Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Папилломавирусная инфекция при воспалительных заболеваниях шейки матки. Патогенетические подходы к лечению

003466235

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВА Марианна Игоревна

ПАПИЛАОМАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ШЕЙКИ МАТКИ. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ЛЕЧЕНИЮ

14.00.10 - Инфекционные болезни 14.00.01 - Акушерство и гинекология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2009

003466235

Работа выполнена в ФГУН «ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ» федеральной службы по защите прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Алексей Викторович ТУТЕЛЬЯН Светлана Ивановна РОГОВСКАЯ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

Ксения Ивановна ЧЕКАЛИНА

Олег Васильевич МАКАРОВ

Ведущая организация: ГОУВПО «Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова» Росздрава

Защита диссертации состоится « 24 » апреля 2009 года в 10 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 208.114.01. в ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (111123, Москва, ул. Новогиреевская, д. За).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Автореферат разослан «......» марта 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Александр Васильевич ГОРЕЛОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сохранение репродуктивного здоровья населения страны является одной из ключевых медико-социальных проблем, важным фактором национальной безопасности. Репродуктивная функция является одним из основных интегральных показателей здоровья женщины, определяет качество жизни ее и потомства, а соответственно здоровья и качества жизни нации. (Э.К. Айламазян, 2004).

Известно, что генеративная функция женщин в значительной степени зависит от наличия и характера воспалительных процессов репродуктивного тракта женщины, которые являются частой патологией и составляют 60-65% в структуре гинекологических заболеваний (Кулаков В.И. и др., 2006). В последние годы среди вирусных инфекций, передающихся половым путем, наибольшего внимания заслуживает возрастающая заболеваемость папилломавирусной инфекцией (ПВИ) (Bosch X., 2008). Многочисленные эпидемиологические и молекулярно-генетические данные свидетельствуют о значении вируса папилломы (ВПЧ) человека в генезе не только воспалительных заболеваний шейки матки, но и возникновении дисплазий и рака шейки матки. Ключевой концепцией этиопатогенеза рака шейки матки признана вирусная теория, центральное место в которой занимает вирус папилломы человека, обладающий высоким онкогенным потенциалом и являющийся основным экзогенным фактором цервикального канцерогенеза.

Частота ПВИ гениталий в гинекологической практике составляет 44,3% (Роговская С.И., 2003). При массовых обследованиях ВПЧ обнаружен у 40-50% молодых женщин, который в последующие периоды у большинства носителей способен спонтанно исчезать. У 5-15% ВПЧ вызывает хроническое воспаление шейки матки (цервицит), реже вульвы и влагалища (М.А.Башмакова, А.М.Савичева). Длительное персистирование вируса папилломы человека часто ассоциировано с наличием хламидийной, условно-патогенной, вирусной инфекцией и другими нарушениями микроэкологии влагалища и способствует развитию злокачественных эпителиальных поражений шейки матки (Al-Risasi, 2008).

Своевременная диагностика урогенитальных инфекций, на фоне которых развивается хронический цервицит, имеет важное значение, поскольку у многих женщин клинические проявления заболевания могут отсутствовать, а недиагностированное и, как следствие, нелеченное поражение может вызвать развитие болевого синдрома, нарушение менструальной и генеративной функций (W.Kinney, 2008).

В связи с этим необходимо использовать новые, более совершенные методы диагностики, обладающие высокой достоверностью, специфичностью и воспроизводимостью, с возможностью определения степени онкогенности вируса и его решшкативной активности. Применение такого метода в практике лабораторного обследования позволит наиболее адекватно определить тактику ведения пациентов, оценить прогноз заболевания, осуществить выбор лекарственных средств и длительность терапии (Куевда Д.А., Минкина Г.Н., 2007).

Проблема терапии персистирующих инфекций также не решена до настоящего времени и, по мнению большинства исследователей, массивная антибактериальная терапия в ряде случаев не эффективна и приводит к нарушению микробиоценоза урогенитального тракта (Анкирская A.C., 2007).

При выявлении цервицита, ассоциированного с ПВИ, необходимо проведение комплексной терапии, направленной как на микро-, так и на макроорганизм. Специфических препаратов для лечения ПВИ в настоящее время не существует (М. Stanley, 2008). Локальная терапия направлена на удаление кондилом и атипически измененного эпителия. Однако, учитывая то обстоятельство, что воспалительная патология, как правило, сопровождается синдромом общей интоксикации, не следует ожидать хорошего результата при применении только местных деструктивных средств терапии, не учитывая влияния токсических продуктов, накапливающихся в организме в условиях персистирования инфекции (Тутельян A.B., 2007). Использование сочетанного воздействия местных и общих факторов детоксикации может привести к ускорению процессов репарации и снижению количества возможных осложнений. Однако механизмы действия и эффективность этого комплекса в лечении заболеваний шейки матки изучена недостаточно.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности изучения проблемы вирусно-бакгериальных воспалительных заболеваний шейки матки, необходимости разработки более эффективных методов комплексной терапии, основанных на применении эффективных противовоспалительных и иммуномодулирующих средств, направленных на ускорение процессов регенерации слизистой оболочки шейки матки, сокращение сроков лечения и профилактики рака шейки матки.

Цель исследования.

Повышение эффективности терапии хронических рецидивирующих ВПЧ-ассоциированных цервицитов у женщин репродуктивного возраста путем включения в схему комбинированной терапии регуляторного пептида имунофан.

Задачи исследования.

1.Оценить частоту выявления папилломавирусной инфекции у больных хроническими цервицитами, выделенных из контингента женщин репродуктивного возраста, обращающихся в гинекологическую клинику по поводу генитальных выделений.

2.Изучить структуру сопутствующих этиологических факторов цервицитов, ассоциированных с ПВИ.

3. Изучить кольпоскопические и цитологические особенности ВПЧ-ассоциированного цервицита.

4. Исследовать влияние комплексной терапии, включающей регуляторный пептид имунофан, на морфологические изменения эпителия шейки матки, длительность ремиссии и эффективность антибактериальной терапии у больных хроническими ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

5. Проанализировать динамику клинически значимых изменений уровня ПВИ у больных хроническими рецидивирующими цервицитами на фоне антибактериальной и иммунотропной терапии с использованием Digene теста.

б.Определить функциональную активность фагоцитирующих клеток до и после лечения имунофаном женщин с ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

7. На основании результатов клинического обследования, состояния противовирусного иммунитета, оксидантного статуса организма разработать научно-обоснованные показания к применению имунофана и дать комплексную оценку эффективности препарата в лечении воспалительных заболеваний шейки матки.

Научная новизна.

Впервые для лечения больных хроническими рецидивирующими цервицитами, ассоциированными с ПВИ, применен новый иммунокорректор - регуляторный пептид имунофан. Доказана его эффективность и научно обоснована

целесообразность включения данного препарата в схему комплексной терапии хронических рецидивирующих ВПЧ-ассоциированных цервицитов у пациенток репродуктивного возраста.

Установлены патогенетические механизмы развития воспалительного процесса шейки матки, включающие изменения функциональной активности клеток моноцитарно-макрофагального ряда у женщин с ВПЧ-ассоциированными хроническими цервицитами.

Практическая значимость.

На основании клинико-лабораторных исследований разработана оптимальная схема применения пептидного препарата имунофан и определена эффективность его лечебного действия у пациенток с ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

На основании молекулярно-генетических и иммуно-биохимических методов разработан алгоритм ведения и возможность прогнозирования течения патологического процесса у больных хроническими рецидивирующими ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

Расширен спектр молекулярно-генетических и иммуно-биохимических методов, применяемых для оценки эффективности терапии.

Показана целесообразность отнесения больных хроническими цервицитами к группе риска по ВПЧ-инфицированию и развитию плоскоклеточных интраэпителиальных поражений.

Внедрение в практику.

Результаты проведенных исследований внедрены в клиническую практику работы Научно-поликлинического отделения ФГУ Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии Росмедтехнологий им. академика В.И.Кулакова и используются в качестве лекционного материала на курсах повышения квалификации для практических врачей из различных регионов РФ и СНГ.

Личный вклад автора заключается в непосредственном ведении всех больных, проведении лечебно-диагностических процедур и анализе полученных данных.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на апробационной комиссии ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, на Международном конгрессе «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии» (Москва. 2731 марта 2006г.), научно-практической конференции «Актуальш питания сучастного акушерства» (Украина, Тернополь, 19-20 марта 2007г.), VIII Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва. 2006г.), VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва 27-29 июня 2007г.), IX Всероссийский форум «Мать и дитя» (Москва. 2007г.), Российской научно-практической конференции «Патология шейки матки и генитальные инфекции - от теории к практике» (Москва. 26-30 марта 2007г.), Международной научно-практической конференции «Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее» (Москва 31марта-3апреля 2008г.), Международном конгрессе «Актуальш питания акушерства, пнекологп та перинатологп» (Украина, Судак, 21-23 мая 2008г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации.

