет1$ эиЬзр. Ио1агсПса 15 активировали моноциты (С025+, ИЛ-1а) в большей степени, чем другие БЛПСКт К ш1агет'ич, что может являться объяснением способности этих препаратов повышать фагоцитарную активность системы мононуклеарных фагоцитов.

В ходе экспериментов у мышей, иммунизированных БЛПСКт Е ш1агеп$15, выявлены множественные корреляционные связи субпопуляций лимфоцитов и моноцитов, что свидетельствует о высокой сопряженности между клетками иммунной системы и подтверждает их участие в формировании адаптивного иммунного ответа к БЛПСК туляремийного микроба.

Повышение интенсивности В-клеточной активации на фоне увеличения процентных показателей С03+С04+ИЛ-4+-клеток (Т-хелперы 2-го типа) в ходе антигенной (БЛПСК) стимуляции свидетельствует о включении гуморального иммунного ответа. С применением проточной цитофлуориметрии установлено непосредственное участие БЛПСК туляремийного микроба в механизмах пролиферации иммунокомпетентных клеток и модуляции апоптоза, регулирующего численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях формирования адаптивного иммунитета.

Кратко резюмируя изложенные выше материалы, можно констатировать, что по совокупности проведенных исследований БЛПСК туляремийного микроба обладает выраженной иммуногенной активностью. Безусловно, важен факт успешного применения БЛПСК туляремийного микроба в качестве средства, повышающего резистентность организма экспериментальных животных в отношении Е 1и1агеп$1$.

С учетом литературных данных о БЛПСК, материалов о роли туляремийного микроба на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных представляется возможным гипотетически сформулировать комплекс факторов, обеспечивающих иммунокоррегирующее действие БЛПСК Е шЬгет'и разных подвидов на иммунокомпетентные клетки макроорганизма.

БЛПСК Ргапс1зе11а Ыагеп$1В

| виЬэр.Ио/агсйса |-Н 15 НИИЭГ (вакцинный)(Т)-»'{ И-25о(Т)

5иЬзр, те(ИаШюа(^)_[ зиЬэр. лоуШа(4) | виЬзр.

Н Макроорганизм"

Активированные фагоциты

_(ПЯЛ, ПМ)

| Фагоцитарная активность (ПАФ, ФЧ)

Кислороднезависимые (НКБ) и кислородзавиеимые (Г6ФДГ, НСТ-тест) бактерицидные системы

Субпопуляционный состав клеток _периферической крови

Лимфоциты

1 2 3 4 N

5Т .

Лейкоциты

1 2 3 N 4 1 5 Т

Нитроксидзависимые (ЫОсинтаза) бактерицидные системы

Антиоксидантная система (СОД) |

"Г

Завершенный фагоцитоз

1 з О

2 4 5 =

Активированные моноциты

•лимфоциты N

Активированные ► Т-лимфоциты

\

Т-лимфоциты

1 2 3 4 N

5|

Активированные В-лимфоц^ты

к

С04*-клетки I

СОа'-кпетки I 1

-Л-

Увеличение

ИРИ (С04СС>8)

1

5Т

Регуляторные Т-лимфоциты

Рис. 9. Концептуальная схема действия БЛПСК Р. Ги/агелв/э разных подвидов на функциональное состояние клеток иммунной системы в эксперименте: Т - активация; 4- - ингибирование; (+) - завершенный фагоцитов; (-) - незавершенный фагоцитоз; N - отсутствие изменений.

На основании вышеизложенного нами предложена концептуальная схема закономерностей изменений функционального состояния клеток иммунной системы под действием БЛПСК F. íularensis разных подвидов (рис. 9), суть которой состоит в следующем: БЛПСК туляремийного микроба повышает активность Г6ФДГ, N0-синтазы, СОД МПО и содержание НКБ, обеспечивая высокий уровень бактерицидной способности фагоцитов и завершенность фагоцитоза; активированные моноциты синтезируют ИЛ-1 а, оказывающий аутокрйнное действие, а также способствующий активации Т-лимфоцитов, синтезирующих В-клеточный ростовой фактор (ИЛ-4). В процессе иммуногенеза, вызванного БЛПСК туляремийного микроба, активируется пролиферация иммунокомпетентных клеток и модуляция апоптоза

ВЫВОДЫ

1. Фагоцитоз туляремийного микроба макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами, примированными БЛПСКт F. tularensis разных подвидов в условиях in vitro, является преимущественно незавершенным (60-70 %), тем не менее, в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ и БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica А-120 он носит завершенный характер.

2. БЛПСКт туляремийного микроба, независимо от подвидовой принадлежности, в условиях in vitro повышает кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов, что характеризуется высокими показателями НСТ-теста, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, NO-синтазы и увеличением содержания неферментных катионных белков. Вместе с тем, достоверное повышение уровня неферментных катионных белков в 1,9 раза, по сравнению с контролем, выявлено в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica А-120.

3. БЛПСК туляремийного микроба, независимо от подвидовой принадлежности, в условиях in vitro стимулирует продукцию ИЛ-10. Способность клеток иммунофаго-цитарной системы продуцировать этот противовоспалительный цитокин выражена в большей степени относительно БЛПСКт F tularensis subsp. tularensis Schu. Препараты БЛПСК F. tularensis в условиях in vivo стимулируют синтез ИЛ-la и ИЛ-4, тем не менее, в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica А-120 и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ показатели содержания клеток, синтезирующих ИЛ-1а, в 1,5-2,0 раза выше, по сравнению с другими препаратами БЛПСК, что обеспечивает запуск каскада иммунных реакций, способствующих повышению резистентности организма экспериментальных животных.

4. БЛПСК туляремийного микроба как в in vitro, так и in vivo, является индуктором моноцитов, CD3+CD4+h CD3+CD8+ Т-клеток, однако степень активации этих клеток зависит не только от подвидовой принадлежности F. tularensis, но и от способа выделения БЛПСК. Множественные корреляционные связи субпопуляций лимфоцитов и моноцитов у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis, указывают на высокую сопряженность между клетками иммунной системы и подтверждают их участие в формировании адаптивного иммунитета к БЛПСК туляремийного микроба.

5. БЛПСК F. tularensis оказывает влияние на уровень циркулирующих апоп-тотических клеток, регулируя численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях формирования адаптивного иммунитета.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах, рецензируемых ВАК

1. Войткова В.В. Изучение апоптоза клеток макроорганизма методом проточной цитофлуориметрии // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2010. - № 6 (1). - С. 220-226.

2. Влияние туляремийного микроба разных подвидов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток экспериментальных животных / В.И. Дубровина, С.А. Татарников, Ж.А. Коновалова, В.В. Войткова и др. // Проблемы особо опасных инфекций.-2010.-№ 106 (4).-С. 51-53.

3. Особенности влияния липополисахарида туляремийного микроба разных подвидов на метаболическую активность фагоцитов в условиях in vitro / В.И. Дубровина, Ж.А. Коновалова, В.Б. Николаев, В.В. Войткова и др. // Проблемы особо опасных инфекций.-2011,-№ 107.-С. 57-60.

