Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка влияния гриппозной инфекции и иммунизации живой реассортантной гриппозной вакциной на возникновение и течение IgE-опосредованных аллергических реакций организма

На правах рукописи

I

ЧИРКОВА 0030583Б9

Татьяна Викторовна

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ГРИППОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОЙ РЕАССОРТАНТНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНОЙ НА ВОЗНИКНОВЕНИЕ И ТЕЧЕНИЕ ^-ОПОСРЕДОВАННЫХ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ОРГАНИЗМА

14 00 36 - Аллергология и иммунология 03 00 06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003058369

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель

доктор медицинских наук Найхин Анатолий Нойевич

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Полевщиков Александр Витальевич доктор медицинских наук, профессор Аксенов Олег Алексеевич

ФГУ Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт Росздрава

Защита диссертации состоится «¿-/» мая 2007 года в часов на заседании Диссертационного Совета Д 001 022 01 при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул Акад Павлова, 12)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Автореферат разослан « ¿0 » ¿к^ф-буи1 2007 г

Ученый секретарь /ЗИ-"/^--

Диссертационного Совета, ЛГ/^Сг/

доктор медицинских наук ^ Бурова Лариса Александровна

Актуальность проблемы. В последние десятилетия в России, как и во всем мире, отмечен бурный рост распространенности аллергических заболеваний [Хаитов Р М и др , 1995, Marshall G D , 2004, Upham J W et al, 2005] В современной аллергологии одним из актуальных направлений является исследование роли респираторных вирусов в возникновении и проявлении IgE-опосредованных аллергических заболеваний дыхательного тракта [Хаитов М Р , 2003, Message S D, 2001, Openshaw Р J et al, 2004]

Эпидемиологические данные убедительно свидетельствуют о наличии прямой связи между острыми респираторными вирусными инфекциями и развитием или обострением таких форм аллергопатологии как атопическая бронхиальная астма и аллергические обструктивные бронхиты [Федосеев Г Б , 1996, Tan W С et al, 2003, Yasuda Н et al, 2005] Согласно одной из существующих концепций причиной тому является способность ряда возбудителей инфекции индуцировать так называемый патологический ТЬ2-иммунный ответ Предполагается, что вирус сам (за счет аллергенности своих поверхностных или внутренних белков) или опосредованно через повышенную продукцию ТЬ2-цитокинов (особенно ИЛ-4) приводит к накоплению общих и (или) вирусспецифических IgE и провоцирует развитие клинических симптомов аллергии [Holt Р G, 2002, Message S D , 2001, Openshaw Р J et al, 2004]

В последние годы установлено, что таким иммунопатологическим действием обладают респираторные инфекции, вызываемые респираторно-синцитиальным вирусом (PC), вирусами парагриппа (ПГ) и риновирусами [Хаитов М Р , 2003, Openshaw Р J et al, 2005, Welliver RC, 2003] Иммунный ответ на эти вирусы может сопровождаться развитием аллергической сенсибилизации к самому возбудителю и (или) к неинфекционным аллергенам Однако сведения о наличии такой способности у вируса гриппа носят противоречивый характер

С одной стороны, получены настораживающие экспериментальные данные о способности гриппозной инфекции отменять иммунологическую толерантность к неинфекционным респираторным аллергенам [Tsitoura DC et al, 2000] и повышать приток в слизистую респираторного тракта аллергенспецифических клеток памяти [Marsland В J et al, 2004] и дендритных клеток [Yamamoto N et al, 2000], за счет чего происходит усиление аллергического воспаления в легких Кроме того, в эпидемические сезоны именно грипп является наиболее частой причиной госпитализации лиц с симптомами острого осложнения астмы [Atmar R L et al, 1998, Teichtahl H et al, 1997]

С другой стороны, введение добровольцам с аллергическим ринитом в стадии ремиссии умеренно вирулентного вируса гриппа A(H1N1) не приводило к повышению продукции аллергенспецифических IgE и ИЛ-4 [Gentile D A et al, 2001] Получены данные, свидетельствующие о ингибирующем влиянии гриппозной инфекции на повышенную продукцию ТЬ2-цитокинов у мышей с экспериментально воспроизведенной бронхиальной астмой [Barends М et al, 2004] Таким образом, вопрос об аллергизирующем воздействии возбудителя гриппа на организм требует дополнительного изучения

Проблема развития аллергических IgE-опосредованных иммунных реакций в полной мере относится и к противовирусной вакцинации [Медуницин НВ, 2004] Высокая аллергенность экспериментальных инактивированных PC-вакцин [Openshaw Р J et al, 2005] и мукозальной интраназальной инактивированной гриппозной вакцины [Hodge L М et al, 2001] до сих пор не позволила внедрить эти высоко востребованные препараты в практику В обоих случаях причиной их повышенной аллергенности явилось поствакцинальное развитие патологического ТЪ2-иммунного ответа с накоплением высоких уровней общих и (или) вирусспецифических IgE Кроме того, показана способность парентеральной сплит-ИГВ за счет активации 1Ъ2-клеток индуцировать конъюнктивиты и респираторные осложнения анафилактоидного типа [Babiuk S et al, 2004, De Serres G et al, 2005]

Альтернативой парентеральной НТВ является живая холодоадаптированная реассортантная интраназальная вакцина (ЖГВ), разработанная академиком А А Смородинцевым и проф Г И Александровой [Смородинцев А А, 1984, Александрова Г И, Климов А И, 1994] Недавно подобная, но не идентичная вакцина лицензирована и в США [Smith S et al, 2006] За более чем двадцатилетний период практического применения ЖГВ уровень клинических аллергических реакций у привитых людей никогда не превышал нормы [Rudeko LG et al, 1996] В то же время, аллергенность ЖГВ с иммунологических позиций была проверена лишь в период ее внедрения в 80-х гг с использованием доступного тогда радиоиммунологического метода [Руденко JI Г и др, 1989] Однако накопленные за последние годы данные о повышенной аллергизации населения и роли респираторных вирусов в развитии аллергопатологий требуют изучения этого вопроса на новом качественном уровне

Если рассматривать массовую противогриппозную вакцинацию населения с позиции возможного возникновения негативного поствакцинального аллергизирующего эффекта, то особое внимание должны привлекать люди, предрасположенные к развитию патологического ТЪ2-иммунного ответа Анализ современной литературы позволяет выделить, по меньшей мере, три группы таких людей

Люди с возрастными дефектами иммунной системы — дети первых лет жизни и престарелые лица Особенность иммунного реагирования данных возрастных контингенгов заключается в недостаточности Thl-звена иммунитета, что может приводить к смещению противоинфекционного иммунного ответа в сторону Th2 [Openshaw Р J et al, 2004, Meyer К С , 2005] Иммунологическая безвредность ЖГВ у таких людей нуждается в более углубленном изучении

Лица с латентной сенсибилизацией, то есть имеющие повышенные уровни общих и (или) аллергенспецифических IgE, без клинических проявлений собственно аллергии Такие лица составляют группу риска в отношении перехода скрытой формы сенсибилизации в манифестную [Федосеев Г Б , 2001, Holt P.G et al, 2002] Потенциально

вакцинация может стать индуктором этого процесса Вопрос об последствиях вакцинопрофилактики гриппа у таких людей практически не изучен

Люди, страдающие бронхиальной астмой Такие лица особенно нуждаются в защите от гриппа, поскольку инфекция может вызывать тяжелейшие обострения данной аллергопатологии [Atmar R.L et al, 1998, Teichtahl H et al, 1997] На сегодняшний день профилактическая эффективность ИГВ у этих людей многими авторами ставится под сомнение [Abadoglu О et al, 2004, Bueving Н J, 2006] Как влияют на течение бронхиальной астмы аттенуированные реассортантные вирусы гриппа, остается неизвестным

Настоящая работа посвящена изучению перечисленных выше вопросов Цель исследования. Оценить у людей и экспериментальных животных влияние гриппозной инфекции и вакцинации атгенуированными реассортантными вирусами гриппа на возникновение и течение IgE-опосредованных иммунных реакций Задачи исследования.