Диссертация представлена в традиционном виде, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственные результаты и обсуждение, заключения, выводов, практических

рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает 127 источников (59 отечественных и 68 зарубежных работ). Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, содержат 24 таблицы, 3 рисунка, 1 схему.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования.

Настоящее исследование проводили на базе научно-поликлинического отделения ФГУ НЦАГиП Федерального агенства по высокотехнологичной помощи им. В.И. Кулакова и лаборатории иммунологии и биотехнологии ФГУН Центрального НИИ эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Обследовано 690 пациенток с жалобами на выделения из половых путей, обратившихся на общий поликлинический прием, в период с 2005 по 2007 год. Всем больным проводили общеклиническое обследование, которое включало: изучение анамнестических и эпидемиологических данных; общий и гинекологический осмотр. Также проводили специальное обследование: расширенная кольпоскопия, цитологическое исследование эпителия шейки матки, бактериоскопическое и бактериологическое исследования отделяемого из цервикального канала, заднего свода влагалища, ПЦР для выявления специфических инфекций, иммунологическое, биохимическое исследования. По показаниям проводили гистологическое исследование прицельно взятого биоптата шейки матки. У всех женщин исключен сифилис, гепатит В, ВИЧ.

Расширенную кольпоскопию проводили с помощью стандартного кольпоскопа фирмы "Ляйзеганг" (Германия) при 15-30 кратном увеличении с использованием 3% раствора уксусной кислоты и водного раствора Люголя. При оценке кольпоскопической картины использовали единую Международную кольпоскопическую классификацию, одобренную VII Всемирным конгрессом по патологии шейки матки и кольпоскопии в Риме (1990 г.).

Бактериоскопическое и бактериологическое исследования. Забор материала для бактериоскопического исследования вагинального содержимого осуществляли шпателем Эйера, мазки фиксировали на предметном стекле и окрашивали гематоксилином-эозином и по Граму. Последующую микроскопию проводили под 40-кратным увеличением. Оценку состояния флоры влагалища с применением четырех степеней ее чистоты, проводили по унифицированной схеме Херлена.

Материал для бактериологического исследования забирали стерильным ватным тампоном из цервикального канала и боковых сводов влагалища и помещали в стерильную пробирку. В условиях микробиологической лаборотории производили посев на питательные среды. Оценивали рост микроорганизмов через 7 суток с момента посева.

Морфологические исследования проводили по общепринятым методикам. Цитологическое исследование проводили при первичном обращении пациентки, а также через 6 и 12 месяцев после проведенного лечения, с целью оценки его эффективности и выявления рецидива заболевания. Материал забирали из цервикального канала, переходной зоны и экзоцервикса с помощью одноразовой цервикальной щеточки и шпателя.

Оценку результатов цитологического исследования производили согласно классификационной системе Папаниколау в соотношении с классификацией Бетесда (ТБС). (см. табл.№1).

Таблица № 1

Сравнение различных морфологических классификаций неннвазивных и инвазивных заболеваний шейки матки.

Папаниколау Дисплазия CIN ВПЧ-эффект ТБС

Класс 1 норма норма норма

Класс 2 атипия атипия AS С

Класс 3 Легкая дисплазия CIN I койлоцитоз CIN I LSIL

Умеренная дисплазия CIN II HSIL

Тяжелая дисплазия CIN III

Класс 4 Карцинома in situ

Класс 5 Инвазивный рак Рак Инвазивный рак

Иммунологические методы исследования.

1. Метод двойной гибридной ловушки (Digene Hybrid Capture system). Метод определения количественного содержания ДНК группы высокоонкогенных серотипов вируса папилломы человека в материале с шейки матки (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) без установления типа. Тест оценивали до лечения, через 6 и 12 месяцев после лечения. Digene-Teer или Hybrid Capture II тест (HC II) основан на реакции гибридизации РНК-зондов с вирусной ДНК-мишенью, присутствующей в мазке. Метод разработан специально для рутинного определения ВПЧ в соскобах из шейки матки. В нашей работе использовали наборы для HC II (Digene, Silver Springs, США).

2. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Данный метод использовали для диагностики урогенитальных инфекций таких как: Chlamidia trachomatis, Micoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Ureaplasma parvum, цитомгаловирус, вирус простого герпеса (ВПГ) I и II типа. Реакцию амплификации и подготовку клинических проб проводили согласно методике, описанной в информационном письме Минздрава РФ. Клетки лизировали раствором, содержащим 6М гуанидинизотиоциана, ДНК сорбировали на микропористом стекле, после серии отмываний элюировали и вносили в реакционную смесь. Реакцию проводили в объеме 25 мкл. В течение 30 циклов на программируемом термостате «Терцик», используя праймеры, амплифицирующие фрагменты генов вышеуказанных возбудителей. Исследование проводили, применяя комплекты реагентов для ПЦР-амплификации ДНК фирмы «ДНК-технология» для Chlamidia trachomatis - «хлами-ген», Micoplasma hominis -«Плазмоген-Мх», Ureaplasma urealiticum - «T-960», Ureaplasma parvum -«Уреаплазма парвум», цитомгаловирус - «ЦМВ-ген», ВПГ I и II типа - «ВПГ-ген».

3. Методика непрямой иммунофлуоресценции для определения фенотипа лимфоцитов с помощью моноклональных антител.

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови включало определение основных субпопуляций лимфоцитов (CD3; CD4; CD8; соотношение CD^CDg - иммунорегуляторный индекс, CD|6, CD|9, HLA-DR+) с использованием метода иммунофлуоресценции.

Лимфоциты выделяют из гепаринизированной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (плотность 1,077 г/мл). Клетки дважды отмывают путем добавления в каждую пробирку полной среды культивирования (ПСК), состоящей из среды 199; 0,1% азида натрия и 1% эмбриональной телячьей сыворотки в объеме 5 мл. Центрифугируют при 1000 об./мин на центрифуге Heraeus, Германия (300g) 10 минут.

Лимфоциты (106) в объеме 50 мкл вносят в лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемого моноклонального антитела (МКА) и инкубируют 30-45 минут при +4°С. Планшет ставят в холодильник при 4°С на 30 минут и затем дважды отмывают от МКА. Если МКА не соединены с флуорохромом, проводится процедура докрашивания путем добавления в каждую лунку по 50 мкл антимышиных иммуноглобулинов, меченных флоуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) в соответствующем инструкции разведении. Планшеты ставят в холодильник при 4°С на 30 минут. Добавляют в каждую лунку ПСК по 100 мкл и центрифугируют 5 минут при 1000 об./мин надосадочную жидкость из планшета стряхивают резким движением. Для фиксации к осадку добавляют по 100 мкл 2% параформальдегида и ставят на 30 минут в холодильник при 4°С. Добавляют ПСК до полной лунки.

Окрашенные клетки просматривают с помощью флуоресцентного микроскопа. Для этого клетки суспендируют, суспензию переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и препарат просматривают под иммерсией на флуоресцентном микроскопе (объектив х 90). Используют нефлуоресцирующее иммерсионное масло. Наблюдение проводят в затемненном помещении. Количество антиген позитивных клеток определяют как % флуоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флуоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, за исключением того, что вместо моноклональных антител клетки обрабатывают ПСК.

4. Метод определения концентрации цитокинов в сыворотке крови.

Кровь забирали из локтевой вены утром натощак. Лимфоциты определяли методом разделения на градиенте плотности фиколл-верографин значением 1,077. Для определения количественного содержания ФНО-а и ИЛ-10 выполняли твердофазный иммуноферментный метод с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Один тип ферментов иммобилизируется на поверхностях ячеек. Другой тип - антитела - находятся в виде коньюгата с биотином. Индикатор - пероксидаза хрена со стрептавидином, имеет большое сродство к биотину. Измеряют активность связанной пероксидазы. Использовали коммерческие наборы РгоСоп («Протеиновый контур», Санкт-Петербург, Россия). Измерения проводили с помощью вертикального спектрофотометра «Multiscan МСС 340». Количественное содержание цитокинов в крови выражали в пкг/мл.

Биохимические методы исследования.

/. Определение функциональной активности нейтрофилов человека с помощью хемилюминесценции.

