Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Иммунодефицитные состояния, их профилактика и лечение тимолизатом

КАЗАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ

МЕДИЦИНЫ им. Н.Э.БАУМАНА

На правах рукописи

ЗИГАНШИНА ЮЛИЯ САБИРОВНА

Иммунодефицитные состояния, их профилактика и лечение тимолизатом

16.00.02.- Патология, онкология и морфология животных

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: Доктор ветеринарных наук, профессор Д.Ш.Шарипов

Казань - 1998 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

2.1. Механизмы резистентности организма и ее нарушения 8

2.1.1. Некоторые механизмы неспецифической резистентности 8

2.1.2. Механизмы специфической иммунологической резистентности 11

2.1.3. Иммунодефицитные состояния 14

2.2. Профилактика и лечение иммунодефицитных состояний 16

2.3. Гистолизаты как стимуляторы естественной резистентности животных 24

2.3.1. Общие принципы изготовления гистолизатов 24

2.3.2. Механизмы действия гистолизатов на организм животных 27

2.3.2.1. Влияние гистолизатов на обменные процессы 32

2.3.2.2. Влияние гистолизатов на гематологические показатели животных 33

2.3.2.3. Влияние гистолизатов на иммунобиологические показатели животных 34

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 37

3.1. Материалы и методы исследований 37

3.2. Результаты исследований 47

3.2.1. Количественная и качественная оценка гидролизата из тимуса 47

3.2.2. Определение острой и хронической токсичности и оптимальной дозы тимолизата 48

3.2.3. Изучение профилактической и лечебной эффективности тимолизата у белых крыс при экспериментальном иммунодефиците, вызванном нанесением термического ожога кожи 65

3.2.3.1.Результаты клинико-гематологических и иммунобиологических

исследований 66

3.2.3.2. Результаты патологоанатомических и гистологических

исследований 85

3.2.4. Изучение профилактической и лечебной эффективности тимолизата при экспериментальном иммунодефиците, вызванном введением иммунодепрессанта циклофосфана 102

3.2.4.1. Результаты опытов на белых крысах 102

3.2.4.2. Результаты опытов на кроликах 114

3.2.5. Влияние тимолизата на гематологические и иммунобиологические показатели у поросят, подвергнутых вакцинации 130

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 137

5. ВЫВОДЫ 152

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 154

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 155

8. ПРИЛОЖЕНИЯ 180

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время одной из важнейших проблем ветеринарной науки и практики является разработка эффективных мер профилактики и лечения иммунодефицитных состояний у животных.

Существует целый ряд биологически активных препаратов, оказывающих стимулирующее влияние на гуморальные и клеточные факторы иммунитета. Это полисахариды, препараты цинка, лимфокины, вакцина BCG, липополисаха-риды, мурамилдипептиды, биопрепараты, изготовленные из селезенки, имму-норегуляторные пептиды из костного мозга и др.(Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985; Петров Р.В. с соавт., 1986; Кирпиченок В.А., 1993; Макаревич Г.Ф., 1993а, б; Медведский В.А. с соавт., 1993; Мотузко Н.С., Никитин Ю.И., 1993).

Для стимуляции иммуногенеза и повышения естественной резистентности животных применяются препараты, выделенные из тимуса, в частности тимо-зин, тималин, тактивин, и другие (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1978; Арион В.Я., 1981; Квачев В.Г., Кассич А.Ю., 1991; Чучалин А.Г. и др., 1989; Мотузко Н.С., Никитин Ю.И., 1993; Макаревич Г.Ф., 1993а, 1993в и др.).

Для этих же целей, кроме вышеуказанных средств, рекомендованы тканевой препарат из тимуса гомотин (Никитенко A.M., 1990) и комбинированный тканевой препарат из тимуса и селезенки тимоспленин (Смирнов A.M. и др., 1984). Однако многие рекомендованные препараты являются дефицитными или дорогостоящими.