1. В эксперименте на мышах изучить продукцию общих, вирусспецифических и овальбумин-(ОВА)-специфических IgE в сыворотке крови и секретах дыхательных путей при гриппозной инфекции и вакцинации атгенуированным реассортантным вирусом -экспериментальным аналогом вакцинного штамма для ЖГВ

2. Исследовать продукцию общих и вирусспецифических IgE системной и локальной природы у людей после перенесенной гриппозной инфекции

3. Сравнить продукцию общих, вирусспецифических и ОВА-специфических IgE, а также ТЫ- и ТЬ2-цитокинов у вакцинированных ЖГВ людей разных возрастов с учетом исходных уровней общих сывороточных IgE

4. Оценить влияние гриппозной инфекции и вакцинации атгенуированным реассортантным вирусом гриппа на течение и выраженность экспериментально индуцированной бронхиальной астмы у мышей

Научная новизна работы.

1. Впервые сопоставлена продукция у мышей трех типов локальных и сывороточных IgE (общие, вирусспецифические и ОВА-специфические) при первичной и вторичной гриппозной инфекции и вакцинации атгенуированным реассортантным вирусом гриппа Показаны постинфекционные и поствакцинальные отличия синтеза общих IgE Во всех случаях не обнаружено повышенного уровня вирусспецифических и ОВА-специфических IgE ни в сыворотке крови, ни в секретах дыхательных путей

2. Впервые проведено исследование влияния иммунизации ЖГВ на IgE-статус людей разного возраста в зависимости от исходных концентраций общих IgE в сыворотке крови Установлено, что введение ЖГВ детям, молодым людям и пожилым лицам не провоцировало развитие патологического ТЬ2-иммунного ответа Это касалось и лиц с исходными уровнями общих сывороточных IgE, значительно превышающими показатели нормы

3. Впервые охарактеризована локальная и системная продукция общих и вирусспецифических у переболевших гриппом людей Отмечено, что неосложненная гриппозная инфекция, вызванная вирусом А(НЗЫ2), не повышала синтез этих иммуноглобулинов у лиц с нормальными и высокими исходными уровнями общих сывороточных ^Е

4. Впервые осуществлено экспериментальное изучение влияния гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным штаммом на течение бронхиальной астмы в стадии обострения и в стадии ремиссии Показано, что и инфекция, и вакцинация, воспроизведенные у мышей на фоне острого аллергического воспаления респираторного тракта, приводили к усилению астматических явлений и аллергенспецифического ^Е-ответа То же самое наблюдалось при инфекции, развившейся в стадии ремиссии астмы Вакцинация же в этот период аттенуированным вирусом не сопровождалась повышением секреции ^Е и обострением астмы

Практическая значимость работы.

1. Осуществлено скрининговое обследование проживающих в Санкт-Петербурге людей разного возраста (дети, молодые люди, престарелые лица) для определения частоты выявления лиц с гиперпродукцией общих сывороточных 1£Е

2. Обоснована иммунологическая безвредность ЖГВ для детей дошкольного и школьного возраста, молодых людей и лиц пожилого возраста с позиций опасности поствакцинальной стимуляции патологического ТЪ2-иммунного ответа у лиц с латентной сенсибилизацией

3. Получены экспериментальные данные, являющиеся предпосылкой для обоснования возможности клинических испытаний ЖГВ у больных бронхиальной астмой в стадии ремиссии этого заболевания

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Скрининговые данные о концентрации общих сывороточных у детей 3-15 лет и молодых людей 18 — 22 лет без клинических признаков аллергических расстройств свидетельствуют о высокой частоте выявления случаев повышенной продукции этих иммуноглобулинов

2. Вакцинация ЖГВ таких людей не приводит к утяжелению аллергического статуса в форме усиления продукции общих, вирусспецифических и овальбуминспецифических IgE в сыворотке крови и секретах верхних дыхательных путей

3. Неосложненная гриппозная инфекция, вызываемая вирусом гриппа А, не индуцирует у условно здоровых молодых людей повышения синтеза сывороточных и локальных IgE

4. В отличие от инфекции, вакцинация мышей с экспериментальной астмой аттенуированным реассортантным вирусом (экспериментальный аналог вакцинного штамма для ЖГВ) не провоцирует усиление астматических явлений, если вакцинация осуществляется в стадии ремиссии этого заболевания

Личным вкладом автора является самостоятельное проведение всех экспериментальных исследований, включая приготовление необходимых препаратов, разработку схем их введения, работу с лабораторными животными, отбор и анализ материалов Автор принимал непосредственное участие в клинических испытаниях, включая сбор анамнестических данных, отбор и иммунологический анализ материалов Интерпретация полученных результатов выполнена лично автором Отбор добровольцев для клинических испытаний проводили медицинские работники местных лечебно-профилактических учреждений Автор выражает искреннюю благодарность дбн П В Пигаревскому за помощь в интерпретации патоморфологических данных, а также к м н С А Дониной за помощь в постановке иммунологических реакций

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IX научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург,

2005), на научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006) -доклад занял I место на конкурсе молодых ученых, на X научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург,

2006), на VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва,2006) Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отделов

иммунологии и вирусологи ГУ НИИЭМ РАМН 5 марта 2007 г

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи и 6 тезисов

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 134 страницах текста, включающего 21 таблиц и 12 рисунков Список цитируемой литературы содержит 186 источников, в том числе 30 отечественных и 156 иностранных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Вакцины. Для иммунизации использовали коммерческую живую холодоадаптированную реассортантную тривалентную гриппозную вакцину - ЖГВ (ФГУ «Микроген» - Иркутское предприятие по производству иммунобиологических препаратов) В состав ЖГВ входили рекомендованные ВОЗ холодоадаптированные реассортантные вирусы с биологической активностью штаммов типа A(H1N1), A (H3N2) 106,5 ЭИД 50/0,2 мл, типа В - Ю6'0 ЭИД 50/0,2 мл ЖГВ вводили ишраназально по 0,25 мл в каждый носовой ход

Обследованные контингенты. Вакцинированные ЖГВ 118 детей 3-6 лет и 114 детей 8-15 лет, посещавших детские сады и школы, 132 человека 18 - 22 лет из организованных коллективов и 42 пожилых человека 65 - 87 лет из домов престарелых

Больные гриппом 32 человека 18-20 лет из наблюдавшегося в эпидемический сезон 2003 - 2004 гг организованного коллектива Все коллективы и учреждения находились в г Санкт-Петербурге Отобранные для исследования лица не имели в анамнезе клинически выраженных аллергических заболеваний и лабораторно подтвержденных гельминтозов Молодые люди и дети прививались ЖГВ однократно, пожилые люди двукратно с интервалом в 21 день Вакцинация и забор исследуемых материалов (до иммунизации и через 21 день после вакцинации) производились на добровольной основе, у детей - после письменного разрешения родителей В каждой возрастной группе случайно-выборочным методом были сформированы подгруппы вакцинируемых и контроля, которым вводили препарат плацебо - стерильный физиологический раствор После вакцинации клинически выраженных аллергических реакций не было зафиксировано ни у одного из добровольцев в течение 21 дня наблюдения

Лабораторные животные. Экспериментальные исследования проводили на мышах линии СВА, самках, в возрасте 8-10 недель

Экспериментальная модель гриппозной инфекции и вакцинации. Мышам ишраназально вводили (i) 4,0 ^ЭИД^о/О,! мл патогенного для мышей вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), моделировавшего инфекцию, (п) 6,0 lg3HHso/0,l мл атгенуированного реассортанта 6/2, созданного по технологии приготовления вакцинных штаммов для ЖГВ и моделировавшего вакцинацию Реассортанг унаследовал 2 гена поверхностных белков (гемагглютинин и нейраминидаза) от (i) и все гены внутренних белков от холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) В качестве контроля использовались интактные мыши или животные, получившие не содержащую вирус аллантоисную жидкость куриных эмбрионов

Экспериментальная модель овальбумин-индуцированной бронхиальной астмы мышей. Бронхиальную астму у мышей воспроизводили согласно методике Tsitoura D С и соавт [Tsitoura D С et al, 2000] Для создания первичной сенсибилизации животным внутрибрюшинно (день 0 опыта) вводили 100 мкг овальбумина (OBА) (МР Biomedicals, Inc, США), сорбированного на 2 мг адьюванта гидроксида алюминия Затем спустя 10 дней троекратно (дни 10, 11 и 12) вводили интраназально разрешающие дозы OB А (50 мкг)

