Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Оценка роли системы детоксикации при бесплодии неясного происхождения

На правах рукописи

Кудрявцева Елена Владимировна

ОЦЕНКА РОЛИ СИСТЕМЫ ДЕТОКСИКАЦИИ ПРИ БЕСПЛОДИИ НЕЯСНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

14.01.01 - акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 2014

005549694

Казань-2014

005549694

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Ковалев Владислав Викторович - доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Баранов Игорь Иванович - доктор медицинских наук, профессор, руководитель организационно-методического отдела ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, г. Москва

Кузьмин Владимир Николаевич - доктор медицинских наук, профессор кафедры репродуктивной медицины и хирургии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России

Ведущая организация:

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «18» июня 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.033.01 на базе государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 36.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Минздрава России, сайт www.kgma.info

Автореферат разослан « »_2014г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доцент кандидат медицинских наук

Тухватуллина Лилия Мухаметзяновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

По данным ВОЗ частота бесплодных браков колеблется в широких пределах и в последние годы не имеет тенденции к снижению во всех государствах мира. Наша страна не является исключением из этого печального правила. Частота бесплодных браков в разных регионах России составляет от 8 до 20%, оказываясь более высокой в крупных городах (Кулаков В.И., 2005).

В значительной части случаев, несмотря на применение регламентированных нормативными документами Минздрава России методов исследования, так и не удается выявить причины данной патологии. Углубленный анализ факторов, вызывающих бесплодный брак, показывает, что частота «бесплодия неясного генеза» в структуре всего бесплодия занимает немалую долю, составляя около 15%. Данная группа пациентов представляет собой весьма сложный контингент больных, что связано с отсутствием у них явных причин нарушения репродуктивной функции.

Одним из наиболее перспективных направлений научного поиска в последние годы стало изучение фундаментальных молекулярно-генетических механизмов формирования патологии вообще, и репродуктивной системы в частности. По мнению Баранова B.C. (2009), стратегическую основу нового, быстро развивающегося направления в медицине, получившего название предиктивная медицина, составляет исследование межгенных и ген-средовых взаимодействий.

Ассоциация генов, регулирующих процессы детоксикации, с патологией репродуктивной системы (эндометриоз, онкопатология репродуктивной системы, акушерские осложнения) установлена в ряде исследований (Адамян J1.B., 2007; Иващенко Т.Э. и соавт., 2006; Корчагина Р.П. и соавт. 2011; Sata F. et al. 2003; Coller G.K. 2011). Существуют данные нескольких научных работ, свидетельствующих о возможной роли некоторых генов

детоксикации в патогенезе бесплодия, выявлена положительная корреляция между мутациями в этих генах и вторичным трубно-перитонеальным бесплодием, бесплодием, ассоциированным с эндометриозом, мужским бесплодием (Исхакова Г.М. и соавт. 2006; Рутинский А.И. 2013; Ьакроиг N. 2013). Однако роль этих генов при бесплодии неясного генеза не изучалась.

Существенный интерес представляет изучение не только различных групп генов по отдельности, но и межгенные взаимодействия, выявление наиболее неблагоприятных сочетаний генов. Весомым подтверждением роли генетических полиморфизмов и генных сетей в генезе идиопатического бесплодия должна стать оценка биохимического фенотипа пациенток с данной патологией, т.е. изучение уровня эндотоксикоза, так как ферменты, регулируемые генами детоксикации, отвечают за нейтрализацию экзо- и эндотоксических веществ. В связи с этим в нашей научной работе мы поставили перед собой следующие цель и задачи.

Цель исследования - оптимизация алгоритма обследования пациентов с бесплодием неясного генеза на основе изучения полиморфизмов генов системы детоксикации и их фенотипических проявлений для повышения обоснованности принятия тактических решений при идиопатическом бесплодии.

Задачи исследования:

1. Провести клинико-статистический анализ акушерско-гинекологического анамнеза и соматического статуса пациенток исследуемых групп.

2. Выяснить частоту встречаемости полиморфизмов генов детоксикации и дисфункции эндотелия, патогенетическую феноменологию в исследуемых группах.

3. Изучить особенности биохимического профиля, уровня эндогенной интоксикации у пациенток исследуемых групп.

4. Модифицировать алгоритм обследования пациентов с бесплодием неясного генеза на основе полученных данных.

Научная новизна

В данной работе впервые подробно изучена роль полиморфных вариантов генов детоксикации и генов дисфункции эндотелия при бесплодии неясного генеза. Впервые выявлено, что наличие аллелей в в 415 положении гена ЕРНХ1 и аллеля А в 460 положении гена ТРМТ являются прогностически неблагоприятными в отношении развития данного вида бесплодия. Причем, их негативное действие реализуется в основном при гомозиготном генотипе, а в гетерозиготном варианте эти полиморфизмы фенотипически не проявляются.

Впервые показано, что полиморфный аллель 238С гена ТРМТ чаще встречается у женщин с ненарушенной фертильностью, что свидетельствует об его протективном эффекте в отношении развития бесплодия.

Установлены взаимосвязи некоторых полиморфизмов генов и их сочетаний с биохимическим фенотипом пациенток с идиопатическим бесплодием. Полученные данные могут стать базой для разработки и научного обоснования новых патогенетических моделей формирования данной патологии, методов ее коррекции, внесения изменений в нормативные документы, регламентирующие ее диагностику.

Практическая значимость

В практической работе врача акушера-гинеколога необходимо учитывать возможную роль нарушений в системе детоксикации при идиопатическом бесплодии. Разработан модифицированный алгоритм обследования женщин с бесплодием неясного генеза, включающий исследование факторов регулирующих работу данной системы, и анализ биохимического фенотипа при наличии полиморфизмов в генах детоксикации.

Показана целесообразность обязательного проведения

цитогенетического анализа в супружеских парах, страдающих идиопатическим бесплодием.

Внедрение результатов исследования

Результаты научного исследования внедрены в клиническую практику ФГБУ «Уральский НИИ охраны материнства и младенчества» Минздрава России, МГБУ «Клинико-диагностический центр охраны здоровья матери и ребенка» Минздрава Свердловской области, МУЗ ГКБ № 14 Управления здравоохранения администрации города Екатеринбурга. Материалы диссертации используются в преподавании на кафедре акушерства и гинекологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Апробация работы

Положения диссертации были представлены на следующих конференциях, конгрессах и форумах: Республиканская научно-практическая конференция «Инновационные технологии в охране здоровья матери и ребенка» (Екатеринбург, 2012г.); научно-практическая конференция молодых ученых «Репродуктивная медицина. Взгляд молодых» (Санкт-Петербург, 2013г.); XIV Всероссийский научный форум «Мать и дитя» (два доклада) (Москва. 2013г.); а также на совместном заседании кафедр акушерства и гинекологии №1 ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, акушерства и гинекологии №1 и №2 ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Казань, 2014).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, для публикации результатов диссертационных работ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 2 рисунка. Диссертация состоит из введения, 4 глав:

обзор литературы, материалы и методы, две главы с изложением результатов собственных исследований; обсуждение полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 168 источников, из которых 79 зарубежных и 89 отечественных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ряд полиморфных вариантов генов и их сочетаний, регулирующих процессы детоксикации, достоверно чаще встречаются у пациенток, страдающих бесплодием неясного происхождения, что подтверждает их роль в генезе данной патологии.

2. Фенотипические проявления особенностей молекулярно-генетического статуса, пациенток с идиопатическим бесплодием, сводятся к повышению уровня общей интоксикации, изменению ряда биохимических параметров крови.

3. Правило прогноза роли полиморфных вариантов генов детоксикации с чувствительностью 74,3% и специфичностью 70,7% позволяет предсказать их значение в этиопатогенезе бесплодия неясного происхождения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для достижения поставленной цели исследования и решения указанных выше задач, которые сводились к изучению роли полиморфизмов генов, регулирующих систему детоксикации, в генезе бесплодия неясного происхождения, нами были отобраны 100 супружеских пар с данной патологией. В качестве контрольной группы было отобрано 50 пациенток, не имевших бесплодия в анамнезе, и у которых был, по крайней мере, один живой ребенок. Проведено сравнительное контролируемое когортное исследование.

Всем пациенткам выполнено клинико-лабораторное обследование, в соответствие с приказом Министерства здравоохранения России № 572н от 01 ноября 2012 г., по результатам которого были исключены ведущие факторы, приводящие к бесплодию в браке: инфекции, передаваемые половым путем, гормональные нарушения, трубно-перитонеальный фактор (проходимость маточных труб), маточная патология и мужской фактор бесплодия (спермограмма). При отсутствии очевидных факторов, способных вызвать отсутствие спонтанной беременности в течение минимум одного года, выставлялся диагноз «бесплодие неясного генеза», код МКБ-Х -N97.8.

Критериями включения в основную группу являлись: согласие пациентки на участие в исследовании; бесплодие неясного генеза; возраст 18-38 лет. Общими критериями исключения из групп стали: трубно-перитонеальное бесплодие (отсутствие или непроходимость маточных труб); эндокринные нарушения, сопровождающиеся отсутствием овуляции; мужской фактор бесплодия; пороки развития половых органов и внутриматочная патология; возраст младше 18 и старше 38 лет; наличие инфекций, передаваемых половым путем; эндометриоз; экстрагенитальная патология, являющаяся противопоказанием для вынашивания беременности.

При дальнейшем анализе основная группа, в свою очередь, была разделена на 2 подгруппы: женщины с первичным бесплодием (60 пациенток) - подгруппа 1а и с вторичным бесплодием (40 пациенток) -подгруппа - 16.

Статистически значимых различий между основной и контрольной группой по возрасту, социальному положению, соматической патологии, наличием вредных привычек и профессиональных вредностей не выявлено.

Перечень исследуемых генов и их полиморфных вариантов, используемых в работе представлены в таблице 1.

Таблица 1

Исследуемые гены и полиморфизмы

Ген Локализация на хромосоме Белковый продукт Полиморфизм SNTJD

ЕРНХ1 Ц42.1 Эпоксидгндролаза микросом Т337С (Y113H) rsl051740

ЕРНХ1 lq42.1 Эпоксндгадролаза микросом A415G (H139R) rs2234922

GSTP1 1 lql3 S- трансферазаглугатиона типа PI A313G (I105V) rsl695

GSTP1 1 lql3 S- трансферазаглутатиона типа PI С341Т (Al 14V) rs 1138272

ТРМТ бр22.3 тиопурин S-метилтрансфераза G238C (А80Р) rs 1800462

ТРМТ 6р22.3 тиопурин S-метилтрансфераза G460A (А154Т) rsl800460

ТРМТ 6р22.3 тиопурин S-метилтрансфераза A719G (Y240C) rsl 142345

NOS3 7q36 эвдотелиальиая NO-синтаза Т786С (-786) rs 163729

NOS3 7q36 эндотелиачьная NO-сиитаза G894T (G298A) rsl 799983

Оценка особенностей хромосомного аппарата супружеских пар, страдающих бесплодием неясного происхождения, была выполнена в соответствие с существующими стандартными процедурами.

Для оценки уровня эндотоксикоза проводились биохимический анализ крови и оценка оптической плотности ВСиНММ в плазме крови и эритроцитах. Кроме этого исследовались уровни общего и эндотелиального оксида азота.

Статистическую обработку материалов исследования проводили с использованием стандартных статистических программ Microsoft Excel 2007 для Windows 7 и Statistica 6.0.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Наше исследование показало, что пациентки с бесплодием неясного генеза не имеют значимых клинико-анамнестических особенностей. Они не имеют существенных различий по частоте соматической и генитальной патологии, по сравнению с фертильными женщинами. Отмечено превалирование частоты первичного бесплодия (частота первичного и вторичного бесплодия составила соответственно 60% и 40%), что согласуется с данными литературы.

Полученные нами результаты показали, что наряду с хорошо изученными причинами снижения фертильности к бесплодию могут приводить также генетические факторы.

В результате цитогенетических исследований было установлено, что среди супружеских пар, страдающих идиопатическим бесплодием частота различных особенностей кариотипа, не имеющих критического характера, существенно выше, чем в общей популяции. По нашим данным 8,8% пациентов, среди 45 супружеских пар с идиопатическим бесплодием, которым был сделан анализ кариотипа имели те или иные цитогенетические особенности, что существенно превосходит популяционный уровень. Аномалии кариотипа, либо нормальный гетероморфизм хромосом выявлены у 5 женщин и у 3 мужчин. Среди выявленных перестроек встречались числовые аномалии (мозаичные варианты анеуплоидий гоносом с небольшим количеством аномальных клонов клеток - кариотипы 45,Х[1]/47,ХХХ[4],46,ХХ[39] и 45,Х[6]/[46,ХХ[38]), структурные аномалии (3 случая робертсоновских транслокаций между 13 и 14 хромосомами, 1 инверсия 7 хромосомы), нормальный гетероморфизм хромосом - увеличение гетерохроматинового блока на 9-й хромосоме и увеличение спутничной нити 13-й хромосомы (кариотипы 46,ХХ,9рЬ и 46,ХХ,13рз(к+).

Изучение, указанных выше полиморфизмов в 3 генах второй фазы детоксикации принесло следующие результаты. По частоте встречаемости трех из них получены достоверные различия между исследуемыми

группами. В частности, в группе пациенток с бесплодием неясного генеза достоверно чаще встречались полиморфные варианты гена ЕРНХ в 415 локусе(А415С) и ТРМТ в 460 локусе (С460А).

Полиморфный аллель в в 415 положении гена ЕРНХ в основной группе встречался с частотой 44,5%, а в контрольной - 30% (р=0,01, 011= 1,87 (1,123,11). Гомозиготный генотип ОЭ по данному полиморфизму составил 17% в основной группе и 4% в контрольной группе (р=0,02, (Ж 4,91 (1,1-22,2). Частота гетерозиготного генотипа была высокой в обеих исследуемых группах и составила соответственно 55% и 52%.

Аллель в в 415 положении гена ЕРНХ называют «быстрым» аплелем, поскольку при данном полиморфизме активность фермента микросомальной эпоксидгидролазы повышена (у носителей гомозиготного генотипа примерно на 25%). При этом, согласно литературным данным, после реакции, катализируемой этим ферментом некоторые токсиканты становятся более опасными для организма (например, образуются особо опасные эпоксид-гидродиолы). Поэтому в отношении некоторых вредных веществ эпоксид-гидролаза играет потенцирующую роль. В связи с этим именно «быстрая» форма гена ЕРНХ оказалась более неблагоприятной, тогда как по частоте встречаемости «медленного» полиморфизма Т337С (при котором у гомозиготных носителей активность фермента снижена на 40-50%, а у гетерозиготных на 25%) существенных различий между исследуемыми группами не выявлено.

Ген ТРМТ кодирует фермент, катализирующий реакции Б-метилирования, - тиопуринметилтрансферазу, который экспрессируеггся в печени, почках, эритроцитах, лейкоцитах и ряде других тканей. При определенных условиях данный фермент также участвуют в процессах метилирования ДНК, которые являются ключевыми в плане реализации эпигенетических механизмов, отвечающих за экспрессию генов.

Полиморфный аллель А в 460 положении гена ТРМТ в основной группе встречался с частотой 20%, а в контрольной - 10% (р=0,03, СЖ=2,25 (1,07-

4,41). Гомозиготный полиморфный генотип АА в основной и контрольной группе встречался с частотой соответственно 12% и 2% (р=0,04, (Ж=6,68 (1,84-62,9). Существенных различий по частоте встречаемости гетерозиготного генотипа не выявлено. Частота встречаемости гетерозиготного генотипа в А в обеих группах составила 16%.

Вероятно, наличие аллелей в в 415 положении гена ЕРНХ и аллеля А в 460 положении гена ТРМТ являются прогностически неблагоприятными в отношении развития бесплодия. Причем их негативное действие реализуется лишь при гомозиготном генотипе, а в гетерозиготном варианте эти полиморфизмы фенотипически не проявляются. Это можно объяснить тем, что у носителей гетерозиготного генотипа изменение активности (или количества) соответствующих ферментов незначительно и не влияет на устойчивость организма в действию различных экзо- и эндотоксических субстанций.

Полиморфизм же С238С гена ТРМТ, напротив, чаще встречался в контрольной группе. Частота встречаемости полиморфного аллеля 238С гена ТРМТ в основной группе оказалась значительно ниже, чем в контрольной -соответственно 12,5% и 23% (р=0,02, СЖ=0,47 (0,25-0,89). Суммарная частота генотипов, содержащих полиморфный аллель 238С (ОС, СС) составила соответственно 22% и 38% (р=0,04, СЖ=0,46 (0,21-0,96). Генотип СО, напротив, в основной группе встречался достоверно чаще - частота генотипа Об составила соответственно 78% и 62% (р=0,04, 011=2,17 (1,044,56). Следовательно при данном полиморфизме более неблагоприятным является «дикий» аллель в, тогда как полиморфный аллель С, возможно, • обладает протективным эффектом в отношении развития бесплодия.

Поскольку все исследуемые гены кодируют ферменты, принимающие участие в процессах детоксикации, мы предположили вероятность межгенных взаимодействий и проанализировали частоту встречаемости различных комбинаций полиморфных аллелей.

В основной группе достоверно чаще, чем в контрольной, встречались 3 сочетания: ЕРНХ1 337С/- + С8ТР1 341С/- (частота встречаемости этого сочетания в основной и контрольной группах составила соответственно 26% и 5% (р=0,021, 011=3,16 (1,16-8,82); 08ТР1 3130/- + ТРМТ 460А/-(частота встречаемости исследуемых группах составила соответственно 18% и 2% (р=0,005, СЖ=10,75 (1,34-85,07) и 08ТР1 341С/- + ТРМТ 460АУ-(частота встречаемости данного сочетания составила соответственно 16% и 2% (р=0,03, 011=4,57 (1,07-20,73).

Общей особенностью данных комбинаций является то, что в них задействованы полиморфизмы двух разных генов (из трех исследуемых), и в каждой из них присутствует тот или иной полиморфных аллель гена ОБТРК Достоверных различий по частоте встречаемости полиморфизмов этого гена в исследуемых группах не получено. Но, вероятно, его полиморфизмы могут потенцировать негативное влияние полиморфных аллелей других генов второй фазы детоксикации.

Сочетание аллелей ЕРНХ1 337С/- + ТРМТ 238С/-, напротив, достоверно чаще наблюдалось в контрольной группе. В основной группе данное сочетание было выявлено лишь в 11% случаев, а в контрольной группе - в 24% случаев (р=0,033, 011=0,39 (0,15-0,96). Это еще раз подчеркивает протективный эффект полиморфного аплеля С гена ТРМТ.

Количественному анализу подвергалось и общее количество полиморфных аллелей генов детоксикации у пациенток в исследуемых группах. Выяснилось, что количество неблагоприятных аллелей также играет определенную роль - у пациенток с бесплодием в среднем больше число полиморфных аллелей,- чем в контрольной группе: соответственно 3,22±0,26 и 2,54±0,2 (р<0,05). Особенно повышается риск развития бесплодия при наличии 6 и более полиморфных аллелей в генотипе. В основной группе 6 и больше полиморфных аллелей встречалось у 16%, а в контрольной группе лишь у 2% (р=0,01, 011=9,33(1,2-75,55).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что целесообразно проведение тестирования на все полиморфизмы генов второй фазы детоксикации, включенные в данную работу, в том числе и те, по частоте встречаемости которых не получено достоверных различий между исследуемыми группами. Это необходимо для оценки общего числа полиморфных аллелей и поиска неблагоприятных их сочетаний.

Предположение о молекулярно-генетических особенностях механизмов формирования первичного и вторичного бесплодия неясного генеза было исследовано в следующем разделе нашей работы. В подгруппе 1а достоверные различия с контрольной группой выявлены только по частоте встречаемости дикого генотипа Св ТРМТ в238С (соответственно 80% и 62% в первой подгруппе основной группы и в контрольной группе, р=0,03, (Ж=2,45 (1,04-5,74). Суммарная частота гетерозигот и полиморфных гомозигот (вС+СС) по этому полиморфизму оказалась выше в контрольной группе (в подгруппе пациенток с первичным идиопатическим бесплодием 20%, а в контрольной группе 38%, р=0,03, ОЯ=0,4 (0,17-0,95).

В подгруппе 16 с вторичным бесплодием достоверно выше, чем в контрольной группе, оказалась частота полиморфных гомозигот гена ЕРНХ1 (СС в 337 положении и вв в 415 положении). Частота генотипа СС в этой подгруппе составила 17,5%, а в контрольной группе пациенток с таким генотипом не оказалось (0%) (р=0,002). Частота генотипа ОС составила соответственно 27,5% и 4% (р=0,006, (Ж=9,1 (1,88-44,01). Также в этой подгруппе определялась более высокая частота гомозигот АА в гене ТРМТС460А (соответственно 15% и 2%, р=0,02, (Ж=8,12 (1,16-81,6). Частота носительниц полиморфных гомозигот по полиморфизму ТРМТ Б238С в этой подгруппе также как и подгруппе с первичным бесплодием оказалась выше, чем в контрольной группе (72,5% в подгруппе с вторичным бесплодием и 62% в контрольной группе), однако разница не была статистически достоверной.

Анализ показателей эндотоксикоза в зависимости от наличия или отсутствия генетических полиморфизмов ЕРНХ1 А4150, ТРМТ0238С и ТРМТС460А, по частоте встречаемости которых нами были выявлены достоверные различия между основной и контрольной группами, продемонстрировал следующее. У гомозиготных носительниц полиморфизма ЕРНХ1 А415С (генотип в С) достоверно выше была концентрация ВСиНММ в эритроцитах (). 254) по сравнению с носительницами «дикого» генотипа АА (соответственно 0,125±0,008 и 0,114±0,004, ед.опт.пл., р<0,05). Показатели эндотоксикоза у носительниц гетерозиготного генотипа (вА) достоверно не отличались от носительниц «дикого» генотипа.

У носительниц гетерозиготного генотипа (ОА) в 460 полиморфном локусе ТРМТ выше концентрация ВНиСММ в плазме крови (к 254) по сравнению с носительницами «дикого» генотипа - соответственно 0,124±0,006 и 0,110±0,003 ед.опт.пл., (р<0,05). Между гомозиготными носительницами полиморфного и «дикого» генотипов достоверных различий не выявлено. Отсутствие существенного уровня значимости различий между группами может быть обусловлено низкой распространенностью этого генотипа в популяции, а также недостаточной мощностью выборки.

Таким образом, у пациенток, имеющих в генотипе полиморфизмы ЕРНХ1 А415в и ТРМТ в460А уровень эндотоксикоза несколько выше, чем у носительниц «дикого» генотипа. Это свидетельствует о снижении у них эффективности процессов детоксикации и согласуется с данными научной литературы (Серединин С.Б., 2004; Цатерян С.Я., 2003; Ргеткитаг, 2012), которые показывают, что результатом этих изменений может быть токсическое повреждение клеток организма со снижением функциональной активности жизненно важных органов и систем, в том числе репродуктивной системы.

У гомозиготных носительниц полиморфизма ТРМТ С238С, обладающих по нашему мнению протективным эффектом, уровень

эндогенной интоксикации, напротив, ниже, чем у носительниц «дикого» генотипа. У носительниц гомозиготного генотипа СС в 238 полиморфном локусе гена ТРМТ концентрация ВСиНММ в плазме крови и в эритроцитах (X. 254) оказалась достоверно ниже, чем у носительниц «дикого» генотипа ОС. В плазме крови этот показатель у носительниц полиморфного генотипа в гомозиготном состоянии и носительниц «дикого» генотипа составил соответственно 0,082±0,008 и 0,112±0,003 ед. опт. пл. (р<0,05), а в эритроцитах 0,206±0,009 и 0,253±0,005 ед. опт. пл. (р<0,05).

Для оценки функционирования системы детоксикации мы также изучали некоторые биохимические показатели крови пациенток исследуемых групп. В результате выполнения данного раздела работы было установлено, что у женщин с нормальной репродуктивной функцией достоверно выше уровень холестерина и триглицеридов, чем у женщин с бесплодием (уровень холестерина в основной и контрольной группе составил соответственно 5,04±0,11 и 5,39±0,39ммоль/л, триглицеридов -соответственно 0,746±0,05 и 0,9±0,06 ммоль/л). Подобные результаты получены и в других исследованиях. Например, в работе Ганчар Е.П. и соавт. (2013г.) сравнивались женщины с метаболическим синдромом страдающие бесплодием и с нормальной репродуктивной функцией. При этом, у фертильных женщин с метаболическим синдромом показатели холестерина и триглицеридов оказались несколько выше.

Исследование частоты полиморфизмов гена N083 Т786С и 0894Т, а также уровней оксида азота (общего и эндотелиального) не показало достоверных различий между исследуемыми группами. Поэтому, на наш взгляд, полиморфные варианты гена ЫОБЗ не оказывают влияния на функционирование репродуктивной системы, а тестирование данных полиморфизмов при бесплодии неясного генеза мы считаем нецелесообразным.

Для обоснования прогноза значимости эндогенной интоксикации в генезе идиопатического бесплодия для конкретной супружеской пары и

пациентки было разработано правило прогноза, на основе которого был создан модифицированный алгоритм обследования пациенток с бесплодием неясного генеза.

В результате дискриминантного анализа ряда клинических и лабораторных параметров (всего анализу было подвергнуто 92 параметра) были установлены факторы, предрасполагающие к нарушению функционирования системы детоксикации, повышению уровня эндотоксикоза, и, как следствие, к снижению фертильности.

Было выделено несколько генетических (наличие или отсутствие определенных полиморфизмов в генах второй фазы детоксикации и их сочетаний) и биохимических (уровень триглицеридов и холестерина) параметров, позволяющих оценить риск развития эндотоксикоза у пациентки с бесплодием.

На основе выявленных закономерностей разработано правило прогноза эндогенной интоксикации в генезе бесплодия неясного происхождения. Сущность правила заключается в вычислении прогностического индекса Р по формуле:

Р=0,7хХ1+0,9хХ2-1,47хХЗ-1,44хХ4+0,9хХ5 -0,19хХ6-0,39хХ7 -3,74

Где:

XI - концентрация холестерина, ммоль/л;

Х2 - концентрация триглицеридов, ммоль/л;

ХЗ -полиморфизм гена ЕРНХ1 А4150 (генотип СО - 1, генотип Ав или АА - 0);

Х4 - полиморфизм гена ТРМТ С460А (генотип АА - 1, генотип С А или АА - 0);

Х5 - полиморфизм гена ТРМТС238С (генотип Сй - 0, генотип вС - 1, генотип СС - 2);

Х6 - комбинация полиморфных аллелей ЕРНХ1 337С + С8ТР1 341Т (если в генотипе присутствует полиморфный аллель 05ТР1 341Т и

полиморфный аллель ЕРНХ 337С - 1, если указанные полиморфные аллели в генотипе отсутствуют, либо имеется лишь 1 из них — 0);

Х7 - комбинация полиморфных аллелей GSTP1 313G + ТРМТ 460А (если в генотипе присутствует полиморфный аллель GSTP1 313С и полиморфный аллель ТРМТ 460А - 1, если указанные полиморфные аллели в генотипе отсутствуют, либо имеется лишь 1 из них - 0).

Const = - 3,72.

Все полученные данные подставляются в формулу, и рассчитывается значение прогностического индекса Р.

Если Р<-0,5, то вероятна значительная роль эндотоксикоза в генезе бесплодия у данной пациентки. В таких случаях целесообразно проведение анализа крови на эндотоксикоз;

Если Р>0,5, то роль фактора эндотоксикоза маловероятна.

Если -0,5>Р<0,5, то прогноз неопределённый.

Для оценки эффективности разработанного правила прогноза проведена его проверка на экзаменационной выборке, подобранной методом «скользящего» подбора. В результате проведенного анализа установлено, что чувствительность решающего правила составила 74,3%, специфичность 70,7%, эффективность 72,9%.

Данное правило прогноза стало основой разработанного нами алгоритма обследования пациенток с бесплодием неясного генеза, который должен стать важной составляющей обследования пациенток с данной патологией, что позволит улучшить результаты лечения бесплодия и восстановления репродуктивной функции. Алгоритм обследования пациенток с бесплодием неясного генеза представлен на рисунке 1.

Супружеская пара с бесплодием неясного генеза, обследованная в

соответствии с приказом №572н МЗРФ от 1.11.12 - *

Цито генетическое исследование (обоих супругов)

Нормальный кариотна

X

1

Молекулярно-генетнческое тестирование полиморфизмов генов второй фазы детоксикации (ЕРНХ1, «ГП>1. ТМТР)> расчетриска развития эндотоксикоза с помощью решающего правила прогноза

Патологический кариоткп )

Консультация генетика с решением вопроса о проведении ВРТ с ПГД, либо с использованием донорских гамет

Высокий риск (Р<-0,5)

Проведение анализа на зндотокснкоз

[ Низкий риск (Р>0.5)

г

Сомнительный результат (0.5<Р<0,5)

I Решение вопроса о ВРТ

I

1 Анализ не проводится (отсутствие факторов риска)

Решение вопроса о проведении коррекции эндотоксикоза

Анализ проводится (наличие факторов риска)

Решение вопроса о проведении анализа крови на зндотокснкоз в зависимости от данных анамнеза

Рис. 1. Алгоритм обследования супружеских пар с бесплодием неясного генеза.

ВЫВОДЫ

1. Пациентки, страдающие идиопатическим бесплодием, не имеют существенных различий с женщинами с ненарушенной фертильностью по частоте соматической и генитальной патологии. В исследуемых группах также не установлены различия по частоте патологических зависимостей и профессиональному контакту с экзогенными токсикантами.

2. Установлена взаимосвязь полиморфных вариантов гена ЕРНХ1 А415С (генотип вС), гена ТРМТ С460А (генотип АА), а также гена ТРМТ в238С (генотип йв) с идиопатическим бесплодием, обусловленным детоксикационными нарушениями. Полиморфные варианты гена КОБЗ не имеют существенного значения в генезе бесплодия неясного происхождения. Наиболее значимым в отношении развития первичного идиопатического бесплодия оказался 238 полиморфный локус гена ТРМТ. Установлено неблагоприятное воздействие «дикого» аплеля в, а полиморфный аллель С обладает протективным эффектом. Среди пациенток с вторичным

бесплодием выше частота мутантных гомозигот гена ЕРНХ1 (СС в 337 положении и вС в 415 положении), а также более высокая частота гомозигот АА в гене ТРМТ в 460 локусе.

3. Сочетания мутантных аллелей ЕРНХ1 337С/- + СБТР1 341С/-, 08ТР1 3130/- + ТРМТ 460А/- и СБТР1 341С/- + ТРМТ 460А/- оказывают неблагоприятный эффект в отношении репродуктивной функции, а сочетание ЕРНХ1 337С/- и ТРМТ 238С/- обладает протективным эффектом. Риск формирования бесплодия в браке повышается при наличии у пациентки 6 и более полиморфных аллелей в генотипе генов детоксикации. Среднее количество мутантных аллелей у инфертильных пациенток оказалось существенно выше, чем у женщин с нормальной фертильностью: соответственно 3,22±0,26 и 2,54±0,2 (р<0,05).

4. У пациенток основной группы достоверно ниже, чем в контрольной группе уровень холестерина (соответственно 5,04±0,11 и 5,39±0,19 ммоль/л ) и триглицеридов (соответственно 0,9±0,06 и 0,746±0,05 ммоль/л) , по остальным биохимическим показателям значительный различий не выявлено.