4. Особенности динамики апоптоза клеток крови экспериментальных животных, иммунизированных липополисахаридом туляремийного микроба разных подвидов / В.В. Войткова, В.И. Дубровина, С.А. Татарников, В.Б. Николаев и др. // Известия Иркутского государственного университета. Серия «Биология. Экология». - 2011. - № 4. - С. 39-46.

5. Субпопуляционный состав Т-лимфоцитов крови экспериментальных животных примированных липополисахаридом Francisella tularensis / В.В. Войткова, В.И. Дубровина, Ж.А. Коновалова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2011. - № 3 (2). - С. 144-147.

Публикации в иных изданиях

1. Влияние липополисахарида туляремийного микроба на метаболическую активность фагоцитов / В.И. Дубровина, В.В. Войткова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2008. - Т. 60, № 2. - С. 65-67.

2. Влияние туляремийного микроба разных подвидов на бактерицидные системы фагоцитов / В.И. Дубровина, Ж.А. Коновалова, С.А. Татарников, A.B. Мазепа, С. А. Витязева, В.В. Войткова и др. // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. - Киров, 2008. - С. 176.

3. Войткова В.В. Липополисахарид Francisella tularensis и его биологическая активность // Деп. В ВИНИТИ - Иркутск, 2008. - 34 с.

4. Определение функциональной способности фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма: Метод, рекомендации / В.И. Дубровина, Ж.А. Коновалова, О.Б. Колесникова, С.А. Татарников, С.А. Витязева, В.В. Войткова и др. - Иркутск, 2008. - 10 с.

5. Сравнительная оценка влияния ЛПС туляремийного микроба разных подвидов на активность бактерицидных систем фагоцитов in vitro / В.И. Дубровина, С.А. Татарников, ЕЛО. Марков, В.Б. Николаев, Ю.О. Попова, A.B. Мазепа, В.В. Войткова // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Матер. Междунар. симп. (Санкт-Петербург, 2—4 июня 2008 г.). - СПб., 2008. - С. 93.

6. Витязева С.А., Татарников С.А., Войткова В.В. Морфологическая оценка изменений иммунокомпетентных органов животных, инфицированных туляремийным микробом // Фундаментальная наука и клиническая медицина: Матер. 12-й Всерос. медико-биологической конф. молодых исследователей. - СПб., 2009. - С. 70-71.

7. Идентификация геномных областей pdpD и pdpA у туляремийного микроба разных подвидов / С.А. Татарников, A.B. Мазепа, В.И. Дубровина, В.В. Войткова // Биологическая безопасность в современном мире: Матер, науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора. -Оболенск, 2009. - С. 69-71.

8. Изучение влияния Francisella tularensis in vivo на иммунный ответ макроорганизма экспериментальных животных / В.И. Дубровина, С. А. Татарников, Ж.А. Коновалова, В.В. Войткова и др. // Ж. инфекционной патологии. - 2009. - № 3, Т. 16. - С. 103-104.

9. Коновалова Ж. А., Татарников С. А., Войткова В.В. Цитокинпродуцирующая активность мононуклеарных фагоцитов при экспериментальной туляремии // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов. - СПб., 2009. - С. 49-50.

10. Морфологические изменения иммунокомпетентных органов морских свинок, зараженных возбудителем туляремии разных подвидов / С. А. Витязева, Т.П. Старовойтова, В.И. Дубровина, С.А. Татарников, A.B. Мазепа, В.В. Войткова//Ж. инфекционной патологии. - 2009. - № 3, Т. 16. - С. 86-87.

11. Оценка компенсаторно-восстановительных процессов организма животных, инфицированных туляремийным микробом разных по индексу нейтрофильного сдвига и патологической зернистости нейтрофилов: Метод, рекомендации / С.А. Витязева, Т.П. Старовойтова, В.И. Дубровина, С.А. Татарников, В.В. Войткова. - Иркутск, 2009. - 7 с.

12. Влияние липополисахаридатуляремийного микроба разных подвидов на клеточные факторы иммунитета / Ж.А. Коновалова, В.В. Войткова и др. // II Ежегодный Всерос. Конгр. по инфекционным болезням. - М., 2010. - С. 150-151.

13. Войткова В.В. Исследование апоптоза с помощью проточной цитофлуориме-трии // Деп. В ВИНИТИ. - Иркутск, 2010. - 63 с.

14. Выявление фосфатидилсерина на лимфоцитах крови мышей с помощью проточного цитофлюориметра BD FACSCanto™ II: Метод, рекомендации / В.В. Войткова,

B.И. Дубровина, О.Б. Колесникова и др. - Иркутск, 2010.- 16 с.

15. Коновалова Ж.А., Войткова В.В., Дубровина В.И. Изучение биологической активности липополисахарида туляремийного микроба разных подвидов in vitro II Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Матер, науч.-практ. школы-конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2010. - С. 277-279.

16. Influence of Francisella tularensis of different subspecies on cytokine-producing ability of phagocytes in experiment / Z.A. Konovalova, V.l. Dubrovina, S.A. Tatarnikov, V. V. Vojtkova et al. // Current Issues on Zoonotic Diseases. - 2010. - N 18. - P. 226-230.

17. Войткова В.В., Коновалова Ж.А., Козулина Е.Ю. Влияние липополисахарида Francisella tularensis разных подвидов на Т-лимфоциты крови in vitro II Матер. III ежегодного всерос. конгр. по инфекционным болезням. - М., 2011. - С. 71.

18. Методические рекомендации по определению активности НАДФН-диафоразы в фагоцитах экспериментальных животных / Ж.А. Коновалова, В.И. Дубровина, C.B. Балахонов, Т.П. Старовойтова, В.В. Войткова и др. - Иркутск, 2011. - 12 с.

19. Субпопуляционный состав клеток крови мышей, иммунизированных липопо-лисахаридом Francisella tularensis / В.В. Войткова, В.И. Дубровина, Ж.А. Коновалова,

C.А. Татарников, В.Б. Николаев//Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Матер. III науч.-практ. школы-конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2011. - С. 316-319.

20. Influence of Francisella tularensis lipopolysaccharide on subpopulational composition of blood cells in experiment / V.l. Dubrovina, V.V. Vojtkova et al. // Current Issues on Zoonotic Diseases.-2011.-N 19.-P. 141-146.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЛПСК - белковолипополисахаридный комплекс

Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ЗФР - забуференный физиологический раствор рН 7,2

ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза

ИКК - иммунокомпетентные клетки

ИЛ - интерлейкины (1,4, 10 и т.д.)

