Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка живой реассортантной гриппозной вакцины по индукции В - и Т- клеточной иммунологической памяти

(Щг-

На правах рукописи

КОРЕНЬКОВ Даниил Анатольевич

ОЦЕНКА ЖИВОЙ РЕАССОРТАНТНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ ПО ИНДУКЦИИ В- И Т-КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ПАМЯТИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология 03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2009

003474510

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного

отделения РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Найхин Анатолий Нойевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Назаров Петр Григорьевич

доктор медицинских наук Зазимко Любовь Александровна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки

«НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Роспотребнадзора»

Защита диссертации состоится «(¿/ » оз _ 2009 года в «-О часов на заседании Диссертационного Совета ДМ 001.022.01 при НИИЭМ СЗО РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН.

Автореферат разослан « ЗО .» ¿Ж" 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Бурова-Я.А. доктор медицинских наук

Актуальность проблемы. Грипп, наряду с вирусными гепатитами и ВИЧ-нфекцией, является одной из главных вирусологических проблем. Мировой аучной общественностью уделяется огромное внимание разработке методов редотвращения именно этих заболеваний. В настоящее время к самым ффективным способам борьбы с гриппом относят вакцинопрофилактику [Global andemic influenza action plan to increase vaccine supply, WHO Document Production ervices, 2006].

Качество противогриппозных вакцин, как и других вакцинных препаратов, ценивают по трем главным критериям: эпидемиологическая эффективность, езвредность и иммуногенность. До сих пор об иммуногенности гриппозных вакцин удят только по их способности стимулировать продукцию сывороточных нтигемагглютинирующих антител. В последнее время развернута дискуссия о остаточности такой оценки [Meeting report: FDA/NIH/WHO public workshop on mune correlates of protection against influenza A viruses in support of pandemic accine development, Vaccine 26 (2008) 4299-4303].

Принцип вакцинации основан на создании у людей иммунологической памяти возбудителю инфекции. За счет вакцинации организм при последующей встрече с атогеном отвечает ускоренной и усиленной мобилизацией факторов иммунной ащиты. Поэтому совершенно логично, что главная задача вакцинальной ммунологии должна быть связана именно с оценкой препаратов по индукции ммунологической памяти [Медуницин Н.В., 2004; Welsh R.M. et al, 2004; Halwani . et al, 2006]. В последние годы это направление активно развивается за рубежом anzavecchia A., Sallusto F., 2005; Halwani R. et al, 2006; Takahashi Y., 2007; Sanz I. t al, 2008; Galli G. et al, 2009]. В России подобные исследования не проводились.

Настоящая работа является первой попыткой комплексной оценки ффективности вакцинации людей по стимуляции В- и Т-клеточной памяти живыми еассортантными вакцинными штаммами, входящими в состав отечественной ивой гриппозной вакцины (ЖГВ).

Цель исследования: изучить способность ЖГВ стимулировать В- и Т-еточную иммунологическую память.

Задачи исследования: . Разработать методические приемы оценки иммунологической памяти у людей. . На материале обследования добровольцев 18 — 20 лет, привитых ЖГВ и не прививавшихся этой вакциной, а также в экспериментальном исследовании in vivo изучить:

- локальную B-клеточную память по критерию авидитета секреторных IgA-антител к вирусам гриппа;

- Т-клеточную память по выявлению общих циркулирующих лимфоцитов с мембранными маркерами CD45RO+;

- Т-клеточную иммунологическую память по определению уровней вирусспецифических циркулирующих лимфоцитов.

Научная новизна работы. . Впервые осуществлено исследование у людей B-клеточной иммунологической памяти к вирусам гриппа А и В по критерию авидитета локальных IgA-антител, включающее оценку количественных характеристик скорости, интенсивности i

прочности образования иммунных комплексов. Показано, что иммунизация ЖГВ повышает эти показатели, т.е. увеличивает продукцию высокоавидных антител в верхнем отделе респираторного тракта.

2. Впервые проведена оценка ЖГВ по индукции у людей общих циркулирующих Т-лимфоцитов иммунологической памяти фенотипов CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+. Установлено, что введение ЖГВ вызывает увеличение уровня этих клеток в периферической крови.

3. Разработана модификация метода TRAP (T-cell recognition of antigen presenting cells by protein capture) для количественного определения у людей и животных специфических к вирусу гриппа А Т-клеток иммунологической памяти. С помощью данной методики показано, что вакцинация ЖГВ индуцирует продукцию этих клеток, отраженную в поствакцинальном увеличении их уровня в периферической крови.

4. Впервые осуществлено сравнение активности индукции на локальном уровне (назоассоциированная лимфоидная ткань мышей) вирусспецифических Т-клеток памяти при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации животных живым реассортантным вирусом гриппа. Отмечено, что как при инфекции, так и при вакцинации происходит увеличение уровней вирусоспецифических CD8+CD44hl Т-лимфоцитов памяти в этой лимфоидной ткани.

Практическая значимость работы.

1. Разработан метод количественного измерения в иммуноферментном анализе авидности IgA-антител к вирусам гриппа А и В в секретах верхних дыхательных путей. Метод дает возможность характеризовать эти иммуноглобулины одновременно по трем параметрам: (i) титры антител; авидность антител с точки зрения (ii) скорости и интенсивности соединения с антигеном, (iii) прочности соединения с антигеном.

2. Разработана модификация TRAP для количественного выявления у людей циркулирующих в крови Т-клеток, специфических к вирусу гриппа А.

3. Эти методы могут быть использованы для оценки индукции В- и Т-клеточной иммунологической памяти у людей, привитых различными гриппозными вакцинами.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Однократная прививка ЖГВ взрослых лиц, уже контактировавших ранее с возбудителями гриппа, вызывает стимуляцию В- и Т-клеточной иммунологической памяти.

2. Даже люди практически одного возраста (18 - 20 лет) весьма гетерогенны по показателям предвакцинального состояния иммунологической памяти к вакцинному штамму вируса гриппа А, входящему в состав ЖГВ.

3. Обнаружена обратная зависимость между предвакцинальными значениями изученных параметров В- и Т-клеточной иммунологической памяти и их поствакцинальными изменениями.

4. Имеются значительные расхождения между данными оценки иммунологических свойств ЖГВ по конверсии титров сывороточных антител в РТГА, с одной стороны, и по тестированию поствакцинальных изменений уровней вирусспецифических Т-клеток памяти, с другой.

Личный вклад автора заключается в непосредственном участии в клинических испытаниях, самостоятельном проведении всех лабораторных исследований, анализе материалов, статистической обработке полученных результатов. Вклад соавторов состоит в помощи при отборе волонтеров, проведения вакцинации и сборе материалов в клинических испытаниях с участием добровольцев, а также в освоении и постановке новых методов исследования (Донина С.А., Григорьева Е.П., Петухова Г.Д., Чиркова Т.В.).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на X Всероссийском Научном Форуме с международным участием им. акад. В.И. Йоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 29 мая - 1 июня 2006 г.); Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 30 июня - 5 июля 2008 г.); The Third European Influenza Conference (Vilamoura, Portugal, September 14 -17, 2008); Школе-Конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 6-10 октября 2008 г.).

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отделов иммунологии и вирусологи НИИЭМ СЗО РАМН «9» апреля 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемых литературных источников. Работа изложена на 135 страницах текста, включающего 20 таблиц и 15 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 175 источников, в том числе 20 отечественных и 155 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Для воспроизведения экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации использовали линейных мышей CBA/J (самок) в возрасте 8-10 недель, полученных из питомника «Рапполово» РАМН.

Модель экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации.

Уровни клеток иммунологической памяти в назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ) мышей изучали на экспериментальной модели, разработанной ранее в отделе вирусологии НИИЭМ СЗО РАМН. Животным вводили следующие вирусы гриппа: (i) патогенный для мышей A/PR/8/34 (H1N1) в дозе 4,0 lg ЭИД50 - моделирование естественной гриппозной инфекции; (ii) аттенуированный реассортантный вирус A/47/PR/8/34 (H1N1) в дозе 6,0 lg ЭИД50 -моделирование вакцинации ЖГВ; (iii) инактивированный формалином вирус A/47/PR/8/34 (H1N1) в дозе 10 мкг по гемагглютинину - моделирование вакцинации инактивированной гриппозной вакциной. Реассортант имел 2 гена наружных белков от вируса (i) и 6 генов внутренних белков от вируса гриппа А/Ленинград/134/47/57 (H2N2). Вирусы вводились под легким эфирным наркозом, живые - интраназально в объеме 50 мкл (по 25 мкл в каждый носовой ход), а инактивированный -парентерально (внутрибрюшинно) в объеме 200 мкл. В качестве контроля

использовались интактные животные. Уровни клеток памяти в НАЛТ определяли на 7 и 60 сутки после введения вирусов.

Волонтеры и вакцинация. Во всех исследованиях участвовали условно здоровые молодые люди 18-20 лет, не имевшие противопоказаний к вакцинации ЖГВ. В исследованиях по формированию авидитета секреторных антител было обследовано 109 непривитых волонтеров, 112 лиц, вакцинированных рекомендованными ВОЗ аттенуированными реассортантными штаммами для ЖГВ: A/17/Соломоновы Острова/Об/9 (H1N1) или В/60/Флорида/04/181. 48 лиц получили препарат плацебо (стерильный физиологический раствор). В исследованиях уровней CD45RO+ и CD45RA+ Т-лимфоцитов участвовали 85 непривитых людей, 32 человека, вакцинированных тривалентной коммерческой ЖГВ; 25 лиц составили контрольную группу - плацебо. В состав ЖГВ входили реассортантные штаммы, рекомендованные ВОЗ: A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1),

А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) и В/60/Джилин/01/1. Для изучения изменений в уровнях вирусспецифических Т-лимфоцитов памяти обследовано 25 непривитых добровольцев, 20 вакцинированных и 10 получивших препарат плацебо. Вакцинация проводилась реассортантным штаммом для ЖГВ A/17/Соломоновы Острова/Об/9 (H1N1), рекомендованным ВОЗ.

Все вирусы вводили однократно, интраназально, по 0,25 мл в каждый носовой ход. Лицам из группы плацебо таким же способом вводился стерильный физиологический раствор. Медицинский осмотр и забор венозной крови у добровольцев проводили до вакцинации и через 1 месяц после вакцинации. Отбор секретов верхних дыхательных путей осуществляли до и через 21 день после введения препаратов. От каждого волонтёра было получено письменное добровольное информированное согласие об участии в исследовании.

Выделение лимфоцитов НАЛТ. Сепарацию НАЛТ осуществляли по ранее разработанной методике[Азапиша Н. et al., 1997]. После цервикальной дислокации у мышей отделяли верхнюю челюсть кзади от глазных яблок и удаляли кожу. Далее выделенную часть черепа освобождали от мозга, мышц и тканей наружного носа вместе с верхними резцами. После сепарации небной пластинки выделяли непосредственно НАЛТ - парные лимфоидные образования по бокам от носовой перегородки. НАЛТ осторожно гомогенизировали с помощью предметных стекол с матовым краем. Приготовление суспензии лимфоцитов осуществляли общепринятым методом [Current Protocols in Immunology, 2003].

