Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Научное обоснование внедрения в практику живой гриппозной моновалентной вакцины "ИНФЛЮВИР" для специфической профилактики пандемического гриппа A/H1N1

005002592

На правах рукописи

БУШМЕНКОВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИКУ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ МОНОВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ «ИНФЛЮВИР» ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ПАНДЕМИЧЕСКОГО ГРИППА

Л/Н1Ш

14.02.02 «Эпидемиология» 14.03.09 «Клиническая иммунология, аллергология»

1 7 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь-2011

005002592

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Фельдблюм Ирина Викторовна

доктор медицинских наук

Миронов Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Слободешок Александр Владимирович

кандидат медицинских наук

Коноплева Ольга Валентиновна

Ведущая организация:

Федеральное государственное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская Академия имени С. М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (г. Санкт-Петербург).

Защита состоится «¿V» р^ЖТу^р 2011 г. в « /Л часов на заседании диссертационного совета Д 208.067.04 при ГБОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Минздравсоцразвития России по адресу: 614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Минздравсоцразвития России (614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26) и с авторефератом на сайте http://vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор

Сандакова Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Пандемии гриппа являются достаточно редкими, но повторяющимися событиями, которые сопровождаются резким повышением заболеваемости и смертности и ведут к значимым медико-социальным потрясениям. Они вызываются штаммами вируса, которые полностью изменили структуру поверхностных гликопротеинов, но к которым иммунитет у населения еще не сформировался, следствием чего является быстрое распространение заболевания по всему миру. [Каверин Н.В., 2003].

Впервые пандемия гриппа была зарегистрирована в 1580 году. С того времени произошло более 10 пандемий, которые возникали нерегулярно с непредсказуемыми интервалами, длящимися от 10 до 50 лет. Наиболее масштабной была пандемия 1918 года, унесшая более 40 млн. жизней.

В апреле 2009 года Центром контроля и профилактики заболеваний США (CDC) было объявлено о случаях инфицирования человека неизвестным штаммом вируса гриппа, комбинация генов которого ранее не встречалась. Он получил название A/Cal¡fornia/7/2009(HlNl). Заболевание настолько быстро распространялось и вызывало летальные исходы (более 28 тысяч лабораторно подтвержденных случаев в 74 странах за 2 месяца, включая 144 случая со смертельным исходом), что 11 июня 2009 года ВОЗ объявила о начале пандемии гриппа A/H1N1. Так началась первая и на данный момент единственная пандемия гриппа XXI века.

Основной мерой профилактики гриппа в современных условиях признана вакцинация. Существуют два основных класса противогриппозных вакцин: живые (ЖГВ) и инактивированные (ИГВ). Согласно данным литературных источников, в период пандемии рекомендуется использовать ЖГВ [Александрова Г.И., 1996, Ерофеева М.К., 2000, WHO, 2007]. В пользу применения ЖГВ в период пандемии говорят их следующие преимущества [Ерофеева М.К., 1997]: простота применения вакцины (интраназально), что позволяет в короткие сроки осуществлять массовую вакцинацию любого коллектива; индукция всех звеньев иммунной системы, в том

числе способность индуцировать секреторные ^А в носоглотке, таким образом обеспечив защиту во входных воротах инфекции; возможность в короткие сроки произвести большие объемы вакцины; способность защищать от дрейфовых вариантов вируса гриппа.

В связи с возникшей угрозой распространения вируса гриппа А/НШЬште на территории РФ и в целях обеспечения защиты населения от инфекции, филиалом ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Иркутске «Иркутское предприятие по производству бакпрепаратов» была разработана вакцина «ИНФЛЮВИР» - Вакцина гриппозная живая моновалентная, штамм А/17/Калифорния/2009/38 (НШ1) - для специфической профилактики высокопатогенного гриппа типа А/Н1Ы1.

В свете вышесказанного целью исследования явилось научное обоснование внедрения в практику живой гриппозной моновалентной вакцины «ИНФЛЮВИР» для специфической профилактики пандемического гриппа типа А/Н1Ш.

Исходя из цели данной работы, были поставлены следующие задачи исследования:

1. оценить безопасность, иммуногенность и протективность вакцины «ИНФЛЮВИР» на лабораторных животных;

2. изучить реактогенность, безопасность и иммунологическую эффективность вакцины «ИНФЛЮВИР» при иммунизации лиц в возрасте 18-60 лет;

3. изучить реактогенность, безопасность и иммунологическую эффективность вакцины «ИНФЛЮВИР» при иммунизации лиц из групп риска развития осложнений — взрослых от 60 лет и старше;

4. изучить реактогенность, безопасность и иммунологическую эффективность вакцины «ИНФЛЮВИР» при иммунизации детей 6-17 лет;

5. определить схему вакцинации (кратность и интервал) вакцины «ИНФЛЮВИР» для специфической профилактики гриппа А/НШ1.

Научная новизна. Впервые в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных и эпидемиологических экспериментальных исследованиях изучены свойства живой гриппозной пандемической вакцины «ИНФЛЮВИР».

Впервые охарактеризованы безопасность, иммуногенность и протективность вакцины «ИНФЛЮВИР» при иммунизации лабораторных животных.