Иммуногенность ЖГВ оценивали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) по стандартной методике с использованием 4 ГАЕ/50 мкл антигенов вирусов гриппа А и В, входящих в состав ЖГВ Для удаления термостабильных и термолабильных ингибиторов гемагглютинации сыворотки обрабатывали экстрактом нейраминидазы авирулентного штамма холерного вибриона (Deka Seiken Со, Япония) с прогреванием при 56°С

Определение общих IgE в сыворотке крови и секретах верхних дыхательных путей (СВДП) у людей проводили в иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием коммерческих тест-систем (ООО «Полигност», Санкт-Петербург) Согласно прилагаемой инструкции к тест-системам, нормальный уровень общих сывороточных IgE составляет

для детей 1 года 8-20 КЕ/л, для детей 5 лет 10 - 50 КЕ/л, для детей 10 лет 15 - 60 КЕ/л, для взрослых 20 - 100 КЕ/л

Титры вирус- и ОВА-специфических IgE у людей определяли в непрямом варианте ИФА по ранее разработанной методике [Найхин АН и др, 1997] Рабочая доза сорбируемого антигена составляла 16 ГАЕ/0,1 мл вирусов или 10 мкг/мл ОВА За титр антител принимали оптическую плотность (ОП) последнего разведения исследуемого материала, превышающую ОП контроля (все ингредиенты реакции без исследуемого образца) в 2 и более раза

Уровни ИФНу и ИЛ-4 у людей определяли в ИФА со стандартными наборами (Biosource International, США) в надосадках 4-дневных культур мононуклеаров периферической крови (МПК), стимулированных 20 ГАЕ/0,1 мл инактивированных антигенов вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В, входящих в состав ЖГВ

Определение общих IgE и ОВА-специфических IgE в сыворотках крови, смывах дыхательного тракта у мышей проводили в ИФА с использованием коммерческих тест-систем (BD Biosciences Pharmingen, США) При определении ОВА-специфических IgE на планшеты сорбировали ОВА (MP Biomedicals, Inc, США) в концентрации 10 мкг/мл [YamamotoN etal,2000]

Титры вирусспецифических IgE и IgG у мышей определяли в непрямом варианте ИФА [Найхин А Н и др , 1997] Вирусный антиген сорбировался в дозе 20 ГАЕ/мл

Уровни ИЛ-4 у мышей определяли в ИФА со стандартными наборами (BD Biosciences Pharmingen, США) в супернатантах 3-дневных культур лимфоцитов селезенки и легких, стимулированных 100 мкг/мл ОВА

Гистологическую обработку кусочков легких мышей после фиксации в нейтральном 10% растворе формалина проводили по стандартной методике [Волкова О В , 1982] с приготовлением парафиновых срезов и окраской гематоксилином и эозином

Статистическая обработка результатов выполнена стандартными методами с помощью t критерия Стьюдента, критерия %2, показателя корреляции г Обработку данных вели в программе «Excel»

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Продукция IgE у мышей после экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации Изучена системная и локальная продукция общих, вирус- и ОВА-специфических IgE у несенсибилизированных мышей при первичной и вторичной экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным вирусом

Показано, что и инфекция, и вакцинация активировали продукцию общих IgE на системном уровне (рис. 1) Однако в отличие от патогенного вируса, аттенуированный реассортант не провоцировал синтез общих IgE в верхних и нижних отделах респираторного тракта Важно отметить, что в обоих случаях не наблюдалось появление

^Е-антител к вводимым штаммам и к ОВА - компоненту аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, в которой происходит накопление вирусов г риппа Л и В.

(О

(О

О S 10 15 20 35

РиС.1. Продукция общи* IgE у мышей при экспериментальной ¡-ригтозной инфекции к

вакцинации. Уровни IgE измеряли: А - в сыворотках крови (м кг/мл); Б — в смывах верхнего отдела респираторного тракта (нг/мл); В — в смьгвах нижнего отдела респираторного тракта (нг/мя) после первичного fi) и вторичного (И) (через 21 день после первичного) введения вирусов. Черные столбики - патогенный вирус гриппа A/PR/8/34 (инфекция); серые столбики -аттенуирован ный реассортант 6/2 (вакцинации); белые столбики — контроль (интакгные животные). Здесь и далее: различия с уровнем контроля достоверны * - при р<0,05; ** - при р<0,01; *** - при р<0,001.

Таким образом, при повторной инокуляции как патогенного, так и аттенуированного вирусов наблюдалось достоверное увеличение концентраций общих IgE в сыворотке крови. В этом наши результаты согласуются с данными американских авторов, полученными при инграназальном введении мышам инактивированного вируса A(H1N1) [Hodge L.M. et al., 2001], Однако эти авторы ограничились исследованием системной продукции IgE, не затрагивая их локальный синтез. В то же время, материалы собственных исследований (рис. 1) свидетельствуют, что принципиальные различия между вирус-индуцированной продукцией IgE при гриппозной инфекции и вакцинации проявляются именно на локальном уровне. По-видимому, эти отличия связаны, прежде всего, с потерей способности аттенуированного реассортантного вируса к активной репликации в легких [Рекстин А.Р. и др., 2002], а следовательно, и к стимулированию синтеза IgE в этом участке респираторного тракта. Косвенным подтверждением тому могут служить данные о возможности переключения В-клеток на синтез IgE посредством антивирусной протеи нкин азы, накапливающейся в клетках при их инфицировании [Rager K.J. et al., 1998], что указывает на связь между интенсивностью репликации вируса и локальной продукциейIgE.

i I

Распределение концентраций общих сывороточных IgE среди людей разных возрастных групп. По данным [Зурочка A.B. я др., 2005J в Уральском регионе доля людей с латентной сенсибилизацией достигала 66%. В Санкт-Петербурге такие исследования не проводились, С целью получения сведений по этому вопросу нами обследовало 438 человек 3 - 6, 8 - 15, 18 - 22 и 65 - 87 лет, проживающих в городе (рис. 2). В качестве скр и нин го во го теста выбрано определение общих IgE в сыворотке крови, поскольку в большинстве случаев их уровень коррелирует с уровнем аллерген специфических IgE у сенсибилизированных людей [Panzani R.C. et al., 1993; Tariq S.M. et a!., 1996] и является общепризнанным тестом первого уровня для диагностики аллергопатологии [Тотолян A.A., 1998].

Рис.2. Уровни общи* сывороточных 1§Е у условно здоровых людей разных возрастных групп. Л - дети 3 — 6 лет (п=118); Б -дети 8 - 15 лет (п=114); В-лица 18-22 лет (в=164); Г - люди 65 -87 лет (п=42). Все обследованные не имели в анамнезе клинически выраженных аллергических заболеваний и лабераторно подтвержденных гельминтозов.

Количество людей (%) с концетрациями ^Е: белый сектор - в пределах нормы; серый сектор -■ в 1,5 - 4,9 раза выше нормы; черный сектор —в 5,0 - 17,4 раза выше нормы.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой частоте выявления у детей и молодых людей случаен превышения нормальных показателей концентрации ^Е. В то же время, у лиц старше 65 лет такая гиперпродукция общих ^Е наблюдалась крайне редко, По-видимому, это связано со сниженной иммунной реактивностью престарелых людей в отношении немедленных (^Е-опосредованных) реакций на аллергены [Ыакага\уа Т., 1994], Поскольку все обследованные лица не страдали клинически выраженными аллергическими расстройствами и лаборатории подтвержденными гельминтозами, обнаруженные нами существенные превышения нормы общих ^Е, по всей видимости, связаны с наличием у обследованных людей скрытой аллергической сенсибилизации.