Определение функциональной активности фагоцитов проводили путем измерения люминол- и люцегенинзависимой хемилюминесценции (XJI) с использованием плашечного люминометра LUCY I (Биохиммак) и пробирочного люминометра LKB 125 (Швеция).

Для постановки реакции используют лейкоцитарную суспензию. Для получения суспензии лейкоцитов 2 мл гепаринизированной крови смешивают с 1 мл 3% раствора желатина в фосфатно-солевой буфере (ФСБ). После спонтанной седиментации эритроцитов при 37°С в течение 15 минут осторожно отбирают надосадочную жидкость. Для двукратной отмывки лейкоцитов от желатины и плазмы применяют ФСБ, pH 7,4. Режим центрифугирования - 200g в течение 10 мин. Концентрацию клеток доводят ФСБ до 2 млн в мл по сегментоядерным лейкоцитам. В специальные полистереновые пробирки добавляем 200 мкл ФСБ, 100 мкл люминола ("Sigma", США) в конечной концентрации 2,5х10"5М и 100 мкл клеток (нейтрофилов), реакция проводится в дублях. При помощи хемилюминометра измеряют спонтанную хемилюминесценцию в течение 30-40 минут. Затем в одну из проб добавляют 10 мкл опсонизированного зимозана (Sigma, США) (0,2 мг/мл) и измеряют стимулированную хемилюминесценцию в течение 20 минут. Учитывают следующие результаты:

1. Пик спонтанной хемилюминесценции в mV/мин

2. Пик стимулированной хемилюминесценции в mV/мин

3. Индекс стимуляции - относительная величина, характеризующая разность

между максимальными значениями стимулированной и спонтанной ХЛ.

2. Оценка внутриклеточной продукции перекиси водорода фагоцитами периферической крови.

Для определения продукции пероксида водорода нейтрофилами и моноцитами используют проточный цитофлюориметр FACS Calibui фирмы «Becton Dickinson» с аргоновым лазером с длиной волны 488 нм и программное обеспечение CELLQuest.

Венозную кровь забирают в пробирки с гепарином (10 Ед/мл). Лейкоцитарную взвесь получают после спонтанной седиментации эритроцитов: к 2 мл крови прибавляют 1 мл 3 % раствора желатины. После двукратной отмывки фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с pH 7,4 клетки ресуспендируют в ФСБ и по сегментоядерным нейтрофилам концентрацию клеточной суспензии доводят до 2х106 кл/мл. В 2 лунки 96-луночного планшета вносят по 90 мкл клеток и 10 мкл рабочего раствора (50 мкМ) дихлорофлюоресцеина диацетат (ДХФ-ДА) (Sigma, США). В течение 20 минут инкубируют при 37СС. Затем в одну лунку вносят 11

мкл рабочего раствора форболмиристат ацетата (ФМА) (Sigma, США)(0,1 мкг/мл), во вторую - контрольную (для оценки спонтанной флюоресценции меченых клеток) лунку - 11 мкл раствора ЭДТА. После 30 минут инкубации при 37°С клетки осаждают при 1000 об./мин. 1 мин., эритроциты лизируют 200 мкл холодного лизирующего раствора, клетки центрифугируют 5 мин. 1000 об/мин., лейкоциты однократно отмывают 200 мкл ФСБ и ресуспендируют в 400мкл ФСБ.

В результате анализа проб получают показатели спонтанной флюоресценции, стимулированной флюоресценции и рассчитывают коэффициент стимуляции (стимул, флюор./спонтан. флюор.) отдельно для

нейтрофилов и моноцитов. В каждом образце анализируют не менее 2000 нейтрофилов.

Методика терапии

При выявлении цервицитов специфической и неспецифической этиологии в обеих группах проводили системную антибактериальную терапию с учетом чувствительности биотопа. Кроме того, больным опытной группы одновременно назначали имунофан суппозитории 100 мкг один раз в сутки ежедневно на ночь интравагинально по 1 суппозиторию на ночь № 10.

Для проведения местной деструктивной терапии у больных с CINII применяли лазерную вапоризацию, где в качестве источника лазерного излучения использовали высокоинтенсивный лазерный хирургический аппарат «Lumenis ЗОС», Германия, с устройством ввода кольпоскопа и микроманипулятором с выходной мощностью луча 16-20 ВТ и глубиной деструкции 0,3 - 0,7 см, что соответствует рекомендациям Европейской Федерации по кольпоскопии.

Оценку эффективности проведенной терапии осуществляли через 1 - 2 месяца после местной деструкции, а также через 6 и 12 месяцев с целью вьивления рецидивов.

Методы статистической обработки.

Для распределения больных на группы проводили простую рандомизацию, основанную на прямом методе с применением таблицы случайных чисел, где они сгруппированы таким образом, что вероятность для каждого из однозначных чисел оказаться в любом месте таблицы была одинакова (равномерное распределение).

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась по общепринятым методикам с помощью пакетов прикладных программ Statistica 6.0, Microsoft Exel 7.0 на ПК PC Pentium 4 - 3000 МГц ММХ. При анализе результатов определяли среднее арифметическая (М), ошибка среднего (т), проводили оценку значимости различий двух средних арифметических по t - критерию Стьюдента, высчитывали коэффициент линейной корреляции и его достоверность (Боровиков В.П., Боровиков И.П., 1998г.). Различия сравниваемых показателей принимали за достоверные при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клинико-иммуиологическая характеристика больных хроническими

цервицитами, ассоциированными с папилломавирусной инфекцией.

В результате обследования 690 пациенток, предъявляющих жалобы на выделения из половых путей, выяснили, что у 352 (51%) пациенток в анамнезе за последний год отмечены различные серотипы ВПЧ, выявленные методом ПЦР. Такой высокий процент выявляемое™ ВПЧ может быть обусловлен целенаправленным обращением пациентов, у которых ранее был выявлен вирус папилломы человека методом ПЦР, или обнаружено какое-либо неблагополучие в тканях шейки матки, к врачам - специалистам в отношении ведения больных с патологией шейки матки. При этом из них 221 (62,8%) женщина отмечала более двух эпизодов цервиковагинитов за последний год. Клинически значимая концентрация вируса в эпителии шейки матки выявлена у 104 (47,1%) больных,

страдающих хроническими цервицитами, методом двойной гибридной ловушки. Известно, что показатель спонтанной элиминации вируса ниже, а риск прогрессии выше в случаях ВПЧ-инфекции с более высокой вирусной нагрузкой. Определение вирусной нагрузки позволяет прогнозировать наличие дисплазии или высокий риск ее развития ^оэеГБЕОп А.,2000, МоЬег§ М. 2005, Зпуёегэ I. 2006).

Возраст больных хроническими цервицитами и ВПЧ, подтвержденным с помощью 01£'спс-тсста, варьировал от 17 до 49 лет. Средний возраст пациенток составил 31,6±0,9 лет. Экзофитные кондиломы шейки матки и влагалища наблюдали у 9,6% женщин с клинически значимым количеством ДНК ВПЧ в эпителии шейки матки. Значительная часть опрошенных 18,3% подтвердили наличие в прошлом или настоящем у их партнеров каких-либо образований на половых органах.

Обращает на себя внимание высокая частота встречаемости хронических экстрагенитальных заболеваний (38,5%) и различных заболеваний органов репродуктивной системы (65,4%). Среди хронических экстрагенитальных заболеваний наиболее часто отмечали хронический тонзиллит, хронические заболевания желудочно-кишечного тракта и мочевыводящих путей. Среди гинекологических заболеваний в анамнезе больных хроническими цервицитами и ПВИ преобладали хронический сальпингоофорит (29,8%) и вагиниты различной этиологии (34,6%).

Наследственность 28,9% больных была отягощена наличием онкологических заболеваний различных органов у близких родственников. Наиболее часто отмечали рак шейки матки и рак молочной железы, доли которых составили 9,6% и 5,8% соответственно.

Гинекологический анамнез женщин с хроническим цервицитом и положительным ВПЧ - 01§епе тестом выявил, что средний возраст менархе в 95,2% составил 13,2±2,7 лет. Позднее менархе наблюдали у 4,8%. Средняя продолжительность менструального цикла составила 29±3,1 дня, средняя продолжительность менструального кровотечения 4±0,7 дня.