Установлены хорошая переносимость, низкая реактогенность,

высокий профиль безопасности как для привитых, так и для окружающих. Одновременно с этим выявлена высокая иммунологическая эффективность вакцины «ИНФЛЮВИР» при иммунизации лиц в возрасте 18-60 лет, а также групп риска -пожилых людей и детей.

Впервые определена тактика иммунизации (доза и схема введения препарата) различных контингентов против гриппа вакциной «ИНФЛЮВИР».

Практическая значимость. Результаты проведенных доклинических и клинических исследований позволили оформить нормативную документацию (НД) на препарат (фармакопейная статья предприятия (ФСП), инструкция), зарегистрировать вакцину «ИНФЛЮВИР» в РФ и определить тактику вакцинопрофилактики пандемического гриппа типа A/H1N1 в РФ.

Проведенные исследования и регистрация препарата позволили своевременно начать в РФ прививочную кампанию по специфической профилактике пандемического гриппа типа A/H1N1.

Положения, выносимые на защиту

1. Живая гриппозная вакцина «ИНФЛЮВИР» при интраназальном двукратном (с интервалом 10 суток) введении лабораторным животным (белым мышам и крысам, морским свинкам, кроликам и хорькам) характеризуется безопасностью и высокой иммуногенностыо, индуцирует развитие выраженного иммунного ответа и защищает 100% иммунизированных животных от заражения диким штаммом вируса гриппа A/H1N1 .

2. Вакцина «ИНФЛЮВИР» при интраназальном двукратном (с интервалом 10 суток) введении людям различных возрастных групп (взрослым 18-60 лет, пожилым и детям 6-17 лет) характеризуется низкой реактогенностью, хорошей переносимостью и безопасностью как для привитых, так и для окружающих. А также стимулирует все звенья иммунной системы (местный, клеточный и гуморальный иммунные ответы) и вызывает формирование протективного иммунитета.

Внедрение результатов работы. Результаты проведенных доклинических и клинических исследований использованы при оформлении НД (ФСП, инструкция) и

разработке регламента производства, что позволило зарегистрировать вакцину «ИНФЛЮВИР» в РФ (РУ №ЛСР-007988/09).

Проведенные исследования и регистрация препарата позволили в октябре

2009 года начать в РФ прививочную кампанию по специфической профилактике пандемического гриппа типа A/H1N1 с использованием вакцины «ИНФЛЮВИР».

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях и встречах: 8-й Российско-Итальянской конференции «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций» (г. Санкт-Петербург, 17-18 декабря 2009 года); первой встрече ведущих экспертов по гриппу «Эпидемиология и иммунопрофилактика гриппа: предварительные уроки сезона 2009/2010 в условиях пандемии» (г. Москва, 26 февраля 2010 года); научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (г. Иркутск, 15-17 сентября 2010г.); 9-ой Российско-Итальянской конференции «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций» (г. Вологда, 30 сентября - 2 октября 2010 года); Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (г. Санкт-Петербург, 5-6 октября 2010 года); конференции «Вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития» (г. Пермь, 28 октября

2010 года); первом конгрессе Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням (г. Санкт-Петербург, 1-3 декабря 2010 года).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 6 -в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах текста, включая 37 таблиц, 18 рисунков и 2 приложения. Состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и методах и двух глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, который содержит 192 источника, из них 82 являются отечественными и 110 - иностранными.

Личный вклад автора. Автором лично были проведены планирование, организация, составление программы и материалов, необходимых для доклинических и клинических исследований (протокол доклинических/клинических исследований, брошюра для исследователя, индивидуальная регистрационная карта,

информация для добровольца, информированное согласие

добровольца), мониторинг проведения исследований, сбор первичных данных. Вся полученная информация систематизирована, проанализирована и обработана статистически. Автор принимал участие в осуществлении рандомизированных клинических исследований и постановке РТГА по определению сывороточных антител к вирусу гриппа в ГБОУ ВПО ПГМА им. Е.А. Вагнера Минздравсоцразвития России и ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития России.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Доклинические и экспериментальные эпидемиологические исследования проводились в соответствии с Федеральным законом о лекарственных средствах от 22.06.1998 г. №86-ФЗ, приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики», приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266 «Правила клинической практики в Российской Федерации», национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р52379-2005 «Надлежащая клиническая практика» и согласно Европейским Предписаниям по ССР и Хельсинкской Декларации.

В качестве лабораторных баз при выполнении работы были задействованы ФГУН «Институт токсикологии» ФМБА (г. Санкт-Петербург), Филиал ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны» - «ВЦ» (г. Сергиев Посад), ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития России (г. Санкт-Петербург) и 1137 Военный госпиталь (г. Сергиев Посад).

Объектом исследования явилась вакцина «ИНФЛЮВИР» - вакцина гриппозная живая моновалентная, штамм А/17/Калифорния/2009/38 (НШ1).

Для оценки протективных свойств вакцины «ИНФЛЮВИР» в рамках доклинических исследований использовали дикий вирулентный штамм вируса гриппа А/СаШгша/7/2009(НШ1). В качестве препарата сравнения (плацебо) в доклинических и эпидемиологических исследованиях использовалась вода для инъекций.