Продукция Е у людей, перенесших естественную гриппозную инфекцию Как

уже упоминалось, нами были получены настораживающие данные о повышении продукции общих сывороточных 1{*Е у мышей, перенесших экспериментальную гриппозную инфекцию (рис 1) В этой связи мы попытались ответить на вопрос, индуцируется ли ^Е-иммунный ответ при естественной гриппозной инфекции людей

У 32 молодых людей из наблюдаемого коллектива, которые перенесли клинически выраженный и серологически подтвержденный неосложненный грипп А(НЗЫ2) в эпидемический сезон 2003 - 2004 гг, было осуществлено определение концентраций общих IgE и средних геометрических тиров (СГТ) вирусспецифических в сыворотке крови и секретах верхних дыхательных путей до и после заболевания (рис. 3)

СГТ 5

4

3

Вирусспецифические ^Е в сыворотках крови

п п

II

КЕ/л 5

Общие ^Е в СВДП

1

II

СГТ 5

4

3

2 Н

Вирусспецифические ^Е в СВДП

яги

II

РисЗ Продукция 1(»Е у людей 18-20 лет, перенесших неосложненную гриппозную инфекцию А(НЗШ). По оси ординат - концентрации общих ^Е (КЕ/л) и ^Е - антител (СГТ) к вирусу гриппа А(НЗ№) I - люда с исходными уровнями общих сывороточных ^Е в пределах нормы (п=15) и II - лица с гиперпродукцией ^Е (уровни общих сывороточных ^Е в 5,0 - 12,7 раз выше нормы) до заболевания (п=10) Пунктиром обозначена верхняя граница нормы общих 1§Е (100 КЕ/л) Белые столбики - до заболевания, серые столбики - после перенесенной инфекции

Ни у лиц с нормальными концентрациями общих ^Е до заболевания, ни у людей с исходной гиперпродукцией (превышение нормы в 5,0 - 12,7 раз) не отмечено достоверное увеличение средних показателей всех перечисленных типов после перенесенной инфекции

Таким образом, экспериментальные данные по заражению мышей патогенным вирусом отличались от результатов обследования переболевших гриппом людей в первом случае отмечено усиление продукции общих сывороточных и локальных ^Е, во втором такое усиление отсутствовало В то же время естественная гриппозная инфекция людей, как и экспериментальная, не провоцировала накопление вирусспецифических ^Е

Продукция у людей разного возраста, иммунизированных ЖГВ Принимая во внимание данные литературы и собственные результаты (рис 2) о значительном количестве людей с латентной сенсибилизацией, нами проведено специальное исследование, цель которого заключалась в оценке аллергоиммунологических последствий вакцинации ЖГВ у этих лиц с учетом их возраста В общей сложности проиммунизировано 196 человек четырех возрастных категорий 3 - 6, 8 — 15, 18 - 22 и 65 -87 лет

В зависимости от предвакцинального уровня общих сывороточных дети и молодые люди были разделены на три группы лица с концентрациями ^Е в пределах нормы, с превышением нормы в 1,5 - 4,9 раза и люди с гиперпродукцией 1§Е (превышение нормы в 5,0 и более раз) У престарелых людей вычленить репрезентативную группу с гиперпродукцией общих ^Е не удалось, поскольку их доля не превышала 5% (рис 2) Определяли уровни общих вирус- и ОВА-специфических ^Е до и после иммунизации в сыворотке крови и СВДП, а также вирусспецифические антигемагглютинирующие антитела в РТГА и секреторные 1£А в ИФА

Тестирование сывороточных и секреторных вирусспецифических антител показало высокую иммуногенность ЖГВ у вакцинированных всех групп (кратность прироста средних геометрических титров антител к вакцинным штаммам колебалась от 1,7 до 5,0 в РТГА и от 1,5 до 3,1 в ИФА, р<0,05 - 0,001)

Иммунизация ЖГВ молодых людей и детей 3-6 лет не приводила к достоверному увеличению средних уровней общих 1§Е в сыворотках крови и СВДП (рис. 4, 5) Такие же результаты получены и в отношении детей 8-15 лет (данные не приведены) Во всех возрастных группах это касалось и лиц с исходной гиперпродукцией (превышение нормы общих сывороточных 1§Е в 5,0 и более раз)

Средние геометрические титры вирусспецифических ^Е у детей, также как и у молодых людей (рис 4), колебались в интервале 1,00 - 1,32 Это связано с тем, что у большинства обследованных (89 - 95%) титры ^-антител, специфических к вакцинным штаммам, не определялись вовсе, а у остальных не превышали разведения 1 2

КЕ/л 1200

1000

КЕ/л

СГТ

Вирусспецифические ^Е в сыворотках крови

И

II

СГТ

Вирусспецифические 1%Е вСВДП

п л I

I

II

Рис.4. Продукция ^Е у людей 18 - 22 лет после иммунизации ЖГВ По оси ординат -концентрации общих ^Е (КЕ/л) и ^Е - антител (СГТ) к вирусу гриппа А(НШ1)* I - люди с исходными уровнями общих сывороточных ^Е в пределах нормы и II - лица с гиперпродукцией 1яЕ (уровни общих сывороточных ^Е в 5,0 - 13,3 раз выше нормы) до вакцинации Пунктиром обозначена верхняя граница нормы общих ^Е (100 КЕ/л) Серые столбики - привитые ЖГВ (I - п=27, II - п=7), белые столбики - получившие препарат плацебо (1-п=21,П-п=6)

* Результаты, полученные с вирусами гриппа А(НЗ№) и В, близки по значению

Близкие по значению результаты получены у вакцинированных 65 лет и старше (рис. 6) Накопления ОВА-специфических 1§Е после вакцинации ни у одного из обследованных обнаружено не было

Таким образом, по нашим данным, ЖГВ не представляет опасности с точки зрения провокации ^-иммунных реакций у детей, лиц активного возраста и стариков даже в случае латентной сенсибилизации организма, проявляющейся в гиперпродукции общих

КЕ/л 2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

Общие /¿Е в СВДП

Ах

Ш

I и

Рис.5. Продукция ^Е у детей 3-6 лет после иммунизации ЖГВ. По оси ординат -концентрации общих 1еЕ (КЕ/л) I - люди с исходными уровнями общих сывороточных ^Е в пределах нормы и П - лица с гиперпродукцией ^Е (уровни общих сывороточных 1§Е в 5,0 -17,4 раз выше нормы) до вакцинации Пунктиром обозначена верхняя граница нормы общих ^Е (50 КЕ/л) Серые столбики - привитые ЖГВ (I - п=31, II - п=20), белые столбики - получившие препарат плацебо (I - п=26, II - п=17)

Обращает на себя внимание факт отсутствия поствакцинального увеличения вирус-и ОВА-специфических Аналогичные данные получены при экспериментальной и естественной гриппозной инфекции (рис 1, 3) и экспериментальной вакцинации (рис 1) Вероятно, это служит доказательством, во-первых, отсутствия у вируса гриппа свойств аллергенности, во-вторых, неспособности вакцинных штаммов отменять толерантность к аллергенному компоненту вакцины - овальбумину В то же время доказано, что РС- и ПГ-инфекции не только стимулируют синтез вирусспецифических 1;>Е, но и провоцируют развитие сенсибилизации к ОВА [Вагепёэ М е1 а1, 2004, Т^еШуег Я С , 2003]

КЕ/л

Рис.6. Продукция ^Е у пожилых людей 65 - 87 лет после иммунизации ЖГВ По оси

ординат - концентрации общих ¡ЯЕ (КЕ/л) Серые столбики -привитые ЖГВ (п=22), белые столбики - получившие препарат плацебо (п=20)

Продукция ТЫ- и ТИ2- цитокинов у молодых и пожилых людей, иммунизированных ЖГВ Основным цитокнном, ответственным за переключение В-клеток на синтез 1§Е, является ИЛ-4 [Бшктое в е! а1, 2000] Считается, что его антагонистом является ИФНу [ТЪурЬгопШБ в е1 а1, 1989] В этой связи нами исследован вопрос о влиянии вакцинации ЖГВ на индукцию этих цитокинов

Показатели вирусспецифической продукции ИЛ-4 и ИФНу оценивали у тех же иммунизированных молодых и пожилых людей, у которых определяли ^-синтез (рис 7) В группу молодых вошли лица с исходными уровнями общих сывороточных 1§Е в >1,5 раза выше нормы, из которых более 30% составляли люди с гиперпродукцией ^Е (превышение нормы в 5,0 — 13,3 раз)

Рис 7. Продукция ИФНу и ИЛ-4 у лиц 18 - 22 и 65 - 87 лет после иммунизации ЖГВ. По оси

