Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:Оценка влияния генно-инженерно-модифицированных источников пищи на репродуктивную систему крыс и их потомство

На право- рукописи

УТЕМБАЕВА НАЗЫМ ТАЛГАТОВНА

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ПИЩИ НА РЕПРОДУКТИВНУЮ СИСТЕМУ КРЫС И ИХ ПОТОМСТВО

14.02.01.- гигиена

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 0 ЯН5 2011

Москва-2010

004619658

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских Научно-исследовательском институте питания РАМН

Научный руководитель: академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Тутельян Виктор Александрович

Ракитский Валерий Николаевич Королев Алексей Анатольевич

Ведущая организация:

ФГБУ «НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 24 января 2011 года на заседании диссертационного совета Д001.002.01 в НИИ питания РАМН (Москва, Устьинский проезд, 2/14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ питания РАМН

Автореферат разослан 23 декабря 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Коденцова В.М.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Практическое применение новых способов трансформации генома растений повлекло за собой потребность в строгой регламентации процесса оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения, предназначенных для использования в пищу. Разработка системы оценки безопасности ГМО, действующей в настоящее время в Российской Федерации, была начата в 1995-1996 г.г. Данная система не только аккумулирует весь отечественный и зарубежный опыт, но и включает новейшие научные подходы, основанные на достижениях современной фундаментальной науки [Тутельян В.А., 2007; Abbott А., 1999; WHO, 2000, 2001; Kuiper H.A. et al., 2003; Codex Alimentarius, 2003, 2004; Jaffe G„ 2004; EFSA, 2008].

Оценка безопасности ГМО проводится на этапе государственной регистрации. Государственной регистрации подлежат новые пищевые продукты, полученные из ГМО растительного происхождения, изготовленные в Российской Федерации, а также пищевые продукты, полученные из ГМО растительного происхождения, ввоз которых на территорию Российской Федерации осуществляется впервые [МУ 2.3.2.2306-07, СанПиН 2.3.2.2340-08]. В системе медико-биологических исследований безопасности ГМО, наряду с общетоксикологическими исследованиями, важное место принадлежит изучению специфических видов токсичности в экспериментах in vivo. В соответствии со сложившейся исследовательской практикой используется комплексный подход, предоставляющий наиболее полную и достоверную информацию о потенциальном генотоксическом, иммунотоксическом и аллергеном действии ГМО, а также позволяющий выявить возможные незаданные эффекты генетической модификации [Дурнев А .Д. и др., 1998; Онищенко Г.Г. и др., 1999; Хабриев Р.У., 2005; Тутельян В.А., 2007]. При необходимости, в случае выявления существенных изменений генома, протеома и метаболома ГМО, могут быть проведены дополнительные исследования: влияние на репродуктивную функцию, гонадотоксическое, эмбриотоксическое, тератогенное действие; влияние на продолжительность жизни, и др. [МУ 2.3.2.2306-07].

Анализ данных научной литературы показывает, что изучение репродуктивной токсичности является одним из интегральных критериев при гигиенической оценке факторов окружающей среды, так как сложность феномена репродукции делает его уязвимым для неблагоприятных воздействий на любом этапе реализации функции. Серьезным ограничением использования методов оценки репродуктивной токсичности является их продолжительность и трудоемкость, поэтому в процедурах оценки безопасности пищевых веществ (пищевых добавок, новых источников пищи) [ВОЗ, 1991; Codex Alimentarius, 2003, 2004; EFSA, 2008] изучение репродуктивной токсичности относится к факультативным исследованиям, проводимым в случае доказанной необходимости. Однако, несмотря на 15-летний опыт использования ГМ источников пищи в питании людей и животных [James С., 2009], сохраняется

необходимость пополнения доказательной базы безопасности ГМО для здоровья человека, что обусловливает важность проведения исследований репродуктивной функции и развития потомства в поколениях [Hodgson Е., 2001; Howlett J. et al., 2003; Paoletti С. et al., 2008].

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы являлась, во-первых, разработка алгоритма оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения и выбор методов исследования генеративной функции экспериментальных животных, пренатального и постнатального развития потомства; во-вторых - изучение влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на генеративную функцию, пренатальное и постнатальное развитие потомства трех поколений крыс. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• на основании анализа литературных данных и результатов предварительных исследований определить порядок оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения и набор методов исследования генеративной функции, пренатального и постнатального развития потомства экспериментальных животных;

• изучить влияние ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на генеративную функцию крыс поколений F0-F1 по фертильной способности, гормональному статусу и уровню гаметогенеза в половых железах самцов и самок в трех поколениях;

• изучить влияние ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на пренатальное развитие потомства поколений F1-F2 по пред- и постимплантационной смертности, зоометрическим параметрам плодов, состоянию внутренних органов и костной системы плодов;

• изучить влияние ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на постнатальное развитие потомства поколений F1-F2 по динамике зоометрических показателей, параметрам физического развития, выживаемости с 0 по 5-й и с 6-го по 25-й дни жизни.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые разработан алгоритм оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения и определен комплекс методов исследования репродуктивной функции крыс и их потомства.

Впервые изучено влияние ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на генеративную функцию, пренатальное и постнатальное развитие потомства трех поколений крыс. Результаты проведенных исследований могут быть расценены как прямые доказательства отсутствия какого-либо отрицательного влияния ГМ кукурузы на репродуктивную функцию экспериментальных животных и на развитие потомства.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Разработанный алгоритм оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения может быть рекомендован для использования при гигиенической оценке биотехнологической пищевой продукции.

Результаты работы дополнили доказательную базу безопасности ГМО для здоровья последующих поколений, и могут быть использованы в качестве иаучного обоснования отсутствия негативного влияния ГМ кукурузы на репродуктивную функцию экспериментальных животных и на развитие потомства.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертационной работы доложены на 2-ой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 29 мая - 1 июня 2007 г.), на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 19-22 мая 2008 г.), на X Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 1-3 декабря 2008 г.), на V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 16-20 марта 2008 г.), на Международной научно-практической конференции «Питание и здоровье» (Алматы, 4 мая 2009 г.). Диссертация апробирована на научной конференции кафедры гигиены питания и токсикологии ММА им. И.М. Сеченова с участием лаборатории по изучению новых и генетически модифицированных источников пищи, лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии НИИ питания РАМН 18 сентября 2009 г.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР НИИ питания РАМН в рамках темы № 098.

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 1 статья в научном журнале, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, и 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК МОН Республики Казахстан.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, главы материалы и

методы исследования, _глав результатов собственных исследований, заключения,

выводов, списка цитированной литературы, включающего_источников, из которых

_- зарубежные. Диссертация изложена на_страницах машинописного текста,

включает_рисунков,_схем,_таблицы.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

• Экспериментальные доказательства эффективности предложенного алгоритма оценки репродуктивной токсичности ГМО и целесообразности его использования в качестве этапа медико-биологических исследований биотехнологической пищевой продукции.

• Экспериментальные доказательства отсутствия влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на репродуктивную систему крыс и их потомство, основанные на результатах изучения генеративной функции, пренатального и постнатального развития потомства трех поколений крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследований использованы образцы ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, и ее традиционного аналога, выращенные в идентичных условиях и прошедшие аналогичную технологическую обработку.

Устойчивость ГМ кукурузы к глюфосинату аммония обусловлена присутствием в ее геноме кассеты экспрессии гена pat, изолированного из Streplomyces viridochromogenes. Действующим веществом гербицидов на основе глюфосината аммония является фосфинотрицин, механизм действия которого обусловлен ингибированием фермента глутаминсинтетазы растительных клеток. В растениях глутаминсинтетаза превращает аммиак в глутамин. Блокирование глутаминсинтетазы глюфосинатом приводит к быстрому истощению запаса глутамина в растении, накоплению аммиака в фотосинтезирующих тканях и отравлению растения [Чумиков И.А., 2001; Cremer J., 2001]. Ген устойчивости к глюфосинату, принято обозначать pat или bar, в зависимости от того, был он выделен из Streptomyces viridochromogenes или Streptomyces hydroscopiciis, вырабатывающих трипептидный антибиотик биалофос; активной составляющей биалофоса является L-фосфинотрицин [Глик Б.Р., Пастернак Д.Д., 2002]. Ген pat/bar кодирует синтез фермента фосфинотрицин ацетилтрансферазы, ацетилирующего свободную NH2 группу фосфинотрицина. Растения, в которые введен этот ген, обладают способностью продуцировать фосфинотрицин ацетилтрансферазу, и, как следствие - устойчивостью к действию глюфосината [Сингер М., Берг П., 1998; Dekker J., Duke S.O., 1995; Cremer J., 2001].

Содержание токсичных элементов, пестицидов и микотоксинов в образцах кукурузы не имело значимых различий и не превышало допустимых уровней, установленных СанПиН 2.3.2.1078-01 (п. 1.4.1.). Зерно кукурузы подвергали измельчению в микромельнице до равномерной крупяной массы с размером частиц 400450 мкм. Измельченное зерно кукурузы включали в состав корма из расчета -8-10 г на крысу в сутки, заменяя ингредиенты рациона по принципу изокалорийности и идентичности химического состава [МУ 2.3.2.2306-07].

Исследования выполнены на трех поколениях крыс линии Вистар: родительском (F0), первом (Fl) и втором (F2). Всего в работе было использовано 270 взрослых животных и 1142 крысенка (табл.1).

Состав экспериментальных групп и количество животных

Группа Р0 П Всего

Контрольная группа Взрослые животные 50?+25с? 40$+20с? 135

Потомство 300 242 542

Опытная группа Взрослые животные 50$+25с? 402+206* 135

Потомство 354 246 600

Исходная колония крыс линии Вистар (самцы и самки, возраст ~30-35 дней) получена из питомника лабораторных животных «Столбовая» РАМН. Животные были произвольно разделены на 2 группы и переведены на рационы с включением кукурузы: крысы опытной группы получали с рационом ГМ кукурузу, крысы контрольной группы - традиционный аналог ГМ кукурузы. Экспериментальные рационы животные получали на протяжении всего срока исследований.