Доклинические исследования вакцины «ИНФЛЮВИР» включали в себя определение следующих параметров: острой и хронической токсичности на белых

половозрелых беспородных мышах (п=60) и крысах (п=260) обоего пола; острой токсичности на крысятах-сосунках (п=60); гиперчувствительности немедленного и замедленного типов на морских свинках (п=108) и белых половозрелых мышах линии ВАЬВ/с обоего пола (п=24); иммунотоксичности на белых половозрелых мышах линии ВАЬВ/с обоего пола (п=56); репродуктивной и эмбриотоксичности на нелинейных белых крысах-самках (п=140) и самцах (п=40); иммуногенности и протективности на беспородных хорьках (п=10).

Изучение влияния на гематологические, патоморфологические и гистологические показатели местного и местно-раздражающего действия проводилось в рамках определения острой и хронической токсичности.

В клинических исследованиях участвовало 120 здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет, 30 добровольцев в возрасте 60 лет и старше, 30 детей в возрасте 12-17 лет и 29 детей в возрасте 6-11 лет.

В рамках клинических исследований на добровольцах 18-60 лет было проведено сравнительное изучение двух интервалов - 10 и 21 сутки - для определения схемы введения вакцины «ИНФЛЮВИР».

Критерии изучения реактогенности и безопасности вакцины «ИНФЛЮВИР» включали оценку витальных показателей (АД, ЧСС, температура тела), нежелательных явлений (местные и системные реакции), согласно МУ 3.3.2.1758-03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа», и лабораторных показателей (определение № общий, биохимический анализы крови и общий анализ мочи).

Безопасность вакцины для окружающих оценивали по выделению вакцинного вируса в назальных смывах как привитых добровольцев, так и их окружения, с последующим проведением вирусологического исследования на 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах (ПЦР, ИФА).

Оценка иммуногенности вакцины включала изучение иммунных ответов: местного (э^А, ИФА), клеточного (СБ4+ и СЭ8+ Т-лимфоциты, проточная цитофлюорометрия) и гуморального (^в, РТГА). Забор крови проводили до вакцинации, на 10 и 31 (интервал между вакцинацией 10 суток) и на 21 и 42 (интервал между вакцинацией 21 сутки) сутки исследования.

Иммунологическую эффективность вакцины оценивали по фактору сероконверсии (повышение среднего геометрического титра антител по сравнению с исходным уровнем), уровням сероконверсии (процент добровольцев, у которых титр антител повысился более чем в 4 раза по сравнению с исходным уровнем) и серопротекции (процент добровольцев с титром антител более 1:40).

Для создания базы данных была использована программа MS Excel. При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартное отклонение (М±ш). При анализе результатов иммуногенности на хорьках определяли среднюю геометрическую и стандартное геометрическое отклонение (А'±ЬХ). Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы Statistica (версия 6,0) с использованием теста t-распределения Стьюдента и критерия Фишера. Различия считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Доклинические исследования вакцины «ИНФЛЮВИР»

Оценка острой токсичности при многократном введении вакцины в течение 6 часов не выявила каких-либо изменений в поведении и общем состоянии животных. Ни в одной из опытных групп - ни у мышей, ни у крыс - гибель не отмечалась, что свидетельствует о том, что по показателю летальности вакцина нетоксична (табл. 1).

Таблица 1

Результаты 6-кратного интраназального введения вакцины мышам и крысам на

протяжении 6 часов

Однократные дозы, мл Суммарная доза, мл (количество прививочных доз) Количество животных, пало/всего

М | F М | F

Мыши (п=30)

0,5 3,0(6) 3,0(6) 0/5 0/5

1,0 6,0 (12) 6,0(12) 0/5 0/5

1,5 9,0(18) 9,0(18) 0/5 0/5

Крысы (п=50)

0,5 3,0(6) 3,0 (6) 0/5 0/5

1,0 6,0 (12) 6,0(12) 0/5 0/5

1,5 9,0(18) 9,0(18) 0/5 0/5

2,5 15,0(30) 15,0 (30) 0/5 0/5

3,5 21,0(42) 21,0(42) 0/5 0/5

Одним из критериев оценки безопасности живых гриппозных вакцин является изменение температуры тела лабораторных животных после введения вакцин, содержащих живой аттенуированный штамм вируса гриппа, что позволяет судить о возможном развитии заболевания гриппом после вакцинации. Результаты оценки влияния однократного введения вакцины на ректальную температуру лабораторных животных свидетельствуют об отсутствии развития гриппоподобных симптомов после введения вакцины (табл. 2).

Таблица 2

Влияние однократного введения препаратов на ректальную температуру белых крыс

Сроки исследования Ректальная температура крыс в различных группах, М±ш, °С

Опытная (п=25) Контрольная (п=25)

М Р М Р

Фон 35,9±0,4 36,3±0,4 36,1±0,3 36,3±0,2

7-й день после введения вакцины 36,5±0,6 36,5±0,6 36,7±0,3 35,9±0,7

Примечание: р>0,05. Различия между группами статистически не значимы

При изучении влияния вакцины «ИНФЛЮВИР» на показатели крови было показано, что каких-либо изменений в гематологических показателях, выходящих за рамки нормальных величин, не выявлено ни в опытных, ни в контрольной группах.