ординат - концентрация цитокинов (пг/мл) в надосадках культур мононуклеаров периферической крови, стимулированных вирусом гриппа A(H1N1)* М-18-22 лет, П - 65 — 87 лет Серые столбики -привитые ЖГВ (М - п=21, П -п=22), белые столбики -получившие препарат плацебо (М -п=24, П - п=20)

* Результаты, полученные с вирусами гриппа A(H3N2) и В, близки по значению

Введение ЖГВ привело к достоверному повышению уровней ИФНу, но не ИЛ-4 у люд«й обоих возрастных групп Другими авторами отмечена очень низкая продукция ИЛ-4 и при неосложненной гриппозной инфекции не только у условно здоровых людей, но и у больяых аллергическим ринитом [Gentile D A et al, 2001] В то же время при РС-инфекции и PC-вакцинации наблюдалась обратная ситуация - гиперпродукция ИЛ-4 и IgE [Pala Р et al, 2002; Sigurs N et al, 1995, Oumouna M et al, 2005] Поэтому с высокой долей достоверности можно утверждать, что приведенные выше данные об отсутствии IgE-имм^таного ответа у больных гриппом и вакцинированных ЖГВ людей (сенсибилизированных и несенсибилизированных) объясняется низкой продукцией ИЛ-4 на фоне активной выработки ИФНу

Таким образом, нами показано, что у людей иммунизация ЖГВ, а также неоспожненная гриппозная инфекция, не провоцируют развития патологического Th2-иммунного ответа в виде гиперпродукции ИЛ-4 и накопления общих, вирус- и ОВА-спепифических IgE

Влияние гриппозной инфекции и вакцинации на течение аилергопатологиц респираторного тракта в условиях экспериментальной модели бронхиальной астмы.

Гриппозная инфекция вызывает тяжелые осложнения у лиц, страдающих бронхиальной астмой [АПпаг ИХ. е! а!., 1998; Те1сЫа]11 Н. е1 а1., 1997]. Поэтому такие люди в первую очередь нуждаются в вакцинопрофилактике. Вопрос о возможности применения ЖГИ у лиц, страдающих бронхиальной астмой, практически не изучен. Естественно, что на первом этапе такие исследования возможны только в условиях эксперимента.

Бронхиальную астму у мышей воспроизводили согласно модели [Тзйошга О.С. е1 а1., 2000]. Обработка данной модели (рис. 8) показала, что через 48 часов после заключительной инокуляции ОВА у мышей наблюдается острая стадии астмы (высокие уровни аллерген-(ОВА)-специфических ¡^Е, признаки острого аллергического воспаления и астмы в легких), а через ] 0 дней - существенный спад аллергического воспалении (снижение уровней ОВА-специфических ^Е, сокращение участков эмфиземы и лимфогистиоцитарной инфильтрации в легких). Таким образом, данная модель позволила выделить две основных стадии течения бронхиальной астмы (острое воспаление и ремиссия).

Рис. 3. Продукции аллерген-{ОВА)-спедифнческих и п агом Орфо логические изменения в легких у мышей с ОВА-индуцированной бронхиальной астмой. По оси ординат — концентрации ОВА-специфических 1£Е (иг/мл). Серый столбик - через 48 часов после заключительного введения ОВА; белый столбик - через 10 дней после заключительного введения ОВА. Патоморфо логические изменения в легких (окраска гематоксилином и эозином)," ! - через 48 часов после заключительной инокуляции ОВА в респираторном отделе легких наблюдается развитие острога воспалительного процесса, развиваются отек слизистой оболочки бронхов и инфильтрация непрофильными и эозинофильньеми лейкоцитами. В соседних участках легочной ткани присутствуют признаки острой обструктивной эмфиземы. '¡. -через 10 дней после заключительного введения ОВА в легочной ткани мышей отмечается смена острой фазы воспаления на продуктивную. Среди клеток лимфогистиоцитарной Лериброяхиальной инфильтрации преобладают не грану по питы, а различной степени зрелости лимфоциты и макрофаги. В респираторном отделе легкого сохраняются участки очагов зй эмфиземы. 3 - все перечисленные патоморфо логические изменения отсутствуют при нормальном строении паренхимы легких (интактные животные).

Главные отличия нашего опыта от воспроизводившихся ранее [Маге1апс1 В I й а1, 2004, Твйоига Б С е1 а1, 2000, УашашоЮ N е1 а1, 2000] заключались в следующем Во-первых, в цитируемых работах авторы акцентировали свое внимание на течении аллергопатологии респираторного тракта, индуцируемой на разных стадиях инфекционного процесса, тогда как условия нашего эксперимента позволили оценить влиянии вирусов на разные фазы собственно аллергического воспаления Во-вторых, авторы использовали только патогенные вирусы гриппа, в нашей работе впервые проведено сравнительное изучение инфекции и вакцинации атгенуированным реассортантным вирусом

Воспроизведение гриппозной инфекции и вакцинации на разных стадиях течения бронхиальной астмы осуществляли по следующей схеме (рис. 9-А, -Б)

В стадии острой астмы и гриппозная инфекция, и вакцинация провоцировали усиление аллергического воспаления Это выражалось в повышенной продукции аллерген-(ОВА)-специфических (рис. 9-В) и выраженных патоморфологических изменениях в легких (рис. 9-Г) В то же время в период ремиссии астмы такой эффект наблюдался только при введении патогенного вируса У животных, вакцинированных атгенуированным реассортантом, все перечисленные показатели аллергического ответа не превышали уровней контроля

Ранее было показано, что экспериментальная гриппозная инфекция за счет активации процессов захвата и презентации аллергена может провоцировать обострение ОВА-зависимой астмы [Маг$1ап<1 В I й а1, 2004, УататоЮ N е1 а1, 2000] Однако выводы авторов основывались только на результатах, полученных в остром периоде астмы Наши данные свидетельствуют, что гриппозная инфекция активно стимулирует аллергический ответ не только в острой фазе, но и в период ремиссии бронхиальной астмы В то же время иммунизация атгенуированным реассортантом приводит к усилению аллергического воспаления только в его острой стадии

Таким образом, в отличие от инфекции вакцинация атгенуированным реассортантным вирусом гриппа в период ремиссии бронхиальной астмы не представляет угрозы с точки зрения провокации обострения данной аллергопатологии. Полученные результаты могут явиться предпосылкой для клинических исследований возможности применения ЖГВ у людей, страдающих астмой

/ОВА\ 1 л ) \ ) 1 /ТЛ А |

*шт<о:Ы ы М»1

Индукция ОВА-зависимой бронхиальной астмы гг

Ведение вирусов или АлЖ (контроль)

700 г-

600 I

500 400

|

300 ] 200 100 1

О -

Рис.9. Влияние гриппозной инфекции и вакцинации на течение разных патогенетических стадий бронхиальной астмы. Стадия острого воспаления (А): мышам после индукции ОВА-зависимой бронхиальной астмы (дни 0 - 12), через 48 часов (день 14) вводили патогенный вирус гриппа (инфекция), аттенуированный реассортант (вакцинация) или не содержащую вирусы аллгтоисную жидкость куриных эмбрионов (АлЖ) в качестве контроля. Стадия ремиссии (Ь): те же вирусы вводили мышам через 10 дней (22 день) после индукции астмы. В - продукция ОВА-специфических (пг/мл) в сыворотках крови мьгшсй с ОВА-зави симоЙ бронхиальной астмой после введения исследуемых вирусов. Черные столбики - патогенный вирус АУРКУ8/34 (инфекция); серые столбики - аттенуированный реассортант 6/2 (вакцинация); белые столбики — АлЖ -контроль (АлЖ, как субстрат для накопления вируса, является компонентом вирусного ннокумта), Г - патоморфологические изменения в легких мышей с бронхиальной астмой после введения вирусов (окраска гематоксилином и эозином). При иммунизации животных патогенным вирусом в острой стадии астмы (К) признаки развития воспалительного процесса в легких и бронхиальной астмы значительно усиливаются. Слизистый и подслизистый слои стенок бронхов заполнены лимфо-гистиоцитарньЕм клеточным инфильтратом, в просветах выявляются многочисленные нейтроф ильные и эозиноф ильные лейкоциты. При введении в острой стадии астмы агтенуированного вируса (2) в ткани легкого у большинства животных выявляется обширные очаги воспаления, в просветах бронхов и альвеол выявляются целые поля, состоящие из нейтрофипьных и эозинофильных лейкоцитов, большинство из которых находится на стадии распада. При иммунизации животных патогенным вирусом в период ремиссии астмы (3) в респираторном отделе легкого встречаются Обширные участки очаговой эмфиземы, резко выражена пери бронхиальная и перчваскулярная лимфогиетиоцитарная инфильтрация. При введении в период ремиссии астмы аттенуированного вируса (4) патоморфологнческие изменения в респираторном отделе лепсих практически отсутствуют, строение бронхов и альвеолярного аппарата соответствует норме (см, рис. 8-3).