Для оплодотворения самок подсаживали к самцам в соотношении 2:1 сроком на 1 эстральный цикл (5 сут.). В период спаривания возраст крыс составлял 100-120 дней. Крысят отсаживали от материнских животных на 26-й день жизни, для продолжения эксперимента отбирали потомство от разных самок (с целью рандомизации исследований и исключения возможности инцеста). В течение эксперимента велись наблюдения за поедаемостью корма, массой тела и общим состоянием животных.

Для оценки состояния репродуктивной системы крыс были изучены генеративная функция гонад, пренатальное и постнатальное развитие потомства. Генеративную функцию гонад оценивали у половозрелых крыс (возраст 100-120 дней) по фертильности, синтезу половых гормонов - прогестерона, эстрадиола - яичниками и тестостерона - семенниками, уровню гаметогенеза в яичниках и семенниках - по концентрации ДНК.

Эффективность спаривания оценивали по способности к оплодотворению самок и самцов, выраженную в процентном соотношении забеременевших самок/оплодотворивших самцов к общему количеству ссаженных самок/самцов. Так как самок ссаживали с самцами в соотношении 2:1, беременность обеих или одной самки подтверждала фертильность самца, в случае, если ни одна из самок не забеременела, самец считался не фертильным, а обе самки - потенциально фертильными.

Для изучения пренатального развития потомства по 9-11 беременных самок из каждой группы подвергали эвтаназии на 20-й день беременности, подсчитывали количество желтых тел в яичниках, количество мест резорбции и мест имплантации, определяли число живых и мертвых плодов, вычисляли предимплантационную гибель (по разности между количеством желтых тел в яичниках и количеством мест имплантации в

матке) и постимплантационную гибель (по разности между количеством мест имплантации в матке и количеством живых плодов). Плоды извлекали, проводили макроскопический осмотр, определяли массу и краниокаудальный размер [Хабриев Р.У., 2005]. После осмотра, измерения и взвешивания плоды каждого помета делили на три группы: у одной группы плодов выделяли и взвешивали внутренние органы (печень, почки, сердце, легкие), плоды второй группы фиксировали в жидкости Буэна и использовали для изучения внутренних органов по методу Wilson J.G. [Хабриев Р.У., 2005; Wilson J.G., 1965], плоды третьей группы фиксировали в 96° этаноле и использовали для изучения состояния скелета по методу Dawson A.B. [Хабриев Р.У., 2005; Dawson A.B., 1926].

Эвтаназию животных проводили в соответствии с Приказом Минздрава Российской Федерации № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». За 12 часов до эвтаназии животных лишали пищи. Отбор крови производили из сосудов шеи в пробирки «Vacuette». Цельную кровь центрифугировали 20 мин. при скорости 2500 об/мин на центрифуге «Опн-ЗМ». Сыворотку разливали по 0,50 мл в пластиковые микропробирки «Eppendorf» и хранили при -20 °С. Содержание эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови беременных самок (20-й день беременности), тестостерона - в сыворотке крови половозрелых самцов, определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы «Diagnostics Biochem Canada Inc.» (кат. №№ CAN-E2-430; CAN-P-305; CAN-TE-250). Исследования выполнены на иммуноферментном анализаторе «Anthos-2020».

Яичники и семенники измельчали путем продавливания через перфорированную пластину из нержавеющей стали. Полученную массу переносили в стеклянный гомогенизатор Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком и гомогенизировали при 2000 об/мин в течении 60 сек. В качестве среды выделения использовали 1-кратный фосфатно-солевой буфер. Конечное разведение гомогенатов соответствовало 0,1 г : 1,5 мл. Содержание ДНК в яичниках и семенниках крыс определяли по методу Burton К., 1956, основанным на способности входящей состав ДНК дезоксирибозы давать синее окрашивание при нагревании с дифениламином в присутствии сильных кислот. Содержание ДНК в ткани рассчитывали по калибровочному графику. Для построения калибровочной кривой использовали стандарт ДНК фирмы «Sigma» (кат. № D3664). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «Biorad SmartSpec™ 3000».

Постнатальное развитие потомства Fl и F2 оценивали в течение первого месяца жизни по числу живых и мертвых новорожденных, динамике зоометрических показателей (массы тела и краниокаудального размера), общему физическому развитию (срокам отлипания ушных раковин, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, открытия глаз, опускания семенников, открытия влагалища). Массу тела и краниокаудальный размер крысят измеряли на 2-е, 5-е, 10-е, 15-е, 20-е и 25-е сутки жизни. Также определяли среднюю величину помета, соотношение самцов и

самок, вычисляли выживаемость с 0 по 5-й дни жизни (отношение числа крысят, доживших до 5-го дня, к числу родившихся живыми) и с 6-го по 25-й дни жизни (отношение числа крысят, доживших до 25-го дня, к числу доживших до 6-го дня).

Результаты приведены в виде М±ш и min-max, где М - выборочное среднее измеряемых величин, ш - стандартная ошибка, min и max - соответственно минимальное и максимальное значение измеряемой величины, а также долях (процентах) или абсолютных числах. В соответствии со структурой исследования проведено сравнение количественных признаков контрольной и опытной групп.

Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ SPSS 17.0. Характер распределения количественных признаков определяли с помощью -¿-критерия, равенство дисперсий - с помощью критерия Левена. Оценку достоверности различий средних величин, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, проводили методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для сравнения количественных признаков, не удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий, использовали непараметрический аналог для независимых выборок - U-критерий Манна-Уитни. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05 [Реброва О.Ю., 2006; Norusis M.J., 2009]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка алгоритма исследований репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения

Продолжительность исследований репродуктивной токсичности на нескольких поколениях животных обусловливает необходимость стандартизации фоновых воздействий в течение эксперимента, однако влияние сезонных факторов невозможно полностью нивелировать даже в условиях лаборатории. Содержание в режиме естественного освещения и соответствующий времени года фотопериодизм оказывают модифицирующее действие на функцию репродуктивной системы крыс [Виноградова И.А. и др., 2006; Hoffmann J.C., 1969, 1970; Drickamer L.C., 1977], поэтому данные, полученные в рамках одного эксперимента, могут изменяться в значимом диапазоне. Для отработки модели изучения репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения были проведены предварительные исследования репродуктивной функции крыс в осенне-зимний, весенний и летний периоды.

На основании анализа данных литературы [Хабриев Р.У., 2005; FDA/CFSAN/OFAS, 2004; OECD, 2004] и результатов предварительных исследований определен порядок оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения (схема 1).

Первым этапом эксперимента является подготовительная стадия, предназначенная для выведения животных (поколение F0), получавших

9

экспериментальные рационы на протяжении всего срока онтогенетического развития организма, включая периоды плацентарного питания и питания молоком матери, максимально стандартизованных для целей данного исследования; непосредственное изучение репродуктивной функции крыс проводится на животных поколений РО, Р1,

Схема 1. Этапы эксперимента

ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЙ ЭТАП

ИЗУЧЕНИЕ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ КРЫС ГО, П, Г2, ПОЛУЧАВШИХ С РАЦИОНОМ ГМ КУКУРУЗУ И ЕЕ ТРАДИЦИОННЫЙ АНАЛОГ

Изучение влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосииату аммония, на генеративную функцию крыс

Общее состояние животных F0-F1 было удовлетворительным: по внешнему виду, качеству шерстного покрова, поведению и скорости роста животные опытной группы не отличались от животных контрольной группы. Еженедельный прирост массы тела крыс обеих групп в возрасте 30-93 дней (рис. 1-2) соответствовал уровню прироста, характерному для животных данного вида и возраста [Pullen А.Н., 1976; Derelanko M.J. et al., 2001; Hood R.D., 2006].

Дмнамвка массы тела крыс поколения F0

500

450

400

L. 350

2 300

я 250

£ 200

< 150

100

50

0

.....

500 450 400 . 350 ! 300 ; 250 | 200 i 150

too

50 О

30 37 44 51 53 65 72 79 86 93 Дви жшии

- Традиционный аналог

У"

30 37 44 51 58 65 72 79 86 93

ДНИ ЖН1ЫН

-О- ГМ кукуруза

Рис. 1. Динамика массы тела крыс поколения F0

Динамика массы тела крыс поколения Fi

.....

500

450

400 -

350

300

250

£ 200 ■

Е 150

100

50 ■

0

30 37 44 51 58 65 72 79 86 93 Дцнжмзш!

- Тралшнонкый аналог

51 58 65 72 79 Днижщнн

-ГМ кукуруза

Рис. 2. Динамика массы тела крыс поколения Fl

Интегральным показателем генеративной функции гонад является эффективность спаривания, подтверждающая фертильность экспериментальных животных. Согласно данным, представленным в табл. 2, эффективность спаривания у самок обеих групп поколения F0 составляла 79-80%, поколения Fl - 77-87%, эффективность спаривания у самцов - 89-95% и 100%, соответственно.

Эффективность спаривания соответствовала ожидаемой при данных условиях эксперимента: при продолжительности ссаживания 5 сут., соответствующей средней длительности эстрального цикла крысы [Хабриев Р.У., 2005], количество не забеременевших самок во всех группах поколений F0-F1 варьировало в пределах 13-23%. Поскольку, согласно [Mandl A.M., 1951], у 11-28% крыс эстральный цикл длится 5,5-10,0 сут., часть ссаженных самок не достигла фазы эструса в отведенном временном периоде.

