Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Ассоциированные с повреждением ДНК лейкоцитов изменения иммунного статуса у больных с вторичными иммунодефицитами

На правах рукописи

КИЗЕНКО Г 1 О ОД

Олеся Анатольевна

- 7 окт ьзз

АССОЦИИРОВАННЫЕ С ПОВРЕЖДЕНИЕМ ДНК ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗМЕНЕНИЯ ИММУННОГО СТАТУСА У БОЛЬНЫХ С ВТОРИЧНЫМИ ИММУНОДЕФИЦИТАМИ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ка соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 1999

Работа выполнена во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения Минздрава Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор А. В. Караулов Научный консультант:

доктор биологических наук Е. Ю. Москалева Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л. П. Алексеев доктор биологических наук, профессор В. П. Кузнецов

Ведущая организация: НИИ Физико-химической медицины МЗ РФ

диссертационного совета Д 074.09.01 при ГНЦ Институте иммунологии Минздрава

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ Института иммунологи МЗРФ.

Защита состоится

России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

Автореферат разослан«

я

1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л. С. Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Врожденная или приобретенная недостаточность иммунологических механизмов защиты организма приводит к нарушению функционирования отдельных звеньев иммунной системы, появлению инфекционных осложнений, аутоиммунной патологии, аллергических заболеваний.

В настоящее время сложились условия для перехода от эмпирических исследований к патогенетическому подходу изучения вторичных иммунодефицитных состояний, выявления механизмов иммунологических процессов и оценке их роли в этиопатогенезе конкретных заболеваний. Такой подход подразумевает комплексное изучение различных функций, реализуемых иммунокомпетентными клетками в процессе иммунного ответа, каковыми являются: распознавание, активация, пролиферация, дифференциров-ка и регуляция. Полноценная реализация функций иммунокомпетентных клеток во многом определяется их генетической стабильностью. Генетическая стабильность может быть охарактеризована состоянием структуры ДНК лимфоцитов и их способностью к репарации ДНК.

Впервые теоретическое обоснование возможной роли повреждений ДНК в развитии иммунодефицитных состояний было сделано G. Harris (1982, 1985) при изучении многих наследственных заболеваний с дефектами репарации ДНК.

За последние годы в литературе накоплены экспериментальные данные о роли повреждений ДНК лимфоцитов периферической крови в развитии вторичных иммунодефицитных состояний при различных заболеваниях. А. В. Карауловым и Е. Ю. Москалевой было обнаружено значительное снижение способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК и повышение спонтанного репаративного синтеза ДНК при неспецифических заболеваниях легких, остром инфаркте миокарда, рассеяннном склерозе.

Также было показано, что свежевыделенные ядросодержащие клетки крови здорового человека практически не содержат спонтанных разрывов ДНК и могут быть использованы для индикации различных воздействий.

При заболеваниях, сопровождающихся снижением способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК (неспецифических заболеваниях легких, остром инфаркте миокарда, рассеянном склерозе) обнаружено и накопление повреждений в ДНК этих клеток. Аналогичные повреждения обнаружены и при иммунизации здоровых . добровольцев (Караулов. 1991).

Снижение способности лимфоцитов к репарации ДНК и накопление повреждений в ДНК лимфоцитов периферической крови человека при заболеваниях рассматривается как один из неизвестных ранее механизмов нарушения функций иммунокомпетентных клеток, приводящих к формированию временной иммунологической недостаточности у человека.

В связи с этим представляется крайне актуальным исследовать, насколько широко данное явление встречается при социально значимых заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЦЕПЬЮ работы является изучение повреждений ДНК по скорости щелочной денатурации ДНК лейкоцитов периферической крови и их способности к репарации ДНК в

>

сравнении с оценкой иммунного статуса у больных с различными заболеваниями, часто сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний: при бруцеллезе, при гнойно-септических осложнениях у хирургических больных и при вирусном гепатите В.

ЗАДАЧИ исследования:

1. Исследование и оценка показателей иммунного статуса;

2. Оценка способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК;

3. Изучение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови по скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток у больных при хроническом бруцеллезе, при гнойно-септических осложнениях у хирургических больных и у больных вирусным гепатитом В.

4. Проведение сравнительного анализа влияния иммунокорректоров, используемых при лечении больных хроническим бруцеллезом, по исследуемым показателям скорости щелочной денатурации ДНК ЛПК и их способности к репарации ДНК лимфоцитов в сравнении с классическими показателями иммунного статуса.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Новизна работы заключается в новом подходе к проблеме изучения механизмов развития вторичной иммунологической недостаточности с использованием параметров генетической стабильности иммуннокомпетентных клеток.

Впервые показано, что при инфекционных заболеваниях, сопровождающихся развитием иммунодефицитных состояний, — у больных хроническим бруцеллезом, у хирур-

гических больных с гнойно-септическими осложнениями и у больных с вирусным гепатитом В — наблюдаются вырыженные нарушения структуры ДНК лейкоцитов периферической крови, что позволяет рассматривать скорость щелочной денатурации ДНК D как важный прогностический признак при оценке иммунного статуса.

Обнаружена эффективность тимогексина при использовании в качестве иммуно-корректора у больных хроническим бруцеллезом, выявлена его способность повышать генетическую стабильность лимфоцитов in vivo и in vitro и защитное действие тимогексина в отношении перекисных соединений, отмечена высокая клиническая эффективность этого рпепарата, оцениваемая по исчезновению основных симптомов болезни. Использование бруцеллезной вакцины при лечении хронического бруцеллеза, напротив, приводило к сохранению низких показателей клеточного иммунитета.