Ведение вирусов ни л АлЖ (контроль)

ВЫВОДЫ

1 Среди обследованных жителей г Санкт-Петербурга 3-6,8-15и18-22 лет, не имеющих в анамнезе аллергических заболеваний и лабораторно подтвержденных гельминтозов, доля лиц с превышением нормальных уровней общих сывороточных 1||Е в 2 - 17 раз составляет 48 - 57% У людей 65 лет и старше этот показатель не превышает 5%

2 Иммунизация этих возрастных контингентов живой гриппозной вакциной не приводит к повышению продукции общих, вирус- и овальбуминспецифических

на системном и локальном уровнях Это касается лиц как с нормальными, так и с высокими исходными концентрациями общих сывороточных 1§Е

3 Неосложненная гриппозная инфекция у молодых людей 18 - 20 лет с повышенными и нормальными исходными уровнями общих 1{>Е также не провоцирует усиление ¡^-синтеза (общие и вирусспецифические ^Е в сыворотках крови и секретах верхних дыхательных путей)

4 Гриппозная инфекция, возникающая на фоне экспериментально индуцированной бронхиальной астмы, приводит к обострению аллергического воспаления респираторного тракта как в острой фазе астмы, так и в период ремиссии

5 В отличие от инфекции иммунизация атгенуированным реассортантным вирусом гриппа (экспериментальный аналог вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины) в период ремиссии астмы не представляет угрозы с точки зрения усиления 1£Е-опосредованных аллергических реакций и воспалительных изменений в респираторном тракте

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1 Чиркова Т.В , Найхин А Н , Донина С А , Григорьева Е П , Петухова Г Д, Руденко Л Г Продукция сывороточных и локальных IgE у молодых людей при гриппозной инфекции и иммунизации живой гриппозной вакциной//Аллергология -2006 -№ 1 -С 33-38

2 Чиркова Т.В., Найхин АН, Донина С А, Григорьева ЕП, Петухова ГД, Рекстин \ Р, Дешева Ю А, Руденко Л Г Продукция общих и вирусспецифических IgE у детей и пожилых людей, иммунизированных живой гриппозной вакциной // Аллергология - 2006 - №3 - С 17 -21

3 Чиркова Т.В., Петухова Г Д, Найхин А Н Аллергическое воспаление респираторного тракта и вирус гриппа инфекция и противогриппозная вакцинация // В сб Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань - Волгоград - Москва - Иэд-во Астраханской государственной медицинской академии -2006 - С 165-169

Тезисы:

4 Чиркова Т.В , Донина А С, Григорьева Е П, Баранцева И Б, Найхин А Н Атопический ГЬ2-иммунный ответ при гриппозной инфекции и иммунизации гриппозными вакцинами // Медицинская иммунология -2005 -Том 7 -№2-3 -С 330-331

5 Чиркова Т.В, Донина С А, Григорьева ЕП, Найхин АН Изучение влияния гриппожой инфекции и вакцинации на возникновение IgE-опосредованных иммунных реакций у людей разного возраста//Цитокиныи воспаление -2005 -Том4 -№3 -С 148-149

6 Чиркова Т.В, Найхин А Н Последствия гриппозной инфекции и противогриппошой вакцинации у мышей с экспериментально индуцированным аллергическим воспалением респираторного тракта//Медицинская иммунология -2006 -Том 8 -№2-3 - С 188-189

7 Чиркова Т.В., Донина С А , Петухова Г Д , Григорьева Е П , Найхин А Н Иммунный отв<т на гриппозную инфекцию и вакцинацию живой гриппозной вакциной в условиях аллергиче:кой сенсибилизации организма//Аллергология и иммунология —2006 —Том 7 -№3-С 341

8 Чиркова Т.В , Петухова Г Д Изучение влияния гриппозной инфекции и противогриппозной вакцинации на течение аллергопатологии респираторного тракта в эксперименте in vivo // Тез докл междунар конф молодых ученых ОГМУ «Вчет майбутнього» - ОГМУ, 2006 - С 34

9 Naykhin А N, Rekstin A R, Domna S А , Barantseva IВ , Gngoneva Е Р , Chirkova T.V., Petuhova G D , Rudenko L G Experimental Study of Immunogenic Properties of Russian Live Influenza Vaccine // In Abstract book of "IVW-2004 Conference" - 2004, 24-26 May, Lisbon, Portugal Poster session A -P 91

Подписано в печать 18 04 07 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ 34

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ "ЛЭТИ"

Издательство СПбГЭТУ "ЛЭТИ" 197376, С-Петербург, ул Проф Попова, 5

Актуальность проблемы. В последние десятилетия в России, как и во всем мире, отмечен бурный рост распространенности аллергических заболеваний [29, 104, 174]. В современной аллергологии одним из актуальных направлений является исследование роли респираторных вирусов в возникновении и проявлении IgE-опосредованных аллергических заболеваний дыхательного тракта [26, 109,125].

Эпидемиологические данные убедительно свидетельствуют о наличии прямой связи между острыми респираторными вирусными инфекциями и развитием или обострением таких форм аллергопатологии как атопическая бронхиальная астма и аллергические обструктивные бронхиты [24, 164, 182]. Согласно одной из существующих концепций причиной тому является способность ряда возбудителей инфекции индуцировать так называемый патологический ТЬ2-иммунный ответ. Предполагается, что вирус сам (за счет аллергенности своих поверхностных или внутренних белков) или опосредованно через повышенную продукцию Т112-цитокинов (особенно ИЛ-4) приводит к накоплению общих и (или) вирусспецифических IgE и провоцирует развитие клинических симптомов аллергии [87, 109, 125].

В последние годы установлено, что таким иммунопатологическим действием обладают респираторные инфекции, вызываемые респираторно-синцитиальным вирусом (PC), вирусами парагриппа (ПГ) и риновирусами [26, 124, 176]. Иммунный ответ на эти вирусы может сопровождаться развитием аллергической сенсибилизации к самому возбудителю и (или) к неинфекционным аллергенам. Однако сведения о наличии такой способности у вируса гриппа носят противоречивый характер.

С одной стороны, получены настораживающие экспериментальные данные о способности гриппозной инфекции отменять иммунологическую толерантность к неинфекционным респираторным аллергенам [172] и повышать приток в слизистую респираторного тракта аллергенспецифических клеток памяти [106] и дендритных клеток [179], за счет чего происходит усиление аллергического воспаления в легких. Кроме того, в эпидемические сезоны именно грипп является наиболее частой причиной госпитализации лиц с симптомами острого осложнения астмы [36, 168].

С другой стороны, введение добровольцам с аллергическим ринитом в стадии ремиссии умеренно вирулентного вируса гриппа A(H1N1) не приводило к повышению продукции аллергенспецифических IgE и ИЛ-4 [75]. Получены данные, свидетельствующие о ингибирующем влиянии гриппозной инфекции на повышенную продукцию ТЬ2-цитокинов у мышей с экспериментально воспроизведенной бронхиальной астмой [41]. Таким образом, вопрос об аллергизирующем воздействии возбудителя гриппа на организм требует дополнительного изучения.