Выделение и приготовление суспензии мононуклеаров периферической крови (МПК) людей осуществляли центрифугированием в градиенте плотности Histopaque-1077 традиционным способом [Current Protocols in Immunology, 2003].

Иммуногенность ЖГВ оценивали по уровню антигемагглютинирующих сывороточных антител в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В качестве антигена использовали по 4 гемагглютинирующие единицы вирусов гриппа А или В, входящих в состав вакцины. Перед постановкой РТГА сыворотки инкубировали с RDE (II) (receptor destroying enzyme, "Seiken", Япония) и прогревали в течении 0,5 часа при 56°С.

IgA-анитела в секретах верхних дыхательных путей (СВДП) определяли в непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА) по ранее разработанной методике [Донина С.А. и др., 1997]. За титр антител принимали последнее

разведение образца, оптическая плотность (ОП) которого превышала в 2 и более раза среденее арифметическое значение ОП контрольных лунок (все компоненты кроме образцов СВДП).

Авидность локальных IgA-антител у людей в тесте с мочевиной определяли в ИФА по методике [de Souza V.A. et al., 2003], модифицированной в части, касающейся его адаптации для исследования СВДП. Расчёт индекса авидности (ИА) осуществляли по формуле:

среднее арифметическое ОП в лунках, обработанных мочевиной

ИА =------------------------------------------------------------------------------------хЮО, (%)

среднее арифметическое ОП в контрольных лунках

Авидность локальных IgA-антител у людей в динамическом варианте

ИФА проводили по ранее разработанной методике [Найхин А.Н. и др., 1993], основанной на определении скорости и интенсивности образования комплекса антиген-антитело. Индексы авидности (ИА) рассчитывали по формуле:

(T,:To^)+(Ti:To,5)+(Ti:Ti) ИА = ---------------------------------,где

tmax

Т], Т0>5, Т0,25 _ обратные величины титров антител соответственно после инкубации СВДП в течение 1 часа, 0,5 часа и 0,25 часа. tmax - время достижения максимального титра, то есть через 1 час или 0,5 часа или 0,25 часа. В случае, когда титры секреторных IgA были меньше 1:8, индексы авидности считали равными 1,0; при титрах от 1:8 до 1:16 - равными 2,0; для тиров свыше 1:16, индексы авидности всегда были выше 2,0.

Распределение лимфоцитов по мембранным маркерам. Для определения количества (%) Т-клеток фенотипов CD4+CD45R0+, CD8+CD45R0+ и CD4+CD45RA+, CD8+CD45RA+ использовали моноклональные антитела к этим молекулам («BD Biosciences Pharmigen», США). Клетки окрашивали по стандартному протоколу, предоставленному производителем в инструкции к антителам. Учёт результатов проводили по данным проточной цитометрии на приборе «COULTER EPICS XL», США.

Вирусспецифические Т-клетки в периферической крови людей и мышей определяли с использованием модифицированного метода TRAP (T-cell recognition of antigen presenting cells by protein capture), основанного на опубликованных методиках [Beadling, Slifka, 2006; Daubeuf et al., 2006]. Схема метода представлена на рис. 4. Для фенотипирования клеток применяли антитела к CD4 человека или к CD8 и CD44 мыши (BD Biosciences Pharmigen, USA). Результаты учитывали по данным проточной цитометрии на приборе «COULTER EPICS ALTRA», США.

Статистические методы. Статистический анализ проводился в программе «MS Excel» с применением непарамертических методов (U-критерий Манна-Уитни, тест Вилкоксона для парных сравнений и коэффициент корреляции по Спирмену). За уровень статистической значимости была принята р<0,05. Средние величины уровней локальных IgA и антигемагглютинирующих антител представлены в виде средних геометрических обратных значений титров (СГТ).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оценка у людей локальной В-клеточной иммунологической памяти по критерию авидитета секреторных ^А-антител

В целом вопрос о формировании иммунологической памяти во входных воротах инфекции носит дискуссионный характер [Ярилин А.А., 1999; ТакаЬайЫ У., 2007; ваш: I. й а1, 2008]. Это относится и к локальным В-клеткам памяти. Существует несколько методов оценки В-клеточной памяти: (1) по количественному определению в ЕЫ8РОТ плазматических клеток, секретирующих антитела различных изотипов; (и) по тестированию в проточной цитометрии уровней В-клеток, несущих мембранные маркеры памяти СБ27, СБ38, Вс1-2; (ш) по повышению авидности продуцируемых антител при повторных контактах организма с возбудителем. Нами был выбран последний метод, поскольку, во-первых, он более прост, во-вторых, отражает функциональное состояние В-клеточной памяти, в-третьих, не требует выделения клеток. Кроме того, сведения об авидитете локальных антител в литературе отсутствовали.

Адаптированы два метода количественной оценки в ИФА авидности локальных антител к вирусам гриппа А и В, ранее применявшиеся только для изучения авидитета сывороточных иммуноглобулинов [Найхин А.Н. и др, 1995; Боига V. е1 а1, 1997; Раипю М. et а1, 2003] - динамический тест и тест с мочевиной. Эти тесты неравнозначны по своей сути, поскольку первый измеряет авидитет с позиции скорости реагирования антитела с антигеном (время достижения максимального титра) и интенсивности иммунной реакции (частное от деления максимального титра на минимальный), тогда как второй в большей мере оценивает авидитет с точки зрения прочности соединения антигена с антителом на основании количественных данных о разрыве слабоавидных связей под действием мочевины.

Обследование 109 условно здоровых лиц 18-20 лет, ранее не прививавшихся ЖГВ, показало наличие широкого диапазона индивидуальных показателей авидности локальных 1§А-антител. Так, по данным теста с мочевиной и динамического теста, значения индексов авидности этих антител колебались соответственно от 33 до 96% и от 1 до 23. Полученные результаты позволили произвести разделение добровольцев на три группы: с низким авидитетом антител (индексы авидности в тесте с мочевиной от 33 до 60% и в динамическом тест от 1 до 3), средним (индексы авидности соответственно от 61 до 80% и от 4 до 7) и высоким (индексы авидности соответственно от 81 до 96 % и от 8 до 23).

Далее на материале обследования тех же лиц был проанализирован вопрос о связи между титрами и индексами авидности секреторных ^А-антитсл. Актуальность такого анализа заключалась в том, что в случае наличия полного совпадения этих показателей, необходимость оценки антител по ИА отпадает, поскольку о нем можно будет судить по величине титров.

Оказалось, что у части людей (до 50%) наблюдались расхождения в этих данных, то есть наличие у волонтеров локальных 1§А-антител с высокими индексами авидности при низких титрах и, наоборот, с низкими индексами при высоких титрах. Кроме того, коэффициент корреляции между показателями теста с

мочевиной и динамического теста, с одной стороны, и титрами антител, с другой, не был статистически значимым (0,22 и 0,47 соотвественно, р>0,05).

Обобщая результаты этой части работы, можно отметить, что проведенное обследование непрививавшихся ЖГВ людей позволило, во-первых, убедиться в хорошей воспроизводимости двух использованных методов оценки авидности 1§А в СВДП, во-вторых, выбрать конкретные параметры такой оценки.

На следующем этапе методы были апробированы на материале обследования добровольцев, иммунизированных вакцинными штаммами вирусов гриппа А (НШ1) и В.

При разработке любого иммунологического метода важно установить, происходит ли изменение его показателей под влиянием антигенного стимула. Это, с одной стороны, является проверкой специфичности теста, а с другой - дает представление о действии препарата с точки зрения его способности индуцировать изучаемые факторы иммунитета. Сказанное в полной мере относится и к авидности антител.

После прививки волонтеров вакцинными штаммами для ЖГВ средние геометрические титры локальных ^А к вирусам гриппа А (НШ1) и В увеличились соответственно в 2,3 (р<0,001) и 2,1 (р<0,01) раза, а доля лиц, давших достоверный прирост этих антител, составила соответственно 50 и 39%. В группе лиц, получивших препарат плацебо, эти показатели не превышали 3,7% (1 человек). Таким образом, штаммы обладали достаточной иммуногенностью в отношении индукции локального гуморального иммунного ответа.

Далее мы проследили характер изменений индексов авидности секреторных ^А в до- и поствакцинационный периоды у трех групп волонтеров: (¡) у привитых с наличием достоверного прироста в ИФА локальных антител; (и) у привитых с отсутствием такого прироста и (Ш) у получивших препарат плацебо (рис. 1).

% «

Тест с мочевиной

35,7

32,1

■'Г'' : ' я;

ш и

•'

■ - 9,5

■я

1—

1

%

Динамический тест

ИФА(+) ИФА(—) Плацебо

ИФА(+) ИФА(—) Плацебо

Рисунок 1. Авидность локальных I» V :пп иг ел к вирусу гриппа А (НШ1) у привитых ЖГВ добровольцев в зависимости от наличия или отсутствия локального иммунного ответа на вакцинацию. По оси абсцисс: ИФА(+) - лица, давшие после вакцинации достоверный прирост титров ^А-антител в секретах верхних дыхательных путей (п=28); ИФА(-) - лица, не давшие такого прироста(п=28); плацебо - лица, получившие препарат плацебо(п=21). По оси ординат: процент лиц, с высокими показателями авидности антител (для теста с мочевиной - индексы авидности 81 - 96%, для динамического теста - индексы авидности 8-23). О- До вакцинации; Д- после вакцинации.

После иммунизации среди вакцинированных волонтеров с наличием достоверной конверсии секреторных ^А-антител, доля лиц с высокими показателями индексов авидности к вирусу гриппа А (НШ1), по данным теста с мочевиной и динамического теста, увеличилась соответственно в 8,9 (р<0,001) и в 1,5 раза (р<0,05). У привитых людей без достоверного накопления ^А-антител эти показатели либо изменились очень незначительно (р>0,05), либо не изменились вообще, а у добровольцев, получивших препарат плацебо они даже снизились.

Результаты, полученные при изучении авидности секреторных ^А-антител к вирусу гриппа В, значительно не отличались.

Таким образом, после прививки ЖГВ количественное накопление антител в секретах верхних дыхательных путей сопровождалось увеличением их авидности. Выраженность этого увеличения зависила от количественных характеристик авидитета, на фоне которых осуществлялась прививка.

При измерении индивидуальной авидности антител у конкретного вакцинируемого человека важно зафиксировать не только изменения данного показателя после вакцинации, но и установить величины достоверности такого изменения, так как нельзя исключить, что в каких-то пределах значения индексов авидности антител могут быть подвержены не связанным с вакцинацией неспецифическим колебаниям в промежуток между отбором проб. Результаты такого анализа для обоих тестов представлены в таблице 1. При выработке этих критериев опирались на наиболее надежный биологический принцип достоверности - отсутствие увеличения измеряемого признака в контрольной группе, то есть группе, получавшей препарат плацебо.