Регистрированные в нашем исследовании раннее начало половой жизни до 18 лет (75,9%), смена половых партнеров (63,5%), практикование большинством пациенток нетрадиционного коитуса (73,1%) являются самыми значимыми факторами риска инфицирования вирусом папилломы человека и другими заболеваниями, передающимися половым путем. Так, 68,3% больных имели в анамнезе одно или несколько инфекционных заболеваний, таких как кандидоз, бактериальный вагиноз, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, трихомониаз, гонорея, сифилис. Таким образом, наши данные подтверждают мнение, что одним из факторов, инициирующих развитие ВПЧ-поражений шейки матки, является наличие в анамнезе инфекций, передаваемых половым путем (Быковская О.В., 2006).

Анализ сопутствующей вагинальной флоры у женщин с ВПЧ-ассоциированными хроническими цервицитами показал нередкую (84,6%) контаминацию ее с другими возбудителями, присутствие которых в большинстве случаев объясняет те или иные клинические проявления в виде дискомфорта, зуда, белей и т.п. Наиболее часто встречался неспецифический вагинит (37,5%), уреаплазма (36,5%), бактериальный вагиноз (БВ) (22,1%), кандидоз (16,3%). ПВИ как моноинфекцию выявили в 12,5% у бактериологически обследованных пациентов. (см.рис.1) Болезненные менструации преимущественно в 1 день менструального цикла отмечали 41,3% больных.

Микоплазма Е. coli 5,6% 5,6"

Трихомониаз 4,8%

ЦМВ 5,6%

Ent. Faecalis 10,6%

Уреаплазма 36,5%

Хламидин 8,6%

стафилококк 10,6%

□ Candida albicans

□ Роста нет Я Хламидин

Ш Носительство ЦМВ ■ Микоплазма

□ Стрептококк А

Ш Уреаплазма

О Эпидермальный стафилококк

DEnt. Faecalis □ Трихомониаз

ШЕ. coli

Q Вирус герпеса

Рисунок I. Вирусные и микробные тенты, выявляемые при хронических рецидивирующих ВПЧ-ассоциированных цервицитах.

Известно, что наиболее специфичным кольпоскопическим признаком наличия ВПЧ-поражения эпителия является обнаружение ацетобелого эпителия (АБЭ) вне и в пределах зоны трансформации (ЗТ) (Минкина Г.Н., 2007г.).

По результатам наших кольпоскопических исследований цервицит чаще проявлялся в виде низкоатипической зоны трансформации (НАЗТ) (77,9%). НАЗТ сочеталась с ацетобелым эпителием (АБЭ) у 63 пациенток (60,5%), из них АБЭ вне зоны трансформации отмечен у 20 (19,2%); с макулярным цервицитом у 57 (54,8%); с йоднегативными участками (ЙНУ) у 59 (56,7%); выраженные пунктация и мозаика (П и М) выявлены у 25 и 29 (24% и 27,9 % соответственно); эктопия у 29 (27,9%), нормальная зона трансформации (НЗТ) у 9 (8,6%) больных. По совокупности кольпоскопических признаков при обследовании больных хроническим цервицитом и положительным Digene тестом, ПВИ шейки матки была заподозрена у 95 из 104 женщин, а также выявлены некоторые специфичные признаки воспаления эпителия шейки матки, такие как АБЭ, йоднегативная крапчатость и неравномерное прокрашивание эпителия раствором Люголя в виде пятен. При этом, некоторые исследователи отмечают, что у женщин-носительниц высокоонкогенных типов ВПЧ достоверно чаще выявляют кольпоскопические признаки большей степени выраженности, чем у носительниц других штаммов (Роговская С.И., 2003). У 21 (20,2%) больного кольпоскопическая картина предполагала наличие SIL, что являлось показанием для биопсии. У 85,7% этих больных гистологически подтверждены CIN II, CIN III и PLUM. В остальных случаях цитологический метод диагностики и контроля был достаточным. Следовательно, кольпоскопия с высокой вероятностью помогает заподозрить наличие хронического воспалительного процесса, сочетание его с ПВИ в тканях шейки матки, и является дифференцирующим этапом определения целесообразности применения цитологического или гистологического метода обследования.

Одним из основных цитологических признаков ПВИ считается наличие клеток с койлоцитозом, которые были обнаружены в мазках с шейки матки у 49 (47,1%)

пациентов. Таким образом, койлоцитоз является частым, но не обязательным признаком ВПЧ ассоциированного цервицита. Другой тип клеток, который считают патогномоничным для ПВИ - клетки с дискератоцитозом, обнаруживали реже (24%), чем койлоциты, у женщин с ПВИ шейки матки. С высокой частотой выявляли 2-х ядерные клетки с увеличенной площадью ядра и цитоплазмы (33,7%), дистрофически измененные клетки (76,9%), нейтрофилы (66,4%), что свидетельствовало о наличии воспалительного процесса. Наиболее часто встречающимся признаком хронического цервицита в сочетании с ПВИ являелось наличие клеток плоского эпителия дистрофического типа с псевдодискариозом, лейкоциты, измененные метапластические клетки различной степени зрелости.

Хронический цервицит, верифицированный гистологически, отмечен в образцах ткани всех пациентов, которым проводили биопсию по показаниям исходя из состояния эпителия, установленного кольпоскопически. При этом наряду с дистрофическими изменениями наиболее характерным гистологическим признаком является инфильтрация подэпителиальной соединительной ткани лимфоцитами, гистиоцитами с примесью плазматических клеток и нейтрофилами.

По итогам цитологического исследования 104 больных хроническим ВПЧ-ассоциированным цервицитом результаты 52 пациенток (50%) были отнесены к ASC-US - состояние, которое соответствует второму классу мазка по системе Паппаниколау и отражает в большинстве случаев воспалительные изменения в эпителии шейки матки. Цитологические мазки 34 (32,7%) больных отнесли к LSIL по классификации Бетесда, из них 19 человек (18,3%) по результатам биопсии имели субклиническую форму папилломавирусной инфекции - плоскую кондилому; дисплазию легкой степени или CIN I отметили у 15 (14,4%) больных. При этом гистологически у 4 больных плоская кондилома сочеталась с CIN I. Интраэпителиальные поражения высокой степени по классификации Бетесда обнаружили у 16 больных (15,4%). Из них по итогам анатомо-гистологического исследования умеренная дисплазия, или CIN II выявлена у 10 (9,6%) больных, тяжелая дисплазия или CIN III у 6 (5,8%) пациентов. Результаты исследования 2-х (1,9%) женщин имели заключение рак шейки матки (РШМ). Напротив, следует отметить, что среди 117 больных хроническими цервицитами без ассоциации с ВПЧ выявлено лишь 12 случаев SIL (10,3%). То есть, плоскоклеточные интраэпителиальные поражения (SIL) сопровождают изменения эпителия шейки матки у больных хроническим ВПЧ-ассоциированным цервицитом чаще (48,1%), чем у женщин без клинической картины цервицита, на что указывают и другие авторы (11,4%) (Kulhakova S., 1997, Прилепская В.Н., 2003).

Таким образом, больных хроническими рецидивирующими ВПЧ-ассоциированными цервицитами следует относить к группе риска по развитию плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки.

Комплексное использование вышеперечисленных неинвазивных методов диагностики, в том числе и определение ДНК ВПЧ для выявления папилломавирусной инфекции, повышает достоверность интерпретации результатов исследования, что отмечают и другие авторы (Новиков А.И. 2002, Chhieng D.C. 2001, Gupta P.K. 2001) и позволяет выделить группу больных, нуждающихся в биопсии.

В дальнейшее исследование были включены 96 больных из 104 пациентов с диагнозом хронический цервицит, папилломавирусная инфекция. Восемь больных с CINIII и РШМ были исключены из протокола, так как нуждались в лечении в условиях специализированного лечебного учреждения, где они получали терапию и проходили наблюдение.

На первом этапе при изучении исходных показателей иммунного статуса не выявлено серьезных изменений, практически все средние значения по группам находились в пределах диапазона физиологической нормы. Однако, наличие воспалительной реакции, по данным литературы, свидетельствует о нарушении системы каскадной цитокиновой регуляции. Как хорошо известно, развитие воспалительной реакции сопровождается изменениями регуляции иммуногенеза (Лебедев В.В., Тутельян A.B., 2001, Кузник Б.И., 2004). В частности, при изучении продукции ФНО-а и ИЛ-10 в цервикальной слизи больных с ПВИ выявляли достоверное повышение количества ФНО-а, свидетельствующее об активации воспалительного процесса. При этом, количество ИЛ-10, основного антагониста ФНО-еи, в цервикальной слизи пациенток с ПВИ по сравнению с нормой значительно снижено (Роговская С.И., 2003).