Проблема развития аллергических IgE-опосредованных иммунных реакций в полной мере относится и к противовирусной вакцинации [14]. Высокая аллергенность экспериментальных инактивированных РС-вакцин [124] и мукозальной интраназальной инактивированной гриппозной вакцины [85] до сих пор не позволила внедрить эти высоко востребованные препараты в практику. В обоих случаях причиной их повышенной аллергенности явилось поствакцинальное развитие патологического ТЬ2-иммунного ответа с накоплением высоких уровней общих и (или) вирусспецифических IgE. Кроме того, показана способность парентеральной сплит-ИГВ за счет активации ТЬ2-клеток индуцировать конъюнктивиты и респираторные осложнения анафилактоидного типа [38, 63].

Альтернативой парентеральной ИГВ является живая холодоадаптированная реассортантная интраназальная вакцина (ЖГВ), разработанная академиком А.А. Смородинцевым и проф. Г.И. Александровой [22, 1]. Недавно подобная, но не идентичная вакцина лицензирована и в США [157]. За более чем двадцатилетний период практического применения ЖГВ уровень клинических аллергических реакций у привитых людей никогда не превышал нормы [140]. В то же время, аллергенность ЖГВ с иммунологических позиций была проверена лишь в период ее внедрения в 80-х гг. с использованием доступного тогда радиоиммунологического метода [21]. Однако накопленные за последние годы данные о повышенной аллергизации населения и роли респираторных вирусов в развитии аллергопатологий требуют изучения этого вопроса на новом качественном уровне.

Если рассматривать массовую противогриппозную вакцинацию населения с позиции возможного возникновения негативного поствакцинального аллергизирующего эффекта, то особое внимание должны привлекать люди, предрасположенные к развитию патологического Th2-иммунного ответа. Анализ современной литературы позволяет выделить, по меньшей мере, три группы таких людей.

Люди с возрастными дефектами иммунной системы - дети первых лет жизни и престарелые лица. Особенность иммунного реагирования данных возрастных контингентов заключается в недостаточности Thl -звена иммунитета, что может приводить к смещению противоинфекционного иммунного ответа в сторону Th2 [125, 110]. Иммунологическая безвредность ЖГВ у таких людей нуждается в более углубленном изучении.

Лица с латентной сенсибилизацией, то есть имеющие повышенные уровни общих и (или) аллергенспецифических IgE, без клинических проявлений собственно аллергии. Такие лица составляют группу риска в отношении перехода скрытой формы сенсибилизации в манифестную [25, 87]. Потенциально вакцинация может стать индуктором этого процесса. Вопрос об последствиях вакцинопрофилактики гриппа у таких людей практически не изучен.

Люди, страдающие бронхиальной астмой. Такие лица особенно нуждаются в защите от гриппа, поскольку инфекция может вызывать тяжелейшие обострения данной аллергопатологии [36, 168]. На сегодняшний день профилактическая эффективность ИГВ у этих людей многими авторами ставится под сомнение [31, 48]. Как влияют на течение бронхиальной астмы аттенуированные реассортантные вирусы гриппа, остается неизвестным.

Настоящая работа посвящена изучению перечисленных выше вопросов.

Цель исследования. Оценить у людей и экспериментальных животных влияние гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированными реассортантными вирусами гриппа на возникновение и течение IgE-опосредованных иммунных реакций.

Задачи исследования:

1. В эксперименте на мышах изучить продукцию общих, вирусспецифических и овальбумин-(ОВА)-специфических IgE в сыворотке крови и секретах дыхательных путей при гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным реассортантным вирусом -экспериментальным аналогом вакцинного штамма для ЖГВ.

2. Исследовать продукцию общих и вирусспецифических IgE системной и локальной природы у людей после перенесенной гриппозной инфекции.

3. Сравнить продукцию общих, вирусспецифических и ОВА-специфических IgE, а также Thl- и ТЬ2-цитокинов у вакцинированных ЖГВ людей разных возрастов с учетом исходных уровней общих сывороточных IgE.

4. Оценить влияние гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным реассортантным вирусом гриппа на течение и выраженность экспериментально индуцированной бронхиальной астмы у мышей.

Научная новизна работы.

1. Впервые сопоставлена продукция у мышей трех типов локальных и сывороточных IgE (общие, вирусспецифические и ОВА-специфические) при первичной и вторичной гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным реассортантным вирусом гриппа. Показаны постинфекционные и поствакцинальные отличия синтеза общих IgE. Во всех случаях не обнаружено повышенного уровня вирусспецифических и ОВА-специфических IgE ни в сыворотке крови, ни в секретах дыхательных путей.

2. Впервые проведено исследование влияния иммунизации ЖГВ на IgE-статус людей разного возраста в зависимости от исходных концентраций общих IgE в сыворотке крови. Установлено, что введение ЖГВ детям, молодым людям и пожилым лицам не провоцировало развитие патологического ТЬ2-иммунного ответа. Это касалось и лиц с исходными уровнями общих сывороточных IgE, значительно превышающими показатели нормы.

3. Впервые охарактеризована локальная и системная продукция общих и вирусспецифических IgE у переболевших гриппом людей. Отмечено, что неосложненная гриппозная инфекция, вызванная вирусом A(H3N2), не повышала синтез этих иммуноглобулинов у лиц с нормальными и высокими исходными уровнями общих сывороточных IgE.

4. Впервые осуществлено экспериментальное изучение влияния гриппозной инфекции и вакцинации аттенуированным штаммом на течение бронхиальной астмы в стадии обострения и в стадии ремиссии. Показано, что и инфекция, и вакцинация, воспроизведенные у мышей на фоне острого аллергического воспаления респираторного тракта, приводили к усилению астматических явлений и аллергенспецифического IgE-ответа. То же самое наблюдалось при инфекции, развившейся в стадии ремиссии астмы. Вакцинация же в этот период аттенуированным вирусом не сопровождалась повышением секреции IgE и обострением астмы.

Практическая значимость работы.

1. Осуществлено скрининговое обследование проживающих в Санкт-Петербурге людей разного возраста (дети, молодые люди, престарелые лица) для определения частоты выявления лиц с гиперпродукцией общих сывороточных IgE.

2. Обоснована иммунологическая безвредность ЖГВ для детей дошкольного и школьного возраста, молодых людей и лиц пожилого возраста с позиций опасности поствакцинальной стимуляции патологического ТЬ2-иммунного ответа у лиц с латентной сенсибилизацией.

3. Получены экспериментальные данные, являющиеся предпосылкой для обоснования возможности клинических испытаний ЖГВ у больных бронхиальной астмой в стадии ремиссии этого заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Скрининговые данные о концентрации общих сывороточных IgE у детей 3-15 лет и молодых людей 18-22 лет без клинических признаков аллергических расстройств свидетельствуют о высокой частоте выявления случаев повышенной продукции этих иммуноглобулинов.

2. Вакцинация ЖГВ таких людей не приводит к утяжелению аллергического статуса в форме усиления продукции общих, вирусспецифических и овальбуминспецифических IgE в сыворотке крови и секретах верхних дыхательных путей.

3. Неосложненная гриппозная инфекция, вызываемая вирусом гриппа А, не индуцирует у условно здоровых молодых людей повышения синтеза сывороточных и локальных IgE.

4. В отличие от инфекции, вакцинация мышей с экспериментальной астмой аттенуированным реассортантным вирусом (экспериментальный аналог вакцинного штамма для ЖГВ) не провоцирует усиление астматических явлений, если вакцинация осуществляется в стадии ремиссии этого заболевания.

Личным вкладом автора является самостоятельное проведение всех экспериментальных исследований, включая приготовление необходимых препаратов, разработку схем их введения, работу с лабораторными животными, отбор и анализ материалов. Автор принимал непосредственное участие в клинических испытаниях, включая сбор анамнестических данных, отбор и иммунологический анализ материалов. Интерпретация полученных результатов выполнена лично автором. Отбор добровольцев для клинических испытаний проводили медицинские работники местных лечебно-профилактических учреждений. Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. П.В. Пигаревскому за помощь в интерпретации патоморфологических данных, а также к.м.н. С.А. Дониной за помощь в постановке иммунологических реакций.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IX научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт

Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005); на научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006) - доклад занял I место на конкурсе молодых ученых; на X научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006); на VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва,2006).

Диссертационная работа апробирована на совместной научной конференции отделов иммунологии и вирусологи ГУ НИИЭМ РАМН 5 марта 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 134 страницах текста, включающего 21 таблиц и 12 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 186 источников, в том числе 30 отечественных и 156 иностранных.