Как показали результаты макроскопического и гистологического исследований, однократное введение вакцины в прививочной дозе крысам обоего пола не вызывало воспаления или деструкции тканей в месте введения, а также не сопровождалось развитием дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов.

В результате проведенных исследований острой токсичности на половозрелых и на неполовозрелых животных, было показано, что применение вакцины «ИНФЛЮВИР» не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма и не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата. Полученные данные согласуются с данными наблюдений, выполненных на крысятах-сосунках.

В ходе исследования многократного ежедневного (в течение

30 дней) введения вакцины «ИНФЛЮВИР» не было выявлено ни одного случая гибели лабораторных (крысы, морские свинки) животных. Также не выявлено значимых различий между опытными и контрольной группами животных по всем оцениваемым показателям. Животные не теряли в весе, ректальная температура не превышала физиологической нормы. Не установлено клинически значимых сдвигов показателей общего и биохимического анализов крови и мочи. Вакцина не вызывала развития патологических, в том числе воспалительных, дистрофических и некротических, изменений во внутренних органах животных.

В параллельных сериях экспериментов в рамках изучения хронической токсичности было показано, что вакцина «ИНФЛЮВИР» не вызывает развития реакций гиперчувствительности немедленного и замедленного типов, а также анафилактических реакций и не обладает иммунотоксическим действием как на клеточное, так и на гуморальное звено иммунной системы.

Проведенные исследования показали, что интраназальное введение вакцины самкам крыс в одной и трех прививочных дозах с 1 по 19 день беременности не оказывает эмбриотоксического действия, а также воздействия на репродуктивную функцию самцов и самок крыс. В экспериментах не было выявлено негативного влияния на плодовитость опытных животных, на пре- и постнатальное развитие потомства.

Оценка иммуногенных свойств вакцины «ИНФЛЮВИР» показала, что однократная иммунизация хорьков не привела к развитию протективного иммунного ответа. Однако проведение повторной иммунизации как на 10, так и на 21 сутки, обусловило выработку вирусспецифических антител в крови животных в защитных титрах (р<0,001) в РТГА и РМН (табл. 3).

Таблица 3

Результаты оценки иммуногенных и протективных свойств вакцины «ИНФЛЮВИР» на

хорьках

Препарат, интервал введения Титр вирусспецифических антител в РТГА/РМН (иммуногенность), Х±Ьх Показатель защиты (протективность), %

до первой иммунизации перед второй иммунизацией 14 суток после второй иммунизации

Вакцина «ИНФЛЮВИР», 10 суток (п=4) <1:10±1,0*/ <1:10±1,0* 1:24±1,9*/ 1:34±1,9* . 1:80±1,8*/ 1:95±1,4* 100

Вакцина «ИНФЛЮВИР», 21 сутки (п=4) <1:10±1,0*/ <1:10±1,0* 1:24±1,9*/ 1:28±1,5* 1:40±1,8*/ 1:48±1,4*

Вода для инъекций, 10 суток (п=1) <1:10±1,0/ <1:10±1,0 <1:10±1,0/ <1:10±1,0 <1:10±1,0/ <1.10± 1,0 0

Вода для инъекций, 21 сутки(п=1) <1:10±1,0/ <1:10±1,0 <1:10±1,0/ <1:10±1,0 <1:10±1,0/ <1:10±1,0

Примечание: * - р<0,001

При этом наиболее выраженным иммунный ответ был у хорьков, привитых двукратно с интервалом 10 суток (величина титра в РТГА/РМН 1:80/1:95), в отличие от животных, привитых двукратно с интервалом 21 сутки (величина титра в РТГА/РМН 1:40/1:48).

Инфицирование иммунизированных хорьков диким штаммом А/СаП1Ьгта/7/2009(НШ1) с активностью не менее 7,0 ^ ЭИД50 не вызывало каких-либо патологических изменений в органах животных, репродукции вируса в органах также не выявлено. У непривитых животных, инфицированных аналогичным штаммом, был выявлен как сам вирус, так и патологические изменения в следующих органах: селезенке, легких, головном мозгу, обонятельных луковицах и носовых раковинах; также наблюдалась вирусемия в крови у животных (табл. 4).

Таблица 4

Результаты гистологических исследований внутренних органов хорьков, инфицированных

диким штаммом А/СаМогша/7/2009(НШ1)

Опытная группа (п=8) Контрольная группа (п=2)

V Ж ||у ¡У? ■ ■ V.' .■ \ л"! ряш 1 Шин

Селезенка. Белая и красная пульпа выражены отчетливо. Трабекулы тонкие. Синусоиды заполнены эритроцитами. Белая пульпа представлена скоплениями лимфоцитов и фолликулами разной степени зрелости и величиной центров размножения Селезенка. Строма с умеренными явлениями фиброза. Фолликулы редки, просматриваются не в каждом поле зрения, различных размеров. Зародышевые центры в некоторых фолликулах просматриваются, в некоторых нет, занимают от 1/3 до половины объема фолликула

ИРй■■¡^Р9" ашВШМЯиш

Миокард. Изменений соединительнотканной стромы миокарда не определяется_

Миокард. Сосуды расширены,

полнокровные, умеренный межмышечный отек

Легкие. Нормальное строение легкого (данных о специфической патологии нет)

Легкие. Сосуды полнокровные, умеренный интерстициальный отек, эпителий с подушкообразной деформацией_

Таким образом, двукратная иммунизация хорьков вакциной «ИНФЛЮВИР» не вызывает морфологических и гистологических изменений в органах и тканях, а также гибели животных, индуцирует развитие выраженного иммунного ответа и защищает 100% лабораторных животных от заражения диким вирулентным штаммом вируса гриппа А/СаН1огша/7/2009(НШ1). Оптимальным интервалом введения вакцины, как показали наши исследования, является интервал 10 суток.

