Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Индукция локального и системного иммунного ответа патогенными и аттенуированными вирусами гриппа А

ПЕТУХОВА Галина Дмитриевна

ИНДУКЦИЯ ЛОКАЛЬНОГО И СИСТЕМНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПАТОГЕННЫМИ И АТТЕНУИРОВАННЫМИ ВИРУСАМИ ГРИППА А

14 00 36 — Аллергология и иммунология 03 00 06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003058388

г

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель доктор медицинских наук

Найхин Анатолий Нойевич

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Назаров Петр Григорьевич

доктор биологических наук Харченко Евгений Петрович

Ведущая организация ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный

Медицинский Университет имени академика И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится <уЦ» мая 2007 года в часов на заседании Диссертационного Совета Д 001 022 01 при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул Акад Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Автореферат разослан «&£> » ¿Ък-^&Л^ 2007 г

Ученый секретарь доктор медицинских наук

Диссертационного Совета " Бурова Лариса Александровна

Актуальность проблемы. Грипп, наряду с ВИЧ-инфекцией и вирусными гепатитами, остается одной из центральных проблем вирусологии Особое место в защите от гриппа занимает местный (локальный, мукозальный) иммунитет, формирующийся во входных воротах инфекции, то есть в слизистой оболочке верхнего отдела дыхательного тракта В вирусологической иммунологии изучению локального иммунитета отводится ведущее значение [Davis S S , 2001, Ogra Р L, 2001, Tamura S et al, 2005]

У людей первым и наиболее действенным барьером на пути проникновения в организм возбудителей респираторных инфекций, в том числе и вируса гриппа, является мукозоассоциированная лимфоидная ткань (MAJIT) лимфоглоточного кольца Пирогова-Вальдейера [Köper CF, 1992, Tamura S et al, 2004] Поэтому изучение локального противогриппозного иммунитета сводится, в основном, к получению информации о механизмах развития постинфекционного и поствакцинального иммунного ответа в этом участке слизистой оболочки Однако у людей прямое изучение роли MAJIT в формировании локального иммунитета сопряжено с большими трудностями, поскольку это возможно только путем иммунологических исследований эктомированных или биопсинизированных участков слизистой оболочки органов лимфоглоточного кольца Пирогова-Вальдейера у больных гриппом или вакцинированных лиц Подобная ситуация резко тормозила получение исчерпывающих знаний о клеточном локальном иммунитете к возбудителям гриппа и других респираторных инфекций

Прорывом в данной области послужило открытие [Koomstra Р J et al, 1991, Köper С F et al, 1992, Asanuma H, et al, 1995], а затем и создание метода выделения [Asanuma Н , et al, 1995, Asanuma Н, et al, 1997] у лабораторных животных (мыши, крысы, хомяки) так называемой «назоассоциированной лимфоидной ткани» (HAJIT) - функционального аналога кольца Пирогова-Вальдейера у людей [Koomstra Р J et al, 1991] Считается, что знания об иммунном ответе в HAJIT дают представление об иммунных процессах в эквивалентной человеческой лимфоидной ткани [Koomstra Р J et al, 1991, Tamura S et al, 2004] Все это в совокупности позволило использовать данную методику в наших исследованиях локального противогриппозного иммунитета

В настоящее время огромное внимание в мире уделяется способности противогриппозных вакцин стимулировать именно локальный иммунитет верхних дыхательных путей [Tamura S et al, 2005] В мировой практике для профилактики гриппа применяются два типа вакцинных препаратов интраназальные живые аттенуированные реассортантные гриппозные вакцины (ЖПВ) и парентеральные инактивированные гриппозные вакцины (ИГВ)

Доказано, что парентеральное (традиционное) введение ИГВ практически не стимулирует локальный противогриппозный иммунитет [Brokstad К А et al, 1995, Найхин АН и др, 2000, Brokstad К А et al, 2002] Поэтому в последние годы предпринята попытка создания ИГВ для интраназальной инокуляции совместно с мукозальными адъювантами Однако такие вакцины пока не нашли широкого практического применения из-за наличия побочных эффектов, в том числе алл ер газирующих свойств [Tamura S. et al, 2004]

Альтернативой ИГВ является ЖГВ Она значительно опережает инактивированные гриппозные вакцины по широте спектра индуцируемых

факторов противовирусного иммунитета, в том числе и локальной природы [Найхин АН и др , 2000, Найхин А H и др , 2002]

Эталоном иммуногенности любых вакцин служит иммунный ответ, возникающий при естественной инфекции [Медуницын H В , 2004] Поэтому важно установить, в какой степени метод получения вакцинных штаммов влияет на индукцию разных параметров иммунной защиты по отношению к вирулентному циркулирующему вирусу, из которого они приготовлены Способ создания вакцинных штаммов для ЖГВ основан на генетической реассортации между вирулентным циркулирующим вирусом и холодоадаптированным донором аттенуации [Александрова ГИ, Климов АИ, 1994] В результате такой реассортации вакцинные штаммы приобретают два гена поверхностных белков (гемагглютинина и нейраминидазы) от первого штамма и все гены внутренних белков (шесть) от второго Как следствие, вакцинный штамм становится аттенуированным, то есть неспособным вызывать клинически выраженную инфекцию Однако чрезмерная атгенуация вирусов гриппа может приводить к снижению их иммуногенности Поэтому важно знать, насколько оптимально соблюден баланс между этими двумя признаками Проверить этот баланс можно путем сопоставления иммуногенной активности вакцинного штамма и его вирулентного родительского вируса К сожалению, проведение такого исследования доступно только в эксперименте из-за невозможности заражения людей «диким» вирулентным вирусом Подобные экспериментальные работы по сравнению параметров поствакцинального иммунного ответа на ЖГВ и постинфекционного иммунного ответа ранее не проводились

Недавно в опытах m vitro показано, что вирус гриппа является индуктором апоптоза лимфоцитов [Nichols JE et al, 2001] В этой связи изучение вирусиндуцированного апоптоза клеток лимфоидного ряда становится актуальным с точки зрения оценки последствий как гриппозной инфекции, так и массовой вакцинации гриппозными вакцинами Однако исследований этого вопроса m vivo до настоящего времени не осуществлялось

Цель исследования: изучить формирование локального и системного иммунного ответа на патогенный и аттенуированные вирусы гриппа А Задачи исследования:

1 В эксперименте in vivo сравнить локальный иммунный ответ в НАЛТ мышей на аттенуированный реассортантный вирус гриппа и его генетические родители (патогенный вирус и холодоадаптированный донор аттенуации) по следующим параметрам выработка вирусспецифических секреторных антител, динамика пролиферативной активности общего пула лимфоцитов, накопление CD4+, CD8+ и С019+-лимфоцитов и продукция Thl- и Th2- цитокинов

2 Сопоставить эти данные с результатами тестирования системного иммунного ответа в селезенке мышей по тем же параметрам

3 Изучить апоптоз лимфоцитов при гриппозной инфекции и вакцинации

4 Оценить у людей способность ЖГВ (i) стимулировать накопление CD4+- и CD8+-лимфоцитов в периферической крови, (и) повышать авидность локальных IgA-антител

Научная новизна работы.