С учетом немногочисленных литературных данных о том, что гистолизаты обладают способностью стимулировать естественную резистентность и иммуногенез у животных (Руфимский Н.П., 1931а,б; Руфимский Н.П., Никольский В.В., 1934; Абдуллин Х.Х., 1934; Двинянинов Л., 1935; Фазлуллин Н.С., Не-мшилова H.A., 1935; Лысов В.Ф., 1970), в качестве предполагаемого стимулятора иммунной системы нами был изготовлен тканевой лизат из тимуса путем ферментативного гидролиза по М.П.Тушнову. При этом следует отметить, что

исследования по изучению некоторых сторон биологической активности тимо-лизата проводились лишь единичными авторами и носят отрывочный характер (Генес С.Г., Натанзон Г.Е., 1936; Гольдберг Л.Л., 1936; Трутнев Е.И., 1969; Шарипов Д.Ш. с соавт., 1995). Остались совсем не изученными иммуностимулирующее действие этого препарата, токсичность, дозы, и кратность его применения.

Как следует из вышеизложенного, всестороннее изучение биологического действия тимолизата, как доступного и дешевого препарата является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью работы явились экспериментальное воспроизведение иммунодефицитных состояний у животных и выяснение возможности профилактики и лечения этой патологии тимолизатом.

В соответствии с поставленной целью планировалось решение следующих задач:

1) провести электрофоретическое и спектрофотометрическое исследование тимолизата на предмет определения в нем содержания продуктов гидролиза белков;

2) определить острую и хроническую токсичность и оптимальную дозу тимолизата;

3) изучить клинико-гематологические, иммунобиологические показатели и патоморфологические изменения у животных при экспериментальных имму-нодефицитах;

4) изучить профилактическую и лечебную эффективность тимолизата при экспериментальных иммунодефицитных состояниях;

5) изучить влияние тимолизата на клинико-гематологические показатели у поросят-отъемышей при двухкратном его введении на фоне вакцинации против рожи свиней.

Научная новизна.Установлена возможность использования термического ожога кожи III степени площадью 10% поверхности тела животных в качестве

модели иммунодефицитного состояния. Получены данные, свидетельствующие о целесообразности применения тимолизата для стимуляции факторов естественной и специфической резистентности, роста и развития животных. Установлена выраженная лечебная и профилактическая эффективность препарата при экспериментальных иммунодефицитных состояниях. Определена оптимальная доза тимолизата и разработана схема его применения при иммунодефицитах.

Практическая ценность работы. Тимолизат является высокоэффективным иммуностимулятором с длительным иммунотропным действием. Препарат нетоксичен, прост в применении, не оказывает побочного влияния на организм животных. Приготовление препарата не требует больших технических и денежных затрат.

Рекомендуется для повышения роста и развития молодняка сельскохозяйственных животных, а также для лечения и профилактики иммунодефицитных состояний.

Основные положения, выносимые на защиту:

- данные изучения некоторых физико-химических показателей тимолизата, оценки его острой и хронической токсичности;

- результаты изучения влияния тимолизата на рост, развитие, гематологические и иммунобиологические показатели животных;

- термический ожог кожи как модель экспериментального иммунодефицитного состояния у животных;

- тимолизат - биологический препарат, обладающий выраженным профилактическим и лечебным действием при иммунодефицитных состояниях.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 2-й республиканской научной конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 1996); республиканской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 1996); Всероссийской научно-методической конференции по патологической анатомии сельскохозяйственных животных (Казань, 1996); республиканской научно-производственной

конференции по вопросам ветеринарии и животноводства (Казань, 1997); научно-методической конференции по диагностике и терапии болезней сельскохозяйственных животных (Казань, 1997); республиканской научно-практической конференции "Молодые ученые - агропромышленному комплексу" (Казань, 1998); международной научно-производственной конференции по вопросам ветеринарии и животноводства (Казань, 1998).

Реализация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ. Материал диссертационной работы вошел в отчет о научно-исследовательской работе кафедры патологической физиологии (КГАВМ) за 1995, 1996 и 1997гг.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы, содержащего 267 источников (223 отечественных и 44 иностранных) и приложения. Иллюстрационный материал представлен 26 таблицами и 22 рисунками.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Механизмы резистентности организма и ее нарушения 2.1.1. Некоторые механизмы неспецифической резистентности

Под неспецифической резистентностью понимают способность организма противостоять действию чужеродных агентов стереотипными механизмами, выработанными в процессе эволюции. При возникновении заболевания неспецифическая резитентность осуществляет первую, раннюю защиту организма, давая ему время для формирования полноценного иммунного ответа (Коляков Я.Е., 1986).