выводы

1. Среди обследованных жителей г.Санкт-Петербурга 3-6, 8 - 15 и 18 - 22 лет, не имеющих в анамнезе аллергических заболеваний и лабораторно подтвержденных гельминтозов, доля лиц с превышением нормальных уровней общих сывороточных IgE в 2 -17 раз составляет 48 - 57%. У людей 65 лет и старше этот показатель не превышает 5%.

2. Иммунизация этих возрастных контингентов живой гриппозной вакциной не приводит к повышению продукции общих, вирус- и овальбуминспецифических IgE на системном и локальном уровнях. Это касается лиц как с нормальными, так и с высокими исходными концентрациями общих сывороточных IgE.

3. Неосложненная гриппозная инфекция у молодых людей 18-20 лет с повышенными и нормальными исходными уровнями общих IgE также не провоцирует усиление IgE-синтеза (общие и вирусспецифические IgE в сыворотках крови и секретах верхних дыхательных путей).

4. Гриппозная инфекция, возникающая на фоне экспериментально индуцированной бронхиальной астмы, приводит к обострению аллергического воспаления респираторного тракта как в острой фазе астмы, так и в период ремиссии.

5. В отличие от инфекции иммунизация аттенуированным реассортантным вирусом гриппа (экспериментальный аналог вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины) в период ремиссии астмы не представляет угрозы с точки зрения усиления IgE-опосредованных аллергических реакций и воспалительных изменений в респираторном тракте.

Заключение

Обобщая данные литературы, представленные в разделе 1.З., можно отметить следующее.

Проблема «вакцинация - аллергия» весьма актуальна из-за широчайшего применения вакцин, содержащих потенциальные аллергены. Вакцины против респираторных вирусов не оставляют исключение. До сих пор не внедрены очень востребованные практикой вакцинные препараты против PC-инфекции по причине их повышенной аллергенности, проявляющейся в развитии патологического ТЪ2-иммунного ответа. По этой же причине не нашли широкого применения мукозальные варианты ИГВ. Парентеральная ИГВ не аллергена, но она не обладает достаточной профилактической эффективностью у больных бронхиальной астмой. Очень низкая аллергенность ЖГВ доказана в клинико-эпидемиологических наблюдениях за здоровыми людьми всех возрастов, начиная с Зх-летнего. Однако воздействие этого препарата на IgE-статус требует специальных углубленных исследований с охватом, прежде всего, лиц повышенного риска (детей, пожилых людей и лиц всех возрастов с латентной сенсибилизацией). Вопрос о возможности применения ЖГВ с целью вакцинопрофилактики гриппа у больных бронхиальной астмой остается открытым.

Решению перечисленных вопросов и посвящена настоящая диссертационная работа (разделы 3, 4).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Вакцины

Для иммунизации использовали коммерческую живую холодоадаптированную реассортантную тривалентную гриппозную вакцину

- ЖГВ (ФГУ «Микроген» - Иркутское предприятие по производству иммунобиологических препаратов, Иркутск). В состав ЖГВ входили холодоадаптированные реассортантные вирусы с биологической активностью штаммов типа A(H1N1), A (H3N2) - 106'5 ЭИД 50/0,2 мл, типа В

- Ю6'0 ЭИД 50/0,2 мл. ЖГВ вводили интраназально в объеме 0,5 мл (по 0,25 мл в каждый носовой ход).

В различные прививочные сезоны в состав ЖГВ входили следующие вакцинные штаммы: А/17/Техас/1/3/91 (H1N1), А/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), А/17/Нанчанг/95/4 (H3N2), А/17/Сидней/97/76 (H3N2), А/17/Панама/99/242 (H3N2), А/17/Калифорния/04/6 (H3N2), В/60/Панама/90/4/Е, В/60/Гонконг/01/22, В/60/Джиллин/03/1. Все вакцинные штаммы являлись актуальными для данного эпидемического сезона и были рекомендованы ВОЗ.

2.2. Обследованные контингенты

Гриппозная инфекция. Было обследовано 32 человека 18-20 лет из наблюдавшегося воинского коллектива, которые в эпидемический сезон 2003

- 2004 гг. перенесли неосложненный, клинически выраженный и серологически подтвержденный грипп A (H3N2). Все обследованные люди не имели в анамнезе клинически выраженных аллергических заболеваний и лабораторно подтвержденных гельминтозов. В течение периода наблюдения у волонтеров не было отмечено клинических проявлений аллергических реакций.

Вакцинация. Возрастные контингенты вакцинируемых лиц составили: 132 молодых людей 18-22 лет из организованных коллективов; 118 детей 3

- 6 лет и 114 детей 8-15 лет, посещавших детские сады и школы; 42 пожилых человека 65 - 87 лет из домов престарелых. Все коллективы и учреждения находились в г.Санкт-Петербурге. Все отобранные для исследования лица не имели в анамнезе клинически выраженных аллергических заболеваний и лабораторно подтвержденных гельминтозов. Вакцинацию и забор исследуемых материалов у детей осуществляли с письменного разрешения родителей, а у взрослых людей - на основе добровольного письменного согласия.

Обследованные возрастные контингенты составили две группы: (i) привитые интраназально коммерческой ЖГВ; (ii) лица, которым вводили интраназально препарат плацебо 1 - стерильный физиологический раствор; (iii) лица, которым вводили интраназально препарат плацебо 2 - не содержащую вирус аллантоисную жидкость куриных эмбрионов (стандартный субстрат для накопления вирусов гриппа).

Молодые люди и дети прививались ЖГВ однократно, пожилые люди двукратно с интервалом в 21 день. Двукратная вакцинация для пожилых людей является более эффективным способом специфической вакцинопрофилактики против гриппа [139].

В течение 5 дней после прививки проводились клинические наблюдения, включавшие измерение температуры тела, пульса и кровяного давления, осмотр носоглотки. Через 21 день после иммунизации проводилось дополнительное обследование вакцинированных одновременно с взятием материала для анализа. Клинически выраженных аллергических реакций после вакцинации не было зафиксировано ни у одного из добровольцев в течение всего периода наблюдения.

2.3. Лабораторные животные

Экспериментальные исследования проводили на мышах линии СВА, самках, в возрасте 8-10 недель. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе питания при свободном доступе к воде [9]. Мыши, использовавшиеся для воспроизведения ОВА-индуцированной бронхиальной астмы получали не содержащую яичный белок диету. Работу с мышами осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755).

2.4. Экспериментальные модели

Модель гриппозной инфекции и вакцинации. Мышам интраназально вводили по 50 мкл раствора на 10 мМ фосфатном буфере (рН 7,4) (Sigma Со, США), содержащего: (i) 4,0 lg3M^o/0,l мл общепринятого патогенного для мышей вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1), представляющего собой экспериментальный аналог дикого вирулентного вируса (инфекция); (И) 6,0 ^ЭИД5о/0,1 мл аттенуированного реассортанта, являющегося аналогом вакцинного штамма для ЖГВ и моделировавшего вакцинацию. Вирус (ii) был создан по технологии приготовления вакцинных штаммов для ЖГВ методом генетической реассортации по формуле 6/2 [1]. Реассортант унаследовал 2 гена поверхностных белков (гемагглютинин и нейраминидаза) от патогенного A/PR/8/34 (H1N1) и все гены внутренних белков от холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), прошедшего 47 пассажей на куриных эмбрионах при пониженной температуре. Таким образом, аттенуированный реассортант обладал следующими фенотипическими признаками: 1) холодоадаптированность -способность к активной репродукции при низкой температуре (25 - 27°С); 2) температурочувствительность - неспособность к размножению при повышенной температуре (38°С) [1]. Для подтверждения этих признаков перед проведением эксперимента были проверены репликативные свойства исследуемых вирусов в верхних и нижних отделах респираторного тракта мышей (табл. 1). Интенсивность репликации оценивалась по уровню инфекционной активности вирусов в гомогенатах легких и назофарингеального тракта животных. Инфекционная активность определялась методом заражения куриных эмбрионов 10-кратными разведениями вируссодержащих гомогенатов и выражалась в 50% эмбриональной инфекционной дозе.