1 Впервые проведено сравнительное исследование формирования локального иммунитета в HAJIT мышей при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации мышей аттенуированным реассортантным вирусом гриппа А — экспериментальным аналогом вакцинного штамма для ЖГВ Показано, что аттенуированный реассортант не уступает патогенному родительскому штамму A/PR/8/34 (H1N1) в активности индукции изученных факторов иммунитета

2 Впервые исследован апоптоз лимфоцитов HAJIT и селезенки мышей в процессе развития иммунного ответа при гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным вирусом Установлено, что в обоих случаях не возникает опасности индукции апоптотического дисбаланса иммунной системы

3 Впервые проведена оценка ЖГВ по способности (i) стимулировать накопление CD4+- и CD8+- лимфоцитов в периферической крови, (и) изменять авидность локальных антител Отмечено, что в первом случае ЖГВ повышает уровень CD4+ и CD8+ в периферической крови лишь незначительно, во втором — активно увеличивает показатели авидности секреторных IgA-антител

Практическая значимость работы.

1 В экспериментальных исследованиях на мышах оценен способ приготовления вакцинных штаммов для ЖГВ с позиции сохранения способности аттенуированного реассортантного вакцинного штамма индуцировать полноценный локальный иммунный ответ во входных воротах инфекции

2 Обоснована иммунологическая безвредность ЖГВ с точки зрения опасности возникновения апоптотического дисбаланса иммунной системы

3 Апробирован способ оценки иммуногенности ЖГВ у людей по авидности локальных IgA-антител

4 В эксперименте на мышах дана оценка иммуногенности человеческого вируса А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) как кандидата в вакцинные штаммы для ЖГВ в случае угрозы возвращения в эпидемическую циркуляцию вируса гриппа серотипа A (H2N2)

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Иммунизация мышей аттенуированным реассортантным вирусом гриппа (экспериментальный аналог вакцинного штамма для ЖГВ) не уступает гриппозной инфекции в активности индукции изученных параметров локального иммунитета верхних дыхательных путей (продукция вирусспецифических секреторных антител, пролиферативная активность общего пула лимфоцитов, накопление в HAJIT CD4+-, CD8+- и С019+-лимфоцитов и локальная секреция цитокинов)

2 Повторная неосложненная гриппозная инфекция и повторная вакцинация аттенуированным реассортантом не вызывают усиление апоптоза лимфоцитов НАЛТ и селезенки При первичном поствакцинальном и постинфекционном иммунном ответе апоптоз лимфоцитов этих органов увеличивается только на раннем этапе репродукции вирусов и продолжается не более суток Далее показатели апоптоза возвращаются к норме

3 У людей иммунизация ЖГВ существенно повышает авидность секреторных вирусспецифических IgA-антител Поэтому данный маркер может

рассматриваться в качестве дополнительного критерия оценки иммуногенности вакцинации в отношении индукции локального иммунного ответа

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VIII всероссийском форуме с международным участием им акад В И Йоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004), на I международной конференции "Influenza Vaccines for the World " (Лисабон, 2004), на II всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004), на IX научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005) — доклад занял II место на конкурсе молодых ученых, на научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006) — доклад занял I место на конкурсе молодых ученых, на международной конференции молодых ученых Одесского государственного медицинского университета "Вчеш майбутнього" (Одесса, 2006)

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отделов иммунологии и вирусологи ГУ НИИЭМ РАМН 5 марта 2007 г

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи и 7 тезисов

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 129 страницах текста, включающего 21 таблицы и 12 рисунков Список цитируемой литературы содержит 191 источник, в том числе 33 отечественных и 158 иностранных

Личный вклад автора заключается в самостоятельном проведении всех экспериментальных исследований, включая работу с лабораторными животными, обработку полученного материала, проведение лабораторных тестов и интерпретацию полученных результатов Клинические испытания ЖГВ проводились совместно с сотрудниками отдела вирусологии ГУ НИИЭМ РАМН

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. Для воспроизведения экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации использовали линейных мышей СВА (самок) в возрасте 8—10 недель, полученных из питомника «Рапполово» РАМН Работа выполнялась в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12 08 77)

Модель экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации. Оценку локального и системного иммунитета проводили с использованием экспериментальной модели, разработанной ранее в отделе вирусологии ГУ НИИЭМ РАМН Животным вводили следующие вирусы гриппа в нелетальных дозах (i) патогенный для мышей A/PR/8/34 (H1N1) в дозе 4,0 lg ЭИДзо/0,1 мл - моделировал естественную гриппозную инфекцию, (и) холодоадаптированный донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) в дозе 6,0 lg ЭИДУО,! мл, (ш) аттенуированный реассортантный вирус A/47/PR (H1N1) в дозе 6,0 lg ЭИД50/ОЛ мл

(далее — аттенуированный реассортант 6/2) - моделировал противогриппозную вакцинацию Реассортант имел 2 гена наружных белков от вируса (i) и 6 генов внутренних белков от вируса (и) Вирусы вводились интраназально под легким эфирным наркозом в объеме 50 мкл (по 25 мкл в каждый носовой ход) В качестве контроля использовались интактные животные В случае необходимости повторного заражения, его осуществляли через 21 день после первичной инокуляции вирусов

Вакцинируемые контингенты и вакцина. В исследовании участвовало 57 условно здоровых молодых людей 18 — 20 лет, не имевших противопоказаний к вакцинации ЖГВ Вакцинацию и забор крови осуществляли на основе добровольного согласия после подписания каждым из волонтеров соответствующего договора Все волонтеры случайно-выборочным методом были разделены на две группы (i) группа вакцинированных лиц (32 человека) и (и) контрольная группа (25 человек) Лица из группы (i) были однократно иммунизированы коммерческой живой холодоадаптированной реассортантной тривалентной гриппозной вакциной (ФГУ «Микроген» - Иркутское предприятие по производству иммунобиологических препаратов) в объеме 0,5 мл (по 0,25 мл в каждую ноздрю) В состав ЖГВ входили реассортантные штаммы, рекомендованные ВОЗ A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1),

А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) и В/60/Джилин/01/1 Вакцину вводили интраназально по 0,25 мл в каждый носовой ход Лицам из группы (и) таким же способом вводился препарат плацебо — стерильный физиологический раствор Медицинский осмотр волонтеров и забор венозной крови для исследования осуществляли до вакцинации и через 21 день после вакцинации