Таблица 1

Диапазон изменения авидности локальных ^А-антител к вирусам гриппа А (НШ1) и В

у привитых людей

Вирус гриппа Группа Число лиц Чвсло и доля (%) лиц с измененными индексами авидности антител

Тест с мочевиной Динамический тест

Сниже -ние Увеличение на Снижение Увеличение в

1-15% 16-24% >25% 1,0-1,4 1,5-4,2 >2,5

А (НЖ1) ИФА(+)* 28 4 14,3% 16 57,1% , -7 25,0% 1 3,5% 4 14,3% 9 32,1% 5 17,9% 10 35,7°

Плацебо* 21 12 57,1% 9 42,9% 0 0 6 28,6% 11 52,4% 4 19,0% 0

В ИФА(+) 22 5 22,7% 6 27,3% 2 9,1% 9 40,9% 4 18,2% 10 45,4% 7 31,8% I . 4.5"/

Плацебо 27 14 51,9% 13 48,1% 0 0 9 33,3% 12 44,4% 6 22,2%

ИФА(+) - лица, давшие достоверный прирост титров 1(>А-антител в СВ ДП после вакцинации; Плацебо - лица, получившие препарат плацебо.

По данным теста с мочевиной, достоверный показатель находился в пределах поствакцинального увеличения индексов авидности антител к вирусам гриппа А и В на более чем 15%, а по данным динамического теста - в 2,5 и более раза.

Обращает на себя внимание тот факт, что доля лиц в контрольных группах со снижением показателей авидности антител в период между отборами секретов оказалась в 4,1 (вирус гриппа А, р<0,001) и в 2,7 (вирус гриппа В, р<0,01) раза выше,

по сравнению с аналогичными показателями в группе привитых по данным теста с мочевиной. Это косвенно свидетельствует, что вакцинация не только увеличивает авидитет секреторных 1§А, но тормозит скорость снижения данного покзателя, то есть влияет на длительность сохранения высокоавидных иммуноглобулинов.

При анализе вопроса о широте информации, получаемой в обоих тестах измерения авидности локальных ^А-антител, оказалось, что из 56 иммунизированных лиц, у 21 волонтера (38%) было зафиксировано достоверное возрастание индексов авидности антител в одном сравниваемом тесте без констатации такого возрастания в другом.

Таким образом, по уровню информации о поствакцинальных сдвигах в авидности антител тест с мочевиной и динамический тест полностью не «перекрывали» друг друга.

Ранее отмечено существование обратной зависимости между исходными показателями авидитета циркулирующих сывороточных антител перед противогриппозной вакцинацией и выраженностью последующих изменений этого показателя в поствакцинальный период [Найхин А.Н. и др, 1995]. Точно такая же зависимость наблюдалась и в отношении авидности секреторных ^А-антител. Так, по данным динамического теста, у привитых добровольцев с зафиксированным достоверным приростом авидности этих антител на прививку, средние значения их индексов авидности перед введением вакцинных штаммов составили 1,8 (вирус гриппа А) и 2,0 (вирус гриппа В), тогда как у лиц, которые не ответили достоверным увеличением индексов авидности на иммунизацию, этот показатель был намного выше - соответственно 8,7 и 8,2 (р<0,01). Аналогичная, но менее выраженная зависимость отмечена и по результатам теста с мочевиной. Проведенный статистический анализ индивидуальных данных показал наличие обратной корреляционной зависимости поствакцинальных уровней авидности этих антител от их исходных значений (коэфициенты корреляции между исходными значениями и кратностями их изменения для динамического теста и теста с мочевиной составили соотвественно -0,63 и -0,48 при р<0,05).

Таким образом, успешность постакцинального повышения авидитета секреторных 1§А-антител зависела от фоновых предвакцинальных уровней авидности этих иммуноглобулинов.

В целом проведенные исследования с теоретических позиций показали способность живых реассортантных штаммов вируса гриппа А и В увеличивать у взрослых праймированных людей авидитет ^А-антител в верхнем отделе дыхательного тракта (входные ворота инфекции), а с точки зрения практики -разработать простые и доступные методы измерения авидности этих антител.

Оценка у людей Т-клеточной иммунологической памяти по выявлению в крови общих Т-лимфоцитов с мембранным фенотипом СБ45КО+

Полноценность развития у людей поствакцинального иммунного ответа к возбудителям инфекций зависит от способности вакцинных штаммов индуцировать не только В-клеточную, но и Т-клеточную иммунологическую память.

Американскими авторами оценена иммуногенная активность инактивированной гриппозной вакцины (ИГВ) по индукции у людей циркулирующих общих С04+СБ45К0+ и С08+С045Я0+ Т-клеток памяти

[МсЕШапеу ГЕ. е1: а1, 1995]. Цель настоящего раздела работы заключалась в анализе данного вопроса в отношении ЖГВ. Ранее подобные исследования не проводились.

На примере вакцинации ЖГВ была предпринята попытка получить ответ на главный вопрос: происходит ли при интраназальном введении взрослым людям аттенуированного реассортантного вируса гриппа изменение уровня этих клеток памяти в периферической крови, и, если да, то какова количественная характеристика такого изменения.

На сегодняшний день отсутствуют общепринятые нормы содержания С04'СВ45ТЮ+, С1)8Х:В45ЯО' Т-клеток в периферической крови. Поэтому были изучены их количественные показатели у условно здоровых людей 18-20 лет, ранее не прививавшихся ЖГВ.

При подсчете от общего числа подвергшихся цитометрическому анализу лимфоцитов доля СБ4+СВ45КО+- и СБ8+СВ451Ю+-лимфоцитов колебалась соответственно от 7 до 17% и от 2 до 11%. При этом наибольшие значения превышали наименьшие в 2,3 - 5,5 раза (р<0,01 и <0,001).

Таким образом, отмечено наличие значительных колебаний индивидуальных уровней изученных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови молодых людей.

Далее были прослежены изменения уровня этих же клеток памяти у лиц того же возраста после вакцинации ЖГВ (рис. 2).

Рисунок 2. Индивидуальные показатели кратности изменения уровней (%) СЦ451Ю+-лимфоцитов в периферической крови вакцинированных ЖГВ людей 18 - 20 лет. Столбик - величина кратности изменения у конкретного волонтёра. Кратность изменения - частное от деления поствакцинального уровня {%) на предвакцинальный. Значения: >1,0 - кратность прироста, <1,0 - кратность снижения, 1,0 -без изменения. РТГА(+) -лица с конверсиями сывороточных антител после вакцинации; РТГА(-) - лица с отсутствием конверсии этих антител после вакцинации. Пунктирной линией обозначены границы достоверности кратности изменения уровней клеток.

Средняя кратность увеличения уровня 0040045)10- и С08+С045л0-лимфоцитов оказалась самой высокой у волонтеров с поствакцинальной конверсией сывороточных антител в РТГА (в 1,6 и 1,9 раза соотвественно, р<0,01). У добровольцев, не давших прирост этих антител на прививку, этот показатель был меньше (в 1,2 и 1,5 раза соотвественно, р>0,05 и р<0,05 соотвественно). Самые низкие значения отмечены у лиц из контрольной группы (в 1,1 и 1,2 раза соотвественно, р>0,05).

У части людей наблюдалось снижение уровня изученных субпопуляций лимфоцитов в период между отборами образцов крови. Доля таких волонтеров среди РТГА-положительных составила 28 - 29%, среди РТГА-отрицательных - от 33 до 39%, а у людей из контрольной группы - от 64 до 72%.

Таким образом, приведенные на рисунке 2 результаты свидетельствуют о поствакцинальном повышении уровня изученных субпопуляций лимфоцитов не только у добровольцев с зафиксированным системным гуморальным иммунным ответом на прививку, но и у лиц с отсутствием такового. При этом иммунизация, как и в случае с авидитетом секреторных ^А-антител, изменяла интенсивность снижения уровня иммунологической памяти, опосредованной С04С045К0+- и СО8+СБ45Я0+-лимфоцитами.

Рассмотрение индивидуальных показателей кратности поствакцинального прироста уровней клеток памяти у каждого отдельного добровольца, в сравнении с аналогичными показателями у лиц контрольной группы, позволило установить границы достоверности получаемых результатов - увеличение уровня клеток в 1,5 и более раз (рис. 2). Доля этих лиц среди привитых РТГА-положительных волонтеров составила 36 и 57%, среди привитых РТГА-отрицательных 11 и 22%, тогда как у людей из контрольной группы не наблюдалось ни одного такого случая (рис. 3).

50 40

30

20

10

о

С04+С0451Ю+ С1)8'еВ451Ю'

Рисунок 3. Показатели достоверного увеличения уровня общих Т-лимфоцитов памяти в периферической крови людей 18 - 20 лет после вацинации ЖГВ. По оси абсцисс - фенотипы клеток. По оси ординат - процент лиц с достоверным (в > 1,5 раза) увеличением уровней данных клеток. □ - лица с достоверными приростами титров сывороточных антител в РТГА (п=14); {¿0 - лица, не давшие такого прироста(п=18); | - лица, получившие препарат плацебо(п=25).

57,4-

22,2

чш

"357Г

11,2

Проведенный корреляционный анализ совпадения случаев достоверног увеличения у вакцинированных добровольцев уровней CD4+CD45RO+-СБ8+С0451Ю+-лимфоцитов показал очень высокую степень зависимости межд данными показателями: коэффициенты корреляции колебались от 0,84 до 0,90 пр р<0,01. Это свидетельствует, что, в принципе, факт поствакцинальной активации Т клеточной памяти можно фиксировать даже при определении только одной из двз субпопуляций Т-лимфоцитов памяти.

Установлено, что между исходными (перед введением ЖГВ) уровням изученных субпопуляций клеток памяти и кратностью их поствакцинальног увеличения существует обратная зависимость, то есть, чем ниже был исходны" уровень, тем выше кратность его увеличения и наоборот (коэффициенть корреляции от -0,36 до -0,52 при р<0,05).

В итоге можно отметить, что проведенные исследования свидетельствовали способности ЖГВ индуцировать Т-клеточную иммунологическую память в вид увеличения в периферической крови молодых людей уровней (%) общи CD4+CD45RO+- и С08+С0451Ю+-лимфоцитов.

Оценка у людей и животных иммунологической памяти по тестированию вирусспецифических Т- и В-лимфоцитов

Важным фактором постинфекционного и поствакцинального иммунитета к острым инфекциям является формирование иммунологической памяти в виде специфических к возбудителю Т-клеток [Halwani R. et al, 2006; Takahashi Y., 2007; Sanz I. et al, 2008]. Только в последние годы вопрос об индукции Т-клеток памяти перешел в плоскость практического изучения в связи с разработкой методик их тестирования.

До недавнего времени в мировой практике для количественного измерения ех vivo антигенспецифических Т-клеток использовались два метода: тетрамерный и цитокиновый.

Тетрамерный метод [Gilanders W.E. et al, 1997; Novak E.J. et al, 1999] основан на специфическом взаимодействии TCR Т-лимфоцита с мультимерным (чаще всего тетрамерным) комплексом, представляющим собой молекулу МНС, связанную с пептидом вирусного антигена. Несмотря на высокую специфичность метод имеет ряд недостатков, прежде всего - сложность рекомбинантной технологии получения комплекса МНС-пептид. Кроме того, метод выявляет популяцию Т-клеток, специфичных только к данному комплексу МНС-пептид, и не дает полного представления о суммарном Т-клеточном ответе на все антигенные эпитопы.

Второй метод основан на выявлении антиген-активированных Т-лимфоцитов по внутриклеточному выявлению продукции Th-1 и Th-2 цитокинов [Prussin С., Metcalfe D.D., 1995]. По сравнению с тетрамерной технологией он более прост и дешев и используется гораздо шире. Однако цитокиновый метод не является витальным тестом (см. ниже) и требует достаточно длительной стимуляции in vitro клеток антигеном для формирования полноценного цитокинового ответа.