Попученныо результаты свидетельствуют о том, что изученные показатели — скорость щелочной денатурации ДНК лейкоцитов D и способность лимфоцитов к репарации ДНК — могут быть использованы для регистрации антигенных иммунотоксических нагрузок о клинической и экологической иммунологии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Теоретическое и практическое значение работы заключается:

1. В разработке новых подходов в исследовании механизмов развития вторичной иммунологической недостаточности при бруцеллезе, хирургических больных и при вирусном гепатите В, основанных на определении повреждений в структуре ДНК ЛПК и их способности к репарации ДНК.

2. В установлении взаимосвязи между определяемыми показателями генетической стабильности лимфоидных клеток и клиническими проявлениями вторичной иммунологической недостаточности.

3. В оценке прогностической значимости исследуемых показателей у хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями и у больных с вирусным гепатитом В.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

, 1. При изученных заболеваниях, сопровождающихся вторичными иммунодефицит-ными состояниями, обнаруживаются повреждения структуры ДНК лимфоцитов и гра-нулоцитов периферической крови и снижение способности лимфоцитов к репарации1 ДНК.

2. Действие тимогексина в качестве иммуномодулятора при бруцеллезе, в отличие от лечебной бруцеллезной вакцины, повышает генетическую стабильность лимфоцитов in vivo и in vitro, оцениваемую по степени повреждения ДНК, способствует быстрому и эффективному восстановлению иммунного статуса.

3. Сопоставление степени изменения величины D и показателей клеточного иммунитета при гнойно-септических осложнениях хирургических заболеваний и при вирусном гепатите В позволяет заключить, что снижение величины D в лимфоцитах и грану-лоцитах периферической крови коррелирует с тяжестью клинического состояния в большей степени, чем снижение субпопуляций CD4*-лимфоцитов и ммунорегуляторного индекса.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы работы докладывались и обсуждались на: II Всесоюзном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии» (Самарканд, 1S91); на I Всесоюзном симпозиуме «Повреждение генома клетки» (Ивано-Франковск, 1S91); Московском научном обществе иммунологов (Москва, 1992, 1997); на IV Международном конгрессе «Иммунореабилитация и реабилитация в медицине» (Сочи, 1998); на X Международном конгрессе иммунологов (Дели, 1998).

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Изложена на 111 страницах, содержит 16 таблиц и иллюстрирована 5 рисунками. Список литературы включает 190 наименований, в том числе 79 отечественных и 111 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено клинико-иммунологическое обследование, а также изучена структура ДНК лимфоцитов и их способность к репарации ДНК у 34 больных с различными фор-

мами хронического бруцеллеза в стадии суб- и декомпенсации. Длительность болезни составляла от 1 до 15 лет и характеризовалась рецидивирующим течением с частыми обострениями. Наряду с клинико-анамнестическими данными диагноз бруцеллеза был подтвержден с помощью комплекса серологических методов реакций Хедельсона, Райта, Кумбса, пассивной гемагглютинации, а также внутрикожной аллергической пробы Бюрне.

Обследовано 23 хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями. Из них были: 16 пациентов с острым разлитым гнойным перитонитом (ОРГП), 4 — с сепсисом, 3 — с абсцессами брюшной полости. Возраст больных варьировал от 15 до 67 лет, из них было 9 женщин и 14 мужчин. Причинами возникновения сепсиса были острый деструктивный аппендицит и гинекологические заболевания. При микробиологическом исследовании раневого отделяемого был обнаружен рост бактерий следующих видов: гемолитический эпидермальный стафилококк, негемолитический эпидермаль-ный стафилококк, золотистый стафилококк, зеленящий стрептококк, энтерококк, кишечная палочка, синегнойная палочка, клебсиела окситока и сочетание различных типов перечисленных выше микроорганизмов.

Изучена структура ДНК лейкоцитов и иммунный статус 39 больных с разными клиническими формами вирусного гепатита В (ВГВ). Среди них было обследовано 11 больных с острым ВГВ, 7 больных с хроническим персистирующим ВГВ, 14 — с хроническим активным ВГВ и 7 больных с циррозом печени, развившемся в результате ВГВ. Возраст больных колебался от 21 года до 50 лет, составив в среднем около 33 лет.

Контрольную группу составили 56 практически здоровых людей (доноров).

Момонуклеарные лейкоциты и нойтрофилы из периферической крови человека выделяли по методу Воуит (1968).

Анализ суйпогтуляций лимфоцитов проводили при помощи проточного цитофлюори-метра — анализатора и сортировщика клеток EPICS-C (Coulter Etectronics, Florida, USA).

Определение иммуноглобулинов проводили при ломощи спектрофотометричес-кого метода (Чиркин В. В. ссоавт. 1990).

Определение способности лимфоцитов периферической крови человека к репарации ДНК оценивали по соотношению величин индуцированного УФ-облучением и спонтанного репаративного синтеза ДНК. Для этого свежевыделенные лимфоциты суспендировали о среде Хенкса и делили суспензию на две части (2-6x10* клеток в 1 мл), одну из которых облучали УФ-светом от лампы БУФ-30 в дозе 100 Дж/мг, а другук) использовали для определения спонтанного репаративного синтеза ДНК. Спонтанный репаративный синтез и УФ-индуцированный оценивали в имп/мин/10" клеток или' в имп/мин/мкг ДНК. После этого рассчитывали способность лимфоцитов к репарации

ДНК по отношению удельной радиоактивности ДНК УФ-облученных клеток к удельной радиоактивности контрольных клеток и выражали в условных единицах.