Выделение лимфоцитов HAJIT. Сепарацию НАЛТ осуществляли по методике [Asanuma H, 1997] После цервикальной дислокации у мышей отрезали верхнюю челюсть чуть выше линии глазных яблок и удаляли кожу Далее выделенную часть черепа освобождали от остатков мозга, щечных мышц и наружного носа вместе с верхними резцами После сепарации небной пластинки, выделяли непосредственно НАЛТ - парные лимфоидные образования по бокам от носовой перегородки со стороны задней части неба Доли НАЛТ осторожно гомогенизировали с помощью предметных стекол с матовым краем («Biovitrum», Россия) Лимфоциты НАЛТ отмывали, ресуспендировали и стандартизировали аналогично лимфоцитам селезенки

Выделение и приготовление суспензии спленоцитов и мононуклеаров периферической крови (МНПК) людей осуществляли традиционными методами [Лимфоциты Методы (подред Дж Клауса), 1990]

Иммуногенность ЖГВ оценивали по уровню антигемагглютинирующих сывороточных антител в РТГА по общепринятой методике В качестве антигенов использовали 4 ГАЕ/50 мкл антигенов вирусов гриппа А и В, входящих в состав вакцины

Антитела секретов дыхательных путей и сыворотки крови мышей

определяли в непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА) по ранее разработанной методике [Найхин АН и др , 1997] Рабочая доза сорбируемого антигена составляла 16 ГАЕ/0,1 мл За титр антител принимали последнее разведение исследуемого материала, оптическая плотность (ОП) которого в 2 и

более раза превышала среднее арифметическое значение ОП лунок с контролем конъюгата (все ингредиенты реакции без исследуемого образца)

Авидность секреторных IgA-антител людей определяли в ИФА с использованием хаотропного агента (мочевина) по методике [Lazzarotto Т et al, 1997, de Souza VA et al, 2003]

Пролиферативную активность лимфоцитов HAJJT и селезенки мышей, а также МНПК волонтеров оценивали с помощью РБТЛ по методу [Mosmann Т, 1983] Культуры клеток стимулировали инактивированными антигенами вирусов гриппа в концентрации 20 АЕ/лунку или фитогемагглютинином (ФГА) (Sigma Со, CIIIA) в концентрации 5 мкг/мл Индекс стимуляции (ИС) лимфоцитов определяли как отношение ОП лунок стимулированных лимфоцитов к ОП контрольных лунок

Распределение лимфоцитов по мембранным маркерам. Количество (%) CD4+ Т-хелперов (Th), CD8+ цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) и CD 19+ В-лимфоцитов в лимфоидных органах мышей и периферической крови волонтеров оценивали с помощью набора моноклональных антител (BD Biosciences Pharmmgen, США) Учет результатов проводили по данным проточной цитофлуориметрии (BD FACS-cahbur, США)

Уровень интерферона-у (ИФН-у), интерлейкина-6 (ИЛ-б) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) в НАЛТ и селезенке мышей определяли в супернатантах трехдневных культур лимфоцитов, стимулированных гомологичными вирусами (A/PR/8/34 (H1N1) или АУЛенинград/134/47/57 (H2N2)) с использованием стандартных коммерческих наборов для тестирования в иммуноферментном анализе мышиных цитокинов (BD Biosciences Pharmingen, США)

Апоптоз лимфоцитов определяли в аннексин-пропидиевом тесте (An PI) с помощью стандартного набора ингредиентов «Annexin V-FITC detection kit» (BD Pharmingen, США) О числе (%) клеток с признаками апоптоза судили по данным проточной цитофлуориметрии (BD FACS-calibur, США)

Статистические методы Статистическую достоверность полученных результатов оценивали с помощью t критерия Стьюдента и критерия %2 Обработку данных вели в программе «Excel»

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Локальный и системный гуморальный иммунный ответ при гриппозной

инфекции и вакцинации Системный и локальный гуморальный иммунный ответ у мышей.

Иммуногенность гриппозных вакцин принято оценивать по уровню сывороточных антител до и после вакцинации Нами проведено сравнительное исследование в ИФА динамики IgG-, IgM- и IgA-антител в ответ на введение трех использовавшихся в эксперименте вирусов (рис 1)

После инокуляции каждого из этих вирусов развивался хорошо выраженный системный гуморальный иммунный ответ в виде накопления специфических иммуноглобулинов всех классов При этом патогенный родительский вирус имел

преимущество перед аттенуированными штаммами в индукции сывороточных IgG-антител.

Здн

7 дн.

14 дн.

21 дн.

10

8 -|

IgM

Здн.

7 дн.

14 дн.

21 дн.

10

6

О ■

IgA

Рисунок 1. Динамика продукции сывороточных антител при гриппозной инфекции и вакцинации.

По оси абсцисс - дни после введения вирусов.

По оси ординат - logiCIT.

Черные столбики - патогенный вирус A/PR/8/34

(H1N1); заштрихованные столбики - аттену^рованны

реассортант 6/2 (H1NI); светлые столбики - донор

агтенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2).

Здн. 7дн. 14 дн. 21 дн.

Все вирусы вызывали также активную продукцию секреторных антител в верхних дыхательных путях через 21 день после заражения (рис. 2). Так, реассортант 6/2 не уступал патогенному родителю в интенсивности стимуляции секреторных антител слизистой верхнего дыхательного тракта. Однако он, как и донор аттенуации, отставал от патогенного вируса в индукции ^морального иммунного ответа в нижних отделах дыхательного тракта. Фактически эти данные отражают одно из основных биологических свойств вакцинных штаммов для ЖГВ — резкое снижение способности репродуцироваться в нижних дыхательных путях [Александрова Г.И. и др., 1994].

Рисунок 2. Продукция антител у мышей (общий пул +/£.'1/ в верхних и

нижних отделах дыхательнь1х путей на 21 сутки после гриппозной инфекции и вакцинации

По оси ординат - 1о(&СГТ. Черные столбики - патогенный вирус А/Р1Ш34 (НШ1); заштрихованные столбики - аттенуированный реассортант 6/2 (НШ1); светлые столбики - донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (Н2Ы2),

Н а w ф а рин геа л ьные

Кронхоальвеолярныс

Очевидно, именно это свойство является причиной сниженной способности обоих аттенуированных вирусов к стимуляции продукции как антител в нижних дыхательных путях, так и ^в-антител сыворотки крови

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что аттенуированный реассортантный штамм 6/2 полностью наследовал от патогенного родителя способность к индукции полноценного локального гуморального иммунного ответа во входных воротах инфекции - слизистой оболочке верхних дыхательных путей В то же время патогенный родительский штамм имел преимущество в стимуляции системного гуморального иммунного ответа

Аеидность локальных А-антител у иммунизированных ЖГВ людей. Существует мнение, что поствакцинальный гуморальный иммунный ответ нужно оценивать не только по его количественным параметрам (титры антител), но и по качественным критериям авидности антител [Найхин АН и др , 1995, Хаитов Р М и др, 2001; Медуницын НВ, 2004] Ранее разработан способ тестирования авидности (функциональной активности) сывороточных антигемагглютинирующих антител к вирусам гриппа А и В [Найхин АН и др , 1995] В отношении локальных антител такие исследования не проводились В этой связи нами предпринята попытка восполнить этот пробел