Клинические исследования живой гриппозной вакцины «ИНФЛЮВИР»

на добровольцах 18-60 лет В простом слепом плацебо-контролируемом сравнительном многоцентровом эпидемиологическом экспериментальном исследовании приняло участие 120 добровольцев в возрасте 18-60 лет.

Поствакцинальных осложений и реакций сильной и средней степени выраженности не выявлено. Зарегистрированные местные реакции (у 34,0 % привитых) были слабой степени выраженности, развивались, в основном, на 2-4 сутки после вакцинации и были представлены катаральными явлениями в носоглотке (в 31,0% случаев), першением в горле (7,0%), насморком (11,0%) и заложенностью носа (5,0%).

Системные реакции (у 15,0% привитых) были представлены повышением температуры тела до 37,5 °С (у 12,0% добровольцев), кашлем (у 5,0% привитых) и

болью в горле (у 2,0% привитых). У добровольцев, привитых плацебо, местных и системных реакций не выявлено. В целом, состояние добровольцев не ухудшалось.

Изменения средних показателей биохимического и клинического анализов крови и показателей мочи в ходе исследования были незначительны и находились в пределах нормальных значений, вне зависимости от интервала введения (10 или 21 сутки) и введенного препарата (вакцина или плацебо).

У большинства добровольцев после двукратной вакцинации (92,0% в группе с интервалом введения 10 суток и 82,0% в группе с интервалом введения 21 сутки) не выявлено изменения уровня ^Е, что свидетельствует об отсутствии у препарата аллергенных свойств.

Вакцина «ИНФЛЮВИР» оказалась безопасной также и для лиц, окружающих привитых: у привитых и окружающих их лиц не выявлено изолятов и реизолятов вакцинного вируса после проведения 3-х последовательных пассажей в РКЭ как после первой, так и после второй вакцинации вне зависимости от интервала введения.

Вакцина «ИНФЛЮВИР» индуцировала развитие как местного, так и клеточного иммунных ответов. Проведение двукратной иммунизации с интервалами введения 10 и 21 сутки позволило индуцировать развитие местного иммунного ответа у 50,0% и 59,6% добровольцев соответственно.

Важным звеном в реализации защиты от гриппозной инфекции является клеточное звено иммунной системы (СВ4+ и С08+ Т-лимфоциты).

♦ Опыпш« групп* СР4+ лимфоциты -*- Контрольная группа С04+ лимфоциты

Рисунок 1. Уровень (%) субпопуляции С04+ Т-лимфоцнтов у добровольцев, привитых с интервалом 10 суток

До вакцинации 10 еут 21 суг

—Опыта» группа СОМ+ лимфоциты Контрольная группа СП8+ лимфоциты

Рисунок 2. Уровень (%) субпопуляции СБ8+ Т-лимфоцитов у добровольцев, привитых с

интервалом 10 суток

I «

-•—Опытная группа СГМ+ лимфоциты Контрольная группа Со4+ лимфоциты

Рисунок 3. Уровень (%) субпопуляции С1)4+ Т-лимфоцитов у добровольцев, привитых с

интервалом 21 сутки

До вакшттнн II сут 42 суг Опыта■■ группа СОЯ* лимфоциты «- Коятршчмая групп» СОЯ+ ......фонты

Рисунок 4. Уровень (%) субпопуляции СБ8+ Т-лимфоцитов у добровольцев, привитых с

интервялом 21 сутки

Более быстрая реакция со стороны клеточного звена иммунитета в ответ на повторную вакцинацию добровольцев в группе с интервалом иммунизации 10 суток свидетельствует о более раннем «включении» в иммунный ответ клеток памяти. Важно отметить, что иммуннорегуляторный индекс (С04/СВ8), несмотря на некоторое его повышение, продолжал находиться в пределах нормативных значений (1,2-2,5). Полученные данные свидетельствуют о развитии адекватного клеточного иммунного ответа после двукратной вакцинации добровольцев вакциной «ИНФЛЮВИР», более выраженного при интервале введения препарата 10 суток.

Проведение двукратной иммунизации у добровольцев с 10-

дневным интервалом введения препарата позволило индуцировать развитие гуморального иммунного ответа у 54,0 % привитых. У добровольцев с 21-дневным интервалом введения уровень сероконверсии достигал 34,0 % (р<0,01). Уровень серопротекции после двукратной вакцинации с интервалом 10 суток составил 30,4%, с интервалом 21 сутки - 17,0% (р<0,01). Фактор сероконверсии в группе с интервалом 10 суток достигал 2,8, тогда как в группе с интервалом 21 сутки - 2,1 (рис. 5).