Таким образом, приведенные факты свидетельствуют о том, что при неизменном количественном субпопуляционном составе клеточного звена иммунной системы, активность этих клеток изменена, что подтверждается наличием гиперактивации одних цитокинов (ФНО-а) и сниженной продукцией других (ИЛ-10).

Учитывая дисбаланс цитокиновой продукции, а также тот факт, что возникновение и развитие воспалительных патологий сопровождается увеличением функциональной активности фагоцитов, представляло интерес оценить функциональное состояние фагоцитирующих лейкоцитов у больных хроническими ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

С целью изучения метаболизма фагоцитов при воспалительных заболеваниях шейки матки, ассоциированных с ПВИ, мы применили цитофлюориметрический подход с использованием внутриклеточного индикатора АФК с заблокированными флюорисцирующими свойствами дихлорофлюоресцина диацетат (ДХФ-ДА).

Полученные нами данные показывают, что у 84 (87,5%) больных значение индекса стимуляции нейтрофилов находилось за пределами границ нормы. Так, у 32 больных до лечения индекс стимуляции нейтрофилов был ниже нормы и составил в среднем 9,4±1,5; у 52 больных этот показатель был выше нормы и составил в среднем 35,6±2 и лишь у 12 пациентов показатель индекса стимуляции нейтрофилов соответствовал норме (см. таблицу № 2). Такую же тенденцию отмечали при анализе индекса стимуляции мононуклеарных фагоцитов (у 31,3% больных индекс стимуляции был ниже нормы и составил 2,5±0,3; в 52,1% этот показатель был выше нормы и составил 17,4±1,6).

Также, с целью определения состояния окислительной системы детоксикации оценивали функциональную активность нейтрофилов человека с помощью люминол-и люцегенинзависимой хемилюминесценции (ХЛ). Интенсивность люминолзависимой ХЛ нейтрофилов отражает взаимодействие люминола с такими активными кислородными радикалами, как супероксидный анион, синглетный кислород, перекись водорода и гидроксильный радикал, в то время как люцегенин -специфический активатор ХЛ - обусловлен взаимодействием с супероксид анион радикалом кислорода.

В результате наших исследований повышенная активность свободнорадикальных реакций (СРР) фагоцитирующих клеток выявлена у 68 (70,8%) больных, что свидетельствует о дисбалансе окислительной-антиокислительной системы: увеличении эффективности стадии инициации СРР и уменьшении активности системы антиоксидантной защиты. У 22 (22,9%) пациентов расстройства иммунной системы проявлялись снижением резервной возможности мононуклеарных

клеток к бактериальному киллингу и завершенному фагоцитозу, что демонстрируют сниженные показатели хемилюминесценции нейтрофилов (см. таблицу №3).

Полученные данные позволили обосновать целесообразность назначения регуляторного пептида имунофан у данной категории больных.

2. Лечение и результаты проспективного наблюдения.

Пациентки, включенные в дальнейшее проспективное исследование, были разделены на 2 группы.

I группа (опытная) - 48 пациенток с хроническим цервицитом, ассоциированным с вирусом папилломы человека, которым проводили комплексное лечение, включающее антибактериальную терапию с учетом чувствительности биотопа и курс противовирусного иммунорегулирующего препарата системного действия Имунофан курсом №10 по 1 суппозиторию ежедневно во влагалище на ночь.

II группа (контрольная) - 48 пациенток с хроническим цервицитом, ассоциированным с вирусом папилломы человека, которым проводили антибактериальную терапию с учетом чувствительности флоры.

Пациентки обеих групп были сопоставимы по основным критериям анамнеза и соматического статуса с вероятностью более 95%.

Результаты исследований через 6 месяцев после проведенного лечения показали, что интравагинальное использование имунофана в комплексе с противовоспалительными препаратами приводило к элиминации ВПЧ в 87,5% случаев, в то время как при традиционной терапии вирус исчезал лишь в 43,75% случаев (р<0,05).

Из 26 больных опытной группы с цитологическим диагнозом ASC-US после проведенного лечения физиологическая норма по указанному показателю отмечена у 23 пациентов, в то время как из 26 больных контрольной группы цитологической нормы достигли лишь 16 человек. Плоско клеточные интраэпителиальные поражения низкой степени тяжести (LSIL) после проведенного лечения исчезали у 13 пациентов из 16 больных опытной группы, в то время как из 18 больных контрольной группы цитологической нормы достигли немногим более трети пациентов. Иными словами, регрессия ASC-US до нормы в опытной группе составила 88,5%, в контрольной -61,5%, регрессия LSIL до нормы составила 81,2% и 38,9%, соответственно (р<0,05).

Восстановление гистологически выявленной CIN I до нормы отмечали в 75% случаев в I группе по сравнению с 42,8% в контрольной группе (р<0,05). При анализе результатов лечения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений высокой степени с использованием местной деструкции СОг - лазером обнаружено, что данные цитологии всех 4 больных группы контроля демонстрировали признаки воспалительного процесса в эпителии шейки матки, в то время как у 4 из 6 пациентов опытной группы с CIN II выявили полное выздоровление на фоне аналогичного лечения, но с применением имунофана При оценке динамики кольпоскопической картины в 1 группе пациентов после деструктивного лечения отмечена более быстрая и качественная эпителизация экзоцервикса, чем у пациентов контрольной группы.

Таким образом, нормальные цитологические показатели после лечения через 6 месяцев имели 40 (83,3%) больных опытной группы и 21 больной (43,75%) контрольной группы (р<0,05).

При оценке состояния пациенток через 1 год при кольпоскопическом и цитологическом обследовании не обнаружена прогрессия заболевания у больных опытной и контрольной групп. Рецидивы воспалительного процесса в течение всего

периода наблюдения были отмечены только у трех больных опытной группы с устойчиво положительным Ощепе-тестом, которые проявляли резистентность к специфической антибактериальной терапии. Напротив, рецидивы цервиковагинита у больных контрольной группы отмечены в 45,8% случаев. Эту категорию пациентов преимущественно составили женщины с высокими титрами условно-патогенной флоры.

Таким образом, в результате нашего исследования установлено отсутствие рецидивов цервиковагинитов у 93,75% пациенток опытной группы и лишь у 54,2% больных контрольной группы.

Побочных реакций или индивидуальной непереносимости препарата не наблюдали.

После проведения антибактериальной терапии с учетом чувствительности к антибактериальным средствам, отсутствие патогенной флоры в контрольных исследованиях у пациентов опытной группы отмечено в 93,7% случаев, у пациентов контрольной группы - в 60,4%, что достоверно выше.

Результаты системной антибактериальной терапии женщин по поводу хламидийной, уреаплазменной инфекции из 10 (20,8%) (5 хламидиоз, 5 уреаплазма) больных 1 группы после проведенного курса азитромицина (хемомицина) выявили выздоровление у всех больных, что было подтверждено контрольным ПЦР -исследованием. У 2-й группы больных положительный клинико-лабораторный эффект отмечен у 4-х из 5 пациентов с уреаплазмой и у 3-х из 4-х пациентов с хламидиозом. Таким образом, в контрольной группе резистентными к терапии оказались два пациента с внутриклеточными возбудителями. Можно предполагать, что более высокий эффект проводимой антибактериальной терапии в группе больных с имунофаном по сравнению с группой контроля частично достигается за счет способности препарата преодолевать множественную лекарственную устойчивость -эффект, доказанный ин витро на линиях опухолевых клеток (Новиков С.А., 2008).

Таким образом, регуляторный пептид имунофан целесообразно включать в лечение заболеваний, вызванных не только внутриклеточными возбудителями, но и условно-патогенной флорой с целью повышения эффективности терапии.

3. Динамика иммунологических показателей в процессе лечения имунофаном.

В результате лечения было установлено, что все средние значения показателей клеточного иммунитета в обеих группах находились в пределах нормы. Наблюдали лишь незначительную тенденцию к снижению абсолютного и относительного числа цитотоксических Т-лимфоцитов в опытной группе. При этом отмечали тенденцию к повышению относительного количества хелперных клеток и натуральных киллеров.

На фоне повышения содержания натуральных киллеров, течение воспалительных заболеваний шейки матки в результате применения регуляторного пептида имунофан сопровождалось восстановлением баланса цитокинов. Так, имунофан снижал продукцию ФНО-а, концентрация которого в сыворотке крови достоверно изменялась от 134±19 до 50±11пг/мл, р<0,05.

При этом наблюдали увеличение концентрации ИЛ-10 в сыворотке крови больных в среднем до 120 пг/мл. В то же время у больных контрольной группы отмечено несущественное повышение концентрации ИЛ-10.

