Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка параметров иммунной системы с учетом хемотаксической активности фагоцитов у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания

ДВОРЧИК Елена Евгеньевна

ОЦЕНКА ПАРАМЕТРОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ С УЧЕТОМ ХЕМОТАКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ АТОПИЧЕСКОЙ И СМЕШАННОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ В ФАЗЫ КЛИНИЧЕСКОЙ РЕМИССИИ И ОБОСТРЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003460811

Челябинск - 2009

003460811

Работа выполнена в лаборатории экологической иммунологии НИИ иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Зурочка Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Аклеев Александр Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Суховей Юрий Геннадьевич

Ведущая организация:

Государственное учреждение «Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук» г. Пермь.

Защита состоится «_» февраля 2009 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Автореферат разослан «_» января 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Направленная миграция является важнейшим проявлением реактивности нейтрофилов, основной смысл которой заключается в достижении объекта, вызвавшего активацию клетки (очаг тканевой деструкции, воспаления). Активированный нейтрофил, пришедший в очаг, решает эффекгорные задачи одним из двух способов: либо с помощью фагоцитоза, либо путем секреции биологически активных продуктов (Зурочка А.В., 1991; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Долгушин И.И. и др., 2006). Сложность клеточных и гуморальных механизмов, которые обеспечивают хемотаксис, делает его одной из самых уязвимых форм реактивности нейтрофила (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Характер изменений фагоцитарной и хемотаксической активности нейтрофилов подробно изучен при многих гнойно-воспалительных процессах, при острой патологии и травматической болезни (Зурочка А.В., 1991; Студеникина Ю.Н., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Злакоманова О.Н., 2002; Долгушин И.И. и др., 2006). Не менее важна роль фагоцитов при аллергопатологии, в частности, бронхиальной астме (БА). Однако в формировании данного заболевания часто важную патогенетическую роль играет инфекционное звено, что, с одной стороны, может поддерживать активность аллергического воспаления, а, с другой стороны, аллергическое заболевание при длительном течении (или лечении) приводит к изменениям иммунного статуса по типу вторичной иммунной дисфункции, клиническим проявлением которой являются рецидивирующие хронические воспалительные заболевания. С точки зрения клинико-лабораторной оценки, такие поражения иммунной системы являются наиболее сложными для верификации иммунологического диагноза (Федосеева В.Н. и др., 2004) и требуют индивидуальной тактики ведения больного и иммуно коррекции этих состояний, где важную роль играют именно фагоциты, обеспечивающие первую линию защиты от инфекции и играющие немаловажную роль в поддержании аллергического воспаления в различных органах и системах. Таким образом, формирование инфекционной зависимости у этих больных БА происходит в результате воздействия различных инфекционных агентов; первые клинические проявления или обострения течения БА связаны с воздействием инфекционных факторов, а улучшение состояния возникает после снижения патогенного влияния инфекционного агента. В настоящее время очевидна необходимость диагностики активной и скрытой инфекции у таких больных, так как это тесно связано с выбором адекватной терапии, что определяет актуальность и служит обоснованием цели настоящего исследования.

Цель исследования: изучить характер изменений хемотаксической и фагоцитарной функции нейтрофилов периферической крови у больных

атопической и смешанной бронхиальной астмой на фоне изменения иммунного статуса в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние фагоцитарного звена иммунной системы у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания.

2. Определить характер хемотаксической активности фагоцитов на причинно-значимые аллергены, бактериальные хемоаттрактанты, С5а фрагмент системы комплемента и естественный цитокиновый комплекс у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания.

3. Провести сравнительное исследование состояния лабораторных параметров лимфоцитарного и гуморального звеньев иммунитета у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания.

4. Определить уровень спонтанной и индуцированной продукции цитокинов у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания для оценки состояния регуляторного звена иммунной системы.

Научная новизна. Впервые определен характер хемотаксической активности нейтрофилов на причинно-значимый аллерген у больных атопической и смешанной БА в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания. Изучен хемотаксический ответ на бактериальный хемоаттрактант, С5а фрагмент комплемента и естественный цитокиновый комплекс, что позволило выяснить некоторые особенности формирования ответа фагоцитарных клеток у таких больных и выявить значимость этих нарушений в формировании данной патологии. Кроме того, изучены лабораторные показатели иммунной системы: иммунофенотип лимфоцитов, фагоцитарные свойства, кислородзависимый метаболизм, лизосомальная активность, миграционные характеристики нейтрофилов периферической крови, гуморальное звено иммунитета, цитокиновый статус у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в зависимости от фазы клинической ремиссии или обострения заболевания.

Впервые показано, что при воздействии специфических хемоатграктантов - взвеси суточной культуры S.avreus штамм «Cowan 209» и специфического аллергена, выявлен феномен хемотаксической деактивации к инфекционному агенту на фоне активации неспецифических эстераз у больных смешанной БА, как в фазе обострения, так и в фазе клинической ремиссии, а к причинно-значимому аллергену данный феномен выявлен у больных атопической БА, также независимо от стадии заболевания, при отсутствии метаболической активации нейтрофилов в зоне хемотаксического ответа, что способствует длительному поддержанию воспалительного процесса.

Отсутствие хемотаксической деактивации при ответе на аллерген у больных смешанной БА, возможно, свидетельствует о перераспределении роли аллергена и микроорганизма в формировании данной патологии в сторону инфекционного агента. Подана заявка на патент РФ «Способ выявления нарушения функции фагоцитов при развитии рецидивирующих инфекционных процессов» № 2007108220.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость результатов исследования состоит в расширении знаний о характере иммунологических нарушений и особенностях функциональной активности нейтрофилов у больных атопической и смешанной БА в фазы клинической ремиссии или обострения заболевания.

Выявленные нарушения хемотаксических реакций нейтрофилов периферической крови и оценка их патогенетического значения, а также зафиксированные разнонаправленные изменения состояния иммунной системы позволят разработать новые методы диагностики нарушений иммунной системы у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в зависимости от фазы клинической ремиссии или обострения заболевания. На основе исследования разработан метод выявления нарушения функций фагоцитов при развитии рецидивирующих инфекционных процессов.

Положения, выносимые на защиту:

1. У больных атопической и смешанной бронхиальной астмой наблюдается угнетение фагоцитарной функции и снижение резерва кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови, независимо от фазы процесса.