Исследование структуры ДНК клеток с помощью прямого флюоресцентного метода с бромистым этидием в качестве флюорофэра (ßimboim H. С. 1981 ; Thierry. 1985). При этом оценивали скорость щелочной денатурации ДНК в процентах ДНК, остающейся в форме двунитиевой ДНК (дДНК) через 1 час инкубации лизата клеток при 15°С после установления денатурирующего значения pH 12,8 в течение 30 минут при 0°С, что рассчитывается по формуле: D = (Р-В)/(Т-В) х 100%, где: В — фоновая флюоресценция проб,'которая позволяет оценить вклад всех других флюоресцирующих компонентов, кроме двунитиевой ДНК, включая и свободными бромистый этидий, в общую флюоресценцию: определяемая после обработки лизатов ультразвуком и щелочью (pH 12.8) для полной денатурации ДНК, Т — полная флюоресценция, определяемая двунитиевой ДНК и флюоресцирующими примесями без обработки щелочью, Р — флюоресценция, определяемая долей ДНК, остающейся в форме двунитиевой ДНК после щелочной денатурации, и флюоресцирующими примесями. Величина О определяется количеством однонитиевых разрывов и щелочелабильных сайтов, которые в процессе щелочного лизиса превращаются в разрывы. Флюориметрию проводили на флюори-метре «Jasco FP 550» при длине волны возбуждения 520 нм. и длине волны эмиссии 590 нм.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы «Origin». Достоверными считали различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Показатели клеточного иммунитета и генетической стабильности лейкоцитов периферической крови больных хроническим бруцеллезом

Показатели клеточного иммунитета и генетической стабильности клеток исследовали у 34 больных хроническим бруцеллезом.

У больных хроническим бруцеллезом при поступлении в клинику отмечены незначительная лимфопения, снижение абсолютного количества B-лимфоцитов, абсолютного и относительного количества Т-хелперов (субпопуляции С04'-лимфоцитов) и ИРИ, а относительное количество Т-лимфоцитов (CD2* субпопуляция) было несколько выше нормы. При сравнении групп больных, не получавших и получавших в процессе лечения бруцеллезную лечебную вакцину (БЛВ) в течение года, наиболее глубокие изменения иммунограммы отмечены у больных, которые получали БЛВ за несколько месяцв( до поступления в клинику, табл. 1, 2.

Показатели клеточного иммунитета у больных хроническим бруцеллезом

Группа обслэдованных Лейкоциты, ю'/л Лимфоциты Субпопуляции лимфоцитоа

% 10*/л С02* СР20* С04* сра' ИРИ

Больные хроническим бруцеллезом (п=34) 6,4±0,2 26,4±1,7 1,69±0,13 60.2t1.4-1,34±0,01 0,14±0,01' 34.0±*. .5* 0,55±0,05" 28.2±1.3 0,48±0,05 1,3±0,08*

Здоровые добровольцы (п=15) 5,910,2 33,9±1,3 2,0±0,1 73.9±2.2 1,55±0,04 о,18±о,ог 40,2±1,4 О,04±О,ОЗ 26,911.7 0,56±0,03 1,6±0,1

Примечание. В числителе - относительное содержание (в%), в знаменателе абсолютное содврнажнив(10*/л).

•р<0,01.

Таблица 2

Показатели клеточного иммунитета у больных хроническим бруцеллезом в зависимости от методов лечения (в числителе относительное, в знаменателе — абсолютное количество клеток)

Группа обследованных больных до лечения Лейкоциты, Ю'/л Лимфоциты Субпопуляции лимфоцитов

% Ю'/Л С02' С020' С04* сое* ИРИ

Больные хроническим бруцеллезом (п=34) получавшие БЛВ 6,2±0,2 5,8±0,3 23.5±0,3 29,3±1,1 1,60±0,09* 1,бо±о,оа* 81.6±0.9 1,40±0,07 ш&л 1,23±0,07* £¿±£15 0,09±0,03 0,13±0,03 0,50±0,04 0,52±0,05* 0,50±0,04 28.0±0.6 0,43±0,01* 1,0±0,01 1,5±0

не получавшие БЛВ

Здоровые добровольцы (п=15) 5,Э±0,2 33,9±1,3 2,0±0,1 1Ш2Л 1,55±0,04 ши 0,18±0,02 40.2±1.4 0,84±0,03 0,56±0,03 1,6±0,1

Примечание. В числителе — относительное содержание (в %), в знаменателе абсолютное содернажние (10°/л).

*р<0,01.

Наряду с исследованием иммунного статуса у больных хроническим бруцеллезом оценивалась способность лимфоцитов к репарации ДНК и структура ДНК лимфоцитов периферической крови.

Как видно из данных габл. 3, скорость щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гранулицитов, выражаемая в процентах ДНК, остающейся в виде дДНК через 1 час инкубации лизатов при рН 12,8 — величина О, — у здоровых доноров принята за 100%, в то время, как у больных хроническим бруцеллезом этот показатель составил для. лимфоцитов 79,2% и для. нейтрофоллов 90,9%. У этих пациентов достоверно снижена способность лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК. Таким образом увеличение скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов, и, в меньшей мере, нейтрофилов, а также снижение способности ЛПК к репарации ДНК, свидетельствует о наличии повреждений ДНК в лейкоцитах крови больных хроническим бруцеллезом.

1 *

Таблица 3

Способность лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК и скорость щелочной денатурации ДНК-лизатов лейкоцитов больных хроническим бруцеллезом

Контингент обследуемых лиц Способность лимфоцитов к репарации ДНК <%) Скорость щелочной денатурации ДНК (%) лимфоцитов Скорость щелочной денатурации ДНК (%) нейтрофилов

Здоровые доноры 100+6,7 100+1,8 100+5,6

Больные хроническим бруцеллезом 40,0+6,7 79,2+4,1 90,9+1,9

Примечание: р < 0,05

Такое снижение генетической стабильности лимфоцитов может вызываться как медиаторами воспаления, так и посредством действия различных антигенов на иммунные клетки (Караулов А. В., Москалева Е. Ю. 1991). Эти антигенные воздействия индуцируют окислительный взрыв при взаимодействии с моноцитами, макрофагами и нейтро-филами (Москалева Е. Ю., Федоров А. Н. 1985 г.). Поэтому было проведено исследова-

8

ние влияния бруцеллезной лечебной вакцины на структуру ДНК лейкоцитов, т. к. эта фракция крови содержит много клеток, способных развивать окислительный взрыв. Кроме того было исследовано влияние очищенного белкового антигена и ЛПС бруцел-лы на структуру ДНК лимфоцитов как возможных агентов, индуцирующих изменения в структуре ДНК клеток крови человека при их активации.