При анализе результатов, характеризующих действие имунофана на фагоцитарное звено иммунитета (см. таблицу № 2), обращает внимание усиление кислородзависимого метаболизма фагоцитов, что проявляется достоверным увеличением сниженной продукции перекисных соединений. Иными словами можно

сказать, что имунофан усиливает резервную возможность мононуклеарных фагоцитов к лизису вируссодержащих клеток и бактериальному киллингу. С другой стороны, регуляторный пептид стабилизирует уровень продукции перекисных соединений мононуклеарными клетками (МНК) до значений физиологической нормы, что позволяет сохранять их резервные возможности к бактериальному киллингу и в то же время избежать повреждающего действия АФК на клетки ближайшего окружения.

Таблица №2

Динамика показателей продукции Н202 нейтрофплами крови у больных хроническими ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

Уровень ИС по отношению к норме ИС до лечения Наименование группы Значения ИС после проведенного лечения через:

1 мес. 3 мес. 6 мес.

Ниже нормы 9,4±1,5 (п=32) Опытная (п=19) 11,5±1,6 13,6±1,7 15,1±1,23*

Контрольная (п=13) Ю,5±1,6 11,8±1,7 12,2±1,73

Выше нормы 35,6±2 (п=52) Опытная (п=25) 23,4±1,55* 24±1,61* 21±2,1*

Контрольная (п=27) 32,1±1,8 30,4±1,6 28,6±1,75

Норма 15,6-20,8 (п=12) Опытная (п=4) 18,1±2,1 17,9±1,9 18,8±1,98

Контрольная (п=8) 16,1±1,8 16,8±1,9 17,8±1,98

Примечание. Представлены средние значения индексов стимуляции (ИС) мононуклеарных фагоцитов, представляющие собой отношение показателей стимулированной и спонтанной флюоресценции, выраженной в относительных единицах.

* - р<0,05 по сравнению с индексом стимуляции соответствующей группы до лечения.

п - число больных в группах.

В то же время уровень внутриклеточной продукции перекисных соединений мононуклеарными фагоцитами больных контрольной группы существенно не изменялся в течение наблюдаемого периода времени, что свидетельствует о недостаточности проводимой терапии у больных данной группы и необходимости включения в терапию иммунотропных препаратов.

Данный факт нашел свое подтверждение и при анализе люминол- и люцегенинзависимой хемилюминесценции нейтрофильными лейкоцитами больных исследуемых групп (см. таблицу № 3).

Хорошо известно, что модуляторами функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов являются не только вещества микробного происхождения, иммунные комплексы, медиаторы клеток крови и ткани, но и фармакологические препараты (Маянский А.Н., 1992, Нестерова И.В., 2004). Кроме того, нейтрофильные гранулоциты характеризуются высокой мобилизационной

активностью и способностью к быстрому и точному отражению изменений гомеостаза (Маянский Д.Н., 2004). Это делает возможным, с помощью хемилюминесцентного анализа, оценить прямое и опосредованное действие фармакологических препаратов на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, что позволит определить чувствительность клеток к данному препарату и, в дальнейшем, судить об эффективности терапии.

Таблица № 3

Изменение уровня активности фагоцитирующих нейтрофилов в тесте люминолзависимои хемилюминесценции у больных хроническими ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

Уровень ИС по отношению к норме ИС до лечения Наименование группы Значение ИС после проведенного лечения через:

1 мес. 3 мес. 6 мес.

Ниже нормы 2,5±0,48 (п=22) Опытная (п=13) б,4±1,б 8,7±1,76* 9,2±2,3*

Контрольная (п=9) 3±0,6 4±0,68 4,9±0,71

Выше нормы 79,6±2,5 (п=68) Опытная (п=32) 72,8±2,38 69,2±2,2* б5,5±1,9*

Контрольная (п=36) 81±2,8 76±2,4 72,3±2,15

Норма 10-60 (п=6) Опытная (п=3) 49±2,8 43,8±3,4 40,9±3,7

Контрольная (п=3) 23±1,6 28±1,8 35±2,2

Примечание. Представлены средние значения индексов стимуляции (ИС) мононуклеарных фагоцитов, представляющие собой отношение показателей стимулированной и спонтанной хемилюминесценции, выраженной в относительных единицах.

* - р<0,05 по сравнению с индексом стимуляции соответствующей группы до лечения.

п — число больных в группах.

Как видно из данных, представленных в таблицах №2 и №3, имунофан регулирует не только уровень продукции перекисных соединений, но и таких активных радикалов кислорода как супероксидный анион, синглетный кислород, гидроксильный радикал и др.

Так, данные анализа уровня индекса стимуляции люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ), полученные после лечения имунофаном больных хроническими цервицитами, ассоциированными с ПВИ (см. табл. №3), указывают на восстановление нарушенных функций фагоцитирующих клеток, а именно, нормализацию окислительного баланса и полноценное осуществление бактериального киллинга, то есть завершенность фагоцитоза. Полученные данные, касающиеся индекса стимуляции люцегининзависимой хемилюминесценции

(ЛЦЗХЛ) указывают, что восстановление бактерицидности нейтрофилов происходит преимущественно за счет супераксидного анион радикал кислорода.

При этом, функциональная активность нейтрофилов женщин контрольной группы оставалась нарушенной, что, по-видимому, и приводит к затяжному течению эксудативно-деструктивного воспаления и хронизации цервицита.

Анализ полученных данных обследования показал, что больные хроническими рецидивирующими цервицитами в сочетании с клинически значимой концентрацией вируса папилломы человека в эпителии шейки матки имеют ряд биохимических и иммунологических нарушений. Этот факт может объяснять низкую эффективность традиционной противовоспалительной терапии. В ходе работы мы выделили ключевые моменты, препятствующие получению эффекта от проводимой традиционной терапии. К таким факторам относятся нарушения в системе противовирусной защиты, приводящие к усилению активности папилломавирусной инфекции, нарушение равновесия в окислительной системе детоксикации, дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов.

Результаты иммунологических и биохимических исследований показали, что дизрегуляция функциональной активности клеток моноцитарно-макрофагального ряда является звеном патогенетического механизма развития эпителиальных повреждений шейки матки у больных хроническими рецидивирующими ВПЧ-ассоциированными цервицитами. Регулирующее действие имунофана основано на коррекции нарушенной продукции про- и противовоспалительных цитокинов и устранении агрессивного влияния продуктов метаболизма фагоцитов на окружающие клетки, что приводит к выраженной клинико-иммунологической эффективности препарата. При этом имунофан регулирует не только уровень продукции перекисных соединений, но и таких активных радикалов кислорода как супероксидный анион. Имунофан способен восстанавливать нарушенный процесс бактериального киллинга, осуществляемого клетками моноцитарно-макрофагального ряда, тем самым обеспечивает завершенность фагоцитоза.

Показано, что препарат действует на патогенетические звенья развития вирусной инфекции, обеспечивая элиминацию вируса из клеток. Этот факт свидетельствует о целесообразности назначения иммунотропной терапии, в частности регуляторного пептида имунофан, в дополнение к традиционному этиосимптоматическому лечению, как воспалительных заболеваний шейки матки, так и плоскоклеточных интраэпителиальных неоплазий.

ВЫВОДЫ.

1. Инфицированность больных хроническими цервицитами серотипами вируса папилломы человека высокого онкогенного риска составляет около половины (47,1%) от общего количества больных хроническими цервицитами.

2. В структуре ВПЧ ассоциированных хронических цервицитов преобладающими этиологичесими факторами являются: неспецифический вагинит 37,5%, уреаплазма 36,5%, бактериальный вагиноз 22,1%, кандидоз 16,3%, а в 12,5 % случаев ПВИ выявляется как моноинфекция.

3. Плоскоклеточные интраэпителиальные поражения наиболее часто (48,1%) сопровождают клиническую картину ВПЧ-ассоциированного цервицита, по

сравнению с женщинами без ПВИ, но с клинической манифестацией заболевания (10,3%).

4. Выраженные признаки атипической зоны трансформации (ацетобелый эпителий, йоднегативные участки, мозаика, пунктация) у больных хроническими цервицитами являются показанием для биопсии. Наличие указанных признаков в 85,7% случаев патогномонично для HSIL.

5. Комплексное лечение хронического ВПЧ-ассоциированного цервицита с применением Имунофана приводит к регрессии CIN I до нормы с 42,8% до 75% случаев (р<0,05), быстрой и полноценной эпителизации после деструктивной терапии у больных с CIN II, повышает ремиссию в течение года с 54,2% до 93,75% и эффективность терапии с 60,4% до 93,7% (р<0,05).