Эффективность спаривания крыс FO, Fl

Поколение Группа Пол Количество ссаженных крыс Количество забеременевших $/ оплодотворивших $ Эффективность спаривания, %

F0 Контрольная группа 9 38 26 79

с? 19 17 89

Опытная группа ? 40 30 80

$ 20 19 95

Fl Контрольная группа г 30 26 87

$ 15 15 100

Опытная группа ? 30 23 77

с? 15 15 100

Количество условно стерильных (неоплодотворивших) самцов поколений F0-F1 находилось в диапазоне физиологической нормы [Marty M.S. et al., 2009] и составляло 0-11%. Некоторые колебания эффективности спаривания животных в разных группах не имели определенной тенденции и, следовательно, являлись случайными, не связанными с влиянием каких-либо внешних факторов.

Таким образом, результаты исследований генеративной функции свидетельствуют об отсутствии различий между животными, получавшими с рационом ГМ кукурузу и ее традиционный аналог; при сравнении интегральных показателей, характеризующих общее состояние крыс контрольной и опытной групп, не выявлено различий скорости роста, динамики массы тела и поедаемости корма. Значения изученных показателей находились в пределах физиологических колебаний, характерных для крыс.

Осуществление эстрального цикла у крыс включает в себя координированное изменение активности гипоталамических структур, функции гипофиза, функции яичников, в которых под влиянием гонадотропинов происходит созревание фолликулов, овуляция и развитие желтого тела с соответствующим каждой фазе изменением гормональной активности [Остин К., Шорт Р., 1987]. Динамика гормональных изменений в течение репродуктивного эстрального цикла связана с различной длительностью его фаз (проэструс, эструс, диэструс) и регулярностью повторения цикла. Поскольку половой цикл крыс в среднем длится 5,5 суток (от 1,5 до 10 суток) [Mandl A.M., 1951], и оценка эндокринной функции гонад небеременных самок осложнена невозможностью синхронизации фаз цикла, в эксперименте изучена эндокринная функция гонад беременных самок (на 20-й день беременности). Нарушение баланса половых гормонов в организме приводит к патологии развития гамет и бесплодию, поэтому одним из доказательств нормальной эндокринной регуляции физиологических процессов, протекающих в организмах подопытных животных, является овуляция, оплодотворение и физиологическое протекание беременности.

Содержание эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови беременных самок в норме составляет 71-158 пкг/мл и 25-68 нг/мл [Albrecht E.D., 1998; Mukaddam-Daher S., 2002; Roste L.S., 2003], таким образом, как видно из табл. 3, содержание данных гормонов в крови самок F0-F1 контрольной и опытной групп находилось в пределах нормы. Незначительные статистически недостоверные различия концентрации эстрадиола и прогестерона между группами не выходили за границы физиологических колебаний, что свидетельствует о нормальной эндокринной функции половых желез.

Таблица 3

Эндокринная функция яичников крыс поколений F0-F1

Показатели Поколение F0 Поколение F1

Контрольная группа Опытная группа Контрольная группа Опытная группа

Содержание М±т 99,8±12,3 шз,здз,з 83,0±11,8 76,6±10,7

эстрадиола, пкг/мл Min-Max 66,6-168,4 63.7-173,1 22,3-175,4 44,0-156,9

Содержание М±т 47,9±3,3 40,1 ±2,8 54,4±3,1 56,2±2,3

прогестерона, нг/мл Min-Max 26,9-60,0 23,0-60,0 27,6-60,0 35,7-60,0

У крыс, как и большинства видов животных, концентрация эстрогенов и прогестерона в крови и моче во время беременности повышается, что связано с усилением их секреции яичниками и фетоплацентарной системой [Остин К., Шорт Р., 1987; Кппке в.!, 2000]. Физиологическая адаптация материнского организма к беременности возможна лишь у здоровых особей, так как комплексные изменения гомеостаза, в том числе - эндокринной функции гонад, могут трансформировать компенсированный патологический процесс в декомпенсированный. В сущности, беременность является физиологической провокацией, нагрузкой, позволяющей выявить скрытый в стационарном состоянии гормональный дисбаланс, поэтому изучение эндокринной функции гонад у беременных самок представляет наибольшую диагностическую ценность для целей данного исследования.

Эндокринная функция яичников обеспечивает регулярное образование ооцитов, поэтому оогенная и эндокринная функции яичников тесно взаимосвязаны [Остин К., Шорт Р., 1987]. Яичник, не содержащий ооцитов, не может нормально функционировать в качестве эндокринной железы. У половозрелого животного строение и функция яичника постоянно меняются: гонадотропные гормоны передней доли гипофиза стимулируют рост граафовых пузырьков (фолликулогенез), овуляцию и образование желтых тел. Так, в работе [Ташига Н. е! а!., 1987] выявлено 2-кратное повышение содержания ДНК на 13-14-й дни беременности; в работе [Ыакашига У. е! а1., 1978], продемонстрировано увеличение массы желтых тел и увеличение содержания ДНК в желтых телах крыс во время беременности: масса желтых тел увеличивалась в 3,4 раза, содержание ДНК - в 3,5 раза.

По данным [Татига Н. е1 а1.,1987] содержание ДНК в яичниках беременных

самок составляет 2,5-3,5 мг/г ткани; как видно из табл. 4, содержание ДНК в яичниках самок Р0-Р1 контрольной и опытной групп находилось в пределах сопоставимых значений. Масса яичников самок обеих групп также не имела статистически значимых различий как в поколении РО, так и в поколении Р1 (табл. 5).

Таблица 4

Содержание ДНК в яичниках крыс поколений F0-F1

Показатели Поколение F0 Поколение Fl

Контрольная группа Опытная группа Контрольная группа Опытная группа

Содержание ДНК, М±т 1,78±0,09 1,91±0,11 2,17±0,09 2,01±0,08

мг/г ткани Min-Max 1,43-2,40 1,47-2,67 1,74-2,64 1,58-2,53

Таблица 5

Масса яичников крыс поколений F0-F1

Поколение F0 Поколение Fl

Показатели Контрольная Опытная Контрольная Опытная

группа группа группа группа

Абсолютная масса, г М±т 0,17±0,02 0,17±0,02 0,17±0,01 0,18±0,01

Min-Max 0,11-0,32 0,10-0,26 0,08-0,28 0,10-0,28

Относительная масса, М±т 0,04±0,01 0,05±0,01 0,04±0,01 0,04±0,01

г/Ю0г массы тела Min-Max 0,03-0,06 0,03-0,07 0,02-0,06 0,03-0,06

Принимая во внимание, что уровень ДНК является косвенным критерием уровня оогенеза [Tamura Н. et al.,1987], результаты исследований свидетельствуют о нормальной оогенной функции яичников крыс F0-F1 контрольной и опытной групп.

Гормональная функция половых желез самцов начинается во внутриутробном периоде развития, образующиеся андрогены обеспечивают половую дифференцировку гипоталамуса, а также формирование половых органов по мужскому типу [Остин К., Шорт Р., 1987]. Максимальная продукция андрогенов у самцов крыс наблюдается в возрасте 3-18 мес., при этом эндокринная активность гонад распределяется неравномерно. Например, на протяжении суток наблюдается от 5 до 12 пиков уровня тестостерона в плазме, с увеличением до 10 раз [Баранов В.Г., 1979; Witorsch R.J., 1995; Krinke G.J., 2000]. При динамическом изучении уровня половых гормонов на протяжении длительного периода времени у самцов млекопитающих также отмечаются значительные колебания уровня гормонов. Таким образом, содержание тестостерона в сыворотке крови половозрелых самцов в норме варьирует в диапазоне 2,6-8,7 нг/мл [Tena-Sempere М„ 1999; Souza S.D., 2004; Kuriyama S.N., 2005].

Как видно из табл. 6, содержание тестостерона в крови самцов F0-F1 соответствовало физиологической норме, статистически значимых различий между группами не выявлено.

Эндокринная функция семенников крыс поколений F0-F1

Поколение F0 Поколение F1

Показатели Контрольная Опытная Контрольная Опытная

группа группа группа группа

Содержание М±ш 7,7±1,3 7,0±1,0 3,5±0,5 4,7±0,7

тестостерона, нг/мл Min-Max 4,3-15,1 2,8-13,8 1,8-6,2 1,9-9,8

Рассматривая гормональную регуляцию функции семенников, следует помнить о том, что эндокринная функция семенников и процессы сперматогенеза тесно взаимосвязаны [Остин К., Шорт Р., 1987]. У крысы в канальце длиной 1 см в течение 12-дневного цикла может образоваться 125000 сперматид; при общей протяженности канальцев 500 см в обоих семенниках образуется 10х106 сперматозоидов в сутки [Рузен-Ранге Э., 1980].

Содержание ДНК в семенниках половозрелых самцов в норме составляет 1,8-5,0 мг/г ткани [Mills N.C., 1977], таким образом, как видно из табл. 7, содержание ДНК в семенниках самцов F0-F1 обеих групп находилось в пределах нормы. Масса семенников самцов обеих групп (возраст 100 дней) также не имела статистически значимых различий как в поколении F0, так и в поколении F1 (табл. 8).