2. У больных атопической бронхиальной астмой наблюдается феномен хемотаксической деактивации при воздействии причинно-значимого аллергена при отсутствии метаболической активации нейтрофилов в зоне хемотаксического ответа, а у больных смешанной бронхиальной астмой -при воздействии инфекционного агента - взвеси суточной культуры Staphylococcus aureus штамм «Cowan 209» - на фоне активации неспецифических эстер аз как в фазе обострения, так и в фазе клинической ремиссии.

3. При иммунофенотипировании лимфоцитов у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой отмечается снижение числа клеток, экспрессирующих активационные рецепторы, независимо от фазы заболевания.

4. У больных атопической бронхиальной астмой в стадию обострения по сравнению с группой больных атопической бронхиальной астмой в фазу клинической ремиссии увеличивается соотношение CD4+/CD8+. У больных смешанной бронхиальной астмой в стадию ремиссии по сравнению с группой практически здоровых лиц снижается соотношение CD4+/CD8+. У больных смешанной бронхиальной астмой в стадии

обострения по сравнению с группой пациентов, находящихся в стадии клинической ремиссии, повышается соотношение CD4+/CD8+ за счет увеличения количества С04-позитивных лимфоцитов на фоне снижения уровня CD8+ клеток.

5. У больных атопической и смешанной бронхиальной астмой, независимо от фазы заболевания, отмечаются однонаправленные изменения в продукции цитокинов: снижение продукции ILlß и IFNy и увеличение продукции IL4 и ILIO в фазу ремиссии при относительном снижении IL4 в фазе обострения.

Внедрение результатов в практику. Результаты исследования внедрены в практику отделения аллергологии и иммунологии Клиники ЧелГМА, лаборатории экологической иммунологии НИИ иммунологии ЧелГМА, в учебный процесс самостоятельного курса клинической лабораторной диагностики ЧелГМА.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (г. Санкт-Петербург, 2005, 2006,2007), Конференции иммунологов Урала (г. Челябинск, 2003; г. Оренбург, 2006). Работа была поддержана грантом Правительства Челябинской области (2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Указатель литературы включает 152 источника, из них 97 отечественных и 55 иностранных. Иллюстрации представлены 14 таблицами, 4 рисунками и 4 фотографиями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В процессе работы проведено исследование иммунного статуса у 60 практически здоровых лиц и 158 больных атопической и смешанной (сочетание атопического и инфекционно-зависимого клинико-патогенетического варианта) БА в фазы обострения или ремиссии. На момент обследования из 78 больных атопической БА 30 человек находились в стадии обострения, а 48 - в стадии клинической ремиссии. Среди 80 больных смешанной БА 40 человек находились в стадии обострения и 40 человек в стадии ремиссии.

Все больные с аллергопатологией состояли на диспансерном учете у врача аллерголога-иммунолога ГКБ№2 и в отделении аллергологии и иммунологии Клиники ЧелГМА. Диагноз БА был поставлен на основании

клинических признаков заболевания, данных функционального и лабораторного обследования. Атопический генез заболевания подтвержден проведенными скарификационными кожными пробами. Группа практически здоровых лиц сформирована врачом-терапевтом ГКБ №2 г. Челябинска после проведения углубленного профилактического осмотра, включавшего консультацию врача аллерголога-иммунолога. Практически здоровые лица не болели острыми воспалительными заболеваниями в течение предшествующего месяца и не имели соматических, аллергических, аутоиммунных заболеваний и хронической инфекциокно-воспалительной патологии.

Для оценки иммунологических показателей в периферической крови определяли общее количество лейкоцитов, относительное и абсолютное содержание гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов на гематологическом анализаторе Coulter LH - 500 фирмы Beckman Coulter, США. Содержание различных субпопуляций лимфоцитов оценивали методом проточной цитометрии с использованием двухпараметрических реагентов линии IOTest: CD3-FITC/CD19-РЕ, CD3-FITC/CD4-PE, CD3 -FITC/CD8-PE, CD3-FITC/CD( 16+56)-РЕ, CD3-FITCCD25-PE, CD3-FITC/HLA-DR-PE фирмы Beckman Coulter, США на лазерных проточных цитометрах Epics™ XL™ и Cytomics FC 500 фирмы Beckman Coulter, США. Для изучения функциональной активности нейтрофилов человека исследовали лизосомальную активность (Фрейдлин И.С., 1984), фагоцитарную функцию на модели поглощения частиц латекса (Фрейдлин И.С., 1976), кислородзависимый метаболизм с помощью спонтанного и индуцированного НСТ-теста (Маянский А.Н., Виксман М.Е., 1979). Уровни иммуноглобулинов А, М и G в сыворотке крови определяли методом G. Mancini et al. (1965) в модификации A.A. Тихомирова (1997). Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов оценивали по методу В.Г. Гашковой и др. (1978). Исследование уровня общей гемолитической активности комплемента (СН50) и его компонентов (CI, С2, СЗ, С4, С5) проводилось методом молекулярного титрования (Резникова JI.C., 1967; Красильников А.П., 1984).

Показатели цитокинового статуса оценивались путем определения продукции цитокинов лейкоцитами in vitro в супернатантах цельной крови (Кетлинский С.А., 1998) при спонтанной продукции, стимуляции фитогемагглютинином или липополисахаридом Escherichia coli по концентрации IFNy, ILlß, ILIO, IL4. Уровень цитокинов определяли методом иммуноферментного анализа с использованием соответствующих тест-систем, произведенных ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург) на микропланшетном ридере ANTHOS 2020 (Италия). Оценка хемотаксиса проводилась методом, предложенным R.D. Nelson et al. (1975), основанном на оценке миграционной активности лейкоцитов под агарозным гелем в модификации Л.Я. Эберта и др. (1985). Учет активности неспецифических эстераз в зонах миграции

проводился методом одновременного азосочетания по Пирсу по модифицированной нами методике.

Исследования проведены в лаборатории экологической иммунологии НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, иммунологическом отделе Центральной научно-исследовательской лаборатории ЧелГМА, иммунологической лаборатории Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Клиники ЧелГМА, на учебной базе самостоятельного курса клинической лабораторной диагностики ЧелГМА.