Рисунок 5. Характеристика гуморального иммунного ответа у лиц 18-60 лет при различных

схемах вакцинации

Число лиц после двукратной вакцинации с интервалом 10 суток, у которых были выявлены четырехкратные приросты титров антител по данным РТГА (сыворотка крови) и/или ИФА (носовые секреты), суммарно составило 72,0 % от общего числа привитых добровольцев, при двукратной иммунизации с интервалом 21 сутки - 66,0% (р>0,05).

Таким образом, в ходе проведенного исследования была показана хорошая переносимость, низкая реактогенность, безопасность для привитых и окружающих, а также выраженная иммунологическая эффективность вакцины «ИНФЛЮВИР». Оптимальной схемой, как показали наши исследования, является двукратное введение вакцины «ИНФЛЮВИР» с интервалом 10 суток.

Клинические исследования живой гриппозной вакцины

«ИНФЛЮВИР» на детях

При иммунизации детей вакцина «ИНФЛЮВИР» характеризовалась хорошей переносимостью, низкой реактогенностью и безопасностью. Местные реакции отмечались у 6 (20,0%) детей старшей возрастной группы (12-17 лет) и у 2 (7,0%) детей младшей (6-11 лет). Местные реакции были представлены в основном отечностью слизистой носа, катаральными явлениями в носоглотке, насморком, першением в горле и сухостью в носу. Системные реакции наблюдались у 4 детей старшего возраста (13,3%) и были представлены в основном головной болью, головокружением и повышенной утомляемостью.

Местные и системные реакции были зарегистрированы только после первой вакцинации, имели слабую степень выраженности, носили транзиторный характер и проходили самостоятельно без применения каких-либо лекарственных препаратов.

Оценка показателей общего и биохимического анализов крови, а также анализа мочи и содержащегося в сыворотках крови привитых ^Е у иммунизированных детей старшей и младшей возрастных групп в динамике не выявила каких-либо отклонений. Все показатели независимо от сроков исследования находились в пределах нормальных значений.

Оценка местного иммунного ответа выявила постепенный рост уровня б^А в носоглоточных смывах у детей в возрасте 12-17 лет и 6-11 лет: с 10,1±5,5 и 11,8±15,4 до вакцинации до 38,5±8,8 и 16,7±17,4 (на 10 сутки) и до 42,1±5,5 и 23,6±20,4 МЕ/мл (на 31 сутки) соответственно.

К 10 суткам поствакцинального периода отмечен рост как С04+, так и СЭ8+-лимфоцитов. К 31 суткам исследования наблюдали снижение уровня обеих фракций Т-лимфоцитов, что обусловлено реакцией клеточного звена иммунитета на введение вакцинного препарата (формированием клеточной памяти) (рис. 6).

До виьцииящии

— 11-18 лет СП4+ лимфишпы —в— 6-12 /к': (ЛИ-лимфишпы

- 12-14 лет СОН+лимфшиггы—6-12 Лет лнмфмопы

Рисунок 6. Кииетика клеточного иммунного ответа у детей различного возраста при введении вакцины «ИНФЛЮВИР»

Оценка динамики формирования гуморального иммунитета (рис. 7) показала, что после однократной иммунизации доля лиц, имевших защитный уровень антител (>1:40), составила от 45,0 до 55,0%. После второй вакцинации уровень серопротекции увеличился до 81% в младшей возрастной группе и до 83,0% - в старшей (р<0,05). Уровень сероконверсии после первой иммунизации достигал 41,0%, проведение повторной иммунизации позволило индуцировать развитие гуморального ответа у 59,0% детей младшей возрастной группы и у 52,0% - старшей (р<0,01).

Рисунок 7. Динамика показателей гуморального иммунитета у детей разного возраста в

РТГА

Таким образом, двукратная интраназальная вакцинация детей вакциной «ИНФЛЮВИР» также стимулирует развитие клеточного и гуморального иммунных ответов у детей обеих возрастных групп.

Клинические исследования живой гриппозной вакцины «ИНФЛЮВИР» на добровольцах старше 60 лет

Оценка реактогенности показала, что как после первой, так и после второй вакцинации местные реакции отмечались у 14,3% привитых и были представлены першением в горле, гиперемией зева и сухостью в носу. Системные реакции наблюдались у 20,0% добровольцев после первой и у 14,3 % - после второй вакцинации и выражались в основном головной болью, миалгией, слабостью и утомляемостью.

Показатели общего анализа крови, биохимического анализа крови, общего анализа мочи и содержания уровня ^Е в сыворотках крови привитых старше 60 лет находились в пределах нормальных значений как после первой, так и после второй вакцинации и не имели клинически значимых отличий от фоновых показателей, что позволило сделать заключение о безопасности вакцины и отсутствии у нее аллергизирующих свойств.

Оценка иммунологической эффективности вакцины показала, что препарат способен стимулировать локальный (местный) иммунный ответ с достоверным увеличением уровня б^А к 31 суткам в 1,9 раза (р<0,001).