На сегодняшний день альтернативой перечисленным двум тестам является метод. TRAP [Daubeuf S. et al, 2006], базирующийся на открытом феномене трогоцитоза [Joly Е., Hudrisier D., 2003] - обмена участками клеточных мембран между АПК и Т-лимфоцитом в процессе презентации антигена. Выбор нами этого

метода связан с тем, что он имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с двумя первыми тестами:

- TRAP более прост, менее дорогостоящ, результаты можно получить в течение 24 часов [Daubeuf S. et al, 2006];

- в отличие от тетрамерной технологии он не требует МНС-типирования и знаний об особенностях презентации отдельного антигена [Puaux A.L. et al, 2006];

- позволяет осуществлять определение активированных Т- и В-клеток в одной пробе [Puaux A.L. et al, 2006];

- в отличие от метода определения внутриклеточных цитокинов TRAP является витальным тестом, то есть исследуемые клетки можно не подвергая фиксации использовать для дальнейших прижизненных исследований [Daubeuf S. et al, 2006];

- выявляет межклеточные реакции уже на этапе взаимодействия АПК с лимфоцитом, поскольку трогоцитоз начинается через несколько минут после контакта этих клеток [Joly Е., Hudrisier D., 2003; Rechavi О. et al, 2007].

По данным литературы информация, полученная в TRAP, хорошо коррелирует с результатами тетрамерного и цитокинового методов [Puaux A.L. et al, 2006; Beadling С., Slifka M.K., 2006].

Ранее TRAP использовался в условиях in vitro на клеточных линиях [Puaux A.L. et al, 2006; Machlenkin A. et al, 2008]. Проведено только одно исследование in vivo в эксперименте на мышах [Beadling С., Slifka М.К., 2006]. Поэтому первой задачей настоящего раздела работы являлась адаптация данной методики для тестирования специфических к вирусу гриппа клеток памяти у людей. Разработанная нами модификация TRAP в значительной мере отличалась от модификации, использовавшейся авторами [Beadling С., Slifka М.К., 2006] - рис. 4.

Активность трогоцитоза определяли в общем пуле вирусспецифических В- и Т-лимфоцитов памяти и в субпопуляции С04+-лимфоцитов.

Испытания модификации TRAP при исследовании образцов периферической крови 25 условно здоровых невакцинированных ЖГВ добровольцев 18-20 лет показало, во-первых, наличие значительных колебаний индивидуальных показателей содержания клеток памяти, специфических к вакцинному штамму вируса гриппа A (H1N1), во-вторых, довольно низкие значения их уровней. Так, показатели концентрации изученных клеток варьировали от 0,01 до 1,15%, то есть могли отличаться в 100 и более раз.

На следующем этапе работы была проведена апробация разработанной модификации TRAP при исследовании образцов периферической крови людей 18 -20 лет, отобранных до и спустя 1 месяц после прививки вакцинным штаммом для ЖГВ (рис. 5). Контрольной группой служили лица, получившие препарат плацебо.

Выбор интервала между двумя отборами проб крови (1 месяц) был сделан по следующим причинам:

- во-первых, он гарантировал тестирование во второй пробе именно клеток памяти, поскольку у людей элиминация вакцинного вируса после прививки отечественной ЖГВ происходит не позднее 7 дня с момента введения препарата [Александрова Г.И., Климов А.И., 1994], что

Рисунок 4. Схематическое отображение этапов постановки TRAP. МПК - мононукпеары периферической кро: АПК - клетки-мишени - антигеи-презентирующие клетки; CFSE - внутриклеточный флюорохром; ПЦФ - пр( Знаками (+) и (-) обозначены соответственно мишени, стимулированные или нестимулированные вирусом.

17

сопровождается быстрой апоптотической выбраковкой эффекторных клеток [ЬепапЬ МЛ., 1997]; — во-вторых, отбор второй пробы крови в более отдаленные сроки мог привести к тому, что он совпал бы с эпидемией, когда трудно отдифференцировать причину индукции клеток памяти - собственно вакцинация или гриппозная инфекция. В нашем случае вторая проба отбиралась в предэпидемический сезон.

До- и поствакцинальные средние уровни специфических к вакцинному вирусу риппа А(НШ1) клеток памяти (общий пул В- и Т-лимфоцитов и СБ4+ Т-шмфоцитов) определяли у добровольцев, давших (РТГА+) и не давших (РТГА-) юстоверный прирост титров сывороточных антител в РТГА. Предвакцинальные ровни изученных субпопуляций лимфоцитов в группе РТГА-положительных гюдей оказались в 7,0 и 12,1 раза ниже по сравнению с РТГА-отрицательными р<0,001). После введения ЖГВ средние уровни пула Т- и В-клеток и СБ4+-шмфоцитов увеличились у первых в 19,2 и 25,6 раза соответственно (р<0,001), а у ¡торых, только в 2,2 и 1,4 раза (р<0,01 и р<0,05). В контрольной группе тблюдалось снижение показателей.

РТГА (+)

РТГА (-)

Плацебо

%

0,7 0.6 -0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 -О

CD4+ Т-лимфоциты памяти

0,358

0,236

РТГА (+)

РТГА (-)

Плацебо

'исунок 5. Средний арифметический показатель доли (%) специфических к вирусу гриппа A(H1N1) жмфоцитов памяти в периферической крови вакцинированных ЖГВ людей 18 — 20 лет (по данным TRAP). По

>си абсцисс: РТГА(+) и РТГА(-) - лица соответственно давшие (п=10) и не давшие (п=10) достоверный прирост итров сывороточных антител в РТГА после прививки. Контрольная группа - лпацебо (п=10). По оси ординат - % шределяемых клеток от числа соответственно всех лимфоцитов или CD4+ лимфоцитов. - средние уровни клеток [О вакцинации; g] - средние уровни клеток через месяц после вакцинации.

Эти данные свидетельствуют о влиянии исходных фоновых уровне! вирусоспецифических клеток памяти как на кратноность их возрастания, так и нг гуморальный иммунный ответ в РТГА после прививки. Кроме того, у привиты^ добровольцев была обнаружена обратная зависимость между исходными уровням* перед вакцинацией пула Т- и В-лимфоцитов памяти и СВ4+-лимфоцитов памяти, одной стороны, и накоплением этих клеток, с другой. Коэффициенты корреляцш между данными признаками колебались от -0,54 до -0,84 при р<0,05 и <0,01.

У сравнительно небольшой части волонтеров (20 и 30%) было отмеченс увеличение уровня клеток памяти после введения препарата плацебо. Как и в случае с общими СВ45ШЭ+-лимфоцитами памяти, возник вопрос о критерии достоверности полученных результатов. Рисунок 6 содержит сведения по этому вопросу.

CD4+ Т-лимфоциты памяти

РТГА Ж

РТГА С-1

Плацебо

Пул Т-, В- лимфоцитов памяти

1

Плацебо

1

1

Рисунок 6. Индивидуальные показатели кратности изменения уровней специфических к вирусу гриппа A(H1N1) лимфоцитов памяти у людей 18 - 20 лет после иммунизации ЖГВ (по данным TRAP). РТГА(+) и РТГА(—) - лица соответственно давшие и не давшие достоверный прирост титров циркулирующих антител в РТГА после прививки. По оси ординат - кратность изменения уровней клеток. Кратность изменения - частное от делени^ поствакцинального уровня (%) на предвакцинальный. По оси абсцисс - столбики, отражающие индивидуальны: данные по каждому волонтеру. Пунктирной линией обозначены границы достоверности кратности изменения уровней клеток.

В группе людей, получивших препарат плацебо, не было зафиксировано ни одного случая с десятикратным и более возрастанием уровня вирусспецифических СВ4+-лимфоцитов. В той же контрольной группе в отношении пула

вирусспецифических Т- и В-лимфоцитов данный показатель не превышал пятикратное увеличение. Эти результаты позволили определить границу ¡достоверности в отношении кратности поствакцинального увеличения клеток (памяти в периферической крови людей: для пула Т- и В-лимфоцитов - в 5 и более раз, для СБ4+-лимфоцитов памяти - в 10 и более раз.

По этим критериям среди РТГА-положительных людей доля лиц, давших достоверные увеличения пула Т- и В-лимфоцитов памяти и С04+-лимфоцитов памяти, составила соответственно 80 и 70%, среди РТГА-отрицательных -соответственно 60 и 40% (рис. 7).

% 90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

Рисунок 7. Показатели достоверного увеличения уровней специфических к вирусу гриппа A (H1N1) лимфоцитов памяти в периферической крови людей 18 - 20 лет после вакцинации ЖГВ. По оси абсцисс: фенотипы лимфоцитов. По оси ординат - процент лиц с достоверным увеличением уровней клеток памяти после вакцинации. лица, с достоверными приростами титров сывороточных антител в РТГА после вакцинации (п = 10); И -- лица, не давшие такого прироста (п = 10); Щ - лица, получившие препарат плацебо (п = 10).

Таким образом, поствакцинальный иммунный ответ, опосредованный достоверным накоплением в периферической крови волонтеров изученных вирусспецифических клеток памяти, наблюдался не только у лиц с системным гуморальным иммунным ответом на прививку, но и у людей без этого ответа. У последних увеличение уровней таких клеток была менее выражена (р<0,05).

На заключительном этапе были проведены экспериментальные исследования, касающиеся индукции у мышей специфических к вирусу гриппа A (H1N1) клеток памяти на локальном уровне - в HAJIT мышей (рис. 8). Ранее подобные исследования не проводились.

Сравнивали в TRAP уровни CD8+CD44hi Т-лимфоцитов памяти в НАЛТ спустя 7 и 60 дней после воспроизведения экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации. Выбор НАЛТ связан с тем, что этот лимфоидный орган наиболее часто используется для изучения локального иммунитета в экспериментах на грызунах.

Полученные результаты свидетельствуют, во-первых, об отсутствии существенных отличий в индукции CD8+ Т-лимфоцитов памяти в НАЛТ при гриппозной инфекции и интраназальной вакцинации живым аттенуированным реассортантным вирусом - экспериментальным аналогом вакцинного штамма для ЖГВ, во-вторых, о явном преимуществе в стимуляции этих длительно живущих Т-

80

70

ео

40

.... .... у'^Ш . '

пул Т-, В- лимфоцитов памяти CD4+ Т-лимфоциты памяти

клеток живым вирусом инактивированного штамма.

по

сравнению с парентеральным введение!

% 18 16 14 12 10 8 6 4 2

A/PR/8/34 (HI N1) (гриппозная инфекция)

Sfli

_______________

Аттенуированный

реассортант A/47/PR/8/34 (H1N1) (вакцинация ЖГВ)

-ОЖ-

I I

Инактивированный A/47/PR/8/34 (H1N1) (вакцинация ИГВ)

<Ш

JEaSIL

Контроль (интактныс мыши)

Рисунок 8. Уровень (%) вирусспецифических CD8+CD441" Т-лимфоцитов памяти в НАЛТ мышей поел гриппозной инфекции и вакцинации (по данным TRAP). По оси абсцисс - введенные вирусы. По оси ординат процент вирусспецифических CD8+CD44l" Т-лимфоцитов на 60 день после введения вирусов (клетю иммунологической памяти).