Для тестирования авидности антител носовых секретов применяли метод, ранее апробированный с целью изучения этого параметра сывороточных антител к цитомегаловирусу [ЬаггагоМо Т е1 а1, 1997] Метод основан на обработке исследуемых материалов хаотропным агентом (мочевина), который разрушает слабоавидные связи антитела с антигеном

В исследовании участвовало 50 молодых людей 18-20 лет, которым интраназально вводили ЖГВ (29 человек) или препарат плацебо (21 человек)

У всех параллельно определяли титры ^А-антител в носовых секретах до и после введения и авидность этих антител в упомянутом тесте

Показатели авидности антител существенно отличались у разных лиц и колебались в широком диапазоне от 45% до 95% Среди привитых ЖГВ доля людей с высокими показателями авидности антител (81 — 95%) после вакцинации возросла в 4,0 раза (р<0,01), тогда как у лиц из контрольной группы (препарат плацебо) за период между двумя обследованиями она снизилась При этом в первой группе доля добровольцев с достоверным увеличением авидности антител (на 10 — 31%) значительно превышала аналогичный показатель в группе плацебо (в 4,4 раза, р<0,01)

Таким образом, иммунизация ЖГВ приводила к повышению авидности не только системных антител [Найхин АН и др, 1995], но и локальных антител во входных воротах инфекции

Локальный и системный клеточный иммунный ответ при гриппозной инфекции и вакцинации

Локальный клеточный иммунный ответ к вирусу гриппа изучен значительно слабее, чем гуморальный ["\ViIley IА е1 а1, 2001, Ташига Б й а1, 2004], хотя его роль в противовирусном иммунитете не менее существенна Поэтому в последние годы основное внимание исследователей сосредоточено на изучении именно этого звена противовирусного иммунитета, поскольку противогриппозная вакцинация

должна быть эффективной в индукции не только ТЪ2-гуморального, но и ТЬ1-клеточного иммунного ответа в месте репликации возбудителя, те в назофарингеальном участке дыхательного тракта [Н1Г01 Т , 1998, Татига Б , 2004]

Динамика пролиферативной активности общего пула лимфоцитов НАЛТ и селезенки. Одним из важных показателей общего состояния специфического иммунитета является оценка вирусиндуцированной пролиферации лимфоцитов в РБТЛ В этой связи нами проведена такая оценка лимфоцитов НАЛТ Достоверное возрастание индексов стимуляции лимфоцитов НАЛТ отмечено уже на третий день после заражения, в то время как пик пролиферативной активности спленоцитов приходился на 7 сутки Обращает на себя внимание наличие очень кратковременной (не более суток) иммуносупрессии пролиферативной активности лимфоцитов через 24 ч после введения всех трех вирусов

Рисунок 3 Динамика пролиферативной активности лимфоцитов НАЛТ и селезенки мышей при гриппозной инфекции и вакцинации

А - НАЛТ, Б - селезенка По оси абсцисс - время после введения вирусов По оси ординат -индекс стимуляции лимфоцитов гомологичным вирусом Ромбы - патогенный вирус А/РН/8/34 (ШШ), круги - аттенуированный реассортант 6/2 (НШ1), треугольники - донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (Н2К2), квадраты - контроль (интактные животные) Здесь и далее по тексту * - различия с уровнем контроля достоверны при р<0,05, ** - при р<0,01, *** -прир<0,001.

По-видимому, этот феномен связан со способностью репликативной формы вирусов гриппа А запускать апоптоз клеток лимфоидного ряда на ранних сроках репликации (рис 7)

Таким образом, все изучаемые вирусы активно стимулировали пролиферативную активность общего пула лимфоцитов как во входных воротах инфекции - НАЛТ, так и в селезенке При этом по количественным параметрам поствакцинальный иммунный ответ был приближен к эталону -постинфекционному иммунному ответу Эти результаты подтверждают ранее полученные данные о способности ЖГВ активно повышать пролиферативную активность мононуклеаров периферической крови у людей разных возрастных групп [Найхин АН и др , 2000]

Индукция различных субпопуляций лимфоцитов НАЛТ и селезенки. При анализе клеточных иммунных реакций важно знать, какие конкретно лимфоциты участвуют в ответе на антигенный стимул В этой связи нами было осуществлено

сравнительное исследование способности изучаемых вирусов изменять в НАЛТ и селезенке уровни следующих субпопуляций лимфоцитов: СЭ4+ (ТЬ-), СЭ8+ (ЦТЛ) и СБ 19+ (В-лимфоциты) - рисунок 4. Временные интервалы для проведения анализа выбраны на основании данных о пиках пролиферативной активности общего пула лимфоцитов в каждом из органов: 3 сутки для НАЛТ и 7 сутки для селезенки.

Введение аттенуиро ванного реассортанта 6/2 сопровождалось значительным увеличением в обоих органах уровней всех перечисленных субпопуляций лимфоцитов. В этом качестве атгенуированный реассортантный вирус уступал патогенному родителю только в индукции ЦТЛ в селезенке.

О 20 40 60 80 0 20 40 60 80

Рисунок 4. Индукция различных субпопуляций лимфоцитов НАЛТ и селезенки мышей. По оси абсцисс - процент клеток от числа сортированных (10000), несущих соответствующий маркер.

По оси ординат: I (серые столбики) — контроль (интактные животные); II (светлые столбики) - донор атгенуации А/ЛенинградЛ 34/47/57 (H2N2); III (заштрихованные столбики) - аттенуированный реассортант 6/2(НINI); IV (черные столбики) - патогенный

Следует отметить, что после введения всех использовавшихся вирусов, стимуляция ЦТЛ оказалась на более низком уровне, чем Th и В-лимфоцитев. Что касается донора аттенуации, то этот вирус несколько хуже индуцировал CD4+ и CD 19 - лимфоциты НАЛТ по сравнению с двумя другими.

Таким образом, атгенуированный реассортант 6/2 наследовал от патогенного родителя способность к активной стимуляции как в НАЛТ, так и в селезенке накопления таких важных в противовирусном иммунитете клеток, как Tb, В-лимфоциты и ЦТЛ.

Индукция CD4 - и CD8лимфоцитов у иммунизированных ЖГВ людей. Согласно существующему регламенту, оценка иммувогенности противогриппозных вакцин осуществляется только по данным РТГА об активности накопления сывороточных антигемагглюшнирующих антител. Основываясь на

обнадеживающих экспериментальных результатах (рис. 4), мы попытались ответить на вопрос, можно ли оценивать им моногенность ЖГВ по уровням ЦТЛ и Th в Периферической крови. Ранее подобные исследования не проводились.

У добровольцев до и спустя 21 день после иммунизации тривалентноц ЖГВ или введения препарата плацебо определяли титры сывороточных антител в РТГА к вакцинным штаммам, индексы стимуляции в РБТЛ мононуклеаров периферической крови после их контакта с вакцинными вирусами, а также уровень CD4+- и CD8+-лимфоцитов в периферической крови в проточной цитофлтоориметрни (рис.5).