ИРИ - иммунорегуляторный индекс

ИС - индекс стимуляции

ИФН-у - интерферон-гамма

КЗМ - кислородзависимый метаболизм

КОЕ - колониеобразующая единица

ЯВИ - лейко-В-клеточный индекс

ЛД50 (LDso) - доза испытуемого агента, вызывающая гибель 50 % взятых в опыт животных

ЛПС - липополисахарид

ЛТИ - лейко-Т-клеточный индекс

МПО - миелопероксидаза

НАДФ Н - никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотид фосфат окисленный

НСТ- тест - тест с нитросиним тетразолием

НКБ - неферментные катионные белки

ПАФ - процент активных фагоцитов

ПМ - перитонеальные макрофаги

ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

СОД - супероксиддисмутаза

ФИ - фагоцитарный индекс

ФНО-а - фактор некроза опухолей альфа

ФС - фосфатидилсерин

ФЧ - фагоцитарное число

AnV - аннексин V

CD - кластер дифференциации

Del - доза антигена, вызывающая гибель 100 % животных

LVS - живой вакцинный штамм

NO - окись азота

NOS - фермент NO-синтаза

subsp. - подвид (subspecies)

Подписано в печать 17.10.2012. Бумага офсетная. Формат 60x84'/,6-

Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 _Тираж 100экз. Заказ№091-12.

РИО НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)

Актуальность проблемы

Несмотря на большие достижения в изучении патогенеза туляремии, механизмы вирулентности Francisella tularensis и его взаимодействия с макроорганизмом остаются не до конца выяснены [8, 9, 33, 131, 191, 194]. Для раскрытия этих процессов необходимо привлечение новых современных подходов, способных выявлять ранее неизвестные факторы участия липопо-лисахарида (ЛПС) туляремийного микроба при формировании резистентности организма к туляремии.

В настоящее время большое внимание уделяется ЛПС F. tularensis как одному из факторов патогенности. Следует отметить, что цитотоксичность ЛПС S-форм туляремийного микроба более выражена, чем R-форм. Она проявляется деструктивным действием и отчетливой тенденцией к более резкому ингибированию функциональной активности макрофагов мышей [30]. Известно, что ЛПС возбудителя туляремии не обладает летальной токсичностью как для белых мышей [30, 38], так и для кроликов [145], и является одним из основных индукторов специфического иммунитета [8, 91]. Тем не менее, имеются сведения о том, что ЛПС туляремийного микроба является эндотоксином, однако для реализации токсических свойств необходимо его представление in vivo живыми бактериальными клетками типичных природных штаммов возбудителя [18].

Способность многих патогенных бактерий к выживанию в фагоцитах играет важную роль в патогенезе инфекции. Так, сравнительно недавно было показано участие О-антигена ЛПС F. tularensis в регуляции резистентности к комплементу, что снижает эффективность фагоцитоза макрофагами [82]. По имеющимся в литературе сведениям, О-полисахарид ЛПС F. tularensis subsp. tularensis необходим для внутриклеточного выживания, тогда как О-антиген F. tularensis subsp. novicida является решающим фактором в устойчивости к бактерицидному действию сыворотки и менее значимым для внутриклеточного выживания [53, 185]. Кроме того, способность стимулировать образование цитокинов у ЛПС F. tularensis subsp. novicida выражена сильнее, нежели у ЛПС других подвидов франциселл [84]. Известно, что иммунизация мышей ЛПС вакцинного штамма F. tularensis (LVS) вызывает активацию редкой популяции антиген-специфических В-1а клеток, продуцирующих Т-независимые антитела, что защищает мышей от гибели при заражении летальной дозой F. tularensis LVS [106].

Работы, касающиеся влияния ЛПС туляремийного микроба разных подвидов на функциональную способность иммунокомпетентных клеток, затрагивают, в основном, отдельные их субпопуляции [46, 57, 58, 64, 68, 127, 149, 199]. Между тем, функциональная активность этих клеток и их способности секретировать цитокины в ответ на введение ЛПС F. tularensis -изучены в меньшей мере. В связи с этим, исследование динамики субпопуля-ционного состава клеток крови, экспрессии активационных маркеров (в частности CD25) на поверхности лимфоцитов, а также одного из ключевых факторов подавления иммунного ответа - апоптоза клеток иммунофагоцитарной системы под действием ЛПС F. tularensis, позволит получить новые данные об особенностях взаимоотношений «хозяин-паразит», что будет способствовать пониманию механизмов патогенеза F. tularensis и экспериментальному обоснованию факторов, обеспечивающих резистентность организма к возбудителю туляремии.

Цель работы - выявить закономерности формирования иммунного ответа экспериментальных животных на введение белковолипополисахаридно-го комплекса туляремийного микроба разных подвидов.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:

1. Изучить влияние БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов на кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных.

2. Выявить закономерности изменений цитокинпродуцирующей активности клеток иммунофагоцитарной системы под влиянием БЛПСК F. tularensis разных подвидов.

3. Дать сравнительную оценку действия БЛПСК F. tularensis разных подвидов на индукцию апоптоза клеток крови белых мышей в условиях in vivo.

4. Выяснить закономерности формирования субпопуляционного состава лимфоцитов крови белых мышей, иммунизированных БЛПСК F. tularensis разных подвидов.

Научная новизна

Получены новые сведения о формировании резистентности организма экспериментальных животных (белых мышей и морских свинок) под действием БЛПСК возбудителя туляремии разных подвидов.

Экспериментально доказано, что препараты БЛПСК F. tularensis subsp. tularensis Schu, БЛПСК F. tularensis subsp. mediasiatica A-120, БЛПСК F. tularensis subsp. novicida Utah 112, БЛПСК F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИ-ЭГ и БЛПСК F. tularensis subsp. holarctica И-250, полученные твин-экстракцией в дозе 10 мкг/106 фагоцитов являются антигенным стимулом для активации кислородзависимого метаболизма. Показано, что БЛПСК F. tularensis subsp. medias iatica, в отличие от БЛПСК туляремийного микроба других подвидов, способствует повышению содержания неферментных катион-ных белков в фагоцитах.

Новыми являются сведения о стимулирующем действии БЛПСК F. tularensis subsp. mediasiatica А-120 и БЛПСК F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ на фагоцитарную активность иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих запуск каскада иммунных реакций, и, как следствие, завершенный фагоцитоз туляремийного микроба.

При проведении комплексного сравнительного исследования впервые установлено влияние БЛПСК F. tularensis разных подвидов на формирование субпопуляционного состава клеток крови беспородных белых мышей. Установлено, что БЛПСК туляремийного микроба является индуктором Т-лимфоцитов (СОЗ+СБ4+ и С03С08+) и моноцитов, но, тем не менее, степень активации этих клеток зависит от подвидовой принадлежности Р. Ш1агет18.

Приоритетными являются данные о том, что повышение интенсивности В-клеточной активации на фоне увеличения процентных показателей СВЗ+С04+ИЛ-4+-клеток (Т-хелперы 2 типа) в ходе антигенной (БЛПСК) стимуляции, свидетельствует о включении гуморального иммунного ответа. С применением проточной цитофлуориметрии установлено непосредственное участие БЛПСК туляремийного микроба в механизмах пролиферации имму-нокомпетентных клеток и модуляции апоптоза, регулирующего численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях формирования адаптивного иммунитета.