6. На фоне комплексного лечения с применением имунофана снижение вирусной нагрузки ниже клинически значимого уровня происходит в 87,5%, по сравнению с 43,75% при традиционной терапии (р<0,05). Данный факт отражает снижение репликации ВПЧ под действием препарата.

7. Развитие воспалительного процесса и эпителиальных поражений шейки матки сопровождается нарушением кислородзависимой системы бактерицидности.

8. Терапевтическое действие регуляторного пептида Имунофан при хроническом рецидивирующем цервиците основано на коррекции нарушенной продукции патогенетических факторов воспаления: про- и противовоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-10), активных форм кислорода, преимущественно супероксид анион радикала, а также системы завершенного фагоцитоза и бактериального киллинга.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Больные с хроническими рецидивирующими цервицитами должны быть отнесены в группу риска по наличию ВПЧ и развитию плоскоклеточных интраэпителиальных поражений. Необходимо проводить комплексное обследование данного контингента пациенток, включающее Digene тест с определением вирусной нагрузки, микробиологического, бакгериоскопического, кольпоскопического и цитологического методов.

Женщинам с цервицитами, ассоциированными с серотипами ВПЧ высокого риска онкогенности, имеющим высокое количественное содержание копий вирусной ДНК, необходим мониторинг показателей функциональной активности фагоцитирующих клеток для прогнозирования развития патологического процесса в эпителии шейки матки.

Пациенткам с ВПЧ ассоциированными цервицитами следует рекомендовать включение в традиционный курс этиопатогенетической терапии регуляторный пептид Имунофан, что позволяет добиться длительной ремиссии в высоком проценте случаев.

В комплексной терапии женщин с цервицитами, ассоциированными с ВПЧ, целесообразно использовать имунофан в суппозиториях по 100 мкг один раз в сутки на ночь ежедневно интравагинально № 10 параллельно с комплексной терапией.

Алгоритм ведения больных хроническими ВПЧ-ассоциированными цервицитами предполагает поэтапное обследование с применением 01яепе - теста, бактериологического, бакгериоскопического исследования, ПЦР диагностики, оценки

функциональной активности фагоцитов, кольпоскопии. По результатам кольпоскопии определяется необходимость биопсии или возможность цитологического контроля на фоне проведения этиопатогенетической терапии с включением иммунофана.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лебедева М.И. Применение Имунофана в комплексной терапии папилломатоза. // Материалы Международного конгресса «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии». М. - 2006. - С. 101.

2. Лебедева М.И., Тутельян A.B., Роговская С.И.Оптимизация диагностики и лечения больных цервицитами, ассоциированными с папилломавирусной инфекцией. // Материалы VIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - М. - 2006. - С. 435- 436.

3. Лебедева М.И. Новые аспекты диагностики и лечения больных цервицитами, ассоциированными с вирусом папилломы человека. // Труды VIII Конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - М.,

2007. - С. 267.

4. Лебедева М.И., Роговская С.И., Тутельян A.B. Сопряженная коррекция окислительно-антиокислительной и иммунной систем в процессе лечения больных цервицитами, ассоциированными с вирусом папилломы человека. // Материалы IX Всероссийского научного форума «Мать и дитя». М. - 2007. - С.445.

5. Лебедева М.И., Тутельян A.B., Роговская С.И. Оптимизация диагностики методом ВПЧ Digene-теста и эффективность лечения имунофаном больных цервицитами, ассоциированными с вирусом папилломы человека. // Российская научно-практическая конференция «Патология шейки матки и генитальные инфекции -от теории к практике». М. - 2007. - С. 48.

6. Роговская С.И., Прилепская В.Н., Бебнева Т.Н., Межевитинова Е.А., Лебедева М.И. Оценка уровня знаний о папилломавирусной инфекции среди акушеров-гинекологов и их позиции в отношении вакцинации. // Российская научно-практическая конференция «Патология шейки матки и генитальные инфекции - от теории к практике». М. - 2007. - С. 67.

7. Прилепская В.Н., Роговская С.И., Бебнева Т.Н., Межевитинова Е.А., Голубенко А.И., Лебедева М.И. Лечение плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки низкой степени препаратом генферон. // Материалы Международной научно-практической конференции «Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее». М. -

2008.-С. 111.

8. Лебедева М. И., Тутельян А. В. Хронический цервицит папилломавирусной этиологии: проблемы диагностики и лечения. // Труды Крымского государственного медицинского университета им. С.И.Георгиевского "Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения". - 2008. - Том 144, часть IV. - С.287.

9. Лебедева М. И. Проблема ранней диагностики и лечения воспалительных заболеваний шейки матки ассоциированных с папилломавирусом. // Труды Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского "Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения". 2008. - Том 144, часть IV. - С. 149 - 155.

10. Лебедева М. И., Величко Т.В. Патогенетические аспекты иммунотерапии вирусных инфекций. // Поликлиника. - 2008. - №5. - С. 43 - 44.

11. Лебедева М. И. Применение регуляторного олигопептида в комплексном лечении воспалительных заболеваний шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека. // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2008. - №5. - с.34-37.

12. Лебедева М. И. Патогенетические аспекты применения иммуномодулирующей терапии в комплексном лечении цервицитов, ассоциированных с вирусом папилломы человека. // Инфекционные болезни. - 2008. -Т.6. -№4.-С.41-45.

Формат 60x84 '/16. Тираж 150 экз. Заказ № 29/бп. 1.25 п.л. Подписано в печать 06.03.09 г.

Сохранение репродуктивного здоровья населения страны является одной из ключевых медико-социальных проблем, важным фактором национальной безопасности. Репродуктивная функция является одним из основных интегральных показателей здоровья женщины, определяет качество жизни ее и потомства, а соответственно здоровья и качества жизни нации.

Известно, что генеративная функция женщин в значительной степени зависит от наличия и характера воспалительных процессов репродуктивного тракта женщины, которые являются частой патологией и составляют 60-65% в структуре гинекологических заболеваний (Кулаков В.И. и др., 2006). В последние годы среди вирусных инфекций, передающихся половым путем, наибольшего внимания заслуживает возрастающая заболеваемость папилломавирусной инфекцией (ПВИ). Многочисленные эпидемиологические и молекулярно-генетические данные свидетельствуют о значении вируса папилломы (ВПЧ) человека в генезе не только воспалительных заболеваний шейки матки, но и возникновении дисплазий и рака шейки матки. Ключевой концепцией этиопатогенеза рака шейки матки признана вирусная теория, центральное место в которой занимает вирус папилломы человека, обладающий высоким онкогенным потенциалом и являющийся основным экзогенным фактором цервикального канцерогенеза.

Частота ПВИ гениталий в гинекологической практике составляет 44,3% [51]. При массовых обследованиях ВПЧ обнаружен у 40-50% молодых женщин, который в последующие периоды у большинства носителей способен спонтанно исчезать. У 5-15% ВПЧ вызывает хроническое воспаление шейки матки (цервицит), реже вульвы и влагалища [3]. Длительное персистирование вируса папилломы человека часто ассоциировано с наличием хламидийной, условно-патогенной, вирусной инфекцией и другими нарушениями микроэкологии влагалища и способствует развитию злокачественных эпителиальных поражений шейки матки (Al-Risasi, 2008).

Своевременная диагностика урогенитальных инфекций, на фоне которых развивается хронический цервицит, имеет важное значение, поскольку у многих женщин клинические проявления заболевания могут отсутствовать, а недиагностированное и, как следствие, нелеченное поражение может вызвать развитие болевого синдрома, нарушение менструальной и генеративной функций (W.Kinney, 2008).

В связи с этим необходимо использовать новые, более совершенные методы диагностики, обладающие высокой достоверностью, специфичностью и воспроизводимостью, с возможностью определения степени онкогенности вируса и его репликативной активности. Применение такого метода в практике лабораторного обследования позволит наиболее адекватно определить тактику ведения пациентов, оценить прогноз заболевания, осуществить выбор лекарственных средств и длительность терапии.

Проблема терапии персистирующих инфекций также не решена до настоящего времени и, по мнению большинства исследователей, массивная антибактериальная терапия в ряде случаев не эффективна и приводит к нарушению микробиоценоза урогенитального тракта [10].