Полученные результаты обрабатывались на компьютере под управлением операционной системы Windows ХР с применением пакета прикладных программ "Statistica for Windows 6.0" (Боровиков В., 2003). Статистическая обработка результатов исследований проводилась стандартными методами, с определением средней арифметической вариационного ряда (М) и ошибки средней арифметической (т). Достоверность отличия оценивалась по U критерию Mann-Whitney. Различия считали значимыми при р<0,05 (Гланц С., 1999; Боровиков В., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведение анализа иммунологических показателей у больных атопической и смешанной БА выявило идентичные тенденции изменения формулы крови, которые проявляются в увеличении абсолютного и относительного количества гранулоцитов, преимущественно за счет абсолютных и относительных чисел эозинофилов, играющих важную роль в формировании аллергического воспаления (Фрейдлин И.С., Тотолян A.A., 2001; Borres М.Р., Björksten В., 2004; Liu L.Y. et al., 2006), а также палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, что свидетельствует о наличии длительно текущего воспалительного процесса у данных пациентов, сопровождающегося ростом количества зрелых форм. Кроме того, выявлено снижение относительного количества лимфоцитов и моноцитов. В фазе обострения заболевания в обеих группах достоверно снижено абсолютное и относительное количество сегментоядерных нейтрофилов, при этом у больных атопической БА значительно увеличено абсолютное и относительное количество эозинофилов, а у больных смешанной БА снижено общее количество лейкоцитов и повышено относительное количество лимфоцитов по сравнению с больными в фазе клинической ремиссии.

При изучении функциональной активности нейтрофилов у больных атопической БА в фазе клинической ремиссии выявлено достоверно значимое снижение интенсивности фагоцитоза нейтрофилов и снижение активности и интенсивности индуцированного и индекса резерва НСТ-теста, повышение лизосомальной активности нейтрофилов. У больных атопической БА в фазе обострения отмечено достоверно значимое снижение интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа нейтрофилов, а также снижение активности

и интенсивности индуцированного и индекса резерва НСТ-теста. При этом лизосомальная активность нейтрофилов у пациентов данной группы снижена, а активность и интенсивность НСТ-теста достоверно выше, чем у больных атопической БА в стадию клинической ремиссии.

У больных смешанной БА, независимо от стадии заболевания, по сравнению с практически здоровыми лицами мы выявили снижение активности фагоцитоза нейтрофилов, более значимое в фазе обострения, снижение интенсивности фагоцитоза нейтрофилов, снижение индуцированной способности нейтрофилов восстанавливать нитросиний тетразолий в диформазан, снижение активности и интенсивности индекса резерва НСТ-теста.

Уменьшение функционального резерва клеток свидетельствует о снижении их способности отвечать на дополнительную стимуляцию усилением процессов дыхания, и, следовательно, образованием факторов, способствующих завершенному фагоцитозу (Луткова Т.С. и др., 2004). Все эти данные подтверждают наше предположение о формировании нарушения фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов на фоне длительно текущего воспалительного процесса.

Учитывая, что начальным этапом фагоцитоза является хемотаксическая реакция, целесообразным предвиделось исследование изменений хемотаксиса нейтрофилов.

Нарушений спонтанной миграционной активности нейтрофильных гранулоцитов и в хемотаксическом ответе на стандартный хемоаттрактант во всех исследуемых группах больных БА не выявлено (таблица 1). При обострении смешанной БА отмечено нарушение хемотаксического ответа нейтрофилов на стандартизованное воздействие цитокинового комплекса (таблица 2), вероятно, обусловленное значительными изменениями продукции цитокинов в организме больного в период обострения (Федосеев Г.Б., 2001).

При воздействии специфических хемоаттрактантов - взвеси суточной культуры S. aureus штамм «Cowan 209» (таблица 3) и специфического аллергена (таблица 4), обнаружен феномен хемотаксической деактивации к инфекционному агенту на фоне активации неспецифических эстераз у больных смешанной БА, как в фазе обострения, так и в фазе клинической ремиссии, и к причинно-значимому аллергену (по результатам кожных проб) у больных атопической БА, также и в стадию обострения, и в стадию клинической ремиссии заболевания, при отсутствии метаболической активации нейтрофилов в зоне хемотаксического ответа, что способствует длительному поддержанию воспалительного процесса. Отсутствие феномена хемотаксической деактивации при ответе на аллерген у больных смешанной БА, возможно, свидетельствует о перераспределении роли аллергена и микроорганизма в формировании данной патологии в сторону инфекционного агента.

Таблица 1.

Показатели миграционной активности нейтрофилов у больных БА в фазы ремиссии и обострения заболевания_

Показатели Стат. пока-зате-ли Группы

Практически здоровые лица БА атопическая ремиссия БА атопическая обострение БА смешанная, ремиссия БА смешанная, обострение

п=56 п=34 п=24 п=34 п=32

Индекс адгезии, % М±га 52,29+2,40 59,40+2,81 46,53±3,10** 55,07+2,16 52,32±2,55

Спонтанная миграция, усл.™. М±ш 17,06+0,99 15,97+1,29 20,92+1,78* ** 23,47+2,05* 22,40±2,10

Индекс хемотаксиса к С5а фрагменту комплемента, у.е. М±ш 1,43 ±0,07 1,32+0,04 1,28±0,12 1,4<Ж),05 1,30±0,09

Активность эстераз спонтанная, % М+т 32,50±2,49 42,81+2,91* 45,17+0,84* 29,80±2,77 16,58±0,96* **

Спонтанный суммарный цитохимический коэффициент эстераз, у.е. М±т 60,97+3,88 90,28+5,21* 103,71±4,51* 67,4±2,90 34,7±2,74* **

Показатели хемотаксиса нейт Таблица 2. рофилов к естественному цитокииовому комплексу у больных БА в фазы ремиссии и обострения заболевания

Показатели Стат. показатели Группы

Практически здоровые лица БА атопическая ремиссия БА атопическая обострение БА смешанная, ремиссия БА смешанная, обострение

п=45 п=30 п=22 п=34 п=32

Индекс хемотаксиса к лейкинферону, у.е. М+т 1,41+0,08 1,23+0,06 1,28±0,08 1,40+0,10 1,11±0,05*

Индекс эстеразной активности в зонах ответа к лейкинферону, у.е. М+т 1,12+0,06 1,05+0,07 1Д6±0,07 1,03+0,09 1,06±0,04

Индекс активности суммарного цитохимического коэффициента эстераз к лейкинферону, у.е. М±т 1,10+0,06 0,96±0,08 1,18±0,07 1,03±0,12 1,08±0,09

Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05 ** - достоверность различий показателей больных атонической и смешанной БА в фазу обострения по сравнению с группой больных БА в фазу клинической ремиссии по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

Таблица 3.