Как следует из рис. 1, in vitro лечебная бруцеллезная вакцина индуцирует повреждения ДНК лейкоцитов, пропорциональные количеству добавленных микробных тел. Из рис. 2 следует, что очищенный белковый антиген, но не ЛПС, вызывает изменения структуры ДНК лимфоцитов. Данные этих экспериментов позволяют полагать, что именно длительная персистенция антигена бруцеллы в организме человека при хронической инфекции может приводить к изменению структуры ДНК лимфоцитов и нейтро-фмлов и к появлению таких клеток в периферической крови человека. Обнаруженные изменения показателей клеточного иммунитета и лабилизация структуры ДНК лимфоцитов и снижение способности лимфоцитов к репарации ДНК в сочетании с клиническими данными позволяют считать целесообразным введение в схему комплексной терапии хронического бруцеллеза иммуномодуляторов.

И ммуинореабилитмрующее действие тимогексина при лечении больных хроническим бруцеллезом

Следующим разделом работы явилось изучение иммунокоррегирующее влияние синтетического гексапептида тимогексина на клеточное звено иммунитета. У части пациентов было проведено исследование структуры ДНК лимфоцитов и нейтрофилов, а также способности лимфоцитов к репарации ДНК до и поело окончания курса терапии с использованием тимогексина.

Тимогексин вводили больным подкожно в дозе 100 мкг 1 раз в 3 дня в течение 3-х недель. После окончания лечения с применением тимогексина отмечено увеличение количества CD2*-, CD20*-лимфоцитов и С04+-лимфоцитов и ИРИ до уровня нормы (табл. 4). При этом тимогексин был эффективен, как у больных, получавших БЛВ, так и улиц, не получавших этой вакцины.

При исследовании влияния тимогексина на структуру ДНК лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови нами обнаружена нормализация этих показателей после завершения курса патогенетической терапии с использованием тимогексина (табл. 5).

Логарифм количества убитых микробных тел

Рис. 1. Повреждение ДНК лейкоцитов под действием лечебной бруцеллезной вакцины

Рис. 2. Изменение структуры ДНК лимфоцитов человека через 3 часа инкубации с белковым а! тигеном бруцеллы (2) и ЛПС бруцеллы (3) по сравнению с контрольными клетками (1). Концен рация белкового антигена бруцеллы и ЛПС 1 мгк/мл

Показатели клеточного иммунитета у больных хроническим бруцеллезом после комплексной терапии с использованием ти-могексина (А0±т)

Группа обследованных Лейкоциты, Лимфоциты Субпопуляции лимфоцитов

больных до лечения 10*/Л

% 10> С02* С020* С04* С08* ИРИ

Больные по- получавшие 6,3±0,2 34,7±1,3 2,2±0,1 60,611,0* 7,512,1 36,2±1.7 1,0±0,01

сле лечения с БЛВ 1,90±0,10 0,16±0,02 0,90±0,06 0,50±0,03

использва- не получав- 6,9±0,2 34,5±2,3 2,4±0,1 79,9:12,0 44.1±1.3 2б,1±1.0 1,5±0

нием ТГ шие БЛВ 1,85±0,08 0,16±0,02 0,95±0,07 0,63±0,03

(п=34) получавшие 6,2±0,3 32,6±1,3 2,1±0,2 80,5±1,2 43.7±0,2*" 24.0±2.5 1,6±0,1

Инд 1,9±0,1** 0,17±0,01* 0,99±0,99" 0,70±0,05

Здоровые добровольцы 5,9±0,2 33,9±1,3 2,0±0,1 73,9±2,2 ш 40.2±1.4 Ш2±И 1,6±0,1

(п=15) 1,55±0,04 0,18±0,02 0,84±0,03 0,56±0,03

Примечание. Звездочки — различия достоверны (р < 0,05): одна — по сравнению с нормой, две — по сравнению с исходным уровнем, а три — по сравнению с контролем. В числителе относительное, в знаменателе абсолютное количество клеток.

Способность лейкоцитов периферической крови к репарации ДНК и скорость ее щелочной денатурации до и поело лечения тимогексином больных хроническим бруцеллозом

Больные хроническим бруцеллезом (п=34) Способность лимфоцитов к репарации ДНК (%) Скорость щелочной денатурации ДНК лимфоцитов (%) Схорость щелочной денатурации ДНК нейтрофилов <%)

До лечения 40,0+6,7* 79,2+4,1* 90,9+1,9

После лечения 80,7+13,3 105,7+4,2 88,4+4,1

Примечание: * - р < 0,05

0 10 20 30 40 50

Концентрация пероксида водорода, мкМ

Рис. 3. Влияние тимогексина на структуру ДНК лимфоцитов при повреждении ДНК под действием пероксида водорода. 1 - инкубация клеток в присутствии пероксида водорода; 2 - инкубация клеток в присутствии пероксида водорода после преинкубации с тимогексином

Лабилизацию структуры ДНК лимфоцитов могут вызывать различные антигенные воздействия, индуцирующие окислительный взрыв при взаимодействии с моноцитами, макрофагами и нейтрофилами. Принято считать, что именно интермедиа™ окислительного стресса являются мощнейшими эндогенными факторами, ответственными за повреждения ДНК. Поэтому в модельных экспериментах было исследовано защитное действие тимогексина при повреждении ДНК лимфоцитов перекисью водорода.