Предложена и научно обоснована концептуальная схема механизмов действия ЛПС туляремийного микроба разных подвидов на функциональное состояние клеток иммунной системы

Теоретическое и практическое значение работы

На основании проведенных исследований показана роль БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов в реализации бактерицидных механизмов фагоцитоза (кислород-, нитроксидзависимых и кислороднезависимых) клеток иммунофагоцитарной системы.

Получены новые данные о клеточных и гуморальных факторах врожденного иммунитета и функциональных изменениях, происходящих в клетках организма при формировании адаптивного иммунитета под действием БЛПСК Р. ш1агет1я разных подвидов, которые дополняют теоретические знания и определяют направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к туляремийному микробу.

Экспериментально показано, что иммунный ответ, степень активации лимфоцитов, а также апоптоз иммунокомпетентных клеток лабораторных животных в ответ на введение БЛПСК туляремийного микроба зависит от подвидовой принадлежности и способа получения этих препаратов.

Патогенетически обоснована возможность применения БЛПСК туляре-мийного микроба в качестве средства, повышающего резистентность организма экспериментальных животных в отношении F. tularensis.

Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении методических рекомендаций:

Определение функционального состояния фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Иркутск, 2008);

Оценка компенсаторно-восстановительных процессов организма животных, инфицированных туляремийным микробом по индексу нейтрофильного сдвига и патологической зернистости нейтрофилов» (Иркутск, 2009);

Выявление фосфатидилсерина на лимфоцитах крови мышей с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCanto™ IT» (Иркутск, 2010);

Определение активности НАДФН-диафоразы в фагоцитах экспериментальных животных» (Иркутск, 2011).

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Улан-Удэнского института общей и экспериментальной биологии СО РАН, Новосибирского ГНЦ ВБ «Вектор», Иркутского СИ-ФИБР СО РАН.

Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Положения исследования, выносимые на защиту

1. Фагоциты, стимулированные БЛПСК F. tularensis, продуцируют ИЛ-1а, способствующий повышению степени активации эффекторных функций клеток иммунофагоцитарной системы (микробицидность, цитотоксичность, продукция супероксидных и нитроксидных радикалов), которая зависит от способа получения БЛПСК F. tularensis и его подвидовой принадлежности.

2. В процессе иммуногенеза, вызванного БЛПСК туляремийного микроба, активируется пролиферация иммунокомпетентных клеток и модуляция апоптоза. Особенности формирования субпопуляционного состава и образование апоптотических клеток крови белых мышей, иммунизированных БЛПСК туляремийного микроба, зависят от подвидовой принадлежности, сроков взаимодействия БЛПСК с клетками макроорганизма. Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на: •Международных научных конференциях: «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2008-2010); «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008);

•Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010; 2011);

•Всероссийских научных конференциях: «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных инфекций» (Иркутск, 2009);

•конференциях молодых ученых и специалистов: «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008» (Санкт-Петербург, 2008); «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2009); «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009); «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010; 2011); III ежегодный всероссийский конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2011); Межрегиональных научно-практических конференциях молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2010; 2011);

•научных конференциях ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Иркутск, 2008-2012).

Диссертация оформлена на основе материалов плановой темы «Изучение бактерицидных механизмов фагоцитоза и морфо-функциональных изменений иммунокомпетентных клеток и органов экспериментальных животных при инфекционном процессе, вызванном Fraиcгse//a Ш/агешк разных подвидов» с № ГР 0120.0013859 (2006-2009 гг.) и результатов текущей НИР «Влияние липополисахарида туляремийного микроба разных подвидов на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток макроорганизма» с № ГР 0120.0807000 (2008-2012 гг.).

Публикации: По теме диссертации опубликованы 25 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, две - в иностранных журналах.

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 22 рисунками. Список литературных источников содержит 200 наименований, в том числе 163 - зарубежных.

выводы

1. Фагоцитоз туляремийного микроба макрофагами и полиморфноядер-ными лейкоцитами, примированными БЛПСКт F. tularensis разных подвидов в условиях in vitro, является преимущественно незавершенным (60-70 %), тем не менее, в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ и БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica А-120 он носит завершенный характер.

2. БЛПСКт туляремийного микроба, независимо от подвидовой принадлежности, в условиях in vitro, повышает кислородзависимые и кислороднеза-висимые бактерицидные системы фагоцитов, что характеризуется высокими показателями НСТ-теста, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, N0-синтазы и увеличением содержания неферментных катионных белков. Вместе с тем, достоверное повышение уровня неферментных катионных белков в 1,9 раза по сравнению с контролем выявлено в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica А-120.

3. БЛПСК туляремийного микроба, независимо от подвидовой принадлежности, в условиях in vitro стимулирует продукцию ИЛ-10. Способность клеток иммунофагоцитарной системы продуцировать этот противовоспалительный цитокин выражена в большей степени относительно БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis Schu. Препараты БЛПСК F. tularensis в условиях in vivo стимулируют синтез ИЛ-la и ИЛ-4, тем не менее, в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica А-120 и БЛПСКт/7. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ показатели содержания клеток, синтезирующих ИЛ-la, в 1,5-2,0 раз выше по сравнению с другими препаратами БЛПСК, что обеспечивает запуск каскада иммунных реакций, способствующих повышению резистентности организма экспериментальных животных.

4. БЛПСК туляремийного микроба как в условиях in vitro, так и in vivo является индуктором моноцитов, CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-клеток, однако, степень активации этих клеток зависит не только от подвидовой принадлежности F. tularensis, но и от способа выделения БЛПСК. Множественные корреляционные связи субпопуляций лимфоцитов и моноцитов у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis, указывают на высокую сопряженность между клетками иммунной системы и подтверждают их участие в формировании адаптивного иммунитета к БЛПСК туляремийного микроба.

5. БЛПСК F. tularensis оказывает влияние на уровень циркулирующих апоптотических клеток, регулируя численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях формирования адаптивного иммунитета.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

История изучения возбудителя туляремии - F. tularensis - насчитывает более ста лет, тем не менее, исчерпывающих сведений о факторах патогенно-сти этой бактерии и механизмах их действия до настоящего времени нет [54, 151, 155, 192]. В связи с этим, особое внимание уделяется не только изучению патогенеза и иммуногенеза самого микроорганизма, но и его детерминант вирулентности, которые могут быть использованы при конструировании химической вакцины. В частности, важными являются сведения об участии компонентов бактерий в реализации защитных механизмов врожденного и адаптивного иммунитета [8].

Согласно данным литературы, основной мишенью иммунного ответа человека при туляремийной инфекции и иммунизации является ЛПС F. tularensis, который играет существенную роль в реализации вирулентных свойств F. tularensis [49, 89, 105, 165]. Известно, что в структуре ЛПС туляремийного микроба имеются различия между подвидами, влияющие на биоактивность эндотоксина и вирулентность бактерий [139, 156]. В связи с тем, что ЛПС F. tularensis является одним из иммунодоминантных антигенов возбудителя туляремии и определило необходимость его всестороннего изучения с применением современных аналитических методов, а задача получения сопоставимых данных обусловила проведение экспериментов по единому научно-методическому плану.