Показатели хемотаксиса нейтрофилов к S.aureus штамм «Cowan 209» у больных БА в фазы ремиссии и обострения заболевания_

Показатели Стат. показатели Группы

Практически здоровые лица БА атопическая ремиссия БА атопическая обострение БА смешатая, ремиссия БА смешанная, обострение

п=49 п=34 п=24 п=34 п=32

Индекс хемотаксиса к S.aureus иггамм «Cowan 209», у.е. М±т 1,51+0,05 1,49+0,07 1,41+0,06 1,21±0,07* 1,17±0,03*

Индекс эстеразной активности в зонах ответа к S. aureus штамм «Cowan 209», у.е. М+т 1,07+0,04 1,03+0,06 1,14+0,08 1,22+0,02* 1,20+0,04

Индекс активности суммарного цитохимического коэффициента эстераз S. aureus штамм «Cowan 209», у.е. М±т 1,07±0,05 1,10±0,08 1,05±0,06 1,43+0,14* 1,35±0,04*

Показатели хемотаксиса нейтро< Таблица 4. зилов к специфическому аллергену у больных БА в фазы ремиссии и обострения заболевания

Показатели Стат. показатели Группы

Практически здоровые лица БА атопическая ремиссия БА атопическая обострение БА смешанная, ремиссия БА смешанная, обострение

п=25 п=28 п=24 п=24 п=20

Индекс хемотаксиса к аллергену, у.е. М+т 1,46+0,06 1,19±0,06* 1,22+0,04* 1,39+0,07 1,41+0,08

Индекс эстеразной активности в зонах ответа к аллергену, у.е. М±т 1,02±0,03 1,04±0,07 1,04±0,05 1,01±0,03 1,01±0,03

Индекс активности суммарного цитохимического коэффициента эстераз к аллергену, у.е. М+т 1,04±0,06 1,01+0,09 1,08±0,07 1,01+0,03 1,09±0,07

Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой по U-критершо Манна-Уитни: р<0,05

Таблица 5.

Показатели иммуиофенотипироваиия лимфоцитов больных БА в фазы ре миссии и обострения заболевания_

Показатели Стат. Практически БА атопическая, БА атопическая, БА смешанная, БА смешанная,

обследованных лиц пока- здоровые лица ремиссия обострение ремиссия обострение

зате-ли п =30 п = 48 п = 29 п = 26 п = 32

СО 3+19-,% Mim 72,06+1,36 70,69±0,89 70,97±1,53 69,74±2,39 68,61+1,83

СО 3+19-, абс М±пз 1510,47±53,59 1682,17+100,9 1597,31±176,65 1298,77+115,47 1296,81+123,3

СО 3+4+, % М±т 44,54±1,04 46,61+0,9 53,3911,65* ** 30,32+1,21* 40,7311,35**

СО 3+4+, абс М+т 933,6+37,46 1107,92165,39 1237,41+146,96* 584,54+55,49* 772,88+74,77**

СО 3+8+, % М±га 16,4±1,22 21,08±0,46* 14,08+0,55* ** 37,87+2,1* 24,6910,96**

СО 3+8+, абс М+т 530,87±33,0 505,25+33,66 315,28134,13* ** 724,23+71,15 470,56149,1**

СО 4/С08, у.е. М+т 1,89+0,10 2,25±0,05 3,96±0,19* •к* 0,84+0,03* 1,68+0,06**

СО 3+16+56+, % М±т 2,32+0,32 2,34+0,57 1,88+0,53 4,22+0,54 1,93+0,3**

СО 3+16+56+, абс М±т 47,53+7,04 58,27+17,2 48,38+22,64 77,85±10,07 35,6917,03**

СО 3-16+56+, % М±т 12,33+1,23 6,9+0,6* 8,66+1,29 12,98±2,06 11,08+1,25

СО 3-16+56+, абс М±т 262,33+29,54 144,73+11,6* 161,52+20,07 220,08+30,29 184,5+21,12

СО 3-19+, % М+т 13,04+0,79 16,77+0,85* 15,99+1,44 12,36+0,71 13,68+1,2

СО 3-19+, абс М±т 279,8±21,58 408,81+34,54 384,28+57,22 228,62+21,42 238,47+22,64

СО 3+25+, % М±т 5,05+0,63 2,98+0,24* 3,51±0,37* 2,79±0,3* 2,62+0,24*

СО 3+25+, абс М±т 111,33±17,87 70,46±7,57* 74,03±10,42* 57,23110,34* 47,38+6,28*

СО 3+НЬАОЯ+, % М+т 3,01+0,37 1,12±0,12* 1,23+0,23* 1,88+0,29* 0,9610,11*

СО З+НЬА ОЯ+, абс М±т 61,0+7,14 24,09+2,89* 23,14+4,06* 30,13+4,65* 16,59+1,64*

Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

** - достоверность различий показателей больных атопической и смешанной БА в фазу обострения по сравнению с группой больных БА в

фазу клинической ремиссии по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

Для оценки состояния лимфоцитов у больных атонической и смешанной БА проведено иммунофенотипирование этих клеток методом проточной цитометрии.

Результаты изучения параметров иммунофенотипирования лимфоцитов (таблица 5) методом проточной цитометрии у практически здоровых лиц, проживающих в экологических условиях города Челябинска свидетельствуют о близости полученных нами среднестатистических параметров субпопуляционного состава лимфоцитов к российским (Хайдуков C.B., Зурочка А.В., 2008) и зарубежным (Pope V., et al., 1994; Comans-Bitter W.M., et al, 1997; Zidovec Lepej S., et al, 2003) литературным данным.

При иммунофенотипировании лимфоцитов у больных атопической БА в фазе клинической ремиссии наблюдается увеличение относительного количества В-лимфоцитов (CD3-19+), снижение абсолютного и относительного числа клеток, экспрессирующих маркеры ранней (CD3+25+) и поздней (CD3+HLA-DR+) активации, снижение абсолютного и относительного количества NK (CD3-16+56+) клеток, а в фазе обострения - увеличение соотношения CD4+/CD8+ за счет увеличения относительного и абсолютного количества Т-хелперов (CD3+4+) и снижения абсолютного и относительного количества Т-цитотоксических (CD3+8+) клеток, а также снижение относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов, несущих маркеры ранней и поздней активации.