Неспецифическая резистентность обусловлена большим многообразием защиты, клеточных и гуморальных, включающих по существу деятельность всех систем организма; к ним относятся воспалительные реакции, лихорадка, выделение микробов и их токсинов с рвотой, кашлем и т. д., изменение рН среды в неблагоприятную для размножения микробов сторону, изменение обмена веществ, активация ферментных систем, мобилизация дезинтоксикационной функции печени, легких, почек и других органов.

Механизмы неспецифической резистентности разделяются на клеточные и гуморальные. К их числу относятся защитная роль кожи и слизистых оболочек, лимфатических узлов, фагоцитарная активность микро- и макрофагов, плацентарный и гистогематические барьеры, кровь, наличие целого ряда гуморальных и секреторных факторов, обладающих сами по себе и в сочетании друг с другом бактерицидным действием (лизоцим, комплемент, пропердиновая система, интерфероны, лейкины, неферментные катионные белки, нормальные антитела), ареактивность клеток к отдельным видам микробов и вирусов, а также к токсинам некоторых микроорганизмов, наличие в нормальных тканях, тканевой жидкости ингибиторов ферментативной активности бактерий (ингибиторы

гиалуронидазы, лецитиназы, коллагеназы, фосфолипазы, фибринолизина) и ингибиторы вирусов (муко- и липопротеиды).

Барьерные функции печени, селезенки, легких, костного мозга обеспечиваются фиксированными в этих органах макрофагами.

Противомикробное действие лизоцима, комплемента, пропердина, иммуноглобулинов, обладающих функцией антител в совокупности выражается бактерицидной активностью сыворотки крови (БАСК). БАСК в первую очередь зависит от содержащегося в ней комплемента, так как нормальные антитела, обладающие способностью растворять бактерийные клетки - бактериолизины, активны лишь в комплексе с комплементом (Коляков Я.Е., 1986).

Главным фактором неспецифической резистентности является фагоцитоз. Фагоцитоз - это процесс узнавания, поглощения и переваривания микробов, чужеродных частиц и клеток, продуктов распада клеток и тканей специализированными клетками гематогенного происхождения - фагоцитами.

Различают два основных класса фагоцитов - макрофагов и микрофагов.

К микрофагам относятся полиморфноядерные лейкоциты, прежде всего нейтрофильные гранулоциты. Нейтрофилы содержат "первичные", а в более поздние сроки - "вторичные" гранулы, содержащие связанные с лизосомами гидролитические ферменты, обеспечивающие последнюю стадию фагоцитоза -переваривание микробной клетки.

К макрофагам относятся клетки системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Сюда относятся активированные моноциты крови, свободные и фиксированные макрофаги стромы лимфоузлов, селезенки, костного мозга, клетки Купфера печени, макрофаги сальника, брюшины, интерстиция легкого, альвеолярные макрофаги, а также клетки микроглии, остеокласты, гистиоциты соединительной ткани, клетки Лангерганса и Грэнстейна эпидермиса.

Макрофаги и нейтрофилы несут на своей поверхности рецепторы к Бс-фрагменту и к СЗ, с помощью которых осуществляют распознавание и прикрепление опсонизированных микробов к поверхности фагоцита.

Нормальные (естественные) антитела являются гуморальными факторами неспецифической резистентности - обнаруживаются в сыворотке крови неим-мунизированных животных в невысоком титре (агглютинины, антитоксины и др.). Они образуются в результате скрытой инфекции, при контакте с непатогенными микробами. Они разрушают стрептококков, стафилококков, возбудителей холеры, брюшного тифа, дизентерии и т. д.