Объектом исследования избран БЛПСК туляремийного микроба, который выделяли твин-экстракцией (БЛПСКт) [27] и водно-фенольным методом (БЛПСКф) [1] из клеток F. tularensis subsp. holarctica 15, F. tularensis subsp. tularensis Schu 11, F. tularensis subsp. holarctica И-250, F. tularensis subsp. mediasiatica A-120, F. tularensis subsp. novicida Utah 112.

В качестве типичного ЛПС использовали коммерческий препарат ЛПС S. enteritidis (Sigma, США). Контролем служили клетки интактных животных.

Препараты БЛПСКт по своим физико-химическим свойствам не отличались от БЛПСК, выделенных классическим водно-фенольным способом.

Электрофоретический анализ показал характерную для БЛПСК гетерогенность, проявляющуюся множественностью полос в виде «лестницы» при окраске геля ионами серебра. При взаимодействии с карбоциановым красителем «Stains all» препараты проявляли характерный для ЛПС грамотрицатель-ных бактерий метахроматический эффект. Содержание нуклеиновых кислот, белка, углеводов в исследуемых препаратах БЛПСК колебалось в пределах 0,4-0,9 %; 4,7-8,4 %; 11,4-17,8 %, соответственно.

Показано, что препараты ЛПС в дозах 10, 50 и 100 мкг не токсичны для белых мышей, тем не менее, при введении экспериментальным животным 100 мкг БЛПСК имело место увеличение размеров селезенки и регионарных лимфатических узлов (в случае БЛПСК туляремийного микроба подвида tu-larensis в 1,5-2,0 раза).

Основным механизмом защиты организма при туляремийной инфекции является активация метаболизма макрофагов [128]. Известно, что фагоциты выполняют роль фагоцитирующих клеток с киллерной активностью в неспецифическом иммунном ответе и антигенпрезентирующих клеток в специфическом адаптивном иммунитете, а также продуцируют провоспалительные цитокины [34]. В связи с этим, моделью для изучения влияния БЛПСК F. tularensis на бактерицидные механизмы фагоцитоза в отношении F. tula-rensis subsp. holarctica 15 в условиях in vitro были выбраны эти клетки. Исходя из того, что влияние БЛПСК F. tularensis на механизмы фагоцитоза туляремийного микроба вакцинного штамма могут быть поняты только при комплексном исследовании, мы попытались изучить эффективность основных стадий взаимодействия «фагоцит-микроб». Подобную комплексность и сопоставимость в достаточной мере обеспечило исследование действия БЛПСК F. tularensis на практически все стадии фагоцитарного процесса в отношении F. tularensis subsp. holarctica 15: поглощения микроба с последующим изучением активности ферментов «респираторного взрыва» и завершенности фагоцитоза. Параллельно оценивали также особенности бактерицидных механизмов (кислородзависимых и кислороднезависимых антимикробных систем) фагоцитов восприимчивых к туляремии экспериментальных животных -морских свинок и белых мышей.

С учетом цели и задач исследования в эксперименте по изучению влияния БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов на неспецифическую резистентность организма в условиях in vitro было использовано 115 стандартных по условиям содержания и массе морских свинок и 75 беспородных белых мышей. В качестве экспериментальной модели служили перитонеаль-ные макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты. Объектом для исследования фагоцитарной способности клеток служил вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ.

Поглотительная способность фагоцитирующих ПМ, примированных БЛПСКт, в большей степени выражена в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 и БЛПСКт/7. tularensis subsp. holarctica И-250. ФЧ для этих препаратов варьировало в пределах от 1,9 ± 0,4 у. ед. до 2,4 ± 0,6 у. ед., тем не менее, завершенный фагоцитоз выявлен только в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 (+3,3 ± 0,9 у. ед.; +1,5 ± 0,3 у. ед. соответственно). Данное обстоятельство свидетельствует о способности этих препаратов повышать фагоцитарную активность ПМ.

Известно, что АФК являются промежуточными продуктами, которые участвуют в защите хозяина от возбудителя туляремии [116]. В ходе исследования установлено, что БЛПСК т туляремийного микроба стимулирует ки-слородзависимый метаболизм фагоцитов экспериментальных животных. Цитохимический показатель активности ПМ, примированных БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 (19,2 ± 3,0 у.е.) был достоверно выше, чем в контроле (14,1 ± 1,1 у.е.), вместе с тем, у других препаратов БЛПСКт F. tularensis выявлена тенденция к повышению этого показателя (кроме БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15).

Общеизвестно, что осуществление фагоцитоза клетками системы моно-нуклеарных фагоцитов и ПЯЛ сопровождается увеличением потребления кислорода, повышением активности ферментов гексозомонофосфатного шунта, а также возрастающим образованием перекиси водорода и супероксиданиона в этих клетках [34]. Г6ФДГ является ключевым ферментом пентозомонофос-фатного шунта, катализирующий начальную реакцию окисления глюкозо-6-фосфата, при которой акцептором водорода является НАДФ [26].

Анализ данных, полученных при изучении влияния БЛПСКт туляре-мийного микроба на активность Г6ФДГ показал, что все использованные в эксперименте БЛПСКт F. tularensis независимо от подвидовой принадлежности, достоверно (Р < 0,05) стимулируют активность этого фермента по сравнению с контролем, что свидетельствует об усилении в фагоцитах окисления глюкозы в гексозомонофосфатном шунте и о повышении скорости взаимопревращения НАДФ;£ НАДФ-Н. Связанная с этим активация КЗМ обеспечивает ПМ более высокий уровень бактерицидной способности. Наибольшее потребление глюкозы фагоцитами зарегистрировано в случае макрофагов, примированных БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 (ИС в этом случае выше в 2,0-3,3 раза (Р < 0,05) по сравнению с фагоцитами, стимулированными БЛПСКт F. tularensis других подвидов).

Одним из медиаторов воспаления, который продуцируется при активации макрофагов, является NO, который играет существенную роль в подавлении бактериального роста и развитии экспериментального инфекционного процесса, вызванного F. tularensis [29, 72]. Так, в литературе имеются сведения о том, что ПМ крысы, инфицированные F. tularensis subsp. novicida в условиях in vitro, спонтанно высвобождают NO2 в количествах, достаточных для подавления роста бактерий [66]. Кроме того, имеются сведения о том, что продукцию NO индуцирует БЛПСК F. tularensis subsp. holarctica LVS [109].