Таблица 7

Содержание ДНК в семенниках крыс поколений F0-F1

Показатели Поколение F0 Поколение F1

Контрольная группа Опытная группа Контрольная группа Опытная группа

Содержание ДНК, М±т 1,99±0,08 2,06±0,08 2,55±0,12 2,69±0,11

мг/г ткани Min-Max 1,40-2,24 ¡,54-2,42 1,99-3,40 2,21-3,42

Таблица 8

Масса семенников крыс поколений F0-F1

Поколение F0 Поколение F1

Показатели Контрольная Опытная Контрольная Опытная

группа группа группа группа

Абсолютная масса, г М±ш 3,44±0,16 3,65±0,07 3,11±0,12 3,14±0,07

Min-Max 2,98-4,42 3,25-3,95 2,52-3,74 2,77-3,34

Относительная масса, M±m 0,79±0,03 0,85±0,03 0,79±0,04 0,83±0,04

г/ЮОг массы тела Min-Max 0,68-0,99 0,73-0,97 0,60-0,97 0,65-0,98

Принимая во внимание, что уровень ДНК является косвенным критерием уровня сперматогенеза [Mills N.C., 1977], результаты исследований свидетельствуют о нормальной сперматогенной функции семенников крыс F0-F1 контрольной и опытной групп.

Таким образом, при изучении эндокринной функции гонад самцов и самок поколений F0-F1 не выявлено различий между животными, получавшими с рационом ГМ

кукурузу и ее традиционный аналог. Содержание эстрадиола и прогестерона в крови беременных самок, тестостерона - в крови самцов обеих групп находилось в пределах нормы, что свидетельствует о нормальной эндокринной функции половых желез экспериментальных животных.

Изучение влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на пренатальное развитие потомства

При сравнении пренатального развития потомства самок опытной и контрольной групп (получавших с рационом ГМ кукурузу и традиционный аналог) поколений F0-F1 (табл. 10), не было выявлено значимых различий между группами: количество желтых тел и мест имплантации, количество живых и мертвых плодов, предимплантационная гибель эмбрионов находились в пределах физиологических колебаний, характерных для крыс линии Вистар (табл. 9). Спонтанная постимплантационная гибель зародышей у крыс F0-F1 контрольной и опытной групп была несколько ниже диапазона значений, обычно регистрируемого у крыс данной линии (по данным разных исследователей 3,6-9,2 %, табл. 9). У самок контрольной группы в поколении F0 данный показатель составлял 0%, в поколении Fl - 0,8±0,8%, у самок опытной группы - 0,9±0,9% и 3,7±3,0%, соответственно (табл. 10).

Зоометрические показатели плодов Fl и F2 варьировали в пределах физиологической нормы. Масса тела и краниокаудальный размер плодов опытной группы не имели значимых отличий от аналогичных показателей плодов контрольной группы (табл. 11). При сравнении массы внутренних органов плодов Fl и F2 также не выявлено статистически достоверных различий между контрольной и опытной группами, абсолютная и относительная массы печени, почек, сердца, легких соответствовали норме [Pullen А.Н., 1976; Schneiderit М., 1985; Jurevics H.A. et al., 1997].

Таблица 9

Пренатальное развитие потомства: данные литературы

Регистрируемые показатели М±ш Литературный источник

Griffiths S., 2007 Liberati Т.А., 2002 Saito F.H., 2010 Erna М., 1992 Aoyama Н., 2002 Nöda Т., 2001

Количество беременных самок 26 150 15 11 47 10

Количество желтых тел 12,3+0,2 - 14,0+0,4 14,5+0,3 13,5+0,2 15,8±1,3

Количество мест имплантации 11,2+0,4 - 13,2+0,3 13,5+0,39 12,6+0,2 15,4±1,4

Количество живых плодов 10,8+0,4 10,6±0,3 10,73 12,3±0,3 11,5+0,3 14,6±1,9

Количество резорбций 0,42±0,2 7,2±1,2 - 0 - 0

Предимплантационная гибель, % 8,5+3,0 14,1+1,5 5,14 6,2 7,1±1,4 -

Постимплантационная гибель, % 3,6±1,4 7,4±1,2 5,77 9,2 8,6+1,7 4,69

Пренатальное развитие потомства самок F0, Fl

Поколение F0 Поколение Fl

Регистрируемые показатели Контрольная Опытная Контрольная Опытная

группа группа группа группа

Количество беременных 10 9 11 11

самок

Количество желтых тел Всего 127 117 124 142

М+т 12,70+0,54 13,00±0,53 11,18+0,55 12,91+0,55

min-max 10-15 11-15 8-14 10-16

Количество мест имплантации Всего 120 107 114 132

М+т 12,00+0,54 11,89+0,77 10,27+0,81 12,00+1,04

min-max 9-14 8-14 5-14 3-16

Количество живых плодов Всего 120 106 113 131

М±т 12,00+0,54 11,78±0,76 10,27+0,81 11,91+1,12

min-max 9-14 8-14 5-14 2-16

Количество мертвых плодов 0 1 0 0

Количество резорбций Всего 0 0 1' 1

М+т - - 0,09+0,09 0,09±0,09

min-max - - 0-1 0-1

Предимплантационная гибель, % 5,5+1,3 9,1+3,4 8,7+4,7 8,0±6,5

Постимплантационная гибель, % 0 0,9+0,9 0,8+0,8 3,7±3,0

1 внематочная беременность

Таблица 11

Зоометрические показатели плодов F1-F2 на 20-й день пренатального развития

Показатели Поколение Fl Поколение F2

Контрольная группа п=50 Опытная группа п=45 Контрольная группа п=55 Опытная группа п=52

Масса тела, г 4,998+0,080 4,771±0Д00 4,604±0,063 4,427+0,065

Краниокаудальный размер, см 4,490+0,043 4,329±0,074 4,300+0,032 4,338+0,037

Печень, г абс. 0,275±0,013 0,270±0,013 0,256+0,006 0,254+0,008

отн. 5,4000.211 5,659±0,243 5.5S9+0,138 5,767±0,179

Почки, г абс. 0,037±0,002 0,031±0,002 0,026+0,001 0,024+0,001

отн. 0,708±0,042 0,658±0,042 0,577±0.027 0,522±0,028

Сердце, г абс. 0,029±0,001 0,027±0,001 0,027+0,001 0,025+0,001

отн. 0,563±0,023 0,559±0,019 0,591 ±0,020 0,566±0,014

Легкие, г абс. 0,132±0,005 0,134±0,004 0,113+0,003 0,106+0,004

отн. 2,613±0,081 2,8!4±0,069 2,487±0,061 2,469±П,087

При обследовании плодов Fl и F2 по методу Wilson J.G. [Хабриев Р.У., 2005; Wilson J.G., 1965] (в каждом поколении обследовано по 10 плодов контрольной и опытной групп) аномалий развития внутренних органов выявлено не было (рис. 3). Формирование основных анатомических систем: нервной (головной, спинной мозг),

сенсорной (глазные яблоки, обонятельные луковицы), сердечно-сосудистой (сердце), дыхательной (трахея, легкие, бронхи), пищеварительной (слюнные железы, язык, пищевод, желудок, кишечник, печень), мочевыделительной (почки, мочевой пузырь), половой (внутренние половые органы), локомоторной (лицевой череп, позвоночник, диафрагма), у плодов Р1 и Р2 контрольной и опытной групп протекало без особенностей.

:

Рис.3. Обследование внутренних органов плодов по методу Wilson J.G.

1-й разрез - нижняя челюсть, язык, передние отделы твердого нёба и носовой полости; 2-й -глазные яблоки и обонятельные луковицы; 3-й разрез - кора больших полушарий головного мозга, боковых и третьего желудочка; 4-й разрез - мозжечок, четвертый желудочек и продолговатый мозг; 5-й разрез - гортань, пищевод, позвоночник, спинной мозг и слюнные железы; б-й разрез - пищевод, трахея, спинной мозг; 7-й разрез - сердце, легкие, бронхи, спинной мозг; 8-й разрез -печень (а), диафрагма (б); 9-й разрез - почки, печень, кишечник, желудок (в), после удаления петель кишечника и печени - почки, мочеточники, мочевой пузырь, прямая кишка, внутренние половые органы (г).

Развитие скелета плодов оценивали по методу Dawson A.B. [Хабриев Р.У., 2005; Dawson A.B., 1926]. Поскольку данный метод позволяет выявить врожденные аномалии скелета, незаметные при внешнем осмотре, а также оценить соответствие оссификации скелета стадии внутриутробного развития [Дыбан А.П., 1970; Акимова И.М., 1972], обследование каждого плода включало два последовательных этапа; обзорные исследования скелета, и остеометрические исследования нижней челюсти, плечевых, локтевых, лучевых, бедренных, большеберцовых и малоберцовых костей (рис. 4).

б. в.

В каждом поколении обследовано по 5 плодов контрольной и опытной групп, аномалий развития скелета не выявлено. Длина участков оссификации в закладках костей конечностей и черепа плодов Р1 и Р2 не имела значительных различий между группами (табл. 12) и соответствовала нормальным значениям [Дыбан А.П., 1970; Акимова И.М., 1972; Яао^АХ, 1999].

Таким образом, результаты исследований пренатального развития потомства Р1-Р2 свидетельствуют об отсутствии различий между животными, получавшими с рационом ГМ кукурузу и ее традиционный аналог. Значения изученных показателей не выходили за пределы физиологической нормы.

Рис. 4. Исследование скелета плодов по методу Dawson A.B.

а. Измерение длины нижней челюсти.

б. Измерение длины плечевой, лучевой и локтевой костей.

в. Измерение длины бедренной, большеберцовой и малоберцовой костей.