Практически антитела идентичны гамма-глобулиновой фракции кровяной плазмы (Петров Р.В., 1983 ; Коляков Я.Е., 1986). Иммуноглобулины, помимо плазмы, сыворотки, содержатся и в других жидкостях организма, как то, лимфе, молоке (особенно молозиве), спинно-мозговой жидкости, различных секретах и воспалительных выпотах.

Основную массу сывороточных иммуноглобулинов (70-80%) составляют IgG; IgA -10-15%; IgM - 5-10%; иммуноглобулинов классов Е и D очень мало -около 0,2%. Поскольку прохождение материнских антител через плаценту свойственно только IgG, у новорожденного в крови имеется только этот тип иммуноглобулинов. В период эмбрионального развития синтез иммуноглобулинов столь неинтенсивен, что обнаружить собственные иммуноглобулины плода до рождения не удается. Собственная продукция антител начинается только после рождения (Петров Р.В., 1983).

Реально действие неспецифических факторов защиты макроорганизма направляется высокоспецифичными клеточными и гуморальными факторами иммунитета. Так, стабилизированные антигеном лимфоциты вырабатывают лимфокины, в том числе фактор хемотаксиса и фактор торможения миграции лейкоцитов: первый привлекает фагоциты, а второй удерживает их в зоне повреждения.

В последние годы установлено широкое участие макрофагов в различных иммунобиологических процессах. Они в значительной степени определяют величину будущей иммунологической реакции. С их помощью в процесс иммуногенеза вступают популяции иммунокомпетентных клеток лимфоидного про-

исхождения (Учитель И.Я., 1978; Вазина И.Р. с соавт., 1984; Земсков В.М., 1984; Коляков Я.Е., 1986; Петров Р.В., 1987; Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990; Громыхина Н.Ю., Козлов В .А., 1996). Лимфоциты и моноциты выступают в очаге воспаления как продуценты целого спектра цитокинов, совместно обеспечивающих активацию нейтрофилов и их кооперацию с другими клетками для формирования иммунобиологической реакции по ограничению и подавлению микробной инфекции (Потапов М.П., Печковский Д.В., 1994).

Таким образом, в условиях высшего организма специфические факторы иммунной системы, соединяясь с неспецифическими, по сути, превращают их в комплексы, специфически реагирующие на чужеродное.

2.1.2. Механизмы специфической иммунологической резистентности

Специфическая иммунологическая резистентность заключается в способности организма распознавать, обезвреживать и элиминировать генетически чужеродные вещества, что обеспечивает структурную и функциональную целостность организма, постоянство его генетического гомеостаза (Адо А.Д., Новицкий В.В., 1994; Петров Р.В., 1983). Иммунная система представляет собой совокупность всех лимфоидных органов, тканей и скоплений лимфоидных клеток организма. Различают центральные (первичные) и периферические (вторичные) лимфоидные органы иммунной системы. К центральным лимфо-идным органам относят вилочковую железу (тимус), фабрициеву сумку (у птиц) и аналоги последней у млекопитающих - пейеровы бляшки, миндалины, а также костный мозг (Петров Р.В., 1983; Коляков Я.Е., 1986). В центральных органах лимфоциты созревают, приобретают иммунную компетентность, после чего поступают в циркуляцию (кровь, лимфу) и заселяют периферические лимфоидные органы (селезенку, лимфатические узлы, лимфоидную ткань других органов).

Вил очковая железа - центральный лимфоидный орган. Эпителиальные клетки тимуса регулируют один из этапов созревания лимфоцитов в корковом

веществе тимуса. Они обволакивают своей мембраной мелкие лимфоциты, воздействуя на них как контактным путем, так и с помощью растворимых веществ. Последние представляют собой группу пептидных соединений, называемых гормонами тимуса (Ярилин А.А., Беляков И.М., 1996). Под влиянием гормонов вилочковой железы происходит дифференцировка лимфоцитов в тимус-зависимые клетки или Т-лимфоциты, обеспечивающие клеточные функции иммунитета. Помимо Т-клеток вилочковая железа секретирует в кровь тимичес-кие гуморальные факторы (тимозин, тимопоэтин и др.), способствующие дозреванию Т-лимфоцитов в периферических лимфатических органах (селе