Нами показано, что при взаимодействии БЛПСКт F. tularensis с фагоцитами происходит стимуляция NO-синтазы ПМ, тем не менее, достоверных различий по синтезу монооксида азота между БЛПСКт F. tularensis не выявлено. Полученные в ходе эксперимента данные указывают на способность

БЛПСКт F. tularensis не зависимо от подвидовой принадлежности стимулировать NO-синтазу. На основании имеющихся в литературе данных об участии монооксида азота в бактерицидных механизмах фагоцитоза, логично предположить, что БЛПСК туляремийного микроба может способствовать усилению киллинга инфекционного агента в макроорганизме.

Внутриклеточную антиокислительную защиту обеспечивают, в основном, СОД и каталаза. Считается, что СОД удаляет избыток токсических супероксидных радикалов и, тем самым, защищает биологические мембраны от окислительного повреждения. Активность этого фермента во многих случаях зависит от уровня супероксиданиона в клетках, который выступает по отношению к ферменту в качестве индуцирующего и активирующего фактора [26, 34]. В ходе эксперимента выявлена тенденция БЛПСКт F. tularensis в дозе 10 мкг/106 фагоцитов к повышению продукции фагоцитами медиатора воспаления - супероксиддисмутазы по сравнению с контролем в среднем в 1,5 раза, вместе с тем, выраженность этого процесса не зависит от подвидовой принадлежности БЛПСК туляремийного микроба и его вирулентности.

Известно, что миелопероксидаза является важной составной частью антимикробной активности фагоцитов, обеспечивающей врожденный неспецифический иммунитет [34]. В связи с чем, на следующем этапе исследований нами изучено действие БЛПСКт туляремийного микроба на миелопе-роксидазную систему ПЯЛ в условиях in vitro. Активация МПО системы фагоцитов в отношении БЛПСКт F. tularensis не была достоверной по сравнению с контролем, однако относительно БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasia-tica, БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis и БЛПСКт F. tularensis subsp. novi-cida выявлена тенденция к стимуляции этого фермента.

При исследовании кислороднезависимых бактерицидных механизмов фагоцитов мы уделили особое внимание неферментным катионным белкам, поскольку НКБ обладают электростатическим механизмом воздействия на клеточные структуры бактерий.

Данные, полученные по изучению влияния БЛПСКт туляремийного микроба разных подвидов, указывают на то, что у ПЯЛ, примированных БЛПСКт F. tularensis, наблюдается повышение показателей содержания неферментных катионных белков, свидетельствующее о способности этих препаратов активировать кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов по сравнению с контролем (10,9 ± 3,4 у.е.). Однако достоверные различия выявлены только в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica (19,2 ± 2,7 у.е.).

В следующей серии экспериментов нами проведено сравнительное изучение влияния БЛПСКт F. tularensis разных подвидов на способность моно-нуклеарных фагоцитов вырабатывать противовоспалительный цитокин -ИЛ-10.

Полученные в ходе исследований данные свидетельствуют о стимулирующем воздействии БЛПСКт туляремийного микроба на выработку ИЛ-10 ПМ белых мышей независимо от подвидовой принадлежности. Установлено, что БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarc-tica 15, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 и БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica стимулируют ПМ к продукции ИЛ-10 в большей степени, чем БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida. Тем не менее, БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis оказывает достоверно максимальный эффект на секрецию этого цитокина, концентрация которого превышает контрольные значения в 7,1 раза (Р < 0,001). Вместе с тем, достоверных различий относительно БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 не выявлено.

Таким образом, БЛПСКт F. tularensis in vitro стимулирует неспецифическую резистентность организма при участии кислородзависимых и кисло-роднезависимых бактерицидных систем фагоцитов экспериментальных животных, усиливая тем самым бактерицидный потенциал фагоцитов. Характер изменения активности NO-синтазы и СОД ПМ морских свинок при взаимодействии с БЛПСКт туляремийного микроба не зависит от подвидовой принадлежности. Статистически значимых различий в активации миелоперокси-дазной системы фагоцитов при взаимодействии БЛПСКт F. tularensis разных подвидов с ПЯЛ морских свинок не выявлено.

Имеющиеся в настоящее время в литературе сведения из-за их разрозненности и недостаточности сравнительных данных не позволяют пока определить роль БЛПСК F. tularensis в активации иммунокомпетентных клеток, в частности, их способность синтезировать цитокины и экспрессировать CD25 [46, 57, 64, 68, 127, 149, 199]. Для решения данной проблемы необходимость комплексного сравнительного исследования является очевидной. В связи с чем, следующим этапом наших исследований стало изучение действия БЛПСК туляремийного микроба на активацию лимфоцитов и моноцитов крови белых мышей в условиях in vitro.

Установлено, что БЛПСКт/ф F. tularensis независимо от подвидовой принадлежности способствует увеличению экспрессии CD25 Т-клеток (CD3+ CD25+) в среднем в 3,1 раза (Р < 0,001) по сравнению с контролем, тем не менее, в случае БЛПСКт выявлена тенденция к активации С D3"-клеток в большей степени. Показано увеличение экспрессии раннего маркера активации CD25 на CD3+CD4+ (Р < 0,01) и CD3+CD8+ лимфоцитах (Р < 0,05) в среднем в 2,0 раза по сравнению с контролем, свидетельствующее об участии в иммунном ответе, как Т-хелперов, так и цитотоксических Т-лимфоцитов.

Известно, что в регуляции иммунного ответа на внедрение патогена существенная роль отводится популяции Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD4+CD25high [65], поэтому следующим разделом нашей работы стала идентификация этой популяции в образцах клеток крови, примированных БЛПСКт/ф F. tularensis разных подвидов. Выявлены статистически значимые (Р < 0,01) различия содержания CD3+CD4+CD25hlgh Т-лимфоцитов по сравнению с контролем, которые характеризовались увеличением популяции регу-ляторных клеток. В ходе эксперимента выявлена тенденция БЛПСКт F. tularensis стимулировать образование регуляторных Т-лимфоцитов в большей степени, чем у БЛПСКф F. tularensis, однако, достоверное отличие содержания этой популяции лимфоцитов, было отмечено только в случае БЛПСК F. tularensis subsp. tularensis (Р < 0,05).

При изучении влияния БЛПСК туляремийного микроба на моноциты выявлено увеличение экспрессии CD25 в 1,3-1,7 раза по сравнению с контролем (Р < 0,05), что свидетельствует о стимулирующем эффекте БЛПСК F. tularensis на активацию этих клеток.

В литературе имеются сведения о том, что медиаторы воспалительного ответа, в том числе и цитокины, являются мощным иммунорегуляторными, про- и антивоспалительными агентами, стимуляторами образования и высвобождения других биологически активных веществ [34]. Цитокины регулируют реакции врожденного и адаптивного иммунного ответа при многих инфекционных болезнях, в том числе и туляремии [33, 87, 1 11]. ИЛ-1а выступает в качестве одного из главных медиаторов, ответственных за развитие неспецифических форм защиты, формирование местной воспалительной реакции и острофазного ответа на уровне организма при инфекционном поражении [79]. Важная роль в детоксикации ЛПС принадлежит гуморальным факторам иммунитета с участием ИЛ-4 [148, 153, 156].