Вакцинированные

Плацебо РТГЛ-РБТЛ-

ri-25

O.00 J

Рисунок 5. Кратность изменения уровней CD4* и CDS* лимфоцитов периферической крови волонтеров после иммунизации ЖГВ (индивидуальные показатели).

По оси абсцисс - волонтеры (серые столбики). По оси ординат - отношение у них показателей: % клеток, несущих соответствующий маркер после вакцинации / до вакцинации (>1,0 - прирост; <1,0 - снижение)

Р7ТА+ - лица о 4х~хргтным я более приростом титра сывороточных антител в РТГА к одному и более вакцинным вирусам; РТГА- - лица с отсутствием такого прироста титра антител; РБТЛ+ -лица с увеличением индексов стимуляции лимфоцитов (ИС) в периферической крови по данным РБТЛ в > 1,5 раза к одному и более вакцинным вирусам; РБТЛ- - лица без такого увеличения ИС. Жирной линией отмечено достоверное (в > 1,5 раза) увеличение уровня клеток.

Анализ результатов тестирования этих су б популяций лимфоцитов осуществляли у трех групп волонтеров; (i) с достоверным иммунным ответом в РБТЛ и РТГА к одному или более вакцинному вирусу (РТГА+РБТЛ+); (ii) с

отсутствием таких ответов (РТГА-РБТЛ-) у привитых, (ш) получавших препарат плацебо

Случаи достоверного увеличения уровня CD4+ и CD8+ -лимфоцитов после вакцинации наблюдались только в группе (i) Однако частота таких увеличений не превышала 20% В этой же группе отмечено гораздо меньшее число снижений уровня этих клеток (кратность < 1) по сравнению с группой (ш) В целом, хотя результаты и свидетельствуют об активации Th и ЦТЛ при вакцинации, но, на наш взгляд, информативность этих данных, недостаточна для каких-либо практических выводов

Продукция Thl/Th2-npo(puribHbix цитокинов в HAJIT и селезенке. Для изучения особенностей развития локального и системного Thl- и ТЬ2-иммунного ответа нами осуществлено динамическое исследование продукции Thl (ИФНу)- и Th2 (ИЛ-4 и ИЛ-6)- цитокинов в НАЛТ и селезенке мышей в ответ на те же вирусы (рис 6)

В НАЛТ при инокуляции всех вирусов отмечено активное повышение продукции ИФНу и ИЛ-6, но не ИЛ-4 В селезенке такое повышение наблюдалось только в отношении ИФНу, причем в гораздо большей степени на введение патогенного вируса В определенной мере это согласуется с данными японских авторов, отметивших повышение экспрессии в CD4+ и CD8+ Т-клетках НАЛТ мРНК ИФНу и отсутствие таковой в отношении мРНК ИЛ-4 после заражения мышей патогенным вирусом A/PR/8/34 (H1N1) [Matsuo К et al, 2000] Другими авторами показана очень слабая индукция ИЛ-4 у молодых и пожилых людей, иммунизированных ЖГВ [Найхин АН и др , 2002]

Таким образом, аттенуированный реассортант не уступал патогенному родителю в стимуляции продукции ИФНу и ИЛ-6 во входных воротах инфекции Отмечены отличия в индукции двумя вирусами ИЛ-6 на локальном и системном уровнях

Апоптоз и пролиферация лимфоцитов при гриппозной инфекции и

вакцинации

Апоптоз признан одной из главных проблем биологии и медицины [Ярилин А А , 1998, Lowy R J , 2003] В последнее десятилетие активно изучается проблема вирусиндуцированного апоптоза [Hay S , 2002, Lowy R J, 2003] Доказана способность таких вирусов как ВИЧ, гепатит В и С запускать апоптоз неиммунных и иммунных клеток [Hay S, 2002] Сравнительно недавно в опытах in vitro такая способность вируса гриппа А показана в отношении человеческих лимфоцитов [Nichols JE, 2001] Основываясь на гипотезе о существовании апоптотических дисбалансов иммунной системы, проявляющихся в форме приобретенных иммунодефицитов [Ковальчук Л В , Чередеев А H , 1998], можно предположить, что теоретически гриппозная инфекция может быть причиной перевода физиологического апоптоза этих клеток в патологический, приводящий к дисфункции Т- и В-клеточного иммунитета Естественно, это настораживало с точки зрения потенциальной возможности возникновения поствакцинальных апоптотических поражений иммунной системы при вакцинации живыми вирусами Для поиска ответа на этот вопрос нами было проведено специальное исследование Апоптоз определяли с помощью аннексин-пропидиевого теста, рекомендуемого как

ИФН-у

А *** Б

2500 2000 1500 1000 600 0

/ \

/ \ **

D / ,

г/. . . *- U ЩГ — — еэ— — ■£)

Здн

7дн 14 дн 21 дн

Здн

7дн 14 дн 21 дн

ИЛ-6

А *** Б

1250 1000 750 500 250 0

/К'

Î- -Г-%--п--\

Здн

7дн 14 дн 21 дн

Здн

7 дн 14 дн 21 дн

ИЛ-4

Здн

7дн

14 дн

21 дн

Здн

7дн

14 ДН

21 дн

Рисунок 6 Продукция Тк1/ТН2-цитокинов в НАЛТ и селезенке мышей при гриппозной инфекции и вакцинации

А - HAJIT, Б - селезенка

По оси абсцисс - дни после введения вирусов

По оси ординат - концентрация цитокинов (пг/мл) в супернатантах трехдневных культур лимфоцитов, стимулированных вирусом A/PR/8/34 (H1N1) Ромбы - патогенный вирус A/PR/8/34 (H1N1), круги - атгенуированный реассортант 6/2 (H1N1), треугольники - донор атгенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), квадраты - контроль (интактные животные)

один из надежных методов фиксирования гибели клеток по апоптотическому типу [Vermes 1, 1995, van Engelad M , 1996, Ярилин A A , 1996]

Апоптоз и пролиферация лимфоцитов HAUT и селезенки У мышей параллельно определяли уровень апоптоза и пролиферации локальных (HAJIT) и системных (селезенка) лимфоцитов после первичного и вторичного введения аттенуированного реассортанта 6/2 и его генетических родителей (патогенный вирус и до тор аттенуации) - рис 7

Первичная гриппозная инфекция и первичная вакцинация аттенуированными вирусами сопровождалась кратковременным увеличением уровня апоптоза лимфоцитов как селезенки, так и НАЛТ через 24 ч после заражения Близкие по значению результаты получены американскими авторами в отношении спленоцитов мышей, зараженных сублетальной дозой вируса A/PR/8/34 (H1N1) [Zhang Y et al, 2002]