Полученные результаты представлены на рис 3.

Как следует из этих данных, присутствие тимогексина защищает ДНК лимфоцитов при воздействии низких концентраций перекиси водорода (до 50 мкМ). Обработка клеток тимогексином повышает их защитный потенциал, оцениваемый по степени повреждения ДНК.

Таким образом, обнаружена эффективность тимогексина при его использовании в качестве иммунокорректора у больных хроническим бруцеллезом, способность этого препарата повышать генетическую стабильность лимфоцитов in vivo и in vitro, отмечена высокая клиническая эффективность тимогексина, оцениваемая по исчезновению основных симптомов болезни, компенсации процесса и восстановлению работоспособности.

Исследование иммунного статуса и генетической стабильности лейкоцитоз периферической крови у хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями

Целью настоящего раздела работы явилось исследование лабилизации структуры ДНК лимфоцитов и гранулоцитоз в сравнении с классическими показателями иммунологической недостаточности у хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями.

При анализе полученных результатов для сопоставления степени повреждения ДНК иммунокомпетентных клеток с тяжестью иммунологических нарушений обследованные больные были разделены на две группы (табл. 6). К 1 -й группе отнесены больные, величина D для ДНК лимфоцитов которых была ниже 75 усл. ед., а ко 2-й группе — пациенты, у которых этот показатель был выше 75 усл. ед. Значение D, равное 75 усл. ед., выбрано как пограничное для деления больных на две группы, т, к. это значение соответствует минимальным изменениям величины D лимфоцитов, обнаруженным ранее при иммунизации добровольцев и активации лимфоцитов in vitro. Снижение величины Д до 75% следует рассматривать как настораживающее изменение, а до 65% и ниже —

свидетельствует о действии эндогенных или экзогенных генотоксических факторов (Москалева Е. Ю. и соавт. 1993).

Анализ иммунологических показателей и клинического состояния этих больных выявил следующее.

В 1-й группе (О лимфоцитов < 75) оказались больные с наиболее грозными гнойно-септическими осложнениями: острым разлитым гнойным перитонитом в реактивной или токсической фазе, сепсисом и местным перитонитом (табл. 7,8).

Во 2-й группе (О лимфоцитов > 75) оказались те же больные в период выздоровления и больные хирургического профиля без гнойно-септических осложнений.

Отмеченные существенные изменения иммунограммы, позволяют и ту, и другую группу отнести к больным с иммунодефицитным состоянием (ИДС), но в 1 -й группе отмечены более глубокое понижение относительного и абсолютного количества С04'-лимфоцитов, ИРИ и повышение концентрации (дв в сыворотке.

Из сопоставления изменений величины О лейкоцитов периферической крови с показателями клеточного иммунитета при различных формах гнойно-септических осложнений (табл. 8) можно заключить, что большая степень лабилизации структуры ДНК иммунокомпонентных клеток имеет место при наиболее тяжелых формах осложнений, сопровождающихся токсическими реакциями и наиболее глубокими изменениями показателей клеточного и гуморального иммунитета.

Таблица 6

Скорость щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гракулоцитов О у хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями в группе 1 (Д лимфоцитов < 75) и 2 (Д лимфоцитов > 75)

Группа больных Структура ДНК, О, усл. ед.

Лимфоциты Гранулоциты

1 -я (п=22) 60,7±1,7* 69,6±2,2*

2-я (п=23) 87,9±1,4 85,6*1,6

Здоровые доноры 81,9±1,0 88,8±4,8

- отличия от уровня нормы достоверны (р < 0,05)

Показатели клеточного иммунитета у хирургических больных с гнойно-септичосхими осложнениями, разделенными в зависимости от величины О на группу «риска» 1 (О лимфоцитов < 75) и благополучную группу 2 (О лимфоцитов > 75)

Группа наблюдения Лейкоциты, Ю'/л Лимфоциты, % Субпопуляции лимфоцитов, %

С02 С020 С04 С08 ИРИ

1-я (п=22) 11,0±0,9* 18,0±1,2* (1,9±0,2) 71,6±2,4 (1,35±0,13) 8,2±1,0 (0,15±0,02) 32,8±2,3* (0,62±0,05)* 25,8±1,6 (0,50±0,05)* 1,4±0,2

2-я (п=23) 9,5±0,4* 17,2±0,9* (1,6±0.1) 79,7±1,8 (1,23±0,06) 5,9±0,6* (0,08±0,01)* 41±2,4 (0,60±0,33)* 26,6±1,6 (0,41±0,04)* 1,8±0,2

Здоровые доноры (п=56) 5,9±0,2 33,9±2,2 (2,0±0,1) 73,9±2,2 (1,50±0,04) 8,6±0,7 (0,18±0,02) 40,2±1,4 (0,84±0,03) 26,9±1,7 (0,56±0,03) 1,6±0,1

Примечание. В скобках указано абсолютное количество клеток в Ю'/л. * - отличия от уровня нормы достоверны (р < 0,05)

Скорость щелочкой денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гранулоцитов и показатели клеточного иммунитета у хирургических больных с разными формами гнойно-септических осложнений

Группа наблюдения Структура ДНК, О, усл.ед. Субпопуляция лимфоцитов, %, усл.ед.