Нами показано, что в случае примирования клеток БЛПСКт/ф F. tularensis разных подвидов, кроме БЛПСКф F. tularensis subsp. holarctica 15, имело место достоверное увеличение (Р < 0,05) содержания CD3+CD4+HJI-4+ Т-хелперов по сравнению с контролем. Следует отметить, что БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica стимулирует синтез ИЛ-la моноцитами в большей степени, чем БЛПСК туляремийного микроба других подвидов.

Таким образом, БЛПСК туляремийного микроба является индуктором как CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-клеток, так и моноцитов, но, тем не менее, степень активации этих клеток зависит не только от подвидовой принадлежности и вирулентности F. tularensis, но и от способа выделения БЛПСК.

Выявленные в ходе эксперимента различия в активации ИЛ-la моноцитами в случае БЛПСК т F. tularensis subsp. mediasiatica, могут свидетельствовать о влиянии данного препарата на процесс пролиферации, дифференцировки и индукцию апоптоза клеток в большей степени, чем другие исследованные препараты. Данное обстоятельство, а также полученные нами данные о протективных свойствах БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica, может быть свидетельством плейотропного эффекта цитокинов, синтезированных под действием БЛПСК, на клетки, что в сою очередь способствует поддержанию тканевого гомеостаза путем формирования защитных реакций организма.

Необходимым механизмом регулирования иммунного ответа при воспалительном процессе является апоптотическая гибель иммунокомпетентных клеток, которая играет важную роль в установлении баланса между уровнем циркулирующих эффекторных клеток и их своевременным удалением. Известно, что F. tularensis вызывает апоптоз макрофагов и В-лимфоцитов мыши и человека [97, 118]. Однако, участие в реализации программы апоптоза БЛПСК F. tularensis до настоящего времени не подтверждено. Нами впервые в модельной системе in vivo с применением проточной цитофлуориметрии получены данные о влиянии БЛПСКт/ф туляремийного микроба на развитие апоптоза лейкоцитов крови белых мышей.

При изучении интенсивности апоптоза клеток крови экспериментальных животных, иммунизированных БЛПСКт/ф F. tularensis разных подвидов показано, что процент апоптотических моноцитов и лимфоцитов в крови белых мышей во все сроки наблюдения выше, чем в контроле. Так, показано, что способность клеток крови фиксировать на своей поверхности AnV в Са2+-зависимой среде достоверно повышалась к 3 суткам (Р < 0,05), по сравнению с контролем, что может свидетельствовать об усилении межклеточных взаимодействий при иммунном ответе, вызванном БЛПСК туляремийного микроба.

Установлено, что по содержанию циркулирующих АпУ+-моноцитов во все сроки наблюдения между группами экспериментальных животных, иммунизированных препаратами БЛПСКт/ф F. tularensis, статистически значимых различий не выявлено. Тем не менее, в случае БЛПСКт/ф F. tularensis subsp. tularensis и БЛПСКф F. tularensis subsp. mediasiatica на 9 сутки отмечалось повышение апоптоза моноцитов в 1,3-2,8 раз (Р < 0,05) по сравнению с 3 и 6 сутками наблюдения. Максимальные показатели АпУ+-моноцитов относительно БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 и БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica отмечены на 3 сутки, что может быть связано с особенностями активации иммунофаго-цитарной системы.

Полученные в ходе эксперимента данные о достоверном увеличении (Р < 0,05) на 3 сутки процентного содержания апоптотических Т-хелперов в 1,2-2,3 раза при иммунизации мышей БЛПСКт/ф F. tularensis subsp. holarctica И-250, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 и БЛПСКт/ф F. tularensis subsp. mediasiatica по сравнению с препаратами БЛПСКт/ф ту-ляремийного микроба других подвидов свидетельствуют о повышенной готовности клеток к апоптозу. Тем не менее, при определении количества AnV-положительных Т-хелперов на 6 сутки наблюдения достоверных различий между опытными группами не установлено. Апоптоз зрелых Т-хелперов является средством регуляции интенсивности и продолжительности иммунного ответа, что подтверждается высоким содержанием CD3+CD4+Ha 9 сутки по сравнению с другими субпопуляциями лимфоцитов.

Наличие АпУ+В-лимфоцитов на 3 сутки у экспериментальных животных, иммунизированных БЛПСКт/ф F. tularensis, может указывать на элиминацию аутореактивных В-клеток, избежавших делеции во время раннего развития. В связи с тем, что на 6-9 сутки увеличивается селекция В-клеточных клонов с высокой антиген-связывающей способностью [29], то повышение содержания апоптотических CD3~CD19+ в эти сроки наблюдения может свидетельствовать о гибели низкоаффинных клонов В-лимфоцитов.

Таким образом, иммунизация белых мышей препаратами БЛПСК туля-ремийного микроба приводит к активации и пролиферации Т- и В-клеток, в связи с чем, запускается механизм, позволяющий поддерживать гомеостаз в иммунной системе и элиминировать клоны клеток, которые больше не нужны. Анализ полученных в ходе экспериментов данных указывает на то, что БЛПСК F. tularensis разных подвидов, выделенных с помощью твин-экстракции и водно-фенольным методом не вызывает апоптотический дисбаланс клеточного иммунитета, тем не менее, интенсивность апоптоза клеток крови экспериментальных животных в условиях in vivo зависит от способа получения БЛПСК, его подвидовой принадлежности и сроков наблюдения.

В связи с тем, что препараты БЛПСКф F. tularensis и БЛПСКт F. tularensis являются индукторами иммунного ответа, то в следующей серии опытов по исследованию действия БЛПСК F. tularensis на субпопуляционный состав клеток крови беспородных белых мышей в модельной системе in vivo использовали препараты БЛПСК туляремийного микроба, полученные твин-экстракцией.

Воздействие БЛПСК F. tularensis на экспериментальных животных проявлялось качественными и количественными сдвигами популяций мононук-леарных клеток крови. Так, анализ параметров иммунного статуса у экспериментальных животных, иммунизированных препаратами БЛПСК F. tularensis, выявил, что количественное соотношение клеток крови находилось в пределах физиологической нормы. Тем не менее, относительно БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 отмечалось существенное снижение показателей содержания лейкоцитов, что, возможно, связано с миграцией клеток к очагу воспаления, а в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida - увеличение этих показателей, что указывает на развитие воспалительного процесса, сопровождающееся мобилизацией резервов, демаргинацией (мобилизации клеток маргинального пула в циркуляцию) или увеличением времени циркуляции клеток.

Сравнительный анализ полученных данных показал, что препараты БЛПСКт F. tularensis не оказывали влияние на относительное количество Т-лимфоцитов (СОЗ+-клеток) и величину ЛТИ, свидетельствующее об отсутствии Т-клеточного дефицита. Тем не менее, при оценке содержания Т-лимфоцитов выявлено увеличение ИРИ, превышающее верхнюю границу физиологической нормы до 1,8 раза за счет снижения содержания цитоток-сических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+) и увеличения Т-хелперов (CD3+CD4+), что является подтверждением усиленной работы иммунной системы. Следует отметить, что соотношение CD4/CD8 зависит от подвидовой принадлежности БЛПСКт туляремийного микроба и сроков наблюдения.