Вторичный иммунный ответ как при гриппозной инфекции, так и при вакцинации вообще не сопровождался усилением апоптоза лимфоцитов НАЛТ и селезенки С высокой долей вероятности можно предположить, что в значительной степени это связано со сменой репертуара Т- и В-лимфоцитов, пролиферирующих в ответ на повторную антигенную стимуляцию тем же штаммом В этом случае среди популяции лимфоцитов преобладают клетки иммунологической памяти Считается, что В-клетки памяти (несущие IgG-специфичность) и Т-клетки памяти практически защищены от апоптоза [Nichols JE et al, 2001, Grayson J M et al, 2002]

Рисунок 7 Динамика апоптоза лимфоцитов НАЛТ и селезенки мышей при гриппозной инфекции и вакцинации (маркер Ah*РГ)

По оси абсцисс - дни после введения вирусов

По сси ординат - % Ап+РГ клеток от числа сортированных (10000) Ромбы - патогенный вирус A/PI78/34 (H1N1), круги - аттенуированный реассортант 6/2 (H1N1), треугольники - донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), область с точками - контроль (интакгные животные) А - первичное заражение, Б - повторное заражение

Доказательством состоявшегося клеточного иммунного ответа (как пер зичного, так и вторичного) на эти вирусы служат данные о динамике показателей пролиферативной активности лимфоцитов (ПАЛ) в НАЛТ и селезенке тех же мышей в те же временные интервалы (рис 8) Обращает на себя внимание,

что через 24 ч после первичного заражения, то есть в то же время, когда наблюдался подъем уровня апоптоза лимфоцитов, отмечена супрессия клеточного иммунитета Вторичный иммунный ответ, опосредованный ПАЛ, такой супрессией не сопровождался Следует отметить тот факт, что динамика апоптоза и пролиферации лимфоцитов НАЛТ и селезенки, а также количественные показатели этих процессов были практически одинаковы для всех изучаемых вирусов

Таким образом, на экспериментальном уровне неосложненная гриппозная инфекция (введение мышам нелетальной дозы вируса) и вакцинация аттенуированным реассортантом не представляли угрозы с точки зрения усиления вирусиндуцированного апоптоза локальных и системных лимфоцитов (под ^ем уровня апоптоза наблюдался только при первичном иммунном ответе и в очень короткий промежуток времени - не более суток) Однако при летальной гриппозной инфекции, вызванной тем же штаммом, у мышей перед их гибелью (7-й день) наблюдалось резкое увеличение уровня апоптоза спленоцитов на фоне значительного снижения их пролиферативной активности [Найхин А Н, 2002] По-видимому, это свидетельствует, что при очень тяжелых формах гриппоз той инфекции может развиваться острый апоптотический дисбаланс клеточного иммунитета

Рисунок 8 Динамика ПАЛ НАЛТ и селезенки мышей при гриппозной инфекции и вакцинации

По оси абсцисс - дни после введения вирусов

По оси ординат - индексы стимуляции (ИС) лимфоцитов гомологичным вирусом По оси ординат - % Ап+ГГ клеток от числа сортированных (10000) Ромбы - патогенный вирус А/РК'8/34 (Н1Ш), круги г аттенуированный реассортант 6/2 (НШ1), треугольники - донор аттенущии А/Ленинград/134/47/57 (Н2Ы2), область с точками - контроль (интактные животные) А — первичное заражение, Б - повторное заражение

Апоптоз мопонуклеаров периферической крови людей, иммунизированных ЖГВ. Полученные экспериментальные результаты мы попытались проверить, исследуя апоптоз лимфоцитов в единственно доступном у людей материале -периферической крови (рис 9) Также как и в случае с измерением уровня СБ 1+ и СВ8+-клеток (рис 5), апоптоз рассматривали отдельно у трех групп добровольцев (1) люди, у которых был зафиксирован клеточный и (или) гуморальный иммунный ответ на вакцинацию, (и) лица с отсутствием такой реакции на иммунизацию и (111) добровольцы, получившие препарат плацебо

Ни па усредненном, ни на индивидуальном уровнях не было отмечено каких-либо отличий в уровнях апоглоза у людей всех трех перечисленных трупп.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу отсутствия влияния ЖГВ на апоптоз МГТНК

Рисунок 9, Кратность изменения уровней лимфоцитов Ап+Р1- у волонтеров после вакцинации (индивидуальные показатели).

По оси абсцисс - волонтеры (серые столбики). По оси ординат - отношение у них показателей'. % клеток с признаками апогггоза после вакцинации / до вакцинации (>1,0 — прирост; <1,0 -снижение)

РТГА+ - лица с 4х-кратиым и более приростом титра сывороточных антител в РТГА к одному и более в;шшннь[М вирусам; РТГА- - лица с отсутствием такого прироста титра антител; РБТЛ+ -лица с увеличением индексов стимуляции лимфоцитов (ИС) в периферической крови по данным РБТЛ в > 1,5 раза к одному и более вакцинным вирусам; РВТЛ- - лица без такого увеличения ИС.

ВЫВОДЫ

1 Вакцинация аттенуированным реассортантным вирусом гриппа А (экспериментальным аналогом вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины) активно индуцирует локальный иммунный ответ в назоассоциированной лимфоидной ткани мышей (продукция секреторных антител, пролиферативная активность общего пула лимфоцитов, накопление СБ4+-, СБ8+- и СО 19+-лимфоцитов и локальная продукция цитокинов) При этом по количественным показателям стимуляции перечисленных параметров она не уступает гриппозной инфекции

2 По сравнению с гриппозной инфекцией, вакцинация мышей аттенуированным реассортантным штаммом менее активно стимулирует системный иммунный ответ, в частности, сывороточные ТяО-антитела, накопление С138+-лимфоцитов и продукцию ИФН-у в селезенке

3 Гриппозная инфекция и вакцинация аттенуированным реассортантным штаммом приводят к усилению апоптоза локальных (в назоассоциированной лимфоидной ткани) и системных (в селезенке) лимфоцитов только при первичном иммунном ответе на раннем этапе репродукции вируса и на очень короткий промежуток времени (не более суток) При вторичном иммунном ответе на инфекцию и вакцинацию уровень апоптоза не увеличивается

4 Иммунизация людей живой гриппозной вакциной

- не повышает апоптоз мононуклеаров периферической крови,

- слабо влияет на изменение уровней СЭ4+ и СБ8+ -лимфоцитов в периферической крови,

- способствует увеличению авидности локальных ^А-антител в секретах верхних дыхательных путей

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Ординальные статьи

1 Петухова Г.Д., Найхин А Н, Баренцева И Б , Долина С А, Чиркова Т В , Григорьева Е П, Руденко ЛГ Локальный гуморальный и клеточный иммунный ответ мышей при гриппозной инфекции и вакцинации // «Медицинская иммунология» - 2006 - Т 8 - № 4 -с 511-516

2 Донина С А , Найхин А Н , Петухова Г.Д , Баранцева И Б, Чиркова Т В , Григорьева Б П, Рекстин А Р, Руденко Л Г Системный гуморальный и клеточный иммунный ответ при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации // «Медицинская иммунология» -2006 - Т8 - №1 -с 31-36