лимфоциты гранулоциты С02 СС120 СР4 сэа ИРИ

Местный перитонит (п=6) 72,3±4,7 75,7±2,9 74,5±2,9 8,2±1,5 31,4±4,5 26,6±2,5 1,5±0,3

ОРГП (п=10) 65,6±4,0* 70,2±5,3* 67,2±5,9 7,9±1,8 32,3±1,7* 23,1±2,2 1,4±0,2

Сепсис(п=4) 57,8±5,4* 54,0±9,1* 74,8±5,0 5,2±1,0* 30,0±4,3* 34,2±4,4 0,9±0,1*

Здоровые доноры (п=56) 81,9±1,7* 88,8±4,8 73,9±2,2 8,6±0.7 40,2±1,4 26,9±1,7 1,6±0,1

* - отличия от уровня нормы достоверны (р < 0,05)

Так, в случае местного перитонита степень лабилизации структуры ДНК незначительна (D лимфоцитов — 72,3±4,7 усл. ед. и D гранулоцитов — 75,7±2,9 усл. ед.) и соответствует уровню изменений, наблюдаемых при активации лимфоцитов митогенами in vitro или причумеренной антигенной нагрузке, например, при иммунизации in vivo или при остром инфаркте миокарда (Москалева Е. Ю. 1988). В случае же ОРГП (D лимфоцитов — 65,6±4,0 и D гранулоцитов — 70,2±5,3 усл. ед.) и сепсиса (D лимфоцитов — 57,8±5,4 усл. ед. и D гранулоцитов — 54,0±9,1 усл. ед.) скорость щелочной денатурации ДНК лизатов возрастает и величина D снижается до 66,6 усл. ед. и 57,8 усл. ед., соответственно. У этих же больных отмечено наиболее существенное снижение субпопуляции С04'-лимфоцитов и ИРИ. При сепсисе также отмечено уменьшение содержания В-лимфоцитов до 5,2±1,0%, в то время как у здоровых доноров этот показатель составляет 8,6±0,7%, и умеренное увеличение уровня CD8*-лимфоцитов до 34,2±4,4%, в то время как в крови у здоровых доноров этот показатель составляет 26,9±1,7%. При этом в случае гнойно-септических осложнений обнаружены изменения структуры ДНК не только лимфоцитов, но и гранулоцитов периферической крови больных.

Полученные результаты позволяют рассматривать скорость щелочной денатурации ДНК (D) — параметр, используемый для оценки повреждений ДНК лимфоцитов периферической крови, — в качестве важного прогностического показателя при оценке иммунного статуса больных с тяжелыми токсическими осложнениями.

Исследование иммунного статуса и генетической стабильности лейкоцитов периферической крови у больных вирусным гепатитом В

При вирусном гепатите В (ВГВ) ядросодержащие клетки крови могут быть как непосредственным объектом действия вируса, так и испытывать действие токсических факторов вследствие развития гепатита, целью настоящей работы явилось исследование структуры ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови больных при разных клинических формах ВГВ в сравнении с показателями клеточного иммунитета.

Полученные результаты (табл. 9,10) позволяют заключить, что при различных клинических формах ВГ среднестатистические значения показателей клеточного иммунитета близки к нормо, хотя и имеется тенденция к понижению процентного содержания CD2'-, CD4*-, СО20*-лимфоцитов. В то же время у отдельных больных иммунограмма может быть глубоко измененной. При циррозе печени обнаружено снижение всех субпопуляций лимфоцитов, обусловленное лимфопенией.

Показатели клеточного иммунитета у больных с разными формами вирусного гепатита В. В скобках указано абсолютное количество клеток в 10'/п

Диагноз Лейкоциты 10*/л Лимфоциты, % Субпопуляция лимфоцитов, %

СОЗ С020 Сй4 сое ИРИ

овгв (п=11) 7,0±0,7 28,4±2,6 (2,03±0,22) 68,8±2,0 (1,41±0,15) 5,0±0,7 (0,10±0,01)* 36,4±3,1 (0.77+0,12) 24,8±1,8 (0,48±0,06) 1,6±0,2

ХПГВ (п=7) 7,1±1,4* 32,0±1,9 (2,47±0,55) 65,8±4,2 (1,83±0,44) 10,3±0,8 (0,24±0,05) 31,7±4,1 (0,85±0,24) 23,3±3,6 . (0,60±0,15) 1,5±0,2

ХАГВ (п=14) 6,4±0,7 35,4±2,2 (2,34±0,20) 65,2±4,0 (1,62±0,18) 7,3±0,8 (0,18±0,03) 38,8±2,5 (0,9±0,12) 26,1±1,3 (0,60±0,06) 1,6±0,2

ЦП (П=7) 5,2±0,6 32,1±5,0 (1,38±0,16)* 65,6±2,4 (0,81±0,16)* 8,5±1,3 (0,10±0,06)* 37,8±2,9 (0,46±0,06)* 26,2±3,1 (0,34±0,06)* 1,6±0,2,

Здоровые доноры 5,9±0,2 33,9±2,2 (2,0±0,1) 72,0±7,0 (1,50±0,04) 8,6±0,7 (0,18±0,02) 40,2±1,4 (0,84±0,03) 26,9±1,7 (0,56±0,03) 1,6±0,1

* - отличия от уровня нормы достоверны (р < 0,05)

Для лимфоцитов И гранулоцитов больных ВГ обнаружено увеличение скорости щелочной денатурации ДНК лизатов этих клеток, свидетельствующее о наличии повреждений в их ДНК (табл. 10). Наиболее глубокие повреждения ДНК обнаружены в ДНК гранулоцитов при циррозе Печени.

Таблица 10

Скорость щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гранулоцитов периферическом кропи больных разными формами вирусного гепатита В

Диагноз Структура ДНК, D, усл.ед.

Лимфоциты Гранулоциты

Здоровые доноры (п=56) 81,9±1,0 88,4±4,8

ОВГВ 72,8±4,3 71,2±2,9*

ХПГВ 68,9±4,6* 75,2±4,1

ХАВГ 75,7±1,8* 64,9±3,1*

ЦП 78,0±2,2 56,4±5,2*

* - р<0,05

Корреляционный анализ взаимосвязи исследованных показателей позволил заключить (табл. 11), что степень повреждения ДНК лимфоцитов (степень понижения величины D) коррелирует со снижением числа CD2'- и С04*-лимфоцитов, а также с уровнем повреждения ДНК гранулоцитов.