У больных смешанной БА в стадию ремиссии по сравнению с практически здоровыми лицами, несмотря на отсутствие отличий в общем количестве Т-клеток, отмечено значительное снижение абсолютного и относительного числа Т-хелперов (CD3+4+), увеличение относительного количества Т-цитотоксических (CD3+8+) лимфоцитов, за счет чего произошло более чем двукратное снижение соотношения CD4+/CD8+, что свидетельствует о формировании дисбаланса клеток иммунной системы с истощением функциональных резервов Т-хелперов, о чем свидетельствует и снижение абсолютного и относительного количества клеток, экспрессирующих маркеры ранней (CD3+25+) и поздней активации (CD3+HLA-DR+).

У больных смешанной БА в стадию обострения по сравнению с практически здоровыми лицами мы выявили только значительное снижение относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов, несущих маркеры ранней (CD3+25+) и поздней (CD3+HLA-DR+) активации.

При сравнении же с группой пациентов, находящихся в стадии клинической ремиссии, мы обнаружили достоверно значимое повышение абсолютного и относительного количества Т-хелперов на фоне снижения абсолютных и относительных чисел Т-цитотоксических лимфоцитов, за счет чего соотношение CD4+/CD8+ оказалось достоверно повышено на фоне снижения абсолютного и относительного количества TNK (CD3+16+56+)

клеток, что характеризует активацию иммунной системы в стадию обострения смешанной БА, однако, не достигающую ожидаемого уровня, что свидетельствует о сохранении выраженного дисбаланса клеток иммунной системы у данных лиц в период обострения заболевания.

Таким образом, при изучении иммунофенотипирования лимфоцитов у больных атонической и смешанной БА в фазы обострения и клинической ремиссии заболевания мы выявили некоторые изменения параметров лимфоцитов, более выраженные у больных смешанной БА. Возможно, это связано и с изменением хемотаксического ответа фагоцитов (переключение хемотаксической деактивации с аллергена на инфекционный агент), тем самым нарушается система активации нейтрофил - иммуноциты (Зурочка A.B., 1991, Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001).

При изучении возможностей активации лимфоцитов в реакции бласттрансформации лимфоцитов со стандартными митогенами ФГА и ЛПС Е. Coli (Калинина Н.М., 2002) выявлено достоверно значимое снижение пролиферации под воздействием ЛПС у больных атопической БА в стадию обострения процесса как по сравнению с практически здоровыми лицами, так и с пациентами в фазе клинической ремиссии процесса.

При изучении показателей гуморального звена иммунитета у больных атопической БА в стадию ремиссии по сравнению с практически здоровыми лицами выявлено статистически значимое снижение содержания СЗ компонента комплемента. У больных атопической БА в фазе обострения по сравнению с практически здоровыми лицами выявлено значимое снижение уровня IgA. У больных атопической БА в фазе обострения по сравнению с группой больных атопической БА в фазе клинической ремиссии отмечено снижение уровня IgA и увеличение содержания СЗ и С4 компонентов комплемента.

У больных смешанной БА в стадию ремиссии по сравнению с практически здоровыми лицами выявлено только снижение уровня IgM, однако, при обострении смешанной БА по сравнению с группой контроля резко увеличено количество циркулирующих иммунных комплексов, а также снижена гемолитическая активность комплемента, содержание СЗ и С4 компонентов комплемента. У больных смешанной БА в фазе обострения по сравнению с больными смешанной БА в фазе клинической ремиссии отмечено снижение содержания С1, СЗ и С4 компонентов комплемента, что, возможно, обусловлено повышенным расходованием комплемента на инфекционный агент, приводящим к образованию циркулирующих иммунных комплексов.

По данным литературы (Фрейдлин И.С., Тотолян A.A., 2000), формирование аллергического процесса тесно связано с нарушениями в системе рефляции, связанной с девиацией иммунного ответа. Развитие аллергических реакций немедленного или замедленного типа зависит

соответственно от преимущественной дифференцировки ТЬ2 или ТЫ, которые продуцируют разные спектры цитокинов и проявляют разную чувствительность к действию цитокинов. Поэтому важно было выявить изменения цитокинового статуса у практически здоровых лиц и у больных атопической и смешанной БА в обострение и клиническую ремиссию заболевания с целью оценки адекватности функционирования систем регуляции иммунного ответа.

При оценке продукции 1ЫР (таблица 6) у больных атопической и смешанной БА, независимо от стадии заболевания, по сравнению с практически здоровыми лицами выявлена однонаправленная тенденция к снижению как спонтанной, так и индуцированной ФГА и ЛПС продукции вышеназванного цитокина, однако, достоверно значимым снижение становится только у больных смешанной БА в стадию ремиссии. У больных атопической и смешанной БА, находящихся в стадии обострения, достоверно значимым оказалось снижение индуцированной ФГА и ЛПС продукции 1Ыр, что вполне ожидаемо и соответствует данным литературы о снижении у больных с атопиями способности мононуклеаров клеток крови к спонтанной и индуцированной стандартными индукторами (ЛПС) продукции ПЛр (ОтагеПо С. е! а1., 1993), являющегося основным цитокином, участвующим в запуске иммунного ответа и стимулирующим фагоцитарную активность клеток (Ярилин А.А., 1999).

Статистически значимых отличий в коэффициентах соотношения ФГА- и ЛПС-индуцированной к спонтанной продукции ПЛр у больных атопической и смешанной БА по сравнению с практически здоровыми лицами не выявлено, что свидетельствует о сохранности механизмов активации основных продуцентов указанного цитокина.