Таблица 12

Длина участков оссификании в закладках костей плодов F1-F2

Поколение Fl Поколение F2

Длина костей, мкм Контрольная Опытная Контрольная Опытная

группа группа группа группа

Нижняя челюсть М±ш 8122±204 7449±396 734I±182 7274±149

Min-max 7375-8740 6196-8789 6510-7739 6850-7790

Плечевая кость M±m 3580±157 3781±203 3426±I05 3324±109

Min-max 3102-4156 3059-4299 3132-3735 3296-3843

Локтевая кость M±m 3845±211 3970±245 3726±1!б 3668±154

Min-max 3305-4522 3209-4680 3413-4164 3296-4143

Лучевая кость M+m 2820±140 2929±179 2568±92 2621±98

Min-max 2426-3399 2279-3382 2230-2881 2226-2872

Бедренная кость M±m 2799±184 2804±227 2550±98 2536±103

Min-max 2217-3295 2192-3272 2368-2974 2360-2967

Большеберцовая M±m 3335±230 3394±287 3I65±140 3134±125

кость Min-max 2703-4134 2576-4282 2652-3534 2714-3468

Мапоберцовая M±m 3202±231 3189±244 2982±102 3105±113

кость Min-max 2549-3990 2412-3832 2323-3325 2335-3379

Изучение влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на постнаталыюе развитие потомства

Постнатальное развитие потомства в опытной и контрольной группах характеризуется высокой выживаемостью в поколениях Fl и F2 (табл. 13): в период с О по 5-й дни жизни выживаемость потомства Fl контрольной группы составляла 98%, в период с 6-го по 25-й дни жизни - 96%, опытной группы - 99% и 95%, соответственно. В поколении F2 выживаемость потомства в обеих группах в период с 0 по 5-й дни жизни была не ниже 98-99%, с 6-го по 25-й - не ниже 98%, значимых различий между группами не выявлено. Согласно данным [Marty M.S., 2009], линия Вистар в целом характеризуется относительной вариабельностью ряда показателей репродуктивной функции, в том числе - выживаемость потомства в первый месяц жизни может составлять не более 68% (табл.14), поэтому 95-99 %-ная выживаемость потомства соответствовала оптимальному уровню для крыс данной линии.

Средняя величина пометов у крыс контрольной и опытной групп находилась в пределах физиологических значений, достоверных различий между группами не выявлено (табл. 13, 14). Соотношение самцов и самок в группах несколько различалось в каждом поколении, однако отмеченные колебания не имели определенной тенденции и не выходили за пределы значений, характерных для данной линии крыс. Анализ физического развития потомства F1-F2 - сроков отлипания ушных раковин, появления волосяного покрова, прорезывания резцов и др. (табл. 15) не выявил каких-либо отклонений от нормы [Хабриев Р.У., 2005; Schneider S., 1985; Erna М., 1992; Nöda Т., 2001; Aoyama Н„ 2002; Ohi М„ 2004].

Постнаталыюе развитие потомства F1-F2

Поколение Fl Поколение F2

Регистрируемые показатели Контрольная группа Опытная группа Контрольная группа Опытная группа

Общее количество крысят 300 354 244 246

Из них мертворожденных 0 0 2 0

Средняя величина помета (М±ш) 11,54±0,60 11,80±0,27 9,68±0,77 10,70±0,50

Соотношение с?/2 в помете, % 52/48 49/51 51/49 49/51

Выживаемость с 1-го по 5-й дни жизни, % 98 99 98 99

количество живых (исходное) / количество умерших 300/7 354/4 242/4 246/1

Выживаемость с 6-го по 25-й дни жизни, % 96 95 98 98

количество живых (исходное) / количество умерших 293/12 350/19 238/4 245/5

Таблица 14

Постнаталыюе развитие потомства: данные литературы

Регистрируемые показатели М±т Литературный источник

Schneider S., 1985 Ohi М„ 2004 Ganiger S-, 2007 Nöda Т., 2001 Erna М., 1992 Marty M.S., 2009

Общее количество крысят 215 133 28 146 135 >300

Из них мертворожденных 4 5 1 - 1 -

Средняя величина помета 11,4±0,2 11,1±2,0 9,5±0,5 14,6±0,6 12,3±0,1 11,67±0,1

Выживаемость с 0 по 5-й дни жизни 97,0 96,0 99,3 - - 96,8

Выживаемость с 6 по 25-й дни жизни 99 - 98,6 - - 67,9

Соотношение ¿72 46/54 45/55 - 48/52 47/53 47/53

Общее состояние крысят Fl и F2 было удовлетворительным: по внешнему виду, поведению и скорости роста крысята опытной группы не отличались от животных контрольной группы (рис. 5-6). Прирост массы тела и роста крысят обеих групп в возрасте 2-25 дней соответствовал уровню прироста, характерному для животных данного вида и возраста [Pullen А.Н., 1976; Derelanko M.J. et al., 2001; Hood R.D., 2006].

Таким образом, результаты исследований постнатального развития потомства Fl и F2 свидетельствуют об отсутствии различий между животными, получавшими с рационом ГМ кукурузу и ее традиционный аналог. Значения изученных показателей не выходили за пределы физиологической нормы.

Рис. 5. Динамика массы тела и роста крысят поколения Б1

80 го 60 £ 50

5

5 40

130 20 10 0

Динамика массы тела в роста крысят поколения Г2 16

14 12 10

£

е в

£ е

4 2

О

10 15 Дни жизвя

- Традиционный аналог

—в- гм кукуруза

Рис. 6. Динамика массы тела и роста крысят поколения ¥2

Таблица 15

Физическое развитие крысят Р1-Р2

Регистрируемый показатель Поколение Р1 Поколение И2

Контрольная группа Опытная группа Контрольная группа Опытная группа

Отлипание ушных раковин, день 2,81±0,05 2,95±0,04 2,86±0,08 2,89±0,07

Появление волосяного покрова, день 5,31±0,10 5,74±0,11* 5,98±0,07 5,76±0,09

Прорезывание резцов, день 9,25±0,14 9,72±0,12* 9,46±0,04 9,59±0,15

Открытие глаз, день 15,44±0,11 15,62±0,14 15,18±0,07 15,26±0,22

Опускание семенников, день 23,98±0,22 23,90±0,18 23,72±0,22 23,97±0,23

Открытие влагалища, день 28,73±0,26 28,29±0,17 28,70±0,12 28,83±0,12

По литературным данным [Хабриев Р.У., 2005; Аоуата Н„ 2002], нормальными показателями физического развития крысят линии Вистар является: отлипание ушных раковин - со 2 дня, появление волосяного покрова - с 5 дня, прорезывание резцов - с 6 дня, открытие глаз - с 12 дня, опускание семенников - с 18 дня, открытие влагалища -с 28 дня.

* * *

Результаты проведенных исследований могут быть расценены как прямые доказательства отсутствия какого-либо отрицательного влияния ГМ кукурузы на репродуктивную функцию крыс и на развитие потомства. При изучении влияния ГМ кукурузы на генеративную функцию самцов и самок поколений Р0-Р1, пренатальное и постнатальное развитие потомства Р1-Р2, не было выявлено какого-либо влияния ГМ кукурузы по сравнению с ее традиционным аналогом. Все показатели находились в пределах физиологических норм, характерных для крыс линии Вистар соответствующего возраста. В совокупности полученные данные пополняют доказательную базу безопасности ГМО, и могут быть использованы в качестве научно-обоснованного стимула для дальнейшего развития современной биотехнологии в сфере производства продовольственного сырья.

Разработанный алгоритм оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения и перечень методов исследования репродуктивной функции крыс и их потомства могут быть рекомендованы для использования при гигиенической оценке других видов биотехнологической пищевой продукции.

ВЫВОДЫ

1. Разработан алгоритм оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения, включающий изучение генеративной функции, пренатального и постнаталыюго развития потомства трех поколений крыс.

2. Определен комплекс методов оценки репродуктивной токсичности ГМО, включающий изучение генеративной функции по фертилыюй способности, гормональному статусу и уровню гаметогенеза в половых железах самцов и самок; пренатального развития потомства по пред- и постимплантационной смертности, зоометрическим параметрам плодов, состоянию внутренних органов и костной системы плодов; постнатального развития потомства по динамике зоометрических показателей, параметрам физического развития, выживаемости с 0 по 5-й и с 6-го по 25-й дни жизни.

3. Получены экспериментальные доказательства отсутствия влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на генеративную функцию крыс поколений Р0-Р1. Эффективность спаривания при данных условиях эксперимента составляла: у самок обеих групп поколения РО - 79-80 %, поколения П - 77-87 %, у самцов ГО - 89-95 %, Р1 - 100 %. Эндокринная функция гонад самцов и самок Р0-Р1 соответствовала физиологической норме, характерной для крыс линии Вистар.

4. Получены экспериментальные доказательства отсутствия влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на пренатальное развитие потомства крыс поколений П-Р2. При сравнении показателей, характеризующих пренатальное развитие потомства, не было выявлено значимых различий между контрольной и опытной группами: количество живых и мертвых плодов, предимплантационная

гибель эмбрионов, зоометрические параметры плодов, развитие внутренних органов и костной системы плодов находились в пределах физиологических колебаний, характерных для крыс линии Вистар. Спонтанная постимплантационная гибель плодов F1-F2 обеих групп была несколько ниже диапазона значений, обычно регистрируемого у крыс данной линии: в поколении F1 этот показатель составлял О % - в контрольной группе и 0,9±0,9 % - в опытной группе, в поколении F2 - 0,8±0,8 % и 3,7±3,0 %, соответственно.

5. Получены экспериментальные доказательства отсутствия влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на постнатальное развитие потомства крыс поколений F1-F2. При сравнении показателей, характеризующих постнатальное развитие потомства, не было выявлено значимых различий между контрольной и опытной группами: физическое развитие потомства и динамика зоометрических параметров соответствовали физиологическим значениям, характерным для животных данного вида и возраста. Средняя величина пометов в поколении F1 составляла 11,54±060 - в контрольной группе и 11,80±0,27 - в опытной группе, в поколении F2 - 9,68±0,77 и \0,70±0,50, соответственно. Выживаемость потомства поколений F1-F2 контрольной и опытной групп составляла 95-99 %, что соответствует оптимальному уровню для крыс линии Вистар.