3 Найхин А Н , Петухова Г Д , Баранцева И Б , Донина С А , Чиркова Т В , Григорьева Е П , Руденко Л Г Апоптоз и пролиферация лимфоцитов назоассоциированной лимфоидной ткани и селезенки при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации // «Цитокины и воспаление» - 2006 - № 3 - с 34-39

4 Петухова Г.Д, Чиркова Т В, Донина С А Локальный иммунитет при гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированными вирусами гриппа // В сборнике материалов научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» / АГМУ - Астрахань-Волгоград-Москва, 2006 - с 232 - 236

Тези гы докладов

5 Найхин А Н , Баранцева И Б , Донина С А, Рекстин А Р , Григорьева Е П , Петухова Г Д , Чиркова Т В , Руденко Л Г Влияние вирусов гриппа А на апоптоз лимфоцитов селезенки и назоассоциированной лимфоидной ткани // «Медицинская иммунология» - 2004 - т 6 -№3-5 -с 241

6 Баранцева И Б , Донина С А , Рекстин А Р , Григорьева Е П, Чиркова Т В , Петухова Г Д., Найхин АН Индукция вирусами гриппа А апоптоза лимфоцитов разных участков лимфоидной ткани//«Аллергология и иммунология» -2004 -т 5 - №1 -с 33

7 Петухова Г.Д, Баранцева И Б , Донина С А, Найхин А Н Локальный клеточный и гуморальный иммунный ответ в назоассоциированной лимфоидной ткани при гриппозной инфекции и вакцинации // «Медицинская иммунология» - 2005 — т 7 - № 2-3 - с 264

8 Петухова Г.Д, Баранцева И Б , Донина С А, Найхин А Н Сходства и различия в динамике клеточного локального иммунного ответа мышей на патогенный и атгенуированный вирусы гриппа А//«Цитокины и воспаление» -2005 -т 4 -№3 -с 142

9 Петухова Г.Д., Чиркова Т В , Баранцева И Б Локальный и системный иммунный ответ при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации // Материалы международной конференции молодых ученых ОГМУ «Вчет майбутнього» — 2006 — с 36

10 Naykhm AN, Rekstrn AR, Donina SA, Barantseva IB, Gngoneva EP, Chirkova TV, Petuhova G D., Rudenko L G Experimental Study of Immunogenic Properties of Russian Live Influenza Vaccine // Abstract book of "IVW-2004 Conference" - 2004 - 24-26 May - Lisbon, Portugal - Poster session A - p 91

1 Barantseva I В , Domna S A , Rekstrn A R , Gngoneva E P , Chirkova T V , Petuhova G D , Naykhm AN Influenza "A" viruses induction of lymphocyte apoptosis in different sites of lymphoid tissue // International Journal on Inununoreabilitation - 2004 - Vol 6 - № 2 - p 230

Подписано в печать 18 04 07 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ 35

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ "ЛЭТИ"

Издательство СПбГЭТУ "ЛЭТИ" 197376, С-Петербург, ул Проф Попова, 5

Актуальность проблемы. Грипп, наряду с ВИЧ-инфекцией и вирусными гепатитами, остается одной из центральных проблем вирусологии. Особое место в защите от гриппа занимает местный (локальный, мукозальный) иммунитет, формирующийся во входных воротах инфекции, то есть в слизистой оболочке верхнего отдела дыхательного тракта. В вирусологической иммунологии изучению локального иммунитета отводится ведущее значение [59, 131,164].

У людей первым и наиболее действенным барьером на пути проникновения в организм возбудителей респираторных инфекций, в том числе и вируса гриппа, является мукозоассоциированная лимфоидная ткань (МАЛТ) лимфоглоточного кольца Пирогова-Вальдейера [98, 161]. Поэтому изучение локального противогриппозного иммунитета сводится, в основном, к получению информации о механизмах развития постинфекционного и поствакцинального иммунного ответа в этом участке слизистой оболочки. Однако у людей прямое изучение роли МАЛТ в формировании локального иммунитета сопряжено с большими трудностями, поскольку это возможно только путем иммунологических исследований эктомированных или биопсинизированных участков слизистой оболочки органов лимфоглоточного кольца Пирогова-Вальдейера у больных гриппом или вакцинированных лиц. Подобная ситуация резко тормозила получение исчерпывающих знаний о клеточном локальном иммунитете к возбудителям гриппа и других респираторных инфекций.

Прорывом в данной области послужило открытие [95, 98], а затем и создание метода выделения [37, 39] у лабораторных животных (мыши, крысы, хомяки) так называемой «назоассоциированной лимфоидной ткани» (НАЛТ) - функционального аналога кольца Пирогова-Вальдейера у людей [95]. Считается, что знания об иммунном ответе в НАЛТ дают представление об иммунных процессах в эквивалентной человеческой лимфоидной ткани [95,161]. Все это в совокупности позволило использовать данную методику в наших исследованиях локального противогриппозного иммунитета.

В настоящее время огромное внимание в мире уделяется способности противогриппозных вакцин стимулировать именно локальный иммунитет верхних дыхательных путей [164]. В мировой практике для профилактики гриппа применяются два типа вакцинных препаратов: интраназальные живые аттенуированные реассортантные гриппозные вакцины (ЖГВ) и парентеральные инактивированные гриппозные вакцины (ИГВ).

Доказано, что парентеральное (традиционное) введение ИГВ практически не стимулирует локальный противогриппозный иммунитет [13, 51, 52]. Поэтому в последние годы предпринята попытка создания ИГВ для интраназальной инокуляции совместно с мукозальными адъювантами. Однако такие вакцины пока не нашли широкого практического применения из-за наличия побочных эффектов, в том числе аллергизирующих свойств [161].

Альтернативой ИГВ является ЖГВ. Она значительно опережает инактивированные гриппозные вакцины по широте спектра индуцируемых факторов противовирусного иммунитета, в том числе и локальной природы [13,15,16,17].

Эталоном иммуногенности любых вакцин служит иммунный ответ, возникающий при естественной инфекции [10]. Поэтому важно установить, в какой степени метод получения вакцинных штаммов влияет на индукцию разных параметров иммунной защиты по отношению к вирулентному циркулирующему вирусу, из которого они приготовлены. Способ создания вакцинных штаммов для ЖГВ основан на генетической реассортации между вирулентным циркулирующим вирусом и холодоадаптированным донором аттенуации [1]. В результате такой реассортации вакцинные штаммы приобретают два гена поверхностных белков (гемагглютинина и нейраминидазы) от первого штамма и все гены внутренних белков (шесть) от второго. Как следствие, вакцинный штамм становится аттенуированным, то есть неспособным вызывать клинически выраженную инфекцию. Однако чрезмерная аттенуация вирусов гриппа может приводить к снижению их иммуногенности. Поэтому важно знать, насколько оптимально соблюден баланс между этими двумя признаками. Проверить этот баланс можно путем сопоставления иммуногенной активности вакцинного штамма и его вирулентного родительского вируса. К сожалению, проведение такого исследования доступно только в эксперименте из-за невозможности заражения людей «диким» вирулентным вирусом. Подобные экспериментальные работы по сравнению параметров поствакцинального иммунного ответа на ЖГВ и постинфекционного иммунного ответа ранее не проводились.