При оценке содержания как основного активатора клеточного

иммунитета, выявлена однонаправленная тенденция к снижению как спонтанной, так и индуцированной ФГА и ЛПС продукции вышеназванного цитокина у больных атопической и смешанной БА, независимо от стадии заболевания, по сравнению с практически здоровыми лицами. Достоверно значимым падение ФГА-индуцированной продукции становится у больных атопической БА в стадию обострения и смешанной БА в стадию ремиссии, ЛПС-индуцированной - у больных атопической БА, независимо от стадии заболевания и смешанной БА в стадию обострения. Кроме того, у больных смешанной БА в стадию обострения наблюдается более чем двукратное достоверно значимое снижение спонтанной продукции по сравнению с ремиссией данного процесса, что обусловило резкое возрастание индекса ФГА-индуцированной/спонтанной продукции у этой группы пациентов. При этом данный индекс у больных смешанной БА в стадию клинической ремиссии достоверно снижен за счет резко сниженной ФГА-индуцированной продукции.

Индекс соотношения ЛПС-индуцированной/спонтанной продукции IFNy достоверно снижен во всех обследованных группах больных за счет резкого падения ЛПС-индуцированной продукции, описанного выше, что свидетельствует о сдвиге в сторону преобладания ТЬ2-ответа, при этом недостаточность Thl/IFNy-ответа нередко является результатом дефекта макрофагов, не способных продуцировать цитокины, необходимые для запуска этого ответа (Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000).

Выявленная недостаточность ТЫ-иммунного ответа определила важность изучения продукции основного маркера Th2 иммунного ответа - IL4, который в большинстве случаев выступает в качестве антагониста IFNy при воздействии на макрофаги, Т-хелперы, B-лимфоциты (Федосеев Г.Б., 2001).

При оценке содержания IL4 выявлено достоверно значимое, более чем двукратное повышение как спонтанной, так и индуцированной ФГА и ЛПС продукции данного цитокина во всех изученных группах пациентов по сравнению с практически здоровыми лицами, однако, различий между стадиями обострения и ремиссии БА не получено. Гиперпродукция IL4 также свидетельствует о сдвиге в сторону преобладания ТЬ2-ответа, что характерно при наличии атопии (Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000). При этом ожидаемого повышения продукции IL4 в фазу обострения по сравнению с фазой клинической ремиссии получено не было, что, возможно, связано с некоторым истощением резервных возможностей активации основных продуцентов IL4, или его предшествующим синтезом и секрецией.

Не менее важна оценка продукции ILIO как основного альтернативного регулирующего цитокина для макрофагов, который ингибирует все свойства и функции макрофагов, стимулируемые IFNy и IL4. ILIO является общим для всех Т-хелперов супрессирующим «противовоспалительным» цитокином, эффективным ограничителем воспаления, однако, превалирующе ингибирующим все-таки клеточный ТЫ -иммунный ответ (Федосеев Г.Б., 2001).

При оценке содержания ILIO выявлено достоверно значимое, более чем двукратное повышение как спонтанной, так и индуцированной ФГА и ЛПС продукции во всех изученных группах пациентов по сравнению с практически здоровыми лицами, при этом у больных атопической БА в стадию обострения данные показатели достоверно выше, чем в стадию клинической ремиссии процесса.

Таким образом, ILIO у больных атопической и смешанной БА в фазу обострения значительно растет, особенно его спонтанный уровень продукции, что свидетельствует о включении механизмов обратной связи ограничения воспалительного процесса в организме человека.

При проведении анализа соотношений показателей спонтанной и индуцированной продукции IFNy к IL4 и IFNy, ILlß, IL4 к ILIO выявлены следующие изменения: у больных атопической БА коэффицент соотношения уровней IFNy и IL4, характеризующий Thl/Th2 девиацию иммунного ответа,

по сравнению с контрольной группой снижен как при спонтанной продукции, так и при индуцированной продукции, но статистическая значимость снижения этого соотношения имеет место в случаях стимуляции ФГА и ЛПС, независимо от фазы заболевания, что свидетельствует о выраженной направленности иммунного ответа по Th2 типу.

Соотношение IFNy к ILIO у больных атопической БА в фазе клинической ремиссии по сравнению с практически здоровыми лицами достоверно снижено при индукции ЛПС, а у больных атопической БА в фазе обострения этот коэффициент снижен и при спонтанной, и при индуцированной продукции как по сравнению с практически здоровыми лицами, так и с больными в фазе ремиссии, что свидетельствует о подавлении Thl-иммунного ответа.

Соотношение продукции ILlß к ILIO не изменяется у больных атопической БА в фазе ремиссии и достоверно снижено в фазе обострения по сравнению с группой контроля в связи с включением механизмов ограничения воспаления при обострении процесса.

Коэффициент соотношения продукции IL4 к ILIO достоверно снижен только при спонтанной и ФГА-индуцированной продукции у больных атопической БА в фазе обострения относительно пациентов в фазе ремиссии.

У больных смешанной БА в фазе клинической ремиссии по сравнению с практически здоровыми лицами коэффицент соотношения уровней IFNy и IL4, характеризующий Thl/Th2 девиацию иммунного ответа, снижен при индуцированной продукции, а в фазе обострения - как при спонтанной, так и при индуцированной продукции по сравнению с контрольной группой, а также при ЛПС-индуцированной продукции по сравнению с больными в фазе ремиссии, что свидетельствует о более выраженном преобладании Th2 типа иммунного ответа и при обострении смешанной БА.

Соотношение продукции IFNy к ILIO у больных смешанной Б А в фазе клинической ремиссии по сравнению с группой контроля достоверно снижено при индукции ФГА и ЛПС, а у больных смешанной БА в фазе обострения этот коэффициент снижен и при спонтанной, и при индуцированной продукции по сравнению с практически здоровыми лицами, а спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции также по сравнению с больными в фазе клинической ремиссии, что свидетельствует как о подавлении Thl-иммунного ответа, так и о включении противовоспалительных механизмов, особенно выраженном при обострении заболевания, как и у больных атопической БА.

Соотношение продукции ILlß к ILIO как при спонтанной, так и при индуцированной продукции достоверно снижено у больных смешанной БА, независимо от фазы заболевания по сравнению с практически здоровыми лицами.

При изучении коэффициента соотношения продукции IL4 к ILIO у больных смешанной БА достоверно значимых отличий выявлено не было.

Таблица б.