Таблица 11

Корреляция скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов (величины О) с изменением структуры ДНК гранулоцитов и показателями клеточного иммун-титэта при вирусном гепатите

Показатель Уравнение регрессии Значимость корреляции

D грвнулоцитоа у=0,31х± 48,73 р<0,05

СОЗ* у=0,26х±49,0 р=0,001

CD20" у=0,02х±7,25 р=0,58

CD4" у=0,24х± 18,11 р=0,02

CDQ* у=0,10х± 18,38 р=0,21

ПРИ у=0,004х± 1,227 р=0,51

Как и при анализе материала, полученного при исследовании структуры ДНК ЛПК хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями, обследованные больные были разделены на две группы: к первой отнесены больные, величина О для ДНК лизатов которых была ниже 75 ед., а ко второй — пациенты, у которых этот показатель был выше 75 ед. Оказалось (табл. 12), что как и при исследовании хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями, в 1-ю группу (О лимфоцитов < 75) попали больные с наиболее низким содержанием С02*-лимфоцитов и С044-лимфоцитов. Скорость щелочной денатурации ДНК лизатов гранулоцитов была так же увеличена и составила 62,3 ед. У больных второй группы величина О лимфоцитов и показатели клеточного иммунитета не отличались от нормы, а величина О гранулоцитов была существенно ниже нормы. Полученные данные свидетельствуют о более глубоком поражении гранулоцитов при ВГВ, чем при гнойно-септических осложнениях. Возможно, это связано с нарушением продукции синтезируемых печенью гранулоцитарно-макрофагальных факторов при гепатитах.

Таким образом, при различных формах ВГВ обнаружено повреждение структуры ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови, которые при этом заболевании отражают иммунотоксические процессы в большей степени, чем обычно используемые показатели состояния клеточного иммунитета.

Регистрируемые при изученных заболеваниях изменения в структуре ДНК лимфоцитов и их способности к репарации ДНК могут быть обусловлены токсическими воздействиями эндогенной природы, либо индуцироваться при взаимодействии бактериальных, вирусных, опухолевых или аугоантигенов с клеточной поверхностью. Возможно, что лабилиза-ция структуры ДНК лимфоцитов при заболеваниях определяется взаимодействием различных антигенов с Т-клеточным рецептором в процессе представления антигенов Т-клеткам. Действительно, при контакте Т-клеточных гибридом с иммобилизованными антителами к Т-клеточному рецептору (СОЗ-антитену) наблюдали фрагментацию ДНК клеток (СЬ.Ос1ака е! а1. 1990). С другой стороны наблюдаемые при вакцинации и заболеваниях изменения структуры ДНК могут быть следствием первых этапов акгивационного апоптоза лимфоцитов.

Появление апоптозных клеток в периферическом русле при заболеваниях может быть связано и с ограничением иммунного ответа путем элиминации отвечающих клонов цито-токсическими лимфоцитами. Первый механизм — активационный апоптоз, вызванный взаимодействием с антигенами, возможно, в контексте с МНС I и/или МНС 1!, — может иметь место в начале заболевания. Второй, связанный с ограничением иммунного ответа, — на его более поздних фазах. Действительно, при наблюдении нескольких больных ОВГВ в динамике заболевания скорость щелочной денатурации ДНК ЛПК (и гранулоцитоа) возрастала через 3 недели после поступления больных в клинику, когда токсические проявления

Таблица 12

Показатели клеточного иммунитета у больных ВГ в группах больных с разной скоростью щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов

Группа больных Скорость щелочной денатурации ДНК, О) усл. ед. Субпопуляция лимфоцитов, %

Лимфоциты Гранулоциты соз СР20 С04 Сй8 ИРИ

1-я(п=31) О <75 65,5±2,5* 62,3±3,4* 66,4±2,0 7,0±0,7 33,8±2,1* 26,2±1,9 1,4±0,1

2-я (п=29) Б >75 82,4±3,2 64,8±3,2* 72,5±1,5 7,0±1,0 40,3±2,9 26,0±1,5 1.6Ю.1

Здоровые добровольцы 81,9±1,0 88,4±4,8 73,9±2,2 1,55±0|04 8,6±0,7 0,18±0,03 40,2±1,4 0,84±0,03 26,9±1,7 0,56±0,03 1,6±0,1

- отличия от уровня нормы достоверны, р < 0,05

(уровень билирубина, активность АЛТ и ACT) снижались, что, по-видимому, можно рассматривать как косвенное подтверждение второго механизма.

Учитывая, что клетки, вступающие в апоптоз, кроме того быстро элиминируются фагоцитами и макрофагами (Hart S. Р. 1996), можно полагать, что наблюдаемое при заболеваниях возникновение повреждений в ДНК ЛПК действительно отражает появление клеток е состоянии апоптоза, или коммитированных к апоптозу.

Немаловажная роль в индукции повреждений ДНК лимфоцитов принадлежит АМК, сек-ротируемым моноцитами и гранулоцитами периферической крози при взаимодействии с антигенами и различными активаторами, особенно в очаге воспаления.

При активации окислительного взрыва в моноцитах и полиморфноядерных лейкоцита) in vitro эти клетки сами испытывают повреждающее воздействие АМК и в них, как было показано in vitro, накапливаются повреждения, регистрируемые по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК. Кроме того, in vitro гранулоциты могут погибать в результате индукции в этих клетках апоптоза по иммунным механизмам (Dramfield. 1994). Действительно, при большинстве изученных заболеваний наряду с повреждением ДНК лимфоци тов были обнаружены и повреждения ДНК гранулоцитов, что, по-видимому, может свиде тельствовать о наличии общих механизмов индукции повреждений в этих клетках, напри мер, при гнойно-септических осложнениях. В то же время у обследованных нами больны: циррозом печени обнаружены глубокие изменения в структуре ДНК гранулоцитов, xots изменения в структуре ДНК лимфоцитов у этих больных отсутствовали, несмотря на то что они регистрировались при хроническом гепатите.