Таким образом, по данным, полученным при использовании разработанное модификации TRAP, после прививки живыми реассортантными вирусами гриппа А наблюдалось значительное увеличение уровней вирусспецифических клетот иммунологической памяти как на системном (периферическая кровь людей), так i на органном (НАЛТ мышей) уровнях.

ВЫВОДЫ

1. Однократная вакцинация ЖГВ лиц 18-20 лет вызывает стимуляцию:

- B-клеточной иммунологической памяти в верхнем отделе респираторного тракта в виде повышения продукции В-лимфоцитами высокоавидных локальных IgA-антител;

- Т-клеточной иммунологической памяти в виде увеличения в периферической крови уровня общих лимфоцитов памяти фенотипов CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+, а также специфических к вирусу гриппа С04+-лимфоцитов памяти.

2. Лица 18-20 лет могут значительно различаться по показателям предвакцинального состояния В- и Т-клеточной иммунологической памяти к вакцинному штамму вируса гриппа А: по авидитету локальных IgA-антител и по количеству циркулирующих вирусспецифических CD4+ Т-лимфоцитов памяти.

3. Предвакцинальные значения показателей авидности локальных IgA-антител и уровней циркулирующих вирусоспецифических CD4+-лимфоцитов влияют на интенсивность их поствакцинального изменения (обратная корреляционная зависимость).

4. Часть вакцинированных ЖГВ отвечают достоверным увеличением в периферической крови уровня изученных субпопуляций Т-клеток памяти без наличия зафиксированного в РТГА системного гуморального иммунного ответа. Доля таких лиц составляет 40 — 60%.

5. Вакцинация мышей живым реассортантным вирусом гриппа А (H1N1) не уступает гриппозной инфекции, вызванной патогенным вирусом гриппа А того же сероподтипа, в активности стиуляции CD8+CD44h' Т-лимфоцитов памяти во входных воротах инфекции - назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ). Вакцинация инактивированным вирусом гриппа А (H1N1) практически не индуцирует эти клетки в НАЛТ. Специфичные к вирусу гриппа А (H1N1) CD8+CD44hl Т-лимфоциты сохраняются после вакцинации не менее двух месяцев - срок наблюдения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Найхин А.Н., Кореньков Д.А., Петухова Г.Д., Чиркова Т.В., Григорьева Е.П., Руденко Л.Г. Оценка Т-кпеточной иммунологической памяти по экспрессии молекул CD45 у людей, привитых живой реассортантной гриппозной вакциной // «Медицинская иммунология». - 2008. - Т.10. - №6. - с. 535 -542.

2. Донина С.А., Кореньков Д.А., Руденко Л.Г., Найхин А.Н. Оценка авидности локальных IgA-антител у людей, привитых живой гриппозной вакциной // «Медицинская иммунология». - 2008. - Т. 10. - № 4 - 5. - с. 423 - 430.

3. Petukhova G, Chirkova T., Donina S., Korenkov D., Naykhin A., Rudenko L. Comparative studies of local antibody and cellular immune responses to influenza infection and vaccination with live attenuated reassortant influenza vaccine (LAIV) utilizing a mouse nasal-associated lymphoid tissue (NALT) separation method // Vaccine. -2009, -vol.27:2580-2587.

Тезисы:

1. Кореньков Д.А., Петухова Г.Д., РекстинА.Р., Найхин А.Н. Оценка поствакцинального иммунного ответа к вирусам гриппа по индукции Т-клеточной иммунологичесой памяти // «Медицинская иммунология». - 2006. -Т.8. - № 2 - 3. - с. 272 - 273.

2. Donina S.A., Korenkov D.A., Chirkova T.V., Naykhin A.N., Rudenko L.G. Local antibody immune response to live attenuated reassortant influenza vaccine: generation of secretory IgA and their avidity // The Third European Influenza Conference, Vilamoura, Portugal, September 14 - 17, 2008, Programme and Abstract Book, P. 227

3. Донина C.A., Кореньков Д.А., Чиркова T.B., Петухова Г.Д., Найхин А.Н., Руденко Л.Г. Авидность секреторных IgA-антител у людей после иммунизации живой гриппозной вакциной // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2. - № 2-3. - С. 336

4. Кореньков Д.А., Чиркова Т.В., Петухова Г.Д., Найхин А.Н. Применение метода выявления трогоцитоза для оценки формирования Т-клеточной иммунологической памяти у людей после вакцинации живой гриппозной вакциной // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2. - № 2-3. -С. 337

5. Кореньков Д.А., Петухова Г.Д., Чиркова Т.В. Апробация метода выявления трогоцитоза для определения вирус-реактивных Т-лимфоцитов // Цитология. -2008. - Т. 50. - №9. _ с. 810-811

6. Кореньков Д.А., Чиркова Т.В., Найхин А.Н. Оценка формирования иммунологической памяти у людей при иммунизации живой гриппозной вакциной // Аллергология и иммунология. - 2009. Т.10. - № 2. - С. 299-300

Актуальность проблемы. Грипп, наряду с вирусными гепатитами и ВИЧ-инфекцией, является одной из главных вирусологических проблем. Мировой научной общественностью уделяется огромное внимание разработке методов предотвращения именно этих заболеваний. В настоящее время к самым эффективным способам борьбы с гриппом относят вакцинопрофилактику [66].

Качество противогриппозных вакцин, как и других вакцинных препаратов, оценивают по трем главным критериям: эпидемиологическая эффективность, безвредность и иммуногенность. До сих пор4 об иммуногенности гриппозных вакцин судят только по их способности стимулировать продукцию сывороточных антигемагглютинирующих антител. В последнее время развернута дискуссия о достаточности такой оценки [114].

Принцип вакцинации основан на создании у людей иммунологической памяти к возбудителю инфекции. За счет вакцинации организм при последующей встрече с патогеном отвечает ускоренной и усиленной мобилизацией факторов иммунной защиты. Поэтому совершенно логично, что главная задача вакцинальной иммунологии должна быть связана именно с оценкой препаратов по индукции иммунологической памяти [6, 72, 164]. В последние годы это направление активно развивается за рубежом [62, 72, 95, 140, 156]. В России подобные исследования не проводились.

Настоящая работа является первой попыткой комплексной оценки эффективности вакцинации людей по стимуляции В- и Т-клеточной памяти живыми реассортантными вакцинными штаммами, входящими в состав отечественной живой гриппозной вакцины (ЖГВ).

Цель исследования: изучить способность ЖГВ стимулировать В- и Т-клеточную иммунологическую память.

Задачи исследования:

1. Разработать методические приемы оценки иммунологической памяти у людей.

2. На материале обследования добровольцев 18 - 20 лет, привитых ЖГВ и не прививавшихся этой вакциной, а также в экспериментальном исследовании in vivo изучить:

- локальную В-клеточную память по критерию авидитета секреторных IgA-антител к вирусам гриппа;

- Т-клеточную память по выявлению общих циркулирующих лимфоцитов с мембранными маркерами CD45RO"1";

- Т-клеточную иммунологическую память по определению уровней вирусспецифических циркулирующих лимфоцитов.

Научная новизна работы.

1. Впервые осуществлено исследование у людей В-клеточной иммунологической памяти к вирусам гриппа А и В по критерию авидитета локальных IgA-антител, включающее оценку количественных характеристик скорости, интенсивности и прочности образования иммунных комплексов. Показано, что иммунизация ЖГВ повышает эти показатели, т.е. увеличивает продукцию высокоавидных антител в верхнем отделе респираторного тракта.

2. Впервые проведена оценка ЖГВ по индукции у людей общих циркулирующих Т-лимфоцитов иммунологической памяти фенотипов CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+. Установлено, что введение ЖГВ вызывает увеличение уровня этих клеток в периферической крови.

3. Разработана модификация метода TRAP (T-cell recognition of antigen presenting cells by protein capture) для количественного определения у людей и животных специфических к вирусу гриппа А Т-клеток иммунологической памяти. С помощью данной методики показано, что вакцинация ЖГВ индуцирует продукцию этих клеток, отраженную в поствакцинальном увеличении их уровня в периферической крови.

4. Впервые осуществлено сравнение активности индукции на локальном уровне (назоассоциированная лимфоидная ткань мышей) вирусспецифических Т-клеток памяти при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации животных живым реассортантным вирусом гриппа. Отмечено, что как при инфекции, так и при вакцинации происходит увеличение уровней вирусоспецифических CD8+CD44hl Т-лимфоцитов памяти в этой лимфоидной ткани.

Практическая значимость работы.

1. Разработан метод количественного измерения в иммуноферментном анализе авидности IgA-антител1 к вирусам гриппа А и В в секретах верхних дыхательных путей. Метод дает возможность характеризовать эти иммуноглобулины одновременно по трем параметрам: (i) титры антител; авидность антител с точки зрения (и) скорости и интенсивности соединения с антигеном, (iii) прочности соединения с антигеном.

2. Разработана модификация ТЯАР'для количественного выявления у людей циркулирующих в крови Т-клеток, специфических к вирусу гриппа А.

3. Эти методы могут быть использованы для оценки индукции В- и Т-клеточной иммунологической памяти у людей, привитых различными гриппозными вакцинами.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Однократная прививка ЖГВ взрослых лиц, уже контактировавших ранее с возбудителями гриппа, вызывает стимуляцию В- и Т-клеточной иммунологической памяти.

2. Даже люди практически одного возраста (18-20 лет) весьма гетерогенны по показателям предвакцинального состояния иммунологической памяти к вакцинному штамму вируса гриппа А, входящему в состав ЖГВ.

3. Обнаружена обратная зависимость между предвакцинальными значениями изученных параметров В- и Т-клеточной иммунологической памяти и их поствакцинальными изменениями.

4. Имеются значительные расхождения между данными оценки иммунологических свойств ЖГВ по конверсии титров сывороточных антител в реакции торможения гемагглютинации, с одной стороны, и по тестированию поствакцинальных изменений уровней вирусспецифических Т-клеток памяти, с другой.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на X Всероссийском Научном Форуме с международным участием им. акад. В.И. Йоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 29 мая - 1 июня 2006 г.); Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 30 июня — 5 июля 2008 г.); The Third European Influenza Conference (Vilamoura, Portugal, September 14 - 17, 2008); Школе-Конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 6 -10 октября 2008 г.).

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отделов иммунологии и вирусологи НИИЭМ СЗО РАМН «9» апреля 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемых литературных источников. Работа изложена на 135 страницах текста, включающего 20 таблиц и 15 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 175 источников, в том числе 20 отечественных и 155 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. Однократная вакцинация ЖГВ лиц 18-20 лет вызывает стимуляцию:

- В-клеточной иммунологической памяти в верхнем отделе респираторного тракта в виде повышения продукции В-лимфоцитами высокоавидных локальных IgA-антител;

Т-клеточной иммунологической памяти в виде увеличения в периферической крови уровня общих лимфоцитов памяти фенотипов CD4 CD45RO и CD8 CD45RO , а также специфических к вирусу гриппа СБ4+-лимфоцитов памяти.

2. Лица 18-20 лет могут значительно различаться по показателям предвакцинального состояния В- и Т-клеточной иммунологической памяти к вакцинному штамму вируса гриппа А: по авидитету локальных IgA-антител и по количеству циркулирующих вирусспецифических CD4+ Т-лимфоцитов памяти.