Показатели продукции ILlß, IFNy, IL4 и ILIO у больных БА в фазы ремиссии и обострения заболевания_

Показатели обследованных лиц Стат. показатели Практически здоровые лица БА атопическая, ремиссия БА атопическая, обострение БА смешанная, ремиссия БА смешанная, обострение

п=18 п=16 п = 24 п = 26 п = 26

Спонтанная продукция 1Ы|3, пг/мл М±т 544,96±71,11 458,87±55,66 388,61±36,19 214,89±31,90* 400,14±76,56

ФГА индуцированная продукция 1ЫР, пг/мл М±т 649,78±61Д5 434,60±79,86 471,13±57,20* 323,31±54,25* 430,41±74,65*

ЛПС индуцированная продукция 1Ыр, пг/мл Mim 703,44±53,64 549,53±59,37 577,32±51,71* 312,10±40,29* 463,58±75,40*

ИС (ФГА индуцированная продукция 1ЫР / спонтанная продукция 1Ы|3), у.е. М±т 1,4±0,22 0,91±0,10 1,44±0,22 2,18±0,30 1,90±0,47

ИС (ЛПС индуцированная продукция ГЕЛР / спонтанная продукция 11ЛР), у.е. М±т 1,59±0,26 1,26±0,06 1,48±0,07 3,21±0,71 4,08±1,76

Спонтанная продукция ПТ^Гу, пг/мл М+т 569,28±127,36 613,70±98,56 417,86±54,50 806,49±150,75 349,18±67,42**

ФГА индуцированная продукция 1КЫу, пг/мл М±т 7426,36±545,42 5356,85±749,87 4768,80±575,44* 3523,84±555,69* 6365,12±793,12

ЛПС индуцированная продукция 1КЫу, пг/мл М+т 2577,63±686,03 1438,03±517,39* 818,12±111,97* Ш4,70±210,13 1096,13±434,62*

ИС (ФГА индуцированная продукция ШЧу / спонтанная продукция ТИКу), у.е. М±т 26,70±6,25 14,68±3,59 17,02±3,09 10,45±2,41* 34,06±6,16**

ИС (ЛПС индуцированная продукция 1КЫу / спонтанная продукция И-Ыу), у.е. М±т 12,56±6,39 1,82±0,36* 2,21±0,36* 2,48±0,57* 3,79±1,04*

Показатели обследованных лиц Стат. показатели Практически здоровые лица БА атопическая, ремиссия БА атопическая, обострение БА смешанная, ремиссия БА смешанная, обострение

п =18 п = 16 п = 24 п = 26 п = 26

Спонтанная продукция 1L4, пг/мл М±т 23,46±5,18 57,44±3,59* 59,19±4,00* 55,24±4,66* 55,96±4,22*

ФГА индуцированная продукция IL4, пг/мл М±т 26,15±5,27 71,92±9,22* 69,12±7,34* 72,32±5,27* 67,71±4,85*

ЛПС индуцированная продукция IL4, пг/мл М±т 28,84±6,80 60,63±5,82* 72,08±8,48* 60,38±4,84* 65,05±4,75*

ИС (ФГА индуцированная продукция IL4 / спонтанная продукция IL4), у.е. М±т 1,45±0,28 1,23±0,11 1,1б±0,08 1,43±0,10 1,37±0,10

ИС (ЛПС индуцированная продукция IL4 / спонтанная продукция IL4), у.е. М±т 1,44±0,29 1,12±0,15 1,29±0,13 1,13±0,12 1,29±0,14

Спонтанная продукция ILIO, пг/мл М±т 31,75±5,35 91,75±23,69 171,43±23,18* ** 174,40±35,74* 190,50±31,79*

ФГА индуцированная продукция ILIO, пг/мл М±т 135,32±18,45 324,63±91,41 615,56±33,91* ** 524,92±45,04* 576,95±91,56*

ЛПС индуцированная продукция ILIO, пг/мл М±т 69,44±7,60 189,97±31,82* 378,96±100,82* 364,60±81,47* 243,71±38,07*

ИС (ФГА индуцированная продукция ILIO / спонтанная продукция ILIO), у.е. М±т 5,21 ±0,71 3,10±0,73 6,41±1,22 7,00±1,23 4,46±0,82

ИС (ЛПС индуцированная продукция ILIO / спонтанная продукция ILIO), у.е. М±т 2,83±0,51 4,9 7± 1,43 3,85±1,37 2,77±0,45 1,50±0,15*

Примечание: *- достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

** - достоверность различий показателей больных атопической и смешанной БА в фазу обострения по сравнению с группой больных БА в

фазу клинической ремиссии по и-критерию Манна-Уитни: р<0,05

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что у больных атопической и смешанной БА, независимо от фазы заболевания, отмечаются однонаправленные изменения в продукции цитокинов: снижение продукции ELlß и IFNy и увеличение продукции IL4 и ILIO в фазе ремиссии при относительном снижении IL4 в фазе обострения, что свидетельствует о выраженной направленности иммунного ответа по Th2 типу, имеющейся даже в ремиссию заболевания.

Учитывая, что при смешанной БА в фазе обострения, мы выявили наиболее выраженные изменения продукции цитокинов, мы предполагаем, что снижение хемотаксического ответа на естественный цитокиновый комплекс у данной группы больных связано, в первую очередь, с изменением продукции цитокинов и, прежде всего, с гиперпродукцией ILIO.

Таким образом, у больных атопической и смешанной БА можно предположить следующую цепь событий: изменение хемотаксического ответа на причинно-значимый аллерген у больных атопической БА и на инфекционный агент у больных смешанной БА, влекущее за собой нарушение регуляторных свойств нейтрофилов, снижение их способности активировать иммунную систему, что проявляется в выраженном дисбалансе основных звеньев иммунной системы, снижение продукции IFNy и ILlß, повышение продукции JL4 и ILIO в фазу клинической ремиссии при относительном снижении IL4 в фазу обострения. Такие изменения способствуют поддержанию длительного воспалительного процесса как в фазе обострения, так и сохранение его в период клинической ремиссии.

Выводы

1. У больных атопической и смешанной бронхиальной астмой наблюдается угнетение фагоцитарной функции и снижение резерва кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови, что свидетельствует о снижении их способности отвечать на дополнительную стимуляцию образованием факторов, способствующих завершенному фагоцитозу.

2. У больных атопической бронхиальной астмой наблюдается феномен хемотаксической деактивации при воздействии причинно-значимого аллергена при отсутствии метаболической активации нейтрофилов в зоне хемотаксического ответа, а у больных смешанной бронхиальной астмой — при воздействии инфекционного агента - взвеси суточной культуры St.aureus штамм «Cowan 209» - на фоне активации неспецифических эстераз как в фазе обострения, так и в фазе клинической ремиссии, что способствует длительному поддержанию воспалительного процесса.