Снижение способности ЛПК к репарации ДНК и накопление повреждений в ДНК ЛПК обнаруживаемые с высокой частотой при различных заболеваниях и описанные ране( лишь при экзогенных генотоксических воздействиях, являются новыми, не известным) ранее, молекулярно-биохимическими механизмами формирования иммунологическо! недостаточности и развития вторичных иммунодефицитных состояний.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы.

ВЫВОДЫ

1. У больных хроническим бруцеллезом обнаружено развитие иммунологической недо статочности, характеризующейся снижением абсолютного количества CD 20' лимфоцитов, абсолютного и относительного количества С04*-лимфоцитов, а также суще ственным снижением иммунорегуляторного индекса.

2 . При хроническом бруцеллезе у больных обнаружено снижение генетической сте бильности лимфоцитов, регистрируемое по снижению способности лимфоцитов к pens рации ДНК и по увеличению количества повреждений в ДНК лимфоцитов.

3. При хроническим бруцеллезе обнаружена эффективность тимогексина в качестве ммунокорректора и его способность повышать генетическую стабильность лимфоцитов ак при клиническом применении, так и в экспериментах in vitro.

4. У хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями обнаружены нару-юния клеточного и гуморального иммунитета, которые коррелируют с тяжестью заболе-ания, и Достоверное повышение уровня повреждений ДНК лимфоцитов и гранулоцитов ериферической крови. Степень повреждения ДНК лейкоцитов коррелирует с тяжестью сложнений.

5. При различных формах вирусного гепатита В среднестатистические значения пока-ателей клеточного иммунитета близки к норме, хотя и имеется тенденция к понижению роцентного содержания CD2*-, CD4*- и С020*-лимфоцитоо и только у отдельных больных бнаруживаются глубокие нарушения клеточного иммунитета.

6. При различных формах вирусного гепатита В обнаружены повреждения ДНК лимфо-итоз и гранулоцитов периферической крови, регистрируемые по увеличению скорости елочной денатурации ДНК лизатов клеток. Степень повреждения структуры ДНК лим-|Оцитов коррелировала с уровнем CD2*- и С04*-лимфоцитов и со степенью повреждения ,НК гранулоцитов.

7. Показатели генетической стабильности лимфоцитов и гранулоцитов периферичес-эй крови — скорость щелочной денатурации ДНК лейкоцитов и их способность к репа-ации ДНК — могут быть использованы в качестве тест-системы для регистрации анти-гнных иммунотоксических нагрузок и генотоксических воздействий в клинической и эко-эгической иммунологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Покровский В. И., Сулейманов А. К., Лебедев В. В., Кизенко О. А., Шмаров Д. И., Москалева Е. Ю., Караулов А. В.— Иммунореабилитирующее действие тимогексина при лечении больных хроническим бруцеллезом. Тер. архив, 1992,64, № 11, с. 22-26.

2. Чегин В. М., Брехов Е. И., Караулов А. В., Брыков В. И., Москалева Е. Ю., Хлюстина Е. М., Безобразова Л. В., Кизенко О. А.— Возможности прогнозирования гнойно-септических осложнений в абдоминальной хирургии. Тезисы докладов научной конференции «Гнойно-септические осложнения в неотложной хирургии». Черновцы, 1992, с. 8-9.

3. Сулейманов А. К., Желудков M. М., Кизенко О. А., Шмаров Д. И., Москалева Е. Ю., Караулов А. В.— Показатели клеточного иммунитета и генетическая стабильность ДНК лейкоцитов периферической крови больных хроническим бруцеллезом. Иммунология, 1993, №1,с. 52-54.

4. Москалева Е. Ю., Федоров Н. А., Кизенко О. А., Караулов А. В.— Повреждения ДНК лимфоцитови иммунодефицитные состояния. Вестник РАМН, 1993, №4, с. 12-17.

5. Караулов А. В., Москалева Е. Ю., Чегин В. М., Хлюстина Е. М., Безобразова Л. В., Кизенко О. А., Шмаров Д. А., Сидоренко И. В., Ликин В. Ф.— Структура ДНК лейкоцитоз периферической крови и иммунный статус хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями. Клинический вестник, 1994,4, с. 33-35.

6. Караулов А. В., Москалева Е. Ю., Кизенко О. А., Змызгова А. В., Максимов С. Л., Покровский В. И.— Иммунный статус и структура ДНК лейкоцитов периферической крови больных при вирусном гепатите В. International journal on immunorehabilitation. Тезисы IV Международного конгресса «Иммунореабипитация и реабилитация в медицине». Сочи, 5-9 июля 1998, с. 58.

7. Karaulov А. V., Moskaleva Е. Yu., Kizenko О. A., Zmyzgova А. V., Maksimov S. L., Pokrovsky V. I.— Immunological status and peripheral blood leucocytes DNA structure of patients with virus hepatitus. International journal on irnmunorehabilitation. Abstracts of the IV International congress «Irnmunorehabilitation and Reabilitation in Medicine». Sotchi, 5-9 july 1998, p. 14.

8. Karaulov A. V., Moskaleva A. V. Zmyzgova A. V., Maksimov S. L., Kizenko O. A.— DNA damages in lymphocytes and neutrophils of patients with different forms of virus hepatitis. X international congress of immunology. Abstracts X International congress of Immunology New Dehli 16 november 1998. P. 634.

9. Караулов Л В., Змызгова А. В., Москалева Е. Ю., Максимов С. Я., Кизенко О. А.— Структура ДНК лимфоцитов периферической крови у больных вирусным гепатитом. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1999, № 4, в печати.