Статистически значимое (Р < 0,01) снижение процентного содержания В-лимфоцитов и повышение величины ЛВИ, свидетельствующее об уменьшении доли СШ9 -клеток, выявлено в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica и может быть связано со снижением количества Т-лимфоцитов, продуцирующих В-клеточный ростовой фактор (ИЛ-4). Достоверное увеличение В-лимфоцитов у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250, БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida и БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis на 3 сутки (P < 0,05 по сравнению с контролем), на наш взгляд, может быть связано с тем, что ЛПС относят к тимуснезависимым антигенам [15, 35, 46].

Анализ полученных данных о повышении содержания числа CD3+CD25+ и CD3+CD4+CD25+-KJieTOK в большей степени при инокуляции мышам БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 и БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida во все сроки наблюдения может указывать на особенности структуры О-антигена [144, 172]. Обращает на себя внимание достоверное увеличение на 3 сутки количества Т-хелперов и В-лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации - С025-антиген, у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica (Р < 0,05), что обеспечивает быстрое размножение и последующую дифференцировку наивных клеток до зрелых форм. Выявленное в ходе эксперимента достоверное увеличение активированных Т-лимфоцитов у животных, инокулированных БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis, по сравнению с контролем на 9 сутки (Р < 0,05), возможно, свидетельствует об активации этих клеток путем опосредованного действия фагоцитов и В-лимфоцитов [35]. В случае БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis, БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 достоверное повышение количества активированных В-лимфоцитов зарегистрировано к 6 суткам.

Таким образом, увеличение экспрессии CD25 на иммунекомпетентных клетках характеризует повышение их функциональной активности в условиях антигенной стимуляции. Сравнительный анализ полученных данных между группами обследованных экспериментальных животных в зависимости от использованного для исследования in vivo препарата показал, что высокое содержание в крови мышей, получивших БЛПСКт туляремийного микроба разных подвидов, основных субпопуляций Т-лимфоцитов, положительных по CD25, по-видимому, можно объяснить продолжительной антиген-специфической или неспецифической активацией Т-лимфоцитов. Данные настоящего исследования подтверждают существенную роль БЛПСК F. tularensis в иммуногенезе туляремии с участием моноцитов, Т-хелперов и В-лимфоцитов.

Важная роль в формировании резистентности организма к бактериальным патогенам провоспалительных цитокинов послужила основанием для исследования влияния БЛПСКт F. tularensis на активацию Т-хелперов 2 типа.

У мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis, высокое содержание CD3+CD4+HJI-4+-kietok сопровождалось снижением количества моноцитов, синтезирующих ИЛ-1 а, что, возможно, связано с ингибирующим действием ИЛ-4 на синтез этого провосполительного цитокина [15, 29].

Известно, что функционально ИЛ-1 обусловливает пролиферацию лимфоцитов при развитии иммунного ответа и выступает в качестве одного из главных медиаторов, ответственных за развитие неспецифических форм защиты - формирование местной воспалительной реакции и острофазного ответа на уровне организма при антигенной стимуляции [15,35].

Как показал детальный анализ полученных результатов, БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 активировали моноциты (CD25+, ИЛ-1 а) в большей степени, чем другие БЛПСКт F. tularensis, что может являться объяснением способности этих препаратов повышать фагоцитарную активность СМФ.

В ходе экспериментов у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis, выявлены множественные корреляционные связи субпопуляций лимфоцитов и моноцитов, что свидетельствует о высокой сопряженности между клетками иммунной системы и подтверждает их участие в формировании адаптивного иммунного ответа к БЛПСК туляремийного микроба.

Резюмируя представленный материал можно отметить, что БЛПСК F. tularensis является индуктором лимфоцитов и моноцитов, но, тем не менее, степень активации этих клеток зависит не только от подвидовой принадлежности F. tularensis, но и от способа выделения БЛПСК.

Повышение интенсивности В-клеточной активации на фоне увеличения процентных показателей CD3 С04+ИЛ-4+-клеток (Т-хелперы 2 типа) в ходе антигенной (БЛПСК) стимуляции, свидетельствует о включении гуморального иммунного ответа. С применением проточной цитофлуориметрии установлено непосредственное участие БЛПСК туляремийного микроба в механизмах пролиферации иммунокомпетентных клеток и модуляции апоптоза, регулирующего численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях формирования адаптивного иммунитета.

Кратко резюмируя изложенные выше материалы, можно констатировать, что по совокупности проведенных исследований БЛПСК туляремийного микроба обладает выраженной иммуногенной активностью. Безусловно, важен факт успешного применения БЛПСК туляремийного микроба в качестве средства, повышающего резистентность организма экспериментальных животных в отношении F. tularensis.

С учетом литературных данных о БЛПСК, материалов о роли туляремийного микроба на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных представляется возможным гипотетически сформулировать комплекс факторов, обеспечивающих иммунокоррегирую-щее действие БЛПСК F. tularensis разных подвидов на иммунокомпетентные клетки макроорганизма.

На основании вышеизложенного нами предложена концептуальная схема закономерностей изменений функционального состояния клеток иммунной системы под действием БЛПСК К іиіагетіз разных подвидов (рис. 22).

БЛПСК РгапсІБеІІа іиіагетія

БиЬэр. Ігоіагсііса ГІ15 НИИЭГ (вакцинный) Щ

И-250 зиЬэр. теШа.чіМіса ( я

V. 1-- ^ I зиЬэр. поуісійа эиЬзр. ¿и/ягеят

ЩЖ Л V И ■■. > ііЩ

Макроорганизм 1V Активированные фагоциты

Фагоцитарная активность

ПАФ, ФЧ) N

Кислороднезависимые (НКБ) и кислородзависимые (Г6ФДГ, НСТ-тест) бактерицидные системы

Суопопуляционныи состав клетокпериферической Г

Нитроксидзависимые (N0-синтаза) бактерицидные системы

Синтез цитокинов ж

Лимфоциты

1 2 3 4 N

5І

----і—+ —

Лейкоциты

1 2 3 N 4| 5|

Активированные моноциты

Активированные * Т-лимфоциты

В-лимфоциты

Завершенный фагоцитоза

13 I ] 2 4 5 та

Активированные В-лимфоциты

1 з N

2 4 5 Ї

Регуляторные Т-лимфоциты

Увеличение

ИРИ (С04/С08) J

Рис. 22. Концептуальная схема механизмов действия БЛПСК і7. шІагетІБ разных подвидов на функциональное состояние клеток иммунной системы

Примечание: | - активация; | - ингибирование; (+) - завершенный фагоцитов; (-) - незавершенный фагоцитоз; N - отсутствие изменений.