Величина показателей С04+ и СИ8+ Т-лимфоцитов до и после вакцинации практически не изменялась, что связано, очевидно, с возрастной инволюцией тимуса, костного мозга и лимфоидных органов и , как следствие, недостаточной дифференцировкой Т-лимфоцитов и их способностью пролиферировать иммунорегуляторные и эффекторные функции. Таким образом, применение препарата у пожилых лиц в большей степени стимулирует местный (локальный) иммунитет и незначительно влияет на клеточный.

Оценка гуморального иммунитета в сравнении с другими возрастными группами показала, что на 31 сутки четырехкратное увеличение титров антител наблюдалось лишь у 39,3% привитых (р<0,05), уровень серопротекции достигал 21,4% (р<0,01), при этом кратность прироста среднего геометрического титра антител составила 2,4 (Рис. 8).

Рисунок 8. Динамика изменения показателей гуморального иммунного ответа на введение вакцины «ИНФЛЮВИР» у лиц 60 лет и старше в сравнении с различными возрастными

группами

Как видно из представленных данных, наименьшая выраженность иммунного ответа на вакцинацию наблюдалась у лиц старше 60 лет, при этом вакцина «ИНФЛЮВИР» соответствовала двум из трех критериям СРМР ЕМЕА (2001), предъявляемых к гриппозным вакцинам по показателям сероконверсии и фактору сероконверсии. Слабое образование гуморальных, а также секреторных антител у пожилых людей можно объяснить возрастной редукцией функций иммунной системы, а также плохим размножением вакцинных штаммов в носоглотке пожилых [Powers D., 1991, Treanor J., 1994]. Полученные нами данные изучения иммуногенности сопоставимы с данными, полученными при вакцинации ЖГВ лиц пожилого возраста в США.

ВЫВОДЫ

1. В рамках доклинических исследований установлено, что как однократное, так и многократное интраназальное введение вакцины «ИНФЛЮВИР» не вызывает гибели лабораторных животных, не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного воздействия на основные системы (нервную, сердечно-сосудистую, кроветворную, выделительную, дыхательную), обмен веществ, общее состояние и развитие, что свидетельствует об отсутствии у вакцины токсических свойств.

2. Вакцина «ИНФЛЮВИР» при иммунизации животных (хорьков) характеризуется высокой иммуногенностыо, вызывая после двукратной иммунизации развитие гуморального иммунного ответа (величина титров антител в РТГА/РМН - 1:80±1,8/1:95±1,4) и защищает 100% привитых лабораторных животных от заражения диким вирулентным штаммом вируса гриппа А/СаНГопиа/7/2009(Н Ш1).

3. Установлена хорошая переносимость, низкая реактогенность (местные реакции развивались у 34,0% привитых, системные реакции - у 15,0%) и высокий профиль безопасности как для привитых, так и для окружающих при иммунизации добровольцев 18-60 лет. Вакцина индуцирует развитие местного (у 60,0% привитых), клеточного (у всех привитых) и гуморального (у 54,0% привитых) звеньев иммунитета, что свидетельствует о ее высокой иммунологической эффективности.

4. Сравнительная оценка схем вакцинации с интервалом 10 и 21 сутки на добровольцах 18-60 лет выявила преимущества двукратного введения препарата с 10-тидневным интервалом. После двукратной вакцинации с интервалом 10 суток гуморальный иммунный ответ развивался у 54,0% привитых, уровень серопротекции составил 30,4%, а фактор сероконверсии достигал 2,8. В случае применения интервала 21 сутки эти показатели составили 34,0%, 17,0% и 2,1 соответственно.

5. Двукратная вакцинация детей характеризовалась хорошей переносимостью, низкой реактогенностыо (в старшей возрастной группе были выявлены реакции у 23,3% привитых, в младшей - у 6,9%), безопасностью и выраженной иммунологической эффективностью (местный и клеточный ответ развивался у всех привитых, гуморальный - у 52,0% детей 12-17 лет, и у 59,0% детей 6-11 лет).

6. При иммунизации взрослых старше 60 лет вакциной «ИНФЛЮВИР» поствакцинальные реакции развивались у 26,7% привитых после первой вакцинации и у 14,3% - после второй. Вакцина характеризовалась высоким профилем безопасности и индуцировала развитие локального (местного) иммунитета: уровень секреторного увеличился в 1,9 раз. После двукратной вакцинации

четырехкратное увеличение титров антител наблюдалось у 39,3% привитых, при этом кратность прироста среднего геометрического титра антител составила 2,4. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Результаты доклинического изучения гриппозной живой моновалентной вакцины «ИНФЛЮВИР» / А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, Н.В. Дылдина, A.A. Романова, A.A. Цаан, С.И. Брызгалова, О.В. Никитина, С.Е. Колбасов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - №2. - С. 35-39.

2. Оценка переносимости и реактогенности пандемических вакцин против гриппа типа A/H1N1 / А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, Н.В. Дылдина, A.A. Романова, A.A. Цаан, О.И. Киселев, М.К. Ерофеева, М.А. Стукова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - №3. - С. 32-35.