3. Предвакцинальные значения показателей авидности локальных IgA-антител и уровней циркулирующих вирусоспецифических CD4+-лимфоцитов< влияют на интенсивность их поствакцинального изменения (обратная корреляционная зависимость).

4. Часть вакцинированных ЖГВ отвечают достоверным увеличением в периферической крови уровня изученных субпопуляций Т-клеток памяти без наличия зафиксированного в РТГА системного гуморального иммунного ответа. Доля таких лиц составляет 40 - 60%.

5. Вакцинация мышей живым реассортантным вирусом гриппа A (H1N1) не уступает гриппозной инфекции, вызванной патогенным вирусом гриппа А того же сероподтипа, в активности стиуляции CD8+CD44hl Т-лимфоцитов памяти во входных воротах инфекции — назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ). Вакцинация инактивированным вирусом гриппа A (H1N1) практически не индуцирует эти клетки в НАЛТ. Специфичные к вирусу гриппа A (H1N1) CD8+CD44hl Т-лимфоциты сохраняются после вакцинации не менее двух месяцев — срок наблюдения. 1

Заключение

В настоящей главе приведены приоритетные данные о формировании у людей и животных Т-клеточной иммунологической памяти к вирусу гриппа A (H1N1). Разработана модификация TRAP, пригодная для исследования периферической крови людей. На базе этой модификации оценены количественные показатели концентрации двух популяций вирусспецифических клеток иммунологической памяти (пула Т- и В-лимфоцитов памяти и CD4+ Т-клеток памяти) у условно здоровых людей 18-20 лет, ранее не прививавшихся ЖГВ. Отмечен весьма низкий уровень обеих субпопуляций клеток в периферической крови и широкий размах индивидуальных показателей. Изучена поствакцинальная индукция этих клеток у лиц того же возраста, привитых вакцинным штаммом для ЖГВ. Предложены критерии достоверности полученных в TRAP результатов. Показано, что однократная прививка ЖГВ активно стимулирует у людей накопление в периферической крови специфических к вирусу гриппа A(H1N1) клеток памяти (пула Т-и В-лимфоцитов и CD4+ Т-клеток). Отмечено наличие такого ответа как у лиц, с фиксированным в РТГА накоплением сывороточных антител, так и у людей без такого ответа на прививку. У последних интенсивность прироста изучаемых популяций клеток памяти была менее выражена. Установлено существование обратной зависимости между исходными уровнями изучаемых клеток памяти перед прививкой с одной стороны, интенсивностью их поствакцинального накопления, а также выраженностью системного гуморального иммунного ответа на прививку, с другой. Проведено изучение у мышей индукции CD8+CD44hl-KneTOK памяти при экспериментальной гриппозной инфекции и экспериментальной вакцинации ЖГВ и ИГВ. И инфекция, и вакцинация ЖГВ вызывала активный рост числа этих клеток памяти на локальном уровне - в HAJ1T мышей. При этом высокая концентрация этих клеток (11 — 16%) сохранялась в НАЛТ до шестидесятого дня (срок наблюдения). Экспериментальная вакцинация ИГВ практически не индуцировала изученную субпопуляцию клеток иммунологической памяти в НАЛТ.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение иммунологической памяти должно являться одним из главных направлений развития вакцинальной иммунологии [6, 15, 72, 164]. В последние годы это направление активно развивается за рубежом. В России такие исследования не проводились.

Настоящая работа — первая в мировой практике попытка получения комплексной информации о формировании В- и Т-клеточной иммунологической памяти у людей, привитых отечественной ЖГВ.

Если рассматривать выполненное диссертационное исследование в целом, то оно посвящено поиску ответов.на два главных вопроса:

1«. Какие методы, являются приемлемыми с точки зрения простоты и доступности для количественного измерения у людей В- и Т-клеточной иммунологической памяти к вирусам гриппа? 2. Изменяются1 ли количественные характеристики иммунологической памяти после иммунизации ЖГВ*>у контактировавших ранее с вирусом гриппа взрослых людей, w если да, то каковьь количественные характеристики этого процесса, и как это сочетается с результатами общепринятого метода оценки иммуногенности гриппозных вакцин -определением титров антител в РТГА?

Первый раздел (3:1) посвящен оценке у людей 18 - 20 лет локальной В-клеточной иммунологической памяти к вирусам гриппа А и. В по критерию авидитета локальных (мукозальных) IgA-антител. В целом вопрос о формировании иммунологической памяти во входных воротах инфекции носит дискуссионный характер [20, 140, 156]. Это относится и к локальным В-клеткам' памяти. Существует несколько методов оценки В-клеточной памяти: (i) по количественному определению в ELISPOT плазматических клеток, секретирующих антитела различных изотипов; (ii) по выявляемому в проточной цитометрии уровню В-клеток, несущих мембранные маркеры памяти CD27, CD38, IgD-, Bcl-2; (iii) по повышению авидности продуцируемых антител при повторных контактах организма с возбудителем. Нами был выбран последний метод, поскольку, во-первых, он более прост, во-вторых, отражает функциональное состояние В-клеточной памяти, в-третьих, не требует выделения клеток, что представляет определенную трудность в отношении сепарации у людей локальных В-лимфоцитов. Кроме того, сведения об авидитете локальных антител в литературе отсутствовали.

Нами использованы два метода количественной оценки в ИФА авидности локальных антител к вирусам гриппа А и В, ранее применявшиеся только для изучения авидитета сывороточных иммуноглобулинов -динамический тест и тест с мочевиной [9, 127, 151]. Эти тесты неравнозначны по своей* сути, поскольку первый измеряет авидитет с позиции скорости реагирования антитела с антигеном' (время достижения максимального титра)1 и интенсивности иммунной реакции (частное от деления максимального титра на минимальный), тогда как второй оценивает авидитет с точки зрения прочности соединения антигена с антителом на основании количественных данных о разрыве слабоавидных связей под действием^ мочевины.

На первом этапе (подраздел» 3.1.1) был отработан ряд необходимых параметров; которые позволили адаптировать методы для количественного тестирования авидности локальных антител в СВДП.

Ранее установлено существование хорошо выраженной прямой зависимости величиньктитров сывороточных антител от времени их контакта с антигенами вирусов» гриппа [11]. Аналогичная зависимость обнаружена нами в тех же временных интервалах и в отношении секреторных IgA-антител (табл. 2). Эти данные явились основой для разработки динамического теста определения авидности секреторных антител. Анализ материалов, представленных в таблице 5, свидетельствовал о достаточности применения для расчета ИА этих антител результатов измерения их титров в диапазоне временного контакта с антигеном в пределах 0,25 - 1,0 часа.

У обследованных лиц наблюдались два типа динамических изменений концентрации IgA-антител в СВДП (табл. 3): первый (наиболее часто встречающийся, 71-85% случаев) — титры антител возрастали по мере увеличения времени контакта антител с антигеном, второй - титры антител не изменялись в пределах исследуемых временных интервалов (плато). По-видимому, выход на плато уже через 15 минут контакта реагентов свидетельствует об очень высокой авидности локальных иммуноглобулинов, но приь одном условии — если их концентрации достаточно высокие. При очень низких (титры не более 1:16) или неопределяемых титрах (менее 1:8) концентрациях плато не могло рассматриваться как полноценное отражение авидитета. Поэтому для*, таких случаев в использовавшейся» формуле была введена корректировка для расчета авидности данных иммуноглобулинов (см. раздел «Материалы-и методы»).

Как в динамическом тесте, так и в тесте с мочевиной мы наблюдали довольно широкий диапазон разброса индивидуальных значений ИА локальных антител у непривитых волонтеров (рис. 1). Эти данные позволили произвести группировку величин ИА по низким, средним и высоким значениям: В целом прослеживалось наличие прямой зависимости между авидитетом IgA-антител и величиной'их титров (табл. 6). Данный феномен, по-видимому, объясняется преобладанием у людей с высокими титрами IgA-антител высокоавидных иммуноглобулинов этого класса (недавний контакт с вирусом), тогда как по мере отдаленности такого контакта (низкие титры антител) доля высокоавидных антител должна снижаться.

Может возникнуть вопрос, необходимо ли вообще измерения авидитета антител, если их титры отражают эту качественную характеристику? Оказалось, что далеко не у всех людей авидность секреторных IgA-антител совпадает с их концентрациями (титры) в СВДП1 (табл. 6). У части лиц (30 - 50%) обнаруживались высокие титры слабоавидных секреторных антител, и, наоборот, низкие титры высокоавидных антител (до 15% случаев). Близкие по значению результаты получены при сопоставлении величин титров и ИА сывороточных противогриппозных антител, выявленных в динамическом тесте [4].

Обнаруженные довольно существенные расхождения в этих двух характеристиках локальных IgA-антител (титры и ИА), на наш взгляд свидетельствуют о том, что данные характеристики отражают различные параметры гуморального иммунного ответа у людей и могут быть использованы совместно для получения более полной информации об иммунногенных свойствах вакцинных препаратов.

В итоге; изучение ряда технических условий постановки двух тестов показало их хорошую воспроизводимость-для-решения поставленной задачи- количественного измерения, авидности локальных IgA к вирусам гриппа А и В.

Второй; этап (подраздел 3:1.2) был посвящен оценке способности вакцинных штаммов^ для ЖГВ индуцировать локальную В-клеточную память, опосредованную авидитетом локальных IgA-антител к вирусам гриппа А и В.

Данные, представленные на рисунках 2 и 3, на наш взгляд, убедительно демонстрируют феномен обновления' локальной гуморальной иммунологической памяти под влиянием вакцинации, поскольку подавляющее большинство случаев достоверного повышения авидности секреторных IgA-антител фиксировалось в группе привитых, ответивших повышением их титров. Однако, обращает на себя внимание и» то, что по данным теста с мочевиной, у некоторых лиц в»группе привитых, не давших приросты титров этих антител к вирусу гриппа А и В, авидитет антител увеличился. Это свидетельствует в пользу существования' на первый взгляд парадоксального феномена - повышение авидности» антител без значительного увеличения их количества. Но такой же феномен был отмечен при сравнении авидности и титров сывороточных антител у больных гриппом людей и лиц, иммунизированных гриппозными вакцинами, в том числе и ЖГВ [4]. Чем же это можно объяснить?

Точно ответить на этот вопрос невозможно, поскольку объем знаний о тонких молекулярных механизмах иммунологических переключений, вызывающих продукцию высокоавидных антител после антигенного стимула, пока ещё недостаточен. Нельзя исключить, что у части людей возникает ситуация, когда происходит увеличение выработки высокоавидных антител на фоне незначительного повышения их концентрации, не обнаруживаемой в использовавшейся, измерительной системе — титры в ИФА или РТГА. Другими словами, возможно, есть люди, которые активно реагируют на встречу с возбудителем повышением авидности- антител без существенного увеличения* их продукции, которую можно фиксировать при «шаговом» разведении исследуемого материала в 2 или 10 раз.

При измерении индивидуальной авидности- антител у конкретного вакцинируемого человека важно зафиксировать не только изменения данного показателя под влиянием вакцинации, но и установить величины достоверности такого изменения, так как нельзя исключить, что в каких-то пределах значения ИА антител могут быть подвержены не связанным с вакцинацией неспецифическим колебаниям в промежуток между отбором проб СВДП.