Недавно в опытах in vitro показано, что вирус гриппа является индуктором апоптоза лимфоцитов [128]. В этой связи изучение вирусиндуцированного апоптоза клеток лимфоидного ряда становится актуальным с точки зрения оценки последствий как гриппозной инфекции, так и массовой вакцинации гриппозными вакцинами. Однако исследований этого вопроса in vivo до настоящего времени не осуществлялось.

Цель исследования: изучить формирование локального и системного иммунного ответа на патогенный и аттенуированные вирусы гриппа А

Задачи исследования:

1. В эксперименте in vivo сравнить локальный иммунный ответ в HAJTT мышей на аттенуированный реассортантный вирус гриппа и его генетические родители (патогенный вирус и холодоадаптированный донор аттенуации) по следующим параметрам: выработка вирусспецифических секреторных антител, динамика пролиферативной активности общего пула лимфоцитов, накопление CD4+, CD8+ и CD19+-лимфоцитов и продукция Thl- и Th2- цитокинов.

2. Сопоставить эти данные с результатами тестирования системного иммунного ответа в селезенке мышей по тем же параметрам.

3. Изучить апоптоз лимфоцитов при гриппозной инфекции и вакцинации.

4. Оценить у людей способность ЖГВ: (i) стимулировать накопление CD4+-и CD8+- лимфоцитов в периферической крови; (ii) повышать авидность локальных IgA-антител.

Научная новизна работы.

1. Впервые проведено сравнительное исследование формирования локального иммунитета в HAJIT мышей при экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации мышей аттенуированным реассортантным вирусом гриппа А - экспериментальным аналогом вакцинного штамма для ЖГВ. Показано, что аттенуированный реассортант не уступает патогенному родительскому штамму A/PR/8/34 (H1N1) в активности индукции изученных факторов иммунитета.

2. Впервые исследован апоптоз лимфоцитов HAJIT и селезенки мышей в процессе развития иммунного ответа при гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным вирусом. Установлено, что в обоих случаях не возникает опасности индукции апоптотического дисбаланса иммунной системы.

3. Впервые проведена оценка ЖГВ по способности: (i) стимулировать накопление CD4+- и CD8+- лимфоцитов в периферической крови; (й) изменять авидность локальных антител. Отмечено, что в первом случае ЖГВ повышает уровень CD4+ и CD8+ в периферической крови лишь незначительно, во втором - активно увеличивает показатели авидности секреторных IgA-антител.

Практическая значимость работы.

1. В экспериментальных исследованиях на мышах оценен способ приготовления вакцинных штаммов для ЖГВ с позиции сохранения способности аттенуированного реассортантного вакцинного штамма индуцировать полноценный локальный иммунный ответ во входных воротах инфекции.

2. Обоснована иммунологическая безвредность ЖГВ с точки зрения опасности возникновения апоптотического дисбаланса иммунной системы.

3. Апробирован способ оценки иммуногенности ЖГВ у людей по авидности локальных IgA-антител.

4. В эксперименте на мышах дана оценка иммуногенности человеческого вируса А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) как кандидата в вакцинные штаммы для ЖГВ в случае угрозы возвращения в эпидемическую циркуляцию вируса гриппа серотипа A (H2N2).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иммунизация мышей аттенуированным реассортантным вирусом гриппа (экспериментальный аналог вакцинного штамма для ЖГВ) не уступает гриппозной инфекции в активности индукции изученных параметров локального иммунитета верхних дыхательных путей (продукция вирусспецифических секреторных антител, пролиферативная активность общего пула лимфоцитов, накопление в HAJIT CD4+-, CD8+- и CD19+-лимфоцитов и локальная секреция цитокинов).

2. Повторная неосложненная гриппозная инфекция и повторная вакцинация аттенуированным реассортантом не вызывают усиление апоптоза лимфоцитов HAJIT и селезенки. При первичном поствакцинальном и постинфекционном иммунном ответе апоптоз лимфоцитов этих органов увеличивается только на раннем этапе репродукции вирусов и продолжается не более суток. Далее показатели апоптоза возвращаются к норме.

3. У людей иммунизация ЖГВ существенно повышает авидность секреторных вирусспецифических IgA-антител. Поэтому данный маркер может рассматриваться в качестве дополнительного критерия оценки иммуногенности вакцинации в отношении индукции локального иммунного ответа.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VIII всероссийском форуме с международным участием им. акад. В.И. Йоффе «Дни иммунологии в. Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2004); на I международной конференции "Influenza Vaccines for the World " (Лисабон, 2004); на II всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004); на IX научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005) - доклад занял II место на конкурсе молодых ученых; на научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006) - доклад занял 1 место на конкурсе молодых ученых; на международной конференции молодых учёных Одесского государственного медицинского университета "Вчеш майбутнього" (Одесса, 2006).

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отделов иммунологии и вирусологи ГУ НИИЭМ РАМН 5 марта 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи и 7 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 129 страницах текста, включающего 21 таблицу и 12 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 191 источник, в том числе 33 отечественных и 158 иностранных.

выводы

1. Вакцинация аттенуированным реассортантным вирусом гриппа А (экспериментальным аналогом вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины) активно индуцирует локальный иммунный ответ в назоассоциированной лимфоидной ткани мышей (продукция секреторных антител, пролиферативная активность общего пула лимфоцитов, накопление СБ4+-, СБ8+- и СБ 19+-лимфоцитов и локальная продукция цитокинов). При этом по количественным показателям стимуляции перечисленных параметров она не уступает гриппозной инфекции.

2. По сравнению с гриппозной инфекцией, вакцинация мышей аттенуированным реассортантным штаммом менее активно стимулирует системный иммунный ответ, в частности, сывороточные ^в-антитела, накопление СБ8+-лимфоцитов и продукцию ИФН-у в селезенке

3. Гриппозная инфекция и вакцинация аттенуированным реассортантным штаммом приводят к усилению апоптоза локальных (в назоассоциированной лимфоидной ткани) и системных (в селезенке) лимфоцитов только при первичном иммунном ответе на раннем этапе репродукции вируса и на очень короткий промежуток времени (не более суток). При вторичном иммунном ответе на инфекцию и вакцинацию уровень апоптоза не увеличивается.

4. Иммунизация людей живой гриппозной вакциной:

- не повышает апоптоз мононуклеаров периферической крови;

- слабо влияет на изменение уровней СБ4+ и СБ8+ -лимфоцитов в периферической крови;

- способствует увеличению авидности локальных 1§Д-антител в секретах верхних дыхательных путей.