3. Иммуногенные и протективные свойства живой гриппозной пандемической вакцины «ИНФЛЮВИР» / А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, Н.В. Купина, A.A. Романова, A.A. Цаан, В.А. Меркулов, H.H. Степанов, С.И. Брызгалова // Сибирский медицинский журнал. - 2010. - №4. - С. 71-75.

4. Клиническое исследование реактогенности, безопасности и иммуногенности живой моновалентной гриппозной вакцины (штамм А/17/Калифорния/2009/38 - H1N1) у детей // И.В. Фельдблюм, А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, A.A. Романова, A.A. Цаан // Вопросы современной педиатрии. -2010. - Т. 9. - №4. - С. 101-105.

5. Клиническое исследование пандемической вакцины «ИНФЛЮВИР» на добровольцах от 18 до 60 лет / И.В. Фельдблюм, А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, A.A. Романова, A.A. Цаан, В.А. Меркулов, H.H. Степанов, Д.А. Голубев, М.К. Ерофеева // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. - 2011. - №2(57). - С. 35-40.

6. Результаты клинических исследований живой гриппозной моновалентной вакцины для профилактики гриппа A(HINI) на добровольцах в возрасте 60 лет и старше / И.В. Фельдблюм, А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, М.Г. Меньшикова, О.Ю. Наумов//Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. - 2011. - № 3(58). - С. 19-23.

7. «ИНФЛЮВИР» - вакцина гриппозная моновалентная для профилактики гриппа типа A/H1N1 («свиной» грипп) / А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, Н.В.

Дылдина, A.A. Романова, A.A. Цаан // Материалы международной научной конференции «Противогриппозные вакцины нового поколения». - Санкт-Петербург. -2009.-С. 58-59.

8. Клинические исследования пандемических гриппозных вакцин «ИНФЛЮВИР» и «ПАНДЕФЛЮ» на детях / А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, Н.В. Купина, A.A. Романова, A.A. Цаан // Журнал инфектологии. - 2010. - Т.2. - №3 - С. 127-128.

9. Клинические исследования вакцины «ИНФЛЮВИР» на добровольцах I860 лет / А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, Н.В. Дылдина, A.A. Романова, A.A. Цаан // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Инфекционные и паразитарные болезни в практике клинициста: современное состояние диагностики, лечения и их профилактики». - Харьков. - 2010. - С. 82-83.

10. Клиническое исследование реактогенности, безопасности и иммуногенности новой отечественной вакцины «ИНФЛЮВИР» у лиц старше 60 лет / М.Г. Меньшикова, И.В. Фельдблюм, Т.А. Шишкина, А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, Н.В. Дылдина, К.А. Павроз, О.Ю. Наумов // Материалы научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика: итоги, проблемы, перспективы». - Пермь. - 2010. - С. 72-77.

11. Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности живой моновалентной гриппозной вакцины «ИНФЛЮВИР» среди детей на территории Пермского края / И.В. Фельдблюм, Н.В. Исаева, H.A. Красавина, Л.Б. Кирьянова, O.A. Кубарикова, A.B. Полушкина, Л.А. Тукменева, O.E. Данщина, О.В. Байдина, Е.А. Кочергина, А.Г. Малов, А.Н. Миронов, Д.С. Бушменков, Н.В. Купина // Материалы научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика: итоги, проблемы, перспективы». - Пермь. - 2010. - С. 114-118.

12. Development of pandemic live attenuated influenza vaccine (LAIV) in Russua / Larisa Rudenko, Alexander Mironov, Dmitry Bushmenkov at. al. // Influenza and other respiratory viruses. - 2011. - Vol.5. - Suppl. 1. - P. 333-337.

13. Live attenuated pandemic influenza vaccine: Clinical studies on A/17/California/2009/38 (H1N1) and licensing of the Russian-developed technology to WHO for pandemic influenza preparedness in developing countries / Rudenko L, van den

Bosch H, Kiseleva I, Mironov A, Naikhin A, Larionova N, Bushmenkov D. // Vaccine.-2011.-Vol. l-№29. - Suppl. l.-P. 40-44.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АД Артериальное давление

АЛТ Аланинаминотрансфераза

ACT Аспартатаминотрансфераза

ВАК Высшая аттестационная комиссия

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ВЦ Вирусологический центр

ГОСТ Государственный стандарт

жгв Живая гриппозная вакцина

ИФА Иммуноферментный анализ

МО Московская область

МУ Методические указания

ОРВИ Острая респираторная вирусная инфекция

ПЦР Полимеразная цепная реакция

РКЭ Развивающийся куриный эмбрион

РМН Реакция микронейтрализации

РТГА Реакция торможения гемагглютинации

соэ Скорость оседания эритроцитов

ФЗ Федеральный закон

ФМБА Федеральное медико-биологическое агентство

ЧСС Частота сердечных сокращений

эид Эмбриональная инфицирующая доза

Ьх Геометрическое стандартное отклонение

CDC Centers for Disease Control and Prevention, Центр контроля и

профилактики заболеваний, США

ЕМЕА Европейское медицинское агентство

GCP Good Clinical Practice, Надлежащая клиническая практика

IgE Иммуноглобулин Е

IgG Иммуноглобулин G

slgA Секреторный иммуноглобулин А

Подписано в печать:

25.10.2011

Заказ № 613 7 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru