Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка различных путей активации Т-лимфоцитов при иммунодефицитных состояниях

т №

\ 3 ^

На правах рукописи

ЛИТВИНА Марина Михайловна

ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ ПУТЕЙ АКТИВАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЯХ.

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1996 г.

Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава России

Научный руководитель:

академик РАЕН, доктор медицинских наук,

профессор А.А.Ярилин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

А А. Михайлова

академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А.Н.Чередеев

Ведущая организация - НИИВС им.И.И.Мечникова

Защита диссертации состоится 22 января 1997 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д.24, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава России.

Автореферат разослан «_»_ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.С.Сеславиш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, в основе многих им-

мунодефицитных состояний лежит недостаточность лимфоцитов, проявляющаяся в снижении их численности и/или нарушении функциональной активности. Наиболее универсальным показателем функционального состояния лимфоцитов является их пролиферативный ответ на внешние сигналы, главным, но не единственным из которых является связывание рецепторов для антигена. Это обусловлено тем обстоятельством, что пролиферация клонов лимфоцитов служит условием развития любых форм иммунного ответа. Поэтому оценка пролиферативной активности лимфоцитов на действие митогенов используется для определения их функциональных потенций. Считается, что эта реакция моделирует в поликлональном варианте проли-феративную экспансию клеток под влиянием антигенов. Однако, лектины, обычно используемые для стимуляции Т-лимфоцитов, взаимодействуют с углеводной частью различных молекул клеточной поверхности, а не только комплекса СОЗ-ТсЫ, распознающего антиген.

Изучение путей активации Т-лимфоцитов оказалось весьма плодотворным при анализе пусковых механизмов стимуляции клеток, функционального взаимодействия мембранных макромолекул, его изменений в процессе созревания Т-клеток и при изучении других вопросов, имеющих фундаментальное значение. В частности, дифференцированная оценка активации Т-клеток, вызванная действием на анти-генраспознающие рецепторы (классическая активация) и на другие (костимулирующие, адгезивные) молекулы их мембраны (альтернативная активация), может представлять как теоретический так и практический интерес, поскольку эти пути активации Т-лимфоцитов могут запускаться с участием разных механизмов и повреждаться в разной степени при заболеваниях, сопровождающихся развитием иммунодефи-цитов. Помимо важности для оценки иммунного статуса данные такого рода могут оказаться существенными при

разработке принципов и методов иммунотерапии. Кроме того, оценка активации Т-клеток путем воздействия на конкретные мембранные молекулы дозволит объединить два относительно автономных подхода к изучению лимфоцитов, один из которых основан на характеристике мембранного фенотипа, а другой на оценке их функций.

Наконец, данный подход может прояснить ситуации, когда в результате накопления в сыворотке патологических метаболитов изменяется состояние мембраны лимфоцитов, что влияет как на восприятие, так и на передачу митогенных сигналов.

К настоящему времени имеются лишь единичные сведения о дифференцированном повреждении классического и альтернативного путей активации лимфоцитов при ревматоидном артрите, ряде других заболеваний, связанных с аутоиммунным компонентом, при некоторых первичных иммунодефи-цитах. В нашей лаборатории были проведены подобные исследования у больных с хроническими заболеваниями легких. Однако, механизмы нарушений различных путей активации до сих пор недостаточно изучены.

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ является сравнительное изучение нарушения путей активации Т-лимфоцитов, обусловленных связыванием рецептора для антигена и адгезией клеток, в сопоставлении с уровнем экспрессии функционально значимых поверхностных молекул при первичных и вторичных иммунодефицитных состояниях.

ля осуществления данной цели предполагалось решение

следующих ЗАДАЧ:

1. Изучение пролиферативного ответа Т-клеток, активированных по классическому (СБЗ-зависимому) и альтернативному (СВ2-зависимому) путям, у здоровых доноров и детей с первичными и вторичными иммунодефицитными состояниями, а также у людей, подвергшихся действию малых доз ионизирующей радиации.

:. Оценка влияния сыворотки больных и облученных людей на классическую и альтернативную активацию Т-лимфоцитов здоровых доноров.

. Моделирование влияния ионизирующих излучений на классическую и альтернативную активацию МНПК здоровых доноров in vitro.

АУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые выявлена разная степень поражения классического и альтерна-ивного путей активации при иммунодефицитных состояни-х у детей. При этом выявлено четыре категории поражения ктивационных процессов: 1) с нормальным ответом на >ГА, МАТ к CD3 и адгезивные стимулы (лимфопролифера-ивный синдром, бронхиальная астма, ревматизм, неспеци-ический лимфаденит); 2) с нормальным ответом на класси-ескую и пониженным ответом на альтернативную актива-ию (хронические неспецифические воспалительные роцессы); 3) с нормальным ответом на альтернативную и ониженным на классическую активацию (синдром Вискот-i-Олдрича, атаксия-телеангиэктазия, нейтропения); 4) с на-ушением обоих типов ответа (агаммаглобулинемия,общая хриабельная иммунная недостаточность, агаммаглобули-гмия с нормальным или повышенным IgM).

становлено, что нарушение активации клеток перифериче-сой крови при первичных и вторичных иммунодефицитных >стояниях связано с клеточными дефектами, а не с влияни-л сывороточных факторов.

оказано, что ионизирующее излучение приводит к нару-ению как классического, так и альтернативного путей ак-1вации. Только угнетение классической активации может лть обусловлено влиянием накапливающихся в сыворотке одей факторов; выраженность ингибирующего эффекта .торотки зависит от лучевой нагрузки (он наиболее выра-ен при использовании сывороток ликвидаторов).

первые дана количественная оценка радиационного пора-ения CD3- и CD2- зависимой активации Т-клеток in vitro.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Модифицирована тест-система для оценки пролиферативных реакций Т-лимфоцитов, что позволяет дифференцированно оценивать митогенный ответ лимфоцитов на действие агентов, моделирующих антигенное воздействие и адгезивные стимулы. Разработанный подход используется в Институте иммунологии МЗ РФ, Республиканской детской больнице, Нижнегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии при оценке функций Т-лимфоцитов. Данная разработка включена в качестве составной части в Методические рекомендации (А.А.Ярилин, Н.И.Шарова, М.Ф.Никонова, О.И.Кузьме-нок, Н.И.Кочергина, М.МЛитвина, ЛД.Титова, И.В.Ора-довская, Комплекс методов оценки состояния тимуса и ти-мусзависимого звена иммунной системы человека при действии радиационного фактора; в кн. «Экологическая иммунология», Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин, Х.И.Истамов, ВНИРО, М., 1995, с. 132-145).

Данные о различном характере поражения процессов классической и альтернативной активации Т-лимфоцитов при различных заболеваниях и иммунодефицитных состояниях позволяют уточнить их иммунопатогенез и оптимизировать подходы к иммунокоррекции. Оценка активации Т-клеток путем воздействия на конкретные мембранные молекулы дает возможность объединить два подхода к изучению лимфоцитов, один из которых основан на характеристике мембранного фенотипа, а другой - на оценке функции клеток.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Результаты доложены на I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992 г.), обсуждались на научных конференциях отдела клеточной иммунологии Института иммунологии Минздрава России.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на_страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты собственных исследований и их

обсуждение, Выводы, Список литературы. Содержит _

рисунков и_таблиц. В списке использованной литературы 201 источник, из них - 48 отечественных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалом для исследования служила кровь здоровых доноров, детей с различными иммунодефицитными состояниями, а также лиц, подвергшихся влиянию малых доз ионизирующего облучения.

Нами было обследовано 73 ребенка с различными нарушениями иммунной системы: 49 с врожденными иммунодефи-цитами и 25 с иммунопатологическими состояниями (аутоиммунными и аллергическими синдромами). Больные обследованы до проведения терапии (при поступлении). Все пациенты были разделены на 7 групп:

1. Агаммаглобулинемия с дефектом В-клеток (АГГ)-

2. Преимущественно Т-клеточные дефекты.

3. Общая вариабельная иммунная недостаточность (ОВИН); Агаммаглобулинемия с нормальным или повышенным (АГс^М).

4. Нейтропения, неклассифицированные дефекты фагоцитоза.

5. Лимфопролиферативный синдром (ЛПС).

6. Хронический кожно-слизистый кандидоз (ХКСК).

7. Бронхиальная астма, ревматизм, ревматоидный артрит.

Оценка пролиферативного ответа мононуклеаров перифер-ческой крови. Мононуклеары периферической крови (МНПК) выделяли из гепаринизированной венозной крови на градиенте плотности фиколла - верографина (плот-

ность- 1,077) с помощью центрифугирования при комнатной температуре в течение 30 мин., при 400g. Для культивирования клеток использовали среду RPMI 1640 («Flow») с добавлением L-глутамина, гентамицина («Хиноин»), Hepes («Flow Laboratories») и 10% термоинактивированной сыворотки эмбрионов телят («Calbiochem») (полная питательная среда-ППС).

С целью активации клеток использовали следующие препараты: моноклональные антитела (МАТ) к CD3 (ИКО-90,«Медбиоспектр», ВОНЦ); фитогемагглютинин (ФГА-Р, «Difco»); рекомбинантный ИЛ-2 (рИЛ-2) («Calbiochem»); форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) («Sigma»), а также отмытые аутологичные эритроциты обследованных лиц. Ответ на МАТ к CD3 рассматривался как показатель классической активации, а ответ на сочётанное действие эритроцитов и ФМА как мера альтернативной активации. Культивирование МНПК в количестве 5х104/лунку проводили в течение 72 часов при 37°С и 5% СОг. За 18 часов до окончания культивирования во все лунки добавляли по 40 кБк 3Н-тимидина. Уровень включения 3Н-тимидина определяли на счетчике "ß-Trac". Каждую пробу определяли в трех по-вторностях.

Оценка включения 3Н-тимидина. Эффекты оценивали как в абсолютных величинах (количество импульсов в минуту), так и путем вычисления индексов стимуляции (ИС), определяемых отношением включения 3Н-тимидиыа в опытных образцах к его включению в контрольных образцах.

количество имп./мин в опыте

ИС =-

количество имп./мин в контроле Анализ мембранных маркеров Т-клеток методом проточной цитометрии. К клеточной суспензии (2-5x106 кл/мл) добавляли 50 мкл МАТ ЛТ-2,3,4,8 (любезно предоставленные Филатовым A.B., Ин-т иммунологии МЗ РФ) в разведениях 1:10; ICO—105 и ICO-160 (производство "Медбиоспектр", ВОНЦ) по 50 мкл без разведения и инкубировали 30 мин.

Затем клетки центрифугировали 5 мин. при 250 g. К осадку добавляли 50 мкл Р(аЬ)'-фрагментов антимышиных иммуноглобулинов, меченных ФИТЦ, в разведении 1:100 и инкубировали 30 мин. После этого центрифугировали. Пробы фиксировали 1% параформальдегида («Serva»), приготовленного на среде Игла. Вся реакция проводилась при 4°С. Процент и интенсивность флуоресценции клеток, присоединивших МАТ, определяли на проточном цитофлуориметре Epics Profile II («Cultronics»).

Оценка влияния сыворотки больных на активацию Т-лилгфоцитов здоровых доноров. Сыворотку больных детей, ликвидаторов Чернобыльской аварии, жителей загрязненных территорий после Чернобыльской аварии добавляли в систему для оценки митогенеза МНПК здоровых доноров в количестве 10 мкл, что составляло в конечном разведении 5%.

Статистический анализ. Статистическая обработка данных проводилась с использованием Т-критерия Стъюдента, корреляционного и регрессионного анализов. При обработке результатов использовали пакет статистических программ «Statgraphics».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Нами было обследовано 73 ребенка с различными нарушениями иммунной системы: 49 с врожденными иммуноде-фицитами и 25 с иммунопатологическими состояниями (аутоиммунными и аллергическими синдромами). Больные обследованы до проведения терапии (при поступлении). Все пациенты были разделены на 7 групп (см. главу «Материалы и методы»). В качестве группы сравнения была взята группа здоровых взрослых доноров (12 человек).

Результаты обследования представлены на рисунках 1,2. Уровень спонтанной пролиферации мононуклеаров периферической крови детей с различными заболеваниями не отличался друг от друга и от контроля (здоровые доноры).

При оценке ответа Т-клеток на стимуляторы классического пути (МАТ к СБЗ и ФГА) исследованные патологии четкс распадаются на два разряда: с резко сниженной и нормальной реакцией на стимуляцию. Первый включает в себя все первичные иммунодефицитные состояния, второй приобретенные заболевания, сопровождающиеся развитием иммунодефицита (ревматоидный артрит, ревматизм, бронхиальная астма, туберкулез, хронические воспалительные заболевания), а также лимфопролиферативный синдром Частота развития ответа (при ИС>2) примерно одинакова > больных обоих разрядов и у здоровых доноров (примерно 40% в случае ответа на анти-СБЗ и 60% при ответе на ФГА) Различия касаются именно уровня ответа на указанные стимуляторы, причем соотношение реакций на ФГА и МАТ к СШ в обоих разрядах и контроле совершенно аналогичны, хотя по абсолютным значениям ответ на ФГА существенно выше, чем на анти-СОЗ.

Сведения об индексах стимуляции в двух разрядах больных представлены в табл. 1. Средний индекс стимуляции (ИС] при стимуляции клеток анти-СОЗ составил в объединенной группе первичных ИДС 2,04, при стимуляции ФГА 2,50 (у доноров соответственно 3,68 и 12,84). Добавление ФМА к СБЗ вызывающего дополнительную стимуляцию активности протеинкиназы С, не изменяло уровня ответа МНПК в этой группе. При СВО, ТКИН и Луи-Бар наблюдалось некоторое увеличение ИС при добавлении ИЛ-2 на фоне стимуляции ФГА (ИС увеличивался с 1,75 до 4,06), что свидетельствует о вкладе подавления выработки ИЛ-2 в нарушение митогенеза лимфоцитов при этих заболеваниях.

Таблица 1. Индексы стимуляции мононуклеаров детей при двух группах заболеваний (группы охарактеризованы в тексте). Классическая стимуляция.

Группы: ИС относительно контрольных проб при действии:

„ а-СБЗ а-СОЗ + ФМА ФГА ФГА + ИЛ-2

контроль 3,7 3,2 12,9 —

группа 1 4,5 5,1 10,7 12,4

группа 2 1,9 2,5 2,5 3,6

♦ Группа 1: нормальный ответ на классические стимулы.

♦ Группа 2: пониженный ответ на классические стимулы.

Рисунок 1. Классическая активация МНПК групп детей с различными заболеваниями.

25000

а-СОЗ

ФГА

□ЗДОРОВЬЕ ДОНОРЫ

□ хрон. ксп.

ПРОЦЕССЫ

□ 6р. астма, реплэтиэм

* Различия достоверны относительно соответствующего по казателя в группе доноров.

При анализе альтернативной активации выявляется ее нарушение совсем в другой группе заболеваний, при которых наблюдаются соответственно нормальный и пониженный

ответ на сочетание аутологичных эритроцитов с ФМА и при добавлении ИЛ-2 в систему (рис. 2). Группу с нормальным уровнем альтернативной активации образуют больные как с наследственной патологией (синдромы Вискотта-Олдрича и Луи-Бар, комбинированный иммунодефицит, гипо-1§А-, лимфопролиферативный и ЬАО-синдромы, ней-тропения), так и с приобретенными иммунодефицитами, сопровождающими различные заболевания (ревматизм, ревматоидный артрит, бронхиальная астма, туберкулез, неспецифический лимфаденит). Эта группа довольно многочисленна и по количеству обследованных больных (44 человека). В группу с пониженным ответом также входят больные как с наследственной (ОВИН, агаммаглобулине-мия, гипер ^М-синдром), так и с приобретенной (хронические воспалительные заболевания) патологией общей численностью 29 человек.

Из таблицы 2 следует, что в обеих группах ответ мононук-леаров на действие рекомбинантного ИЛ-2 примерно одинаков (ИС=2, т.е. несколько выше, чем в контроле 1,5). От-ве_и_.на_ хючётанное_аутологичных эритроцитов и ФМА несколько ниже, чем в контроле, причем разница между указанными группами невелика (ИС равны соответственно 3,0 и 2,2 в подгруппах реагировавших и и не реагировавших). При сочетанием действии эритроцитов, ФМА и ИЛ-2 процент лиц, клетки которых дают ответ в реагирующей группе, приближается к взрослому контролю (соответственно 50% и 60%), а уровень ответа в этой группе не отличается от контрольного (ИС=7,7). Во второй группе положительный ответ дают клетки 37% обследованных, и средний уровень ответа среди реагирующих в 2 раза ниже, чем в контроле и 1-й группе (ИС=3,6).

Таблица 2. Индексы стимуляции мононуклеаров детей при двух группах заболеваний (группы охарактеризованы в тексте). Альтернативная стимуляция.

Группы: ИС относительно контрольных проб при действии:

ИЛ-2 ЭРИТР. + ФМА ЭРИТР.+ ФМА+ ИЛ-2

контроль 1,5 4,3 7,7

группа 1 2,0 3,0 7,7

группа 2 1,9 2,2 3,6

♦ Группа 1: нормальный ответ на альтернативные стимулы.

♦ Группа 2: пониженный ответ на альтернативные стимулы.

Рисунок 2. Альтернативная активация МНПК групп детей с различными заболеваниями.

9000

8000 - ■

7000 • •

6000 - •

1 5000 ••

ч с

2 4000 - ■ Г

3000 - •

2000 - ■

1000 • ■

№

1 *й

аутоэрит,+ ФМА

аутоэригр, +ФМА+ИЛ2

□ ЗДОРОВЫЕ ДОНОРЫ

□ ТКИН.СВО, А-Т

□ ОВИН, АГЫдМ

0 неъгтропения

□ ЛПС

□ хрон.воеп,процесс

□ бр, астма, ревматизм

* Различия достоверны относительно соответствующего по казателя в группе доноров.

Суммируя результаты оценок CD3- и С02-зависимых путе£ активации Т-клеток детей с иммунологической недостаточ ностью, можно выявить четыре категории заболеваний:

1. с нормальным ответом на ФГА, МАТ анти-СОЗ и адге зивные стимулы: гипо-IgA- и лимфопролиферативньп синдромы, а также ревматизм, ревматоидный артрит туберкулез, неспецифический лимфаденит;

2. с нормальным ответом на классическую активацию i пониженным на альтернативную активацию: хрониче ские неспецифические воспалительные заболевания;

3. с нормальным ответом на альтернативную и понижен ным на классическую активацию: синдромы Вискотта-Олдрича, Луи-Бар, LAD-синдром, врожденная нейтро-пения;

4. с нарушением обоих типов ответа Т-клеток: агаммагло-булинемия, ОВИН, ranep-IgM-синдром.

Для того, чтобы оценить возможный вклад сывороточного окружения лимфоцитов в нарушении пролифератив-ных реакций лимфоцитов определяли влияние сывороткь больных (сверх содержащейся в культуральной среде эмбриональной сыворотки телят) на митогенез лимфоцшш здоровых доноров.

Действие сывороток детей с первичными и вторичными им-мунодефицитными состояниями на активацию мононуклеа-ров периферической крови было протестировано на клетка* 12 здоровых доноров. В этих опытах было использовано 108 сывороток обследованных детей. В этих опытах параллельно нами было использовано два независимых контроля - ау-тосыворотка и сыворотки здоровых доноров. Всего былс протестировано 12 аутосывороток и 38 донорских сывороток.

Добавление аутосыворотки к клеткам периферической крови здоровых доноров приводит к достоверной стимуляция уровня ответа клеток, активированных антителами к CD3 этими антителами в сочетании с ФМА или одним ФГА. Б

чанных случаях ИУ составил, соответственно, 1,88, 1,77 и 1,95. В то же время, гомологичная сыворотка здоровых доноров усиливала стимуляцию клеток только при их активации ФГА.

При сопоставлении действия сывороток больных и доноров различия не выявлялись в отношении стимуляции, вызванной ФГА. В то же время ответ лимфоцитов доноров на антитела к CD3 усиливался сыворотками больных АГГ, ЭВИН и ATcIgM (табл. 3, рис. 3), которые действовали ана-тогично аутосывороткам. Этот эффект не проявлялся при :тимуляции антителами к CD3 в сочетании с ФМА: по-зидимому, костимулирующие агенты, содержащиеся в сы-юротках больных названными заболеваниями, действуют шалогично ФМА, т.е. через стимуляцию активности проте-шкиназы С. Стимулирующий эффект сывороток на актива-дию лимфоцитов по классическому пути проявляется толь-со на фоне сниженного ответа донорских клеток. Добавление в культуру сыворотки больных АГГ увеличивает процент отвечающих клеток на a-CD3 и ФГА у доноров до 85%, сыворотки больных ОВИН - 92%, нейтропенией -до 75%, а бронхиальной астмой, ревматизмом, ревматоидным артритом до 62%.

Зтвет донорских лимфоцитов на альтернативную стимуля-дию (сочетание ФМА, ИЛ-2 и аутологичных эритроцитов) юдавлялся в присутствии сыворотки больных ЛПС (табл. 4, )ис. 3). И в этом случае активность сывороточной субстан-щи связана с действием на мишени ФМА (поэтому подав-шлся также ответ лимфоцитов на ФМА, вводимый в куль-гуру без ИЛ-2 и эритроцитов), однако направленность 1ействия в этом случае была противоположной.

Таблица 3. Влияние сывороток больных детей на Классическую активацию МНПК здоровых доноров.

Группы: спонт. а-СОЗ ФГА (Юмкг/мл)

Донорские клетки 1319±180 9719±2122 30392+7432

Клетки с донорской сывороткой 1366+102 53481905 28696+4319

Агаммаглобулинемия 1479±269 1031613233* 3530618849

Т- клеточные дефекты 11206±271 4120+1107 2934918116

ОВИН, АГс^М 1210±164 846411146* 2768316439

Нейтропения П56±190 2662+689 1773515934

Липопролиферативный синдром 1430±210 3705+852 3110415202

Хронические воспалительные процессы 1258±144 8248+2956 3731517791

Бронхиальная астма, ревматизм 1477±204 44181818 3489117180

* данные достоверны относительно соответствующих данных с добавлением донорских сывороток (при р<0,05)

Рисунок 3. Влияние сывороток больных детей на классическую и альтернативную активацию клеток здоровых доноров.

□ КЛЕТКИ БЕЗ СЫВОРОТКИ

□ КЛЕТКИ С АУТОСЫВОРОТКОЙ

□ КЛЕТКИ С ДОНОРСКОЙ СЫВОРОТКОЙ

□ КЛЕТКИ С СЫВОРОТКОЙ АГГ

□ СВО, ТКИН, А-Т

□ ОВИН. АГс|дИ □НвДтропени»

□ лпс

ПХрои, воспал, процессы СЗБр. астма, ревматизм

а-СОЗ ЭРИТР.+

ФМА+ ИЛ-2

* данные достоверны относительно соответствующих данных с добавлением донорских сывороток (при р<0,05).

Таблица 4. Влияние сывороток больных детей на Альтернативную активацию МНПК здоровых доноров.

Группы: спонт. ФМА ФМА+ Эритр. ФМА+ Эритр.+ ИЛ-2

Донорские клетки 15481180 17141261 17351212 30551588

Клетки с донорской сывороткой 1366±102 15471194 13951142 26521355

Агаммаглобу-линемия 14791269 16371213 13051265 19601140

Т- клеточные дефекты 12061271 15701482 16461230 25831667

ОВИН, АГс1^М 12101164 12041179 15081310 24381537

Нейтропения 11561190 12121195 13361327 22061604

Липопролифера-тивный синдром 14301210 10811125* 13821143 19211240*

Хронические воспалительные процессы 12581144 14511218 12871144 453812469

Бронхиальная астма, ревматизм 14771204 17061249 19641422 28531670

* данные достоверны относительно соответствующих данных с добавлением донорских сывороток (при р<0,05)

Таким образом, при сопоставлении эффекта сывороток больных детей и здоровых доноров выявлена следующая картина:

1. При АГГ, ОВИН и АГс1§М сыворотка усиливает ответ донорских клеток на МАТ к СРЗ (классическая активация).

2. При ЛПС сыворотка ингибирует ответ на сочетание ау-тологичных эритроцитов, ФМА и ИЛ-2 (альтернативная активация).

Выше указывалось, что при ЛПС ответ как на классическую, так и на альтернативную стимуляцию не нарушен, а при АГГ, ОВИН и АГс^М нарушен ответ на оба типа стимуляции. Таким образом можно заключить, что при рас-

смотренных заболеваниях нарушения ответа Т-клеток на активирующие стимулы, по-видимому, не связаны с наличием в сыворотке ингибирующих агентов.

В качестве примера приобретенных иммунодефицитов были избраны состояния, формирующиеся в отдаленные сроки после действия ионизирующей радиации, при которых умеренно выраженные нарушения в иммунной системе не сопровождаются развитием явно выраженной патологии, которая могла бы оказать дополнительное влияние на состояние иммунитета.

Изучены иммунологические последствия действия однократного (у ликвидаторов аварии на ЧАЭС) или длительного (у населения районов, загрязненных радионуклидами) действия малых доз ионизирующей радиации. У этих лиц выявлено поражение по преимуществу тимуса и тимус-зависимого звена иммунной системы, состоящее в накоплении аутоантител к эпителию тимуса, снижении содержания гормонов тимуса в сыворотке крови и сдвигах соотношения Т-клеток, относящихся к различным субпопуляциям. В связи с этим представилось необходимым изучить реакцию Т-лим-фоцитов этих людей на действие различных по своей природе стимуляторов.

Обследовано 33 мужчины в возрасте 25-60 лет, которые принимали участие в ликвидации последствий аварии на ЧАЭС в 1986-1987 гг. (ликвидаторы). Контролем служили здоровые доноры того же возраста, проживающие в г.Москве.

В таблице 5 и на рис. 4 представлены результаты обследования двух группы ликвидаторов, проживающих в Москве. Они свидетельствуют о резком ослаблении всех форм активации Т-лимфоцитов, выделенных из крови ликвидаторов. Ответ на ФГА оказался сниженным в три, ответ на анти-СОЗ в 2,5 раза. Реакция Т-лимфоцитов на альтернативную активацию (эритроциты + ФМА) подавлялась полностью.

Одновременно снижается доля проб, в которых регистрировалась митогенная реакция на стимуляторы (ИС>2). В нор-

ме реакция на МАТ к CD3 регистрируется в 100% проб, а у ликвидаторов в 70% случаев. Реакция на аутологичные эритроциты в сочетании с ФМА в норме регистрируется в 75% проб, тогда как при тестировании проб мононуклеаров от ликвидаторов реакция на эритроциты и ФМА не наблюдалась ни в одном случае.

Представленный материал свидетельствует о том, что способность Т-лимфоцитов лиц, подвергавшихся действию радиационного фактора, отвечать пролиферацией на мито-генный лектин и МАТ к рецепторному комплексу CD3 -TcR, снижена, а их способность к митогенной реакции на альтернативный (в нашем случае адгезивный) сигнал полностью подавлена.

Ранее было неоднократно показано, что примерно в те же сроки после воздействия факторов аварии на ЧАЭС в крови ликвидаторов снижается содержание клеток, несущих на поверхности Т-клеточные маркеры CD3, CD2, CD4, CD8, однако степень этого снижения (на 15-20%) несопоставима с тем глубоким подавлением митогенных реакций. Если учесть, что пролиферация лимфоцитов лежит в основе любых форм иммунного ответа, эти данные свидетельствуют о преимущественно функциональном характере влияний на Т-лимфоциты тех относительно низких доз радиации, действию которых подверглись ликвидаторы в сочетании с другими отрицательными факторами, включая стресс.

Особый интерес представляет неравномерность поражения у ликвидаторов классического и альтернативного путей активации Т-клеток с преимущественным ингибированием последнего. Аналогичная ситуация была выявлена нами ранее у больных воспалительными заболеваниями в частности хроническим бронхитом, саркоидозом легких, хроническим нефритом. Поскольку классический и альтернативный пути активации Т-клеток различаются только характером пускового сигнала, для объяснения разной степени подавления двух форм активации могли быть привлечены данные об изменении экспрессии мембранных молекул CD3 и CD2 ак-

цепторов сигналов соответственно классической и альтернативной активации. Однако степень снижение числа клеток, несущих эти молекулы, у обследованных лиц примерно одинакова: с 67 (в контроле) до 52% для СБЗ+ и с 78 до 68°/ для СВ2+-клеток. Вероятно, причиной отмены активации по альтернативному пути в рассмотренных нами случаях является не ослабление экспрессии СБ2, а изменение условий функционирования этой молекулы, которое препятствует передаче сигнала, возникающего при связывании с естественным лигандом (СБ 5 8).

Рисунок 4. Активация Т-лимфоцитов у ликвидаторов аварии на ЧАЭС.

зоооо

25000 -

20000 -

| I

х

15000 -

СПОНТ.ПРОД а-003 ФГА ЭРИТР.+ФМА

* Различия достоверны относительно соответствующего показателя в группе доноров.

□ЗДОРОВЫЕ ДОНОРЫ

^ЛИКВИДАТОРЫ

Таблица 5. Активация Т-лимфоцитов по классическому и альтернативному путям у ликвидаторов аварии на ЧАЭС.

группы спонт. ФГА 1 МАТ к СЭЗ Аутоэритр.+ФМА

имп/м ис % имп/м ИС % имп/м ИС %

доноры (п=26) 1600±320 25642±3031 16,1 100 22009±6630 13,8 100 8706+1277 5,4 75

ликвидаторы (п=17) 1065±242 10810±2515 10,2 100 5507±1640 5,2 70 1091 ± 132. 0,7 0

% - процент случаев наличия ответа на стимуляторы (ИС>2).

Таблица 6. Влияние сывороток жителей районов Брянской области, отличающихся по степени загрязнения, и ликвидаторов на пролиферативные реакции лимфоцитов здоровых доноров.

группы кол-во проб спонт. а-СБЗ ФГА ФМА+ эритр. ФМА+ эритр. +И Л-2

донорские клетки 12 1548±299 4933±320 19875±3270 17451238 30551358

донор, сыв. 38 1366+103 5348±905 28698+4219 13961142 28591355

сыв.жителей Но-возыбкова 38 1027+525 3802±525 3869715878 13061199 28041540

сыв. жителей Вышкова 24 20331275 35471385* 1218211496* 17521214 29341597

сыв. ликвидаторов 34 1645±108 1799±14Г 4631+589* 15661109 35111406

* данные достоверны относительно соответствующих данных с добавлением донорских сывороток

(при р<0,05)___

© 20

Как и в случае обследования больных с другими формами иммунодефицитов, нами было изучено влияние сывороток ликвидаторов, а также жителей районов, загрязненных радионуклидами, вследствие аварии на ЧАЭС, на активацию лимфоцитов здоровых доноров. В данном случае подобный подход был особенно важен, поскольку отнюдь не всегда представляется возможность оценить ответ на различные стимуляторы клетки крови самих пострадавших, обследовавшихся, как правило, в экспедиционных условиях, тогда как транспортировка их сывороток вполне возможна.

Нами был изучен эффект 128 сывороток: 62 от жителей загрязненных районов Брянской области Вышкова (содержание шСз 30 Кюри/ км2) и Новозыбкова (содержание 137Сз 12-15 Юори/км2), 34 от ликвидаторов (жителей Москвы и Обнинска) и 38 от доноров (жителей Москвы). Общая доза облучения в первых двух случаях не превышала 0,05 Гр, в случае ликвидаторов составляла 0,1-0,4 Гр.

Результаты исследования отражены в табл. 6 (см. стр. 20), рис. 5. При действии сывороток жителей загрязненных районов и ликвидаторов пролиферация мононуклеаров крови доноров в отсутствие митогенов (спонтанная пролиферация) значимо не изменяется. В то же время сыворотки ликвидаторов и жителей Вышкова подавляют пролиферацию Т-клеток, вызванную ФГА и МАТ к СБЗ. Выраженность ингибирующего эффекта зависит от лучевой назрузки эффект сывороток выстраивается в рад: ликвидаторы > жители Вышкова > жители Новозыбкова (действие отсутствует). Влияния этих сывороток на стимуляцию мононуклеаров адгезивными стимулами (эритроциты + ФМА) не выявлено. Донорские сыворотки не вызывают значимых, изменений ни в одной группе стимуляторов (хотя и появляется тенденция к усилению ответа на ФГА, как и в случае испытания сывороток жителей Новозыбкова).

Суммируя данные об особенностях ответа на различные стимуляторы Т-лимфоцитов крови людей, испытавших воздействие (однократное или длительное) малых доз радиа-

ции, можно констатировать следующее. Ответ Т-клеток крови ликвидаторов (доза облучения 0,1-0,4 Гр) на все испытанные стимуляторы снижена; ответ на адгезивные стимулы отсутствует, при действии МАТ к СВЗ снижен уровень ответа и частота положительных реакций, при действии ФГА только уровень ответа. В сыворотке людей, испытавших действие малых доз радиации, выявляется активность, подавляющая ответ лимфоцитов на стимуляторы, причем частота обнаружения этой активности увеличивается с нарастанием дозы облучения. Сывороточные ингибиторы подавляют в большей степени СОЗ-зависимую, чем С1)2-зависимую активацию.

Рисунок 5. Влияние сывороток жителей загрязненных радионуклидами территорий и ликвидаторов на классическую активацию МНПК здоровых доноров.

40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000

о

□ КЛЕТКИ

а сыворотка

зд, доноров

□ сыворотка жителей н0в03ыбк0ва

0 сыворотка жителей вышкова

И сыворотка ликвидаторов

а-СРЗ

фга

* Данные достоверны относительно соответствующих данных с добавлением донорских сывороток (при р<0,05).

Результаты оценки митогенеза лимфоцитов в отдаленные сроки после действия малых доз радиации заставляют рассмотреть вопрос о том, в какой степени они сопоставимы с непосредственными эффектами ионизирующей радиации на лимфоциты. Поэтому нами был изучен пролиферативный ответ на стимуляторы классической и альтернативной активации МНПК, непосредственно после облучении in vitro крови здоровых доноров. Были избраны дозы облучения 1, 4 и 8 Гр. Исследована реакция клеток 6 доноров Института переливания крови при ВОНЦ РАМН.

В этих опытах нами использована более высокая концентрация клеток, чем обычно 2x106 клеток. Средний уровень спонтанной пролиферации в контроле и при разных дозах облучения оставался одинаковым и составил 3499 имп/мин. При оценке влияния облучения в дозе 1 Гр на активацию клеток по классическому пути (действие анти- CD3 и ФГА) не наблюдалось изменений уровне ответа на эти стимулы или даже регистрировалась некоторая стимуляция ответа (ИС при активации ФГА в концентрации 10 мкг/мл в контроле составлял 13,3, при дозе облучения 1 Гр 16,1). Лишь при дозе 4 Гр регистрировалось значимое подавление ответа на оба стимулятора. При увеличении дозы до 8 Гр наблюдалось примерно двукратное подавление ответа: на действие ФГА или анти- CD3 относительно контроля (табл.7). Добавление ФМА к CD3 или ИЛ-2 к ФГА не вызывало существенных изменений ни в контроле, ни при облучении. Значительно более выраженное подавление ответа относительно контроля наблюдалась в случае альтернативной активации. Если в контроле мы регистрировали в ответ на сочетание ФМА + ИЛ-2 + эритроциты в среднем 40652±16427 имп/мин , то при облучении эта цифра дозозависимо снижалась, начиная с дозы 1 Гр и составляла 23490±11383, 10122+3651 и 5114+1342 имп/мин при дозах 1, 4 и 8 Гр соответственно. Для получения количественных оценок радиочувствительности классической и альтернативной активации лимфоцитов были расчитаны зависимости снижения

этвета клеток в зависимости от их дозы, данные были представлены в полулогарифмических координатах (рис. 6), что тозволило расчитать параметр радиочувствительности Для активации лимфоцитов при действии МАТ к СВЗ он эавен 8,438, для активации комплексом факторов, вклзо-дающими аутологичные эритроциты, ФМА и ИЛ-2 - 4,928. Гаким образом, альтернативная активация характеризуется существенно более высокой радиочувствительностью, чем слассическая активация.

'исуцок 6. Дозовая зависимость нарушения пролиферации МНПК здоровых доноров при классической и альтернативной активации.

0.1

1роцент CD2+, CD3+, CD4+ и CD8+ клеток не меняется на горые сутки после облучении, тогда как процент CD25+ в яде ситуаций изменяется под действием облучения щенивали на третие сутки). При активации МНПК МАТ к D3 и сочетанием эритроциты + ФМА процент содержа-щх цепь ИЛ-211 клеток не меняется, тогда как при актива-ии МНПК ФГА он падает при дозе 8 Гр с 19 до 4%. Со-гржание FAS-рецептора (CD95) при облучении в дозе 8 Гр шже снижается с 22% до 9% .

Сопоставление степени подавления активации лимфоцитов непосредственно после их облучения in vitro свидетельствует о том, что сравнимые эффекты достигаются при огромной разницы доз.

Таблица 7. Влияние различных доз облучения на классический и альтернативный пути активации МНПК здоровых доноров.

Дозы облучен ия спонт. a-CD3 ФГА ФМА ФМА+ эритр. ФМА+ эритр.+ ИЛ-2

ОГр 2957± 630 52722± 1268* 60735± 15092* 15480± 10200 20459± 9444* 40652+ 16427*

1Гр 3793± 892 50800+ 1654* 71598± 19542* 14256± 7956 27104± 17978 23490± 11383

4 Гр 3637± 577 26510± 7529* 53089+ 18028* 8021± 3470 7885± 3560 10122± 3651

8 Гр 3512± 587 21553± 7968* 47172± 19470* 5978± 1569 6394± 2751 5114± 1342

Do 8,438 17,365 4,647

* данные достоверны относительно собственного контроля (при

р<0,05)

Действительно, 2-4-кратное подавление активации по классическому пути и полная отмена альтернативной активации налюдается через несколько лет после облучения в дозах 0,1-0,4 Гр, тогда как при облучении in vitro даже в дозе 8 Гр классическая активация ослабляется в 1,5-2,5 раза, а альтернативная в 3-7 раз. Из этого сопоставления следует, что непосредственное действие радиации на лимфоциты не могло быть причиной значительного ослабления их реакции на ак-тивационное воздействие у ликвидаторов. Нарушение мито-генных реакций Т-лимфоцитов (при мало изменяющейся численности клеток) у жертв Чернобыльской аварии опосредовано иными причинами - вероятнее всего снижением уровня гормонов тимуса, развивающимся вследствие поражения эпителиальных клеток его стромы (Ярилин, 1996).

При этом реакция Т-клеток на адгезивные взаимодействия страдает в большей степени, чем реакция на связывание ан-тигенраспознающего рецептора, что отражает более важную функциональную значимость реакций второго типа и их более надежную защиту в целостном организме.

ВЫВОДЫ

1. Результаты оценок состояния СОЗ- и СБ2-зависимых путей активации лимфоцитов детей с иммунологической недостаточностью, позволяют выделить четыре категории нарушения активации Т-клеток:

• с нормальным ответом на связывание комплекса СОЗ-ТсЯ (классическая активация) и на адгезивные стимулы (альтернативная стимуляция) - ЛПС, бронхиальная астма, ревматизм, неспецифический лимфаденит;

• с нормальным ответом на классическую активацию и пониженным на альтернативную активацию - хронические неспецифические воспалительные заболевания;

• с нормальным ответом на альтернативную и пониженным на классическую активацию - Синдром Вис-котта-Олдрича, комбинированный иммунодефицит, сочетанный с атаксиейтелеангиэктазией, нейтропе-ния;

• с нарушением обоих типов ответа Т-клеток - агам-маглобулинемия с дефектом В-клеток, общая вариа-бельнаяиммунная недостаточность, агаммаглобули-немия с нормальным или повышенным 1яМ.

I. В сыворотоках детей с первичными и вторичными им-мунодефицитными состояниями не содержится ингиби-рующих факторов, подавляющих активацию МНПК здоровых доноров через рецепторный комплекс; при ЛПС в сыворотке выявлена активность, подавляющая

альтернативную активацию; добавление сывороток детей с АГГ, ОВИН, ArcIgM может усилить пролиферацию.