6. Завершены комплексные медико-биологические исследования ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония. На основании анализа результатов токсиколого-гигиенических исследований и результатов оценки репродуктивной токсичности на трех поколениях крыс подтверждена безопасность данной линии кукурузы и обоснованность разрешения ее использования на территории Российской Федерации, ввоза на территорию Российской Федерации и оборота (свидетельство о государственной регистрации № 77.99.26.11.У.803.2.07 от 06 февраля 2007 года).

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки Российской Федерации:

1. Утембаева Н.Т.. Пашорина В.А., Селяскин К.Е., Тышко Н.В. Разработка методических подходов к изучению влияния фактора сезонности на репродуктивную функцию крыс в экспериментальных исследованиях при алиментарных воздействиях // Вопросы питания. -2009.-Т. 78, №1,-С. 43-48.

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендуемых Высшим аттестационным комитетом МОИ Республики Казахстан

2. Утембаева Н.Т. Оценка репродуктивной токсичности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения в международной практике (Обзор литературы). // Гигиена, эпидемиология и иммунобиология. -2010. - Т. 43, №1.-С. 21-24.

3. Утембаева Н.Т. Генно-инженерно-модифицированные организмы (ГМО) растительного происхождения: оценка безопасности (Обзор литературы). // Здоровье и болезнь. -2010. -Т. 86, №1,- С. 5-8.

4. Утембзева Н.Т. Генно-инженерно-модифицированиые организмы растительного происхождения: мировое производство (Обзор литературы). // Здоровье и болезнь. — 2010. — Т. 87, №2. - С. 5-8.

Другие издания:

5. Утембаева Н.Т.. Тышко Н.В. Разработка методических подходов к оценке влияния генно-инженерно-модифицированных источников пищи на репродуктивную систему крыс и их потомство // Материалы 2-ой всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». - Рязань, 2007. - С. 197-198.

6. Тышко Н.В., Утембаева Н.Т. Изучение репродуктивной токсичности генно-инженерно-модифицированной кукурузы в эксперименте на крысах // Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - М., 2008. - С. 442.

7. Тышко Н.В., Утембаева Н.Т.. Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е., Сапрыкин В.П., Тутельян В.А. Оценка влияния генно-инженерно-модифицированой кукурузы на репродуктивную систему крыс и их потомство // Материалы X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье». - М., 2008. — С. 109.

8. Тышко Н.В., Утембаева Н.Т.. Пашорина В.А. Постнатальное развитие потомства трех поколений крыс, получавших генно-инженерно-модифицированную кукурузу // Материалы X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье». -М., 2008.-С. 109-110.

9. Утембаева Н.Т., Тышко Н.В. Генеративная функция крыс, получавших с рационом генно-инженерно-модифицироюнную кукурузу // Материалы X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье». - М., 2008. - С. 112-113.

10. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е., Утембаева Н.Т. Изучение влияния генно-инженерно-модифицированной кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на репродуктивную систему крыс и их потомство // Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - М., 2008.-С. 143-144.

11. Тышко Н.В., Утембаева Н.Т. Изучение репродуктивной токсичности генно-инженерно-модифицированной кукурузы в эксперименте на трех поколениях крыс // Здоровье и болезнь. - 2009 г., №2 (78). Материалы Международной научно-практической конференции «Питание и здоровье». - Алматы, 2009. - С. 200-202.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Результаты настоящей диссертации внедрены в работу Казахской академии питания, а также в

учебный процесс кафедры гигиены питания Казахского национального медицинского

университета им. С. Д. Асфендиярова.

Заказ № 149-А/12/2010 Подписано в печать 23.12.2010 Тираж 250 экз. Усл. п.л. 1,2

¿7г ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

у; www.cfr.ru ; е-таИ:'т/о@с/г.ги

Практическое применение новых способов трансформации генома растений повлекло за собой потребность в строгой регламентации процесса оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения, предназначенных для использования в пищу. Разработка системы оценки безопасности ГМО, действующей в настоящее время в Российской Федерации, была начата в 1995-1996 г.г. Данная система не только аккумулирует весь отечественный и зарубежный опыт, но и включает новейшие научные подходы, основанные на достижениях современной фундаментальной науки: геномный и протеомный анализ, выявление повреждений ДНК и мутагенной активности, выявление продуктов свободнорадикальной модификации ДНК и других чувствительных биомаркеров [10, 42, 57, 58, 92, 98, 124, 125, 141].

Оценка безопасности ГМО проводится на этапе государственной регистрации. Государственной регистрации подлежат новые пищевые продукты, полученные из ГМО растительного происхождения, изготовленные в Российской Федерации, а также пищевые продукты, полученные из ГМО растительного происхождения, ввоз которых на территорию Российской Федерации осуществляется впервые [11, 25]. В системе медико-биологических исследований безопасности ГМО, наряду с общетоксикологическими исследованиями, важное место принадлежит изучению специфических видов токсичности в экспериментах in vivo. В соответствии со сложившейся исследовательской практикой используется комплексный подход, предоставляющий наиболее полную и достоверную информацию о потенциальном генотоксическом, иммунотоксическом и аллергенном действии ГМО, а также позволяющий выявить возможные незаданные эффекты генетической модификации [10, 15, 26, 27, 33]. При необходимости, в случае выявления существенных изменений генома, протеома и метаболома ГМО, могут быть проведены дополнительные исследования: влияние на репродуктивную функцию, гонадотоксическое, эмбриотоксическое, тератогенное действие; влияние на продолжительность жизни, и др. [25].

Анализ данных научной литературы показывает, что изучение репродуктивной токсичности является одним из интегральных критериев при гигиенической оценке факторов окружающей среды, так как сложность феномена репродукции делает его уязвимым для неблагоприятных воздействий на любом этапе реализации функции. Серьезным ограничением использования методов оценки репродуктивной токсичности является их продолжительность и 4 трудоемкость, поэтому в процедурах оценки безопасности пищевых веществ (пищевых добавок, новых источников пищи) [124, 125, 141] изучение репродуктивной токсичности относится к факультативным исследованиям, проводимым в случае доказанной необходимости. Однако, несмотря на 15-летний опыт использования ГМ источников пищи в питании людей и животных [93], сохраняется необходимость пополнения доказательной базы безопасности ГМО для здоровья человека, что обусловливает важность проведения исследований репродуктивной функции и развития потомства в поколениях [83, 88, 120].

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы являлась, во-первых, разработка алгоритма оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения и выбор методов исследования генеративной функции экспериментальных животных, пренатального и постнатального развития потомства; во-вторых - изучение влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на генеративную функцию, пренатальное и постнатальное развитие потомства трех поколений крыс. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• на основании анализа литературных данных и результатов предварительных исследований определить порядок оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения и набор методов исследования генеративной функции, пренатального и постнатального развития потомства экспериментальных животных;

• изучить влияние ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на генеративную функцию крыс поколений БО-П по фертильной способности, гормональному статусу и уровню гаметогенеза в половых железах самцов и самок в трех поколениях;

• изучить влияние ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на пренатальное развитие потомства поколений ¥1-¥2 по пред- и постимплантационной смертности, зоометрическим параметрам плодов, состоянию внутренних органов и костной системы плодов;

• изучить влияние ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на постнатальное развитие потомства поколений П-Р2 по динамике зоометрических показателей, параметрам физического развития, выживаемости с 0 по 5-й и с б-го по 25-й дни жизни.

Научная новизна работы

Впервые разработан алгоритм оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения и определен комплекс методов исследования репродуктивной функции крыс и их потомства.

Впервые изучено влияние ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на генеративную функцию, пренатальное и постнатальное развитие потомства трех поколений крыс. Результаты проведенных исследований могут быть расценены как прямые доказательства отсутствия какого-либо отрицательного влияния ГМ кукурузы на репродуктивную функцию экспериментальных животных и на развитие потомства.

Практическая значимость работы

Разработанный алгоритм оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения может быть рекомендован для использования при гигиенической оценке биотехнологической пищевой продукции.

Результаты работы дополнили доказательную базу безопасности ГМО для здоровья последующих поколений, и могут быть использованы в качестве научного обоснования отсутствия негативного влияния ГМ кукурузы на репродуктивную функцию экспериментальных животных и на развитие потомства.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ГМО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ: ПРОИЗВОДСТВО И

ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ

5. ВЫВОДЫ

1. Разработан алгоритм оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения, включающий изучение генеративной функции, пренатального и постнатального развития потомства трех поколений крыс.

2. Определен комплекс методов оценки репродуктивной токсичности ГМО, включающий изучение генеративной функции по фертильной способности, гормональному статусу и уровню гаметогенеза в половых железах самцов и самок; пренатального развития потомства по пред- и постимплантационной смертности, зоометрическим параметрам плодов, состоянию внутренних органов и костной системы плодов; постнатального развития потомства по динамике зоометрических показателей, параметрам физического развития, выживаемости с О по 5-й и с 6-го по 25-й дни жизни.

3. Получены экспериментальные доказательства отсутствия влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на генеративную функцию крыс поколений Р0-Р1. Эффективность спаривания при данных условиях эксперимента составляла: у самок обеих групп поколения РО - 79-80 %, поколения - 77-87 %, у самцов БО - 89-95 %, Р1 - 100 %. Эндокринная функция гонад самцов и самок Б0-Р1 соответствовала физиологической норме, характерной для крыс линии Вистар.

4. Получены экспериментальные доказательства отсутствия влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония,' на пренатальное развитие потомства крыс поколений Р1-Р2. При сравнении показателей, характеризующих пренатальное развитие потомства, не было выявлено значимых различий между контрольной и опытной группами: количество живых и мертвых плодов, предимплантационная

85 гибель эмбрионов, зоометрические параметры плодов, развитие внутренних органов и костной системы плодов находились в пределах физиологических колебаний, характерных для крыс линии Вистар. Спонтанная постимплантационная гибель плодов Б1 -¥2 обеих групп была несколько ниже диапазона значений, обычно регистрируемого у крыс данной линии: в поколении этот показатель составлял 0 % - в контрольной группе и 0,9±0,9 % - в опытной группе, в поколении Б2 - 0,8±0,8 % и 3,7±3,0 %, соответственно.