5. Установлена более высокая концентрация ВСиНММ у гомозиготных носительниц полиморфизма ЕРНХ1 А4150 (генотип (Ю) и гетерозиготных носительниц полиморфизма ТРМТ в460А (генотип вА) по сравнению с носительницами «диких» генотипов, что свидетельствует о более высокой степени эндогенной интоксикации. У носительниц полиморфного гомозиготного генотипа СС в 238 локусе гена ТРМТ, ниже концентрация ВСиНММ в плазме крови, чем у носительниц «дикого» гомозиготного генотипа 6С, что подтверждает его возможный протективный эффект в отношении формирования эндогенной интоксикации.

6. При обследовании супружеских пар, страдающих бесплодием неясного происхождения, установлены особенности кариотипа у 8 (8,8%) обследованных пациентов, что превышает популяционный уровень.

7. Разработанный алгоритм обследования супружеских пар с бесплодием неясного генеза на основе решающего правила прогноза

эндогенной интоксикации в генезе данной патологии (с чувствительностью 74,3%, специфичностью - 70,7%, эффективностью - 72,9%) может быть использован в практике акушера-гинеколога для повышения обоснованности принятия тактических решений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Всем супружеским парам с бесплодием неясного генеза необходимо проводить цитогенетическое исследование с целью выявления особенностей кариотипа.

2. В диагностике причин бесплодия неясного происхождения необходимо использовать молекулярно-генетические методы, включая полиморфные варианты генов детоксикации (ЕРНХ1, ТРМТ, С8ТР1).

3. Полиморфизмы гена N083, регулирующего вазодилатируюшую функцию эндотелия, не имеют существенной роли при бесплодии неясного происхождения, и поэтому не должны включаться в комплекс обследования при данной патологии.

4. В процессе обследования супружеских пар с бесплодием неясного генеза целесообразно использование разработанного нами модифицированного алгоритма, включающего решающее правило прогноза эндогенной интоксикации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кудрявцева, Е.В., Фенотнческие особенности системы детоксикации у женщин с бесплодием неясного генеза / Е.В. Кудрявцева, В.В. Ковалев, Л.А. Пестряева и др.// Уральский медицинский журнал. -2012. - № 11. - С. 54-56.

2. Кудрявцева, Е.В. Молекулярно-генетические аспекты бесплодия неясного генеза. / Е.В. Кудрявцева, В.В. Ковалев, Т.Б. Третьякова и др. // Материалы конференции "Инновационные технологии в охране здоровья матери и ребенка". - Екатеринбург, 2012,- С. 43-45.

3. Кудрявцева, Е.В., Фенотипические особенности системы детоксикации у женщин с бесплодием неясного генеза / Е.В. Кудрявцева, В.В. Ковалев, Л.А. Пестряева и др.// Материалы конференции, "Инновационные технологии в охране здоровья матери и ребенка". - Екатеринбург, 2012. -С. 42-43.

4. Кудрявцева, Е.В. Роль генов детоксикации в формировании патологии репродуктивной системы / Е.В. Кудрявцева // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2013. - №2. - С.106-109.

5. Кудрявцева, Е.В. "Философские, медицинские и юридические аспекты исследований на генетическую предрасположенность человека к заболеваниям" / Е.В. Кудрявцева // Сборник статей и тезисов докладов конференции "Социальные и гуманитарные аспекты стратегии инновационного развития медицинского университета". - Екатеринбург, 2013. - с.208-214.

6. Кудрявцева, Е.В. Молекулярно-генетические аспекты бесплодия неясного генеза/ Е.В. Кудрявцева // Материалы конференции "Репродуктивная медицина. Взгляд молодых". - СПб, 2013. - С. 45.

7. Кудрявцева, Е.В. Роль нарушений генетической регуляции в генезе бесплодия неясного происхождения / Е.В. Кудрявцева, В.В. Ковалев, Т.Б. Третьякова и др. // Материалы форума "Мать и дитя". -М., 2013. - с.535-536.

8. Кудрявцева, Е.В. Роль полиморфизмов генов второй фазы детоксикации при бесплодии неясного генеза / Е.В. Кудрявцева, В.В. Ковалев, Т.Б. Третьякова // Уральский медицинский журнал. - 2013. -№8(113). -С. 28-31.

9. Ковалев, В.В. Цитогенетическая феноменология бесплодия неясного генеза. / Ковалев В.В., Кудрявцева Е.В., Третьякова Т.Б. // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2014. - №1. - С 17-21.

Подписано в печать 14.04.2014 г. Заказ № 143. Формат 60х84/|6. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России, г. Екатеринбург, ул. РепинаД