3. Изучение последствий действия однократного (у ликвидаторов аварии на ЧАЭС) или длительного ^населения районов,загрязненных радионуклидами)*позволило выявить 2-3 кратное угнетение ответа на CD3 и ФГА и полную отмену ответа на адгезивные стимулы.

4. Сыворотки крови ликвидаторов и жителей территорий,сильно загрязненных радионуклидами, подавляет пролиферацию Т-клеток под действием а-СШ и ФГА и не влияет на альтернативную активацию. Выраженность ингибирующего эффекта зависит отстепени лучевой нагрузки.

5. При облучении крови in vitro здоровых доноров в большей степени поражается ответ на адгезивные стимулы, который полностью отменяется при дозах 4 и 8 Гр при которых ответ на ФГА и антитела к CD3 снижается лишь частично. Do, расчитанное для классической активации составляет 8,438, для альтернативной - 4,647. Степень ослабления активации Т-клеток по классическому пути после облучения in vitro выражена слабее, чем в отдаленные сроки после действия in vivo значительно меньших доз радиации.

6. Облучение крови здоровых доноров в дозах 1 и 4 Гр не влияет на экспрессию молекул CD2, CD3, CD4, CD8, CD25 и CD95. При дозе 8 Гр уменьшается доля клеток, экспрессирующих CD25 при активации ФГА, а также число клеток, несущих рецептор апоптоза fas (CD95).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Никонова М.Ф., Литвина М.М., Кондратенко И.В., Оценка функциональной активности Т-лимфоцитов периферической крови здоровых доноров с помощью моноклональных антител; Тезисы докл. I съезда иммунологов России, 1992 г., стр.333.

2.Яковлева Н.Н., Сокуренко С.И., Литвина М.М., Никонова М.Ф., Особенности классического и альтернативного путей активации Т-лимфоцитов у больных хроническим бронхитом; Тезисы докл. I съезда иммунологов России, 1992 г., стр. 579.

3. Никонова М.Ф., Ярилин А.А., Литвина М.М., Кондратенко И.В., Яковлева Н.Н., Изучение активации по классическому и альтернативному путям лимфоцитов крови здоровых людей; "Иммунология", 1992 г., № 5, стр. 20-24.

4. Асташкин Е.И., Ходорова А.Б., Сурин A.M., Фрезе К.В., Литвина М.М., Никонова М.Ф., Изучение влияния моноклональных антител против СОЗ-кластера, коклюшного токсина и конкава-лина А на концентрацию свободных йонов Са2+ в цитоплазме клеток; "Биологические мембраны", 1992 г., т.9. № 10-11, стр, 1018-1021,

5.Яковлева Н.Н., Никонова М.Ф., Литвина М.М., Мартин Ю.В., Ярилин А.А., Сокуренко С.И., Состояние классического и альтернативного путей активации Т-лимфоцитов при хроническом бронхите; "Иммунология", 1994г., № 1, стр.22-26.

i.M.Litvina, M.Nikonova, A.Yarilin, Y.Martin, N.Yakovleva, The evaluation of CD2 and CD3 molecules role in T-cell activation in pathology, Europeen congress of immunology, 1994, Barcelona, Spane.

M.V.Oradovskaya, N.V.Ulyanova, I.D.Fadeeva, M.F.Nikonova, M.M.Litvina, N.I. Choroshilova, M.Lavdovskaya, et. al., Immunotherapy approaches to immunorehabilitation of people of Bryansk territory containing 137Cs; abst., International jornal of immunorehabilitation, p.260.

!.A.A.Yarilin, M.F.Nikonova, N.N.Yakovleva, M.M.Litvina, The failure of T-cell activation throught alternative pathway as a criterion of chronical bronchitis activity; abst., International jornal of immunorehabilitatiob, p.31.

9.Е.Г.Сирина, М.МЛитвина, М.Ф.Никонова, А.А.Ярилин, Осо бенности активации тимоцитов и их фракций по классическому i альтернативному путям; "Иммунология", 1994, стр,18-22.

Ю.М.М.Литвина, М.Ф.Никонова, А.А.Ярилин, Состояние класси ческого и альтернативного путей активации Т-лимфоцитов у ли квидаторов последствий аварии на ЧАЭС; Радиационная биоло гия. Радиоэкология, 1994г., т.34, вып.4-5, стр.598-602.

1 l.I.V.Oradovskaya, I.D.Fadeeva, N.V.Ulyanova,M.M.Litvina et.al. Six-year observation of immune state of persons affected by th Chernobyl accidend; Radiation protection dosimetry, vol.62, № 1/2 pp. 63-67, 1995, Nuclear technology publishing.

12.A.A.Yarilin, N.I.Sharova, M.M.Litvina, O.I.Kuzmenok, N.I.Kot chergina, M.F.Nikonova, N.P.Savina, The role of the thymus in th appearance of immunologic effects of low dose irradiation; Radiatioi protection dosimetry, vol.62, № 1/2, pp.77-79, 1995.

13. А.А.Ярилин, Н.И.Шарова, М.Ф.Никонова, О.И.Кузьменок Н.И.Кочергина, М,М,Литвина, Л.Д.Титова, И.В.Орадовская Комплекс методов оценки состояния тимуса и тимусзависимог. звена иммунной системы человека при действии радиационное фактора; в кн. "Экологическая экология", Р.М.Хаитов, Б.В.Пи негин, Х.И.Истамов, ВНИРО, М., 1995, с.132-145,

14. А. АЛрилин, Н.И.Шарова, О.И.Кузьменок, А.Н.Митии М.Ф.Никонова, М.М.Литвина, Изменения в иммунной систем пострадавших от действия факторов аварии на ЧАЭС. Проявле ния, природа, возможные последствия; Радиационная биология Радиоэкология, т.36, вып.46, стр.587-600.

«6