5. Получены экспериментальные доказательства отсутствия влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на постнатальное развитие потомства крыс поколений Р1-Р2. При сравнении показателей, характеризующих постнатальное развитие потомства, не было выявлено значимых различий между контрольной и опытной группами: физическое развитие потомства и динамика зоометрических параметров соответствовали физиологическим значениям, характерным для животных данного вида и возраста. Средняя величина пометов в поколении Р1 составляла 11,54±060 - в контрольной группе и 11,80±0,27 - в опытной группе, в поколении ¥2 - 9,68±0,77 и 10,70±0,50, соответственно. Выживаемость потомства поколений П-Р2 контрольной и опытной групп составляла 95-99 %, что соответствует оптимальному уровню для крыс линии Вистар.

6. Завершены комплексные медико-биологические исследования ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония. На основании анализа результатов токсиколого-гигиенических исследований и результатов оценки репродуктивной токсичности на трех поколениях крыс подтверждена безопасность данной линии кукурузы и обоснованность разрешения ее использования на территории Российской Федерации, ввоза на территорию Российской Федерации и оборота (свидетельство о государственной регистрации № 77.99.26.11.У.803.2.07 от 06 февраля 2007 года).

6. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Результаты настоящей диссертации внедрены в работу Казахской академии питания, а таюке в учебный процесс кафедры гигиены питания Казахского национального медицинского университета им. С.Д. Асфендиярова.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Практическое применение новых способов трансформации генома растений повлекло за собой потребность в строгой регламентации процесса оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения, предназначенных для использования в пищу. Разработка системы оценки безопасности ГМО, действующей в настоящее время в Российской Федерации, была начата в 1995-1996 г.г. Данная система не только аккумулирует весь отечественный и зарубежный опыт, но и включает новейшие научные подходы, основанные на достижениях современной фундаментальной науки [10, 42, 57, 58, 92, 98, 124, 125, 141].

Оценка безопасности ГМО проводится на этапе государственной регистрации. Государственной регистрации подлежат новые пищевые продукты, полученные из ГМО растительного происхождения, изготовленные в Российской Федерации, а также пищевые продукты, полученные из ГМО растительного происхождения, ввоз которых на территорию Российской Федерации осуществляется впервые [И, 25]. В системе медико-биологических исследований безопасности ГМО, наряду с общетоксикологическими исследованиями, важное место принадлежит изучению специфических видов токсичности в экспериментах in vivo. В соответствии со сложившейся исследовательской практикой используется комплексный подход, предоставляющий наиболее полную и достоверную информацию о потенциальном генотоксическом, иммунотоксическом и аллергенном действии ГМО, а также позволяющий выявить возможные незаданные эффекты генетической модификации [10, 15, 26, 27, 33]. При необходимости, в случае выявления существенных изменений генома, протеома и метаболома ГМО, могут быть проведены дополнительные исследования: влияние на репродуктивную функцию, гонадотоксическое, эмбриотоксическое, тератогенное действие; влияние на продолжительность жизни, и др. [25].

Анализ данных научной литературы показывает, что изучение репродуктивной токсичности является одним из интегральных критериев при гигиенической оценке факторов окружающей среды, так как сложность феномена репродукции делает его уязвимым для неблагоприятных воздействий на любом этапе реализации функции. Серьезным ограничением использования методов оценки репродуктивной токсичности является их продолжительность и

77 трудоемкость, поэтому в процедурах оценки безопасности пищевых веществ (пищевых добавок, новых источников пищи) [57, 58, 141] изучение репродуктивной токсичности относится к факультативным исследованиям, проводимым в случае доказанной необходимости. Однако, несмотря на 15-летний опыт использования ГМ источников пищи в питании людей и животных [93], сохраняется необходимость пополнения доказательной базы безопасности ГМО для здоровья человека, что обусловливает важность проведения исследований репродуктивной функции и развития потомства в поколениях [83, 88, 120].

Целью настоящей работы являлась, во-первых, разработка алгоритма оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения и выбор методов исследования генеративной функции экспериментальных животных, пренатального и постнатального развития потомства; во-вторых - изучение влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на генеративную функцию, пренатальное и постнатальное развитие потомства трех поколений крыс.

Для исследований использованы образцы ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, и ее традиционного аналога, выращенные в идентичных условиях и прошедшие аналогичную технологическую обработку. Исследования выполнены на трех поколениях крыс линии Вистар: родительском (БО), первом (Н) и втором (Б2). Всего в работе было использовано 270 взрослых животных и 1142 крысенка. Состояние репродуктивной системы крыс были оценивали по генеративной функции гонад, пренатальному и постнатальному развитию потомства. Генеративную функцию гонад оценивали у половозрелых крыс (возраст 100-120 дней) по фертильности, синтезу половых гормонов - прогестерона, эстрадиола -яичниками и тестостерона - семенниками, уровню гаметогенеза в яичниках и семенниках - по концентрации ДНК.

Для отработки модели изучения репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения были проведены предварительные исследования репродуктивной функции крыс в осенне-зимний, весенний и летний периоды. На основании анализа данных литературы [33, 75, 116] и результатов предварительных исследований определен порядок оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения (схема 1). Первым этапом эксперимента является подготовительная стадия, предназначенная для выведения животных (поколение БО), получавших экспериментальные рационы на протяжении всего срока

78 онтогенетического развития организма, включая периоды плацентарного питания и питания молоком матери, максимально стандартизованных для целей данного исследования; непосредственное изучение репродуктивной функции крыс проводится на животных поколений БО, Б1, ¥2.

Таким образом, на основании предварительных исследований и анализа литературных данных был разработан алгоритм оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения и определен комплекс методов исследования репродуктивной функции крыс и их потомства.

В соответствии с предложенным алгоритмом проведены исследования влияния ГМ кукурузы, устойчивой к глюфосинату аммония, на генеративную функцию, пренатальное и постнатальное развитие потомства трех поколений крыс линии Вистар.

Интегральным показателем генеративной функции гонад является эффективность спаривания, подтверждающая фертильность экспериментальных животных. Согласно полученным данным, эффективность спаривания у самок обеих групп поколения БО составляла 79-80%, поколения Р1 - 77-87%, эффективность спаривания у самцов - 89-95% и 100%, соответственно. Эффективность спаривания соответствовала ожидаемой при данных условиях, эксперимента: при продолжительности ссаживания 5 сут., соответствующей средней длительности эстрального цикла крысы [33], количество не забеременевших самок во всех группах поколений Р0-Р1 варьировало в пределах 13-23%. Поскольку, согласно [106], у 1128% крыс эстральный цикл длится 5,5-10,0 сут., часть ссаженных самок не достигла фазы эструса в отведенном временном периоде.

Количество условно стерильных (неоплодотворивших) самцов поколений Р0-Р1 находилось в диапазоне физиологической нормы [107] и составляло 0-11%. Некоторые колебания эффективности спаривания животных в разных группах не имели определенной тенденции и, следовательно, являлись случайными, не связанными с влиянием каких-либо внешних факторов.

Осуществление эстрального цикла у крыс включает в себя координированное изменение активности гипоталамических структур, функции гипофиза, функции яичников, в которых под влиянием гонадотропинов происходит созревание фолликулов, овуляция и развитие желтого тела с соответствующим каждой фазе изменением гормональной активности [28]. Динамика гормональных изменений в течение репродуктивного эстрального цикла связана с различной длительностью его фаз (проэструс, эструс, диэструс) и регулярностью повторения цикла. Поскольку половой цикл крыс в среднем длится 5,5 суток (от 1,5 до 10 суток) [106], и оценка эндокринной функции гонад небеременных самок осложнена невозможностью синхронизации фаз цикла, в эксперименте изучена эндокринная функция гонад беременных самок (на 20-й день беременности). Нарушение баланса половых гормонов в организме приводит к патологии развития гамет и бесплодию, поэтому одним из доказательств нормальной эндокринной регуляции физиологических процессов, протекающих в организмах подопытных животных, является овуляция, оплодотворение и физиологическое протекание беременности.

Содержание эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови беременных самок в норме составляет 71-158 пкг/мл и 25-68 нг/мл [46, 112, 129]. Содержание эстрадиола в крови самок Р0-Р1 контрольной группы в среднем составляло 83-100 пкг/мл, опытной группы - 76-104 пкг/мл, содержание прогестерона - 47-54 нг/мл и 40-56 нг/мл, соответственно, и находилось в пределах нормы. Незначительные статистически недостоверные различия концентрации эстрадиола и прогестерона между группами не выходили за границы физиологических колебаний, что свидетельствует о нормальной эндокринной функции половых желез.

У крыс, как и большинства видов животных, концентрация эстрогенов и прогестерона в крови и моче во время беременности повышается, что связано с усилением их секреции яичниками и фетоплацентарной системой [28, 97]. Физиологическая адаптация материнского организма к беременности возможна лишь у здоровых особей, так как комплексные изменения гомеостаза, в том числе -эндокринной функции гонад, могут трансформировать компенсированный патологический процесс в декомпенсированный. В сущности, беременность является физиологической провокацией, нагрузкой, позволяющей выявить скрытый в стационарном состоянии гормональный дисбаланс, поэтому изучение эндокринной функции гонад у беременных самок представляло наибольшую диагностическую ценность для целей данного исследования.