Мы попытались установить подобные величины для обоих тестов (табл. 8 и 9). При выработке данных критериев опирались на наиболее надежный биологический принцип достоверности — отсутствие увеличения измеряемого признака в контрольной группе, получавшей препарат плацебо. В результате такие критерии достоверности были выработаны для обоих тестов.

Ранее отмечено существование' обратной зависимости между исходными показателями авидитета,циркулирующих сывороточных антител перед противогриппозной вакцинацией и выраженностью последующих изменений этого показателя в поствакцинальный период [4, 11]. Точно такую же зависимость мы наблюдали и в отношении авидности локальных IgA (табл. 10).

Как нам представляется, это очень важные сведения с позиции успешности противогриппозной иммунизации ЖГВ, а именно: во-первых, выраженность повышения авидности локальных IgA ограничена предвакцинальными показателями, во-вторых, прививаемость вакцинных штаммов в верхнем отделе дыхательного тракта может быть снижена у лиц с высокими показателями авидности антител даже при низких концентрациях. К сожалению, в настоящее время противогриппозная вакцинация осуществляется без учета особенностей иммунного статуса индивидуума. По-видимому, индивидуализация прививок (в последнее время активно развиваемая зарубежом) должна опираться, в первую очередь, на результаты-оценки предвакцинального состояния локальной В- и Т-клеточной памяти.

Таким образом, проведенные исследования (раздел 3.1) с теоретических позиций показали способность ЖГВ повышать у взрослых людей авидитет локальных IgA-антител к вирусам гриппа А и В, а с точки зрения практики - разработать простые и доступные методы измерения авидности этих антител.

Второй раздел работы (3.2) был посвящен оценке у людей 18 - 20 лет Т-клеточной иммунологической памяти к вирусу гриппа А. На примере вакцинации ЖГВ мы попытались получить ответ на главный вопрос теоретического характера: происходит ли при интраназальном. введении взрослым людям аттенуированных реассортантных вирусов гриппа активация периферических CD45RO+ Т-лимфоцитов памяти и если да, то какова количественная характеристика этого процесса? Практический аспект работы лежал в плоскости поиска сравнительно простого метода оценки поствакцинальных изменений Т-клеточной иммунологической памяти.

Первая часть раздела (подраздел 3.2.1) касалась количественного измерения в периферической крови людей уровней CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, несущих мембранный маркер иммунологической памяти

CD45RO и маркер наивных лимфоцитов CD45RA. При этом мы не вычленяли среди пула этих клеток лимфоциты с двойной меткой CD45RO+CD45RA+, поскольку их доля весьма незначительна [110].

Обследование невакцинированных людей показало наличие значительных колебаний индивидуальных уровней этих клеток (табл. 12). В количественном отношении CD4+CD45RO+-лимфoциты преобладали над CD8+CD45RO+-лимфoцитaми. Число наивных лимфоцитов тех же фенотипов существенно не отличалось (рис. 6). В пуле измеряемых клеток доля наивных лимфоцитов- была в 2 раза выше по сравнению с лимфоцитами памяти CD45RO+. В целом, полученные нами; результаты близки к данным I исследования тех же клеток американскими авторами [110].

Далее мы проследили изменения в периферической крови людей 18 -20 лет уровней перечисленных выше субпопуляций лимфоцитов после вакцинацииОКГВ.

Использование усредненных показателей увеличения уровня клеток памяти в поствакцинальный- период оказалось не очень убедительно, поскольку величины таких приростов были весьма' скромными (табл. 13). Такие же результаты получили американские исследователи при использовании аналогичного подхода к оценке способности ИГВ стимулировать у людей CD45RO+ Т-клетки памяти [110]. Всё это в совокупности побудило нас прибегнуть к другому методу анализа - по кратности' изменения уровней изучаемых субпопуляций клеток в поствакцинальный период.

Кратность прироста и доля лиц с увеличением уровня клеток памяти оказались самыми высокими, у волонтеров с гуморальным ответом в РТГА на вакцинацию>и существенно меньше.у вакцинированных добровольцев без такового ответа (табл. 14). Самые низкие значения отмечены у людей из контрольной группы. Обращает на себя внимание тот факт, что у части лиц наблюдалось снижение уровня изученных субпопуляций CD45RO+-лимфoцитoв, произошедшее в период между отбором образцов крови. При этом в контрольной группе волонтеров частота таких снижений была намного выше, чем в группе иммунизированных.

Рассмотрение индивидуальных показателей кратности поствакцинального прироста уровней клеток памяти у каждого отдельного добровольца, в сравнении с аналогичными показателями у лиц контрольной группы, позволило установить границы достоверности получаемых результатов - увеличение уровня клеток в 1,5 и более раз (рис. 4). Доля этих лиц среди привитых РТГА-положительных волонтеров-составила 36 - 57%, среди привитых РТГА-отрицательных - от 11 до 22%, тогда как у людей из контрольной группы не наблюдалось ни одного такого случая.

Таким образом, анализ кратности изменения у волонтеров, уровней CD45RO+, CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+ Т-лимфоцитов в периферической крови в поствакцинальный период показал активное влияние прививки на изменение состояния иммунологической памяти: (i) достоверный прирост количества перечисленных клеток не только у РТГА-положительных лиц, но и у добровольцев, не давших конверсий антител в РТГА на прививку; (ii) менее выраженную кратность снижения- уровней этих клеток у вакцинированных лиц ш> сравнению с лицами, получавшими препарат плацебо.

Данные, приведенные в таблице 15, могут служить доказательством очены высокой сочетаемости результатов> оценки иммунологической памяти по трем изученным маркерам (CD45RO+, CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+). Это свидетельствует, что, в принципе, факт поствакцинальной активации Т-клеточной иммунологической, памяти можно фиксировать, используя любую из этих трех меток.

Мы обнаружили достоверное поствакцинальное увеличение у волонтеров не только Т-клеточной иммунологической- памяти, но и наивных CD4+CD45RA+- и СВ8+СБ45ЫА+-лимфоцитов (рис. 7). При парентеральной иммунизации ИГВ такого феномена не наблюдалось [110]. Вполне возможно, что индукция этих клеток является особенностью мукозальной вакцинации

ЖГВ. С другой стороны, недавно обнаружена реэкспрессия молекул CD45RA на активированных Т-клетках памяти при инфекциях людей,, вызванных вирусом Эпштейна-Барр [53] и цитомегаловирусом [167]. Такие клетки были устойчивы, к апоптозу. На основании этих данных авторы отнесли их к особому фенотипу клеток памяти. Не исключено, что после вакцинации отчасти мы.фиксировали прирост именно этих клеток.

Нами показано существование обратной зависимости между исходными уровнями клеток памяти перед вакцинацией и выраженностью поствакцинальных изменений доли этих клеток (табл. 16). Аналогичную зависимость наблюдали1 другие авторы, изучавшие у людей влияние вакцинации американским вариантом ЖГВ - на- индукцию специфических клеток памяти [76, 78].

И наконец, вполне резонен вопрос, что собой представляют определяемые нами CD45RO+ клетки памяти и почему наблюдается рост их уровня после вакцинации? Конечно, в пуле этих клеток присутствуют специфические к вирусам гриппа Т-лимфоциты памяти, но доля> их очень низка (см. данные раздела- 3.3). Основную массу представляют клетки памяти, образовавшиеся при контакте с другими антигенами. В последние годы накопились данные, свидетельствующие о поликлональной активации таких клеток памяти гетерологичными антигенами даже вирусной природы [98; 112, 135]. По-видимому, этот феномен является частью наблюдаемой при введении различных вирусов гетерологичной защиты [98, 135]. Стимуляция-клеток памяти к вакцинным штаммам-может носить позитивный характер, поскольку повышает не только гомологичную, но и гетерологичную защиту против других инфекционных агентов. С другой стороньг, практически- ничего не известно о гетерологичной индукции вакцинами Т-клеток- памяти к аллергенам и аутоантигенам. Этот вопрос требует отдельного детального изучения.

Последняя часть работы (раздел 33) была посвящена оценке у людей 18 — 20 лет и животных иммунологической памяти по количественному определению клеток, специфических к вирусу гриппа*А. Как уже упоминалось, главным фактором постинфекционного и поствакцинального адаптивного иммунитета к острым инфекциям является формирование иммунологической памяти в виде специфических к возбудителю Т- и В-клеток [58, 88, 136, 137, 165]. Только в последние годы вопрос об индукции специфических клеток памяти перешел в плоскость практического изучения в-связи с разработкой методик тестирования таких клеток [32, 65, 72, 122, 128].

Существует два подхода к оценке формирования специфической иммунологической памяти в, ответ на введение антигена — определение уровней антигенспецифических клеток, имеющих соответствующий клеткам памяти фенотип, и/или тестирование количества антигенспецифических клеток на отдаленный срок после введения патогена.

До недавнего времени в мировой практике для количественного определения- ex vivo антигенспецифических Т-клеток использовались два метода: тетрамерный и определение внутриклеточной продукции цитокинов.

Тетрамерный метод основан на специфическом* реагировании TCR Т-лимфоцита с мультимерным (чаще всего тетрамерным) комплексом;, представляющим собой молекулу МНС, связанную с конкретным пептидом того» или иного вирусного белка [65, 122]-. Несмотря на высокую-специфичность, метод имеет несколько недостатков, в частности - сложность рекомбинантной технологии получения комплекса МНС-пептид. Кроме того, метод выявляет популяцию Т-клеток, специфичных только к этому пептиду, и не дает полного представления о суммарном Т-клеточном ответе на все антигенные эпитопы.

Второй метод, основан на выявлении^ антигенактивированных Т-лимфоцитов по внутриклеточной продукции-Th-l иЛЪ-2 цитокинов [128]. Он более прост и дешев, по сравнению' с тетрамерной технологией, и используется^ гораздо* шире. Однако цитокиновый метод не является витальным тестом (см. ниже) и требует достаточно длительной стимуляции клеток антигеном для формирования полноценного цитокинового ответа.

На сегодняшний день альтернативой перечисленным двум тестам является TRAP, базирующийся на недавно открытом феномене трогоцитоза — обмена участками клеточных мембран между АПК и Т-лимфоцитом в процессе презентации антигена [27, 86]. Подробное описание TRAP представлено в разделе «Материалы и методы». Выбор нами этого метода связан с тем, что он имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с двумя первыми тестами [27, 47, 86, 129]:

- TRAP более прост, менее дорогостоящ, более быстр (результат можно получить в течение 24 часов);

- В' отличие от тетрамерной, технологии он, не требует специальных знаний о гаплотипе МНС и особенностях презентации антигена.

- Позволяет осуществлять определение активированных Т- и В-клеток в одной пробе;

- в. отличие от метода определения внутриклеточных цитокинов он является витальным тестом, то есть исследуемые клетки можно, не подвергая фиксации, использовать для дальнейших исследований;

- выявляет межклеточные реакции уже на раннем этапе взаимодействия АПК с"лимфоцитом, поскольку трогоцитоз начинается через несколько минут после контакта этих клеток.

Важно, что информация, полученная в TRAP, хорошо коррелирует с результатами тетрамерного и цитокинового методов [129].