При выявлении цервицита, ассоциированного с ПВИ, необходимо проведение комплексной терапии, направленной как на микро-, так и на макроорганизм. Специфических препаратов для лечения ПВИ в настоящее время не существует. Локальная терапия направлена на удаление кондилом и атипически измененного эпителия. Однако, учитывая то обстоятельство, что воспалительная патология, как правило, сопровождается синдромом общей интоксикации, не следует ожидать хорошего результата при применении только местных деструктивных средств терапии, не учитывая влияния токсических продуктов, накапливающихся в организме в условиях персистирования инфекции [57]. Использование сочетанного воздействия местных и общих факторов детоксикации может привести к ускорению процессов репарации и снижению количества возможных осложнений. Однако механизмы действия и эффективность этого комплекса в лечении заболеваний шейки матки изучена недостаточно.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности изучения проблемы вирусно-бактериальных воспалительных заболеваний шейки матки, необходимости разработки более эффективных методов комплексной терапии, основанных на применении эффективных противовоспалительных и иммуномодулирующих средств, направленных на ускорение процессов регенерации слизистой оболочки шейки матки, сокращение сроков лечения и профилактики рака шейки матки.

Цель исследования. Повышение эффективности терапии хронических рецидивирующих ВПЧ-ассоциированных цервицитов у женщин репродуктивного возраста путем включения в схему комбинированной терапии регуляторного пептида имунофан.

Задачи исследования.

1.Оценить частоту выявления папилломавирусной инфекции у больных хроническими цервицитами, выделенных из контингента женщин репродуктивного возраста, обращающихся в гинекологическую клинику по поводу генитальных выделений.

2.Изучить структуру сопутствующих этиологических факторов цервицитов, ассоциированных с ПВИ.

3. Изучить кольпоскопические и цитологические особенности ВПЧ-ассоциированного цервицита.

4. Исследовать влияние комплексной терапии, включающей регуляторный пептид имунофан, на морфологические изменения эпителия шейки матки, длительность ремиссии и эффективность антибактериальной терапии у больных хроническими ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

5. Проанализировать динамику клинически значимых изменений уровня ПВИ у больных хроническими рецидивирующими цервицитами на фоне антибактериальной и иммунотропной терапии с использованием Digene теста. б.Определить функциональную активность фагоцитирующих клеток до и после лечения имунофаном женщин с ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

7. На основании результатов клинического обследования, состояния противовирусного иммунитета, оксидантного статуса организма разработать научно-обоснованные показания к применению имунофана и дать комплексную оценку эффективности препарата в лечении воспалительных заболеваний шейки матки.

Научная новизна.

Впервые для лечения больных хроническими рецидивирующими цервицитами, ассоциированными с ПВИ, применен новый иммунокорректор -регуляторный пептид имунофан. Доказана его эффективность и научно обоснована целесообразность включения данного препарата в схему комплексной терапии хронических рецидивирующих ВПЧ-ассоциированных цервицитов у пациенток репродуктивного возраста.

Установлены патогенетические механизмы развития воспалительного процесса шейки матки, включающие изменения функциональной активности клеток моноцитарно-макрофагального ряда у женщин с ВПЧ-ассоциированными хроническими цервицитами.

Практическая значимость.

На основании клинико-лабораторных исследований разработана оптимальная схема применения пептидного препарата имунофан и определена эффективность его лечебного действия у пациенток с ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

На основании молекулярно-генетических и иммуно-биохимических методов разработан алгоритм ведения и возможность прогнозирования течения патологического процесса у больных хроническими рецидивирующими ВПЧ-ассоциированными цервицитами.

Расширен спектр молекулярно-генетических и иммуно-биохимических методов, применяемых для оценки эффективности терапии.

Показана целесообразность отнесения больных хроническими цервицитами к группе риска по ВПЧ-инфицированию и развитию плоскоклеточных интраэпителиальных поражений.

Внедрение в практику.

Результаты проведенных исследований внедрены в клиническую практику работы Научно-поликлинического отделения ФГУ Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии Росмедтехнологий им. академика В.И.Кулакова и используются в качестве лекционного материала на курсах повышения квалификации для практических врачей из различных регионов РФ и СНГ.

Личный вклад автора заключается в непосредственном ведении всех больных, проведении лечебно-диагностических процедур и анализе полученных данных.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на апробационной комиссии ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, на Международном конгрессе «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии» (Москва. 27-31 марта 2006г.), научно-практической конференции «Актуальш питания су частного акушерства» (Украина, Тернополь, 19-20 марта 2007г.), VIII Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва. 2006г.), VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва. 27-29 июня 2007г.), IX Всероссийский форум «Мать и дитя» (Москва. 2007г.), Российской научно-практической конференции «Патология шейки матки и генитальные инфекции — от теории к практике» (Москва. 26-30 марта 2007г.), Международной научно-практической конференции «Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее» (Москва 31марта-3 апреля 2008г.), Международном конгрессе «Актуальш питания акушерства, гшекологп та перинатологп» (Украина, Судак, 21-23 мая 2008г.).

ВЫВОДЫ.

1. Инфицированность больных хроническими цервицитами серотипами вируса папилломы человека высокого онкогенного риска составляет около половины (47,1%) от общего количества больных хроническими цервицитами.

2. В структуре ВПЧ ассоциированных хронических цервицитов преобладающими этиологичесими факторами являются: неспецифический вагинит 37,5%, уреаплазма 36,5%, бактериальный вагиноз 22,1%, кандидоз 16,3%, а в 12,5 % случаев ПВИ выявляется как моноинфекция.

3. Плоскоклеточные интраэпителиальные поражения наиболее часто (48,1%) сопровождают клиническую картину ВПЧ-ассоциированного цервицита, по сравнению с женщинами без ПВИ, но с клинической манифестацией заболевания (10,3%).

4. Выраженные признаки атипической зоны трансформации (ацетобелый эпителий, йоднегативные участки, мозаика, пунктация) у больных хроническими цервицитами являются показанием для биопсии. Наличие указанных признаков в 85,7% случаев патогномонично для HSIL.

5. Комплексное лечение хронического ВПЧ-ассоциированного цервицита с применением Имунофана приводит к регрессии CIN I до нормы с 42,8% до 75% случаев (р<0,05), быстрой и полноценной эпителизации после деструктивной терапии у больных с CIN И, повышает ремиссию в течение года с 54,2% до 93,75% и эффективность терапии с 60,4% до 93,7% (р<0,05).

6. На фоне комплексного лечения с применением имунофана снижение вирусной нагрузки ниже клинически значимого уровня происходит в 87,5%, по сравнению с 43,75% при традиционной терапии (р<0,05). Данный факт отражает снижение репликации ВПЧ под действием препарата.

7. Развитие воспалительного процесса и эпителиальных поражений шейки матки сопровождается нарушением кислородзависимой системы бактерицидности.

8. Терапевтическое действие регуляторного пептида Имунофан при хроническом рецидивирующем цервиците основано на коррекции нарушенной продукции патогенетических факторов воспаления: про- и противовоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-10), активных форм кислорода, преимущественно супероксид анион радикала, а также системы завершенного фагоцитоза и бактериального киллинга.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Больные с хроническими рецидивирующими цервицитами должны быть отнесены в группу риска по наличию ВПЧ и развитию плоскоклеточных интраэпителиальных поражений. Необходимо проводить комплексное обследование данного контингента пациенток, включающее Digene тест с определением вирусной нагрузки, микробиологического, бактериоскопического, кольпоскопического и цитологического методов.

Женщинам с цервицитами, ассоциированными с серотипами ВПЧ высокого риска онкогенности, имеющим высокое количественное содержание копий вирусной ДНК, необходим мониторинг показателей функциональной активности фагоцитирующих клеток для прогнозирования развития патологического процесса в эпителии шейки матки.

Пациенткам с ВПЧ ассоциированными цервицитами следует" рекомендовать включение в традиционный курс этиопатогенетической терапии регуляторный пептид Имунофан, что позволяет добиться длительной ремиссии в высоком проценте случаев.

В комплексной терапии женщин с цервицитами, ассоциированными с ВПЧ, целесообразно использовать имунофан в суппозиториях по 100 мкг один раз в сутки на ночь ежедневно интравагинально № 10 параллельно с комплексной терапией.

Алгоритм ведения больных хроническими ВПЧ-ассоциированными цервицитами предполагает поэтапное обследование с применением Digene -теста, бактериологического, бактериоскопического исследования, ПЦР диагностики, оценки функциональной активности фагоцитов, кольпоскопии. По результатам кольпоскопии определяется необходимость биопсии или возможность цитологического контроля на фоне проведения этиопатогенетической терапии с включением иммунофана.

АЛГОРИТМ ВЕДЕНИЯ ЖЕНЩИН С ВПЧ-АССОЦИИРОВАННЫМИ ХРОНИЧЕСКИМИ ЦЕРВИЦИТАМИ.