Эндокринная функция яичников обеспечивает регулярное образование ооцитов, поэтому оогенная и эндокринная функции яичников тесно взаимосвязаны [28]. Яичник, не содержащий ооцитов, не может нормально функционировать в

80 качестве эндокринной железы. У половозрелого животного строение и функция яичника постоянно меняются: гонадотропные гормоны передней доли гипофиза стимулируют рост граафовых пузырьков (фолликулогенез), овуляцию и образование желтых тел. Так, в работе [139] выявлено 2-кратное повышение содержания ДНК на 13-14-й дни беременности; в работе [113] продемонстрировано увеличение массы желтых тел и увеличение содержания ДНК в желтых телах крыс во время беременности: масса желтых тел увеличивалась в 3,4 раза, содержание ДНК - в 3,5 раза.

По данным [139] содержание ДНК в яичниках беременных самок составляет 2,5-3,5 мг/г ткани; содержание ДНК в яичниках самок Р0-Р1 контрольной и опытной групп находилось в пределах сопоставимых значений. Масса яичников самок обеих групп также не имела статистически значимых различий как в поколении РО, так и в поколении Принимая во внимание, что уровень ДНК является косвенным критерием уровня оогенеза [139], результаты исследований свидетельствуют о нормальной оогенной функции яичников крыс Р0-Р1 контрольной и опытной групп.

Гормональная функция половых желез самцов начинается во внутриутробном периоде развития, образующиеся андрогены обеспечивают половую дифференцировку гипоталамуса, а также формирование половых органов по мужскому типу [28]. Максимальная продукция андрогенов у самцов крыс наблюдается в возрасте 3-18 мес., при этом эндокринная активность гонад распределяется неравномерно. Например, на протяжении суток наблюдается от 5 до 12 пиков уровня тестостерона в плазме, с увеличением до 10 раз [39, 97, 149]. При динамическом изучении уровня половых гормонов на протяжении длительного периода времени у самцов млекопитающих также отмечаются значительные колебания уровня гормонов. Таким образом, содержание тестостерона в сыворотке крови половозрелых самцов в норме варьирует в диапазоне 2,6-8,7 нг/мл [99, 136, 140]. Содержание тестостерона в крови самцов Р0-Р1 соответствовало физиологической норме, статистически значимых различий между группами не выявлено.

Рассматривая гормональную регуляцию функции семенников, следует помнить о том, что эндокринная функция семенников и процессы сперматогенеза тесно взаимосвязаны [28]. У крысы в канальце длиной 1 см в течение 12-дневного цикла

81 может образоваться 125000 сперматид; при общей протяженности канальцев 500 см в обоих семенниках образуется 10х 10б сперматозоидов в сутки [32].

Содержание ДНК в семенниках половозрелых самцов в норме составляет 1,8-5,0 мг/г ткани [111]. Содержание ДНК в семенниках самцов F0-F1 контрольной группы в среднем составляло 1,9-2,6 мг/г ткани, опытной группы - 2,0-2,7 мг/г ткани, и находилось в пределах нормы. Масса семенников самцов обеих групп (возраст 100 дней) также не имела статистически значимых различий как в поколении F0, так и в поколении F1. Принимая во внимание, что уровень ДНК является косвенным критерием уровня сперматогенеза [111], результаты исследований свидетельствуют о нормальной сперматогенной функции семенников крыс F0-F1 контрольной и опытной групп.

Таким образом, результаты исследований генеративной функции свидетельствуют об отсутствии различий между животными поколений F0-F1, получавшими с рационом ГМ кукурузу и ее традиционный аналог. По эффективности спаривания, подтверждающей фертильность экспериментальных животных, а также интегральным показателям, характеризующим общее состояние крыс, - скорости роста, динамике массы тела, поедаемости корма, не выявлено различий между крысами контрольной и опытной групп поколений F0-F1. Содержание эстрадиола и прогестерона в крови беременных самок, тестостерона - в крови самцов обеих групп находилось в пределах нормы, что свидетельствует о нормальной эндокринной функции половых желез экспериментальных животных. Сперматогенная и оогенная функции гонад крыс F0-F1 контрольной и опытной групп также соответствовали физиологической норме.

При сравнении пренатального развития потомства самок опытной и контрольной групп поколений F0-F1, не было выявлено значимых различий между группами: количество желтых тел и мест имплантации, количество живых и мертвых плодов, предимплантационная гибель эмбрионов находились в пределах физиологических колебаний, характерных для крыс линии Вистар. Спонтанная постимплантационная гибель зародышей у крыс F0-F1 контрольной и опытной групп была несколько ниже диапазона значений, обычно регистрируемого у крыс данной линии (по данным разных исследователей 3,6-9,2 %). У самок контрольной группы в поколении F0 данный показатель составлял 0%, в поколении F1 -0,8±0,8%, у самок опытной группы - 0,9±0,9% и 3,7±3,0%, соответственно.

82

Зоометрические показатели плодов Fl и F2 варьировали в пределах физиологической нормы. Масса тела и краниокаудальный размер плодов опытной группы не имели значимых отличий от аналогичных показателей плодов контрольной группы. При сравнении массы внутренних органов плодов Fl и F2 также не выявлено статистически достоверных различий между контрольной и опытной группами, абсолютная и относительная массы печени, почек, сердца, легких соответствовали норме [94, 122, 132].

При обследовании плодов Fl и F2 по методу Wilson J.G. [33, 148] аномалий развития внутренних органов выявлено не было. Формирование основных анатомических систем: нервной (головной, спинной мозг), сенсорной (глазные яблоки, обонятельные луковицы), сердечно-сосудистой (сердце), дыхательной (трахея, легкие, бронхи), пищеварительной (слюнные железы, язык, пищевод, желудок, кишечник, печень), мочевыделительной (почки, мочевой пузырь), половой (внутренние половые органы), локомоторной (лицевой череп, позвоночник, диафрагма), у плодов Fl и F2 контрольной и опытной групп протекало без особенностей.

Развитие скелета плодов оценивали по методу Dawson A.B. [33, 64]. Поскольку данный метод позволяет выявить врожденные аномалии скелета, незаметные при внешнем осмотре, а также оценить соответствие оссификации скелета стадии внутриутробного развития [1, 16], обследование каждого плода включало два последовательных этапа: обзорные исследования скелета, и остеометрические исследования нижней челюсти, плечевых, локтевых, лучевых, бедренных, большеберцовых и малоберцовых костей.

В каждом поколении обследовано по 5 плодов контрольной и опытной групп, аномалий развития скелета не выявлено. Длина участков оссификации в закладках костей конечностей и черепа плодов Fl и F2 не имела значительных различий между группами и соответствовала нормальным значениям [1, 16, 123].

Таким образом, результаты исследований пренатального развития потомства F1-F2 свидетельствуют об отсутствии различий между животными, получавшими с рационом ГМ кукурузу и ее традиционный аналог. Значения изученных показателей не выходили за пределы физиологической нормы.

Постнатальное развитие потомства в опытной и контрольной группах характеризовалось высокой выживаемостью в поколениях Fin F2: в период с 0 по

83

5-й дни жизни выживаемость потомства Б1 контрольной группы составляла 98%, в период с 6-го по 25-й дни жизни - 96%, опытной группы - 99% и 95%, соответственно. В поколении ¥2 выживаемость потомства в обеих группах в период с 0 по 5-й дни жизни была не ниже 98-99%, с 6-го по 25-й - не ниже 98%, значимых различий между группами не выявлено. Согласно данным [107], линия Вистар в целом характеризуется относительной вариабельностью ряда показателей репродуктивной функции, в том числе - выживаемость потомства в первый месяц жизни может составлять не более 68%, поэтому 95-99 %-ная выживаемость потомства соответствовала оптимальному уровню для крыс данной линии. Средняя величина пометов у крыс контрольной и опытной групп находилась в пределах физиологических значений, достоверных различий между группами не выявлено. Соотношение самцов и самок в группах несколько различалось в каждом поколении, однако отмеченные колебания не имели определенной тенденции и не выходили за пределы значений, характерных для данной линии крыс. Анализ физического развития потомства Р1-Р2 - сроков отлипания ушных раковин, появления волосяного покрова, прорезывания резцов и др. не выявил каких-либо отклонений от нормы [33, 48, 73, 114, 117, 132].

Общее состояние крысят и ¥2 было удовлетворительным: по внешнему виду, поведению и скорости роста крысята опытной группы не отличались от животных контрольной группы. Прирост массы тела и роста крысят обеих групп в возрасте 2-25 дней соответствовал уровню прироста, характерному для животных данного вида и возраста [66, 87, 122].

Результаты оценки постнатального развития потомства Р1 и ¥2 свидетельствуют об отсутствии различий между животными, получавшими с рационом ГМ кукурузу и ее традиционный аналог. Значения изученных показателей не выходили за пределы физиологической нормы.

Таким образом, результаты проведенных исследований могут быть расценены как прямые доказательства отсутствия какого-либо отрицательного влияния ГМ кукурузы на репродуктивную функцию крыс и на развитие потомства. При изучении влияния ГМ кукурузы на генеративную функцию самцов и самок поколений Р0-Р1, пренатальное и постнатальное развитие потомства Р1-Р2, не было выявлено какого-либо влияния ГМ кукурузы по сравнению с ее традиционным аналогом. Все показатели находились в пределах физиологических норм, характерных для крыс

84 линии Вистар соответствующего возраста. В совокупности полученные данные пополняют доказательную базу безопасности ГМО, и могут быть использованы в качестве научно-обоснованного стимула для дальнейшего развития современной биотехнологии в сфере производства продовольственного сырья.

Разработанный алгоритм оценки репродуктивной токсичности ГМО растительного происхождения и перечень методов исследования репродуктивной функции крыс и их потомства могут быть рекомендованы для использования при гигиенической оценке других видов биотехнологической пищевой продукции.