Как уже упоминалось, ранее TRAP использовался только в условиях in vitro [129; 131] и совсем недавно - in vivo в эксперименте на мышах [27]. Поэтому первой задачей настоящего' раздела работы являлась адаптация данной методики для; тестирования специфических к вирусу гриппа клеток памяти у людей (подраздел 3.3.1). В сущности, разработанная нами модификация TRAP в значительной мере отличалась от модификации, использовавшейся разработчиками теста (рис. 8, табл. 17).

Испытания нашей модификации TRAP при исследовании образцов периферической- крови невакцинированных добровольцев 18-20 лет показало, во-первых,, наличие значительных колебаний индивидуальных показателей содержания клеток памяти, специфических к вакцинному штамму (как пула Т- и В-клеток, так и CD4+ Т-лимфоцитов), во-вторых, довольно низкие значения» их уровней (рис. 10, 11). Данные значения оказались практически идентичны результатам, полученным американскими авторами в цитокиновом методе [79; 90].

На следующем этапе работы (подраздел 3.3.2) мы провели испытания разработанной модификации TRAP при исследовании периферической крови людей 18— 20^eT до и спустя 1 месяц после прививки вакцинным штаммом. Контрольной-группойхлужили лица, получившие препарат плацебо.

Выбор интервала между двумя отборами проб крови (1 месяц) был сделан последующим причинам:

- во-первых, он гарантировал тестирование во второй пробе именно клеток памяти, поскольку у людей элиминация вируса после прививки отечественной ЖГВ происходит не позднее 7 дня*с момента введения, этого препарата [1];

- во-вторых, отбор второй пробы, крови в более отдаленные сроки мог привести к тому, что он совпал бы с эпидемией^ когда трудно отдифференцировать причину индукции клеток памяти - собственно вакцинация или гриппозная инфекция (в нашем наблюдении вторая проба отбиралась в предэпидемический сезон).

Нами показано, что вакцинация приводила к очень значительному увеличению (в 15 — 40 раз) как пула вирусспецифических Т- и В-клеток памяти, так и уровней вирусспецифических CD4+ клеток памяти (рис. 12). По данным американских авторов [77, 79], при тестировании в цитокиновом методе периферической крови детей 5-9 лет, привитых американским вариантом ЖГВГ и ИГВ, также отмечено хорошо выраженное увеличение CD4+ Т-лимфоцитов после введения ЖГВ (в 10 и более раз). Аналогичный показатель для* ИГВ,оказался значительно скромнее. Авторы сделали вывод о преимуществе ЖГВ перед ИГВ в стимуляции Т-клеток памяти.

Поскольку по нашим данным в контрольной группе людей, получивших препарат плацебо, в отдельных случаях наблюдались приросты (хотя и- незначительные) уровней изучаемых клеток памяти (рис. 13), необходимо было установить границу достоверности получаемых при вакцинации данных TRAP. Такими границами для пула вирусспецифических Т- и В-клеток и для CD4+ клеток^ памяти было выбрано увеличение уровней определяемых клеток после вакцинации соответственно в-5 и более раз и в 10* и более раз (рис. 13 и 14). По мнению [90] аналогичный показатель должен• быть, меньше — прирост в 2. и более раз. Однако этот вывод сделан, на материале обследования- в цитокиновом методе только ■ привитых лиц без введения контрольной группьц что, на наш взгляд, понижает корректность такого вывода.

Нами установлено,, что у 40 - 60% иммунизированных лиц без фиксированного в РТГА накопления сывороточных антител наблюдалось достоверное увеличение уровня вирусспецифических клеток памяти* (рис. 14). Аналогичные повышения имели* место у привитых РТГА-отрицательных лиц в отношении CD45RO-KJieTOK памяти (рис. 5) и у ИФА-отрицательных лиц, в отношении авидности локальных IgA-антител (рис. 2, 3).

Нами показано существование обратной зависимости между исходными (до вакцинации) уровнями' изученных вирусспецифических, клеток памяти, в периферической, крови и интенсивностью (кратностью) их накопления после иммунизации вакцинным штаммом (табл. 20):. Точно такая же зависимость недавно обнаружена американскими авторами, изучавшими в. цитокиновом методе изменения концентраций в периферической.' крови людей специфических к вирусу гриппа. A GD4+ Т-клеток памяти после прививки американской ЖГВ [78]. Авторы заключают, что базовый, уровень этих клеток перед вакцинацией может служить одним из главных биологических маркеров успешности противогриппозной иммунизации на индивидуальном уровне. С этим выводом мы не можем не согласиться.

Обращает на себя внимание другой обнаруженный нами факт. Если сравнивать предвакцинальные уровни вирусспецифических клеток памяти в группах РТГА-положительных и РТГА-отрицательных людей, то их средние значения во второй группе оказались во много раз выше (рис. 12). Это свидетельствует в пользу того, что. предвакцинальные концентрации вирусспецифических клеток памяти влияют не только на интенсивность их увеличения после прививки, но и на выраженность системного гуморального иммунного ответа на введение ЖГВ.

Приведенные выше данные- касались количественного определения клеток иммунологической памяти в. периферической крови людей-, которая является единственным доступным объектом изучения у них клеточного иммунитета. Однако» соответствующие циркулирующие в крови клетки хотя и отражают в целом- состояние вирусспецифической иммунологической памяти-, но не дают представления об этом процессе на органном уровне.

В этой связи на- заключительном этапе работы были проведены экспериментальные исследования, касающиеся t индукции у мышей специфических к вирусу гриппа A(H1N1) клеток памяти на локальном уровне (рис. 15). Сравнивали уровни CD8+CD44hl Т-лимфоцитов в НАЛТ на 60-й день после гриппозной инфекции, и вакцинации (интраназальное введение аттенуированного реассортантного вируса или- парентеральное введение инактивированного). Выбор HAJIT был связан с тем, что этот лимфоидный орган наиболее часто используется, для изучения локального иммунитета в экспериментах на грызунах [157]. Однако исследования локальной* Т-клеточной памяти ранее не проводились.

Полученные результаты свидетельствуют, с одной' стороны, об отсутствии существенных отличий в индукции долгоживущих CD8+ Т-клеток памяти в НАЛТ при гриппозной инфекции- и иммунизации реассортантным вакцинным штаммом, с другой, о наличии явного преимущества в стимуляции этих клеток последним по сравнению с парентеральным введением инактивированного вируса.

Существуют наблюдения, которые косвенно подтверждают наши данные об активной стимуляции вирусами гриппа локальной иммунологической памяти. Так, голландские исследователи сообщили об обнаружении в тетрамерной методике в легочных смывах доноров большого количества CD8+CD27+CD45RA- клеток памяти, специфических к Ml и NP-белкам вируса гриппа A (H1N1) [48]. То же самое отметили английские авторы в отношении локальных В-клеток памяти в HAJIT после первичной инфекции мышей патогенным вирусом A (H3N2) [99].

Резюмируя результаты обследования волонтеров и даные экспериментальных исследований, можно отметить следующее.

В разработанной нами модификации TRAP после прививки вакцинным штаммом для ЖГВ весьма четко фиксировалось значительное увеличение уровней изучаемых клеток иммунологической памяти как на системном (периферическая кровь людей), так и на органном (HAJIT мышей) уровнях.

Эта модификация TRAP может быть использована для оценки уровней специфических к вирусу гриппа А Т-клеток в периферической крови людей. Наличие двойного контроля в методе (учет фонового трогоцитоза в каждой пробе и сравнение с данными, полученными при обследовании контрольной группы), а также совпадение наших результатов TRAP с показателями эталонного цитокинового метода в работах других авторов [79, 90], позволяет говорить о полной объективности полученных нами данных о вирусспецифическом Т-клеточном иммунном ответе.

Если рассматривать в совокупности результаты изучения иммунологической памяти, в* трех использовавшихся методах (авидность антител, общие СВ45ЫО*-клетки/ и< вирусспецифические клетки), то в них обнаруживается^ ряд общих закономерностей. При этом следует учитывать, что каждый метод испытывался на материале, полученном в разных коллективах людей практически одного возраста (1820 лет). Данные закономерности можно свести к следующему:

1. Во всех случаях наблюдался широкий разброс индивидуальных показателей среди непривитых лиц, что свидетельствует о гетерогенности этой возрастной популяции в отношении количественных показателей состояния иммунологической памяти к вирусу гриппа.

2. По данным всех трех методов поствакцинальное увеличение количественных характеристик иммунологической памяти находилось в обратной зависимости от фоновых (предвакцинальных) показателей.

По1 нашему мнению, эти две закономерности дают основание высказать предположения, во-первых, о существенном влиянии ряда факторов (время^ после предшествующего контакта организма с возбудителем, тяжесть инфекции, тип ранее использовавшейся-вакцинации) на состояние иммунологической? памяти к- вирусу гриппа, во-вторых, о важности информации о ее предвакцинальном статусе, ибо это может существенно влиять на успешность вакцинации на индивидуальном уровне. Тем- более, что в последние годы главной тенденцией в вакцинопрофилактике является ее индивидуализация, то-есть разработка новых подходов как к вопросу о необходимости вакцинации, так и к методам оценки ее эффективности для каждого конкретного человека [6].

3. Во всех тестах у привитых людей отмечено увеличение изученных показателей иммунологической памяти не только при наличии гуморального иммунного ответа, фиксируемого в РТГА, но и без такового: Это; с одной стороны, подтверждает тезис о расхождении данных, о гуморальном и клеточном противогриппозном иммунитете [120,- 92], с другой, свидетельствует в пользу того, что принятая на сегодняшний день оценка иммуногенности ЖГВ только по конверсиям циркулирующих антител дает далеко не полное представление о поствакцинальной иммунологической перестройке организма в отношении накопления других протективных факторов противовирусного иммунитета.

4. Данные, полученные всеми методами, показали наличие лиц со снижением уровня иммунологической памяти в период между заборами крови среди привитых и, особенно, в контрольной группе. С большой долей вероятности можно утверждать, что данный феномен отражает ежегодно наблюдаемое падение уровня коллективного иммунитета населения в предэпидемический осенний период [16]. В нашем случае отбор до- и поствакцинальных образцов крови происходил именно в этот период (октябрь — ноябрь). Кроме того, интересно, что вакцинация уменьшала степень выраженности такого снижения.

И наконец, заключительный вопрос. Хорошо известно, что в абсолютном большинстве случаев антигенный профиль вакцинного и эпидемических штаммов вирусов гриппа А полностью не совпадает из-за антигенного дрейфа последнего. Тогда могут возникнуть сомнения, может ли поствакцинальная Т-клеточная иммунологическая память защитить людей при последующей встрече с эпидемическим вирусом. Установлена способность живых вирусов гриппа A(H1N1) и A (H3N2) активно стимулировать перекрестнореагирующие Т-клетки памяти к разным штаммам в пределах одного или даже нескольких сероподтипов [98, 135, 159]. Однако, по-видимому, срок сохранения в активном виде таких перекрестнореагирующих клеток памяти не превышает 2 — 3 месяцев [157]. По нашему мнению, если после иммунизации организм контактирует с дрейфовым вариантом «дикого» вируса в пределах данного временного промежутка, можно ожидать высокий уровень протекции, если же нет - то уровень защиты будет значительно снижен.

115