3. При иммунофенотипировании лимфоцитов у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой отмечается снижение числа клеток,

экспрессирующих активационные рецепторы, независимо от фазы заболевания.

4. У больных атопической бронхиальной астмой в стадию обострения по сравнению с группой больных атопической бронхиальной астмой в фазу клинической ремиссии увеличивается соотношение CD4+/CD8+ за счет повышения количества CD4+ лимфоцитов при одновременном снижении CD8+ клеток. У больных смешанной бронхиальной астмой в стадию ремиссии по сравнению с группой практически здоровых лиц снижается соотношения CD4+/CD8+, что свидетельствует о формировании дисбаланса клеток иммунной системы с истощением функциональных резервов Т-хелперов. У больных смешанной бронхиальной астмой в стадии обострения повышается соотношение CD4+/CD8+ по сравнению с группой пациентов, находящихся в стадии клинической ремиссии, что характеризует активацию иммунной системы в стадию обострения смешанной бронхиальной астмы, однако, не достигающую ожидаемого уровня, что свидетельствует о сохранении выраженного дисбаланса клеток иммунной системы у данных лиц в период обострения.

5. У больных атопической и смешанной бронхиальной астмой, независимо от фазы заболевания, отмечаются однонаправленные изменения в продукции цитокинов: снижение продукции ILlß и IFNy и увеличение продукции IL4 и ILIO в фазу ремиссии при относительном снижении IL4 в фазе обострения, что свидетельствует о выраженной направленности иммунного ответа по Th2 типу, имеющейся даже в ремиссию заболевания.

Практические рекомендации

1. Для углубленной дифференциальной диагностики атопической и смешанной БА рекомендуется определять хемотаксис нейтрофилов к причинно-значимому аллергену и персистирующему инфекционному агенту.

2. У больных БА, помимо стандартного обследования иммунного статуса, необходимо оценивать адекватность функционирования систем регуляции иммунного ответа по уровню продукции цитокинов in vitro.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зурочка, A.B. Исследование спонтанной и индуцированной продукции цитокинов in vitro у больных с аллергопатологией в фазу клинической ремиссии заболевания и у условно-здоровых лиц с латентной сенситизацией / A.B. Зурочка, С.В. Квятковская, Е.Е.Дворчик, Е.В. Шестакова, A.C. Бастрон // Медицинская иммунология. - 2004. - Т. 6, № 6.-С. 551-556.

2. Городечный, П.П. Хемотаксис и адгезия нейтрофилов условно-здоровых доноров и больных синдромом раздраженного кишечника / П.П. Городечный, A.B. Зурочка, А.Н. Скороходов, Е.Е. Дворчик, Д.В. Погодин, В .А. Зурочка, Е.В. Шестакова, Е.С. Кремлева // Russian Journal of Immunology. - 2004. - Vol. 9. Supp. 1. - P. 13.

3. Дворчик, Е.Е. Выявление изменений параметров иммунной системы у больных бронхиальной астмой в зависимости от клинико-патогенетического варианта / Е.Е. Дворчик, A.B. Зурочка, ПЛ. Городечный, Е.В. Шестакова, JI.B. Рябова // Медицинская иммунология. - 2005. - Т. 7, № 2-3. - С. 132.

4. Дворчик, Е.Е. Оценка хемотаксической функции нейтрофилов больных бронхиальной астмой / Е.Е. Дворчик, A.B. Зурочка, Е.В. Шестакова, JI.B. Рябова // Иммунология Урала. - 2005. - №1 (4). - С. 171.

5. Дворчик, Е.Е. Изучение иммунологических особенностей больных бронхиальной астмой / Е.Е. Дворчик, A.B. Зурочка, С.В. Квятковская // «Здоровье и образование в XXI веке». Научные труды VI Международной научно-практической конференции. - Москва, 2005. - С. 154.

6. Дворчик, Е.Е. Миграционные возможности нейтрофилов у больных смешанной бронхиальной астмой / Е.Е. Дворчик И Вестник РГМУ. -2006. -№2 (49). - С. 20-21.

7. Дворчик, Е.Е. Исследование продукции цитокинов у больных атопической бронхиальной астмой / Е.Е. Дворчик, A.B. Зурочка, К.В. Никушкина II Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 201202.

8. Дворчик, Е.Е. Локомоторные особенности нейтрофилов больных бронхиальной астмой / Е.Е. Дворчик, A.B. Зурочка // Russian Journal of Immunology. - 2006. - Vol. 9. Supp. 3. - P. 84.

9. Дворчик, E.E. Изучение продукции цитокинов у больных смешанной бронхиальной астмой / Е.Е. Дворчик, A.B. Зурочка // Иммунология Урала. - 2006. - №1 (5). - С. 137.

ДВОРЧИК Елена Евгеньевна

ОЦЕНКА ПАРАМЕТРОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ С УЧЕТОМ ХЕМОТАКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ АТОПИЧЕСКОЙ И СМЕШАННОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ В ФАЗЫ КЛИНИЧЕСКОЙ РЕМИССИИ И ОБОСТРЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск-2009

Подготовлено к печати в издательстве «Челябинская государственная медицинская академия».

Лицензия № 01906. Отпечатано в ПЦ "ПРИНТМЕД". Заказ № 475/8. Подписано к печати 12.01.09 г. Объем 1 п.л. Формат 64x84. Гарнитура «Times New Roman суг». Бумага для офисной техники, 80 мг/м2. Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы

Направленная миграция является важнейшим проявлением реактивности нейтрофилов, основной смысл которой заключается в достижении объекта, вызвавшего активацию клетки (очаг тканевой деструкции, воспаления). Активированный нейтрофил, пришедший в очаг, решает эффекторные задачи одним из двух способов: либо с помощью фагоцитоза, либо путем секреции биологически активных продуктов (Зурочка A.B., 1991; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Долгушин И.И. и др., 2006). Сложность клеточных и гуморальных механизмов, которые обеспечивают хемотаксис, делает его одной из самых уязвимых форм реактивности нейтрофила (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Характер изменений фагоцитарной и хемотаксической активности нейтрофилов подробно изучен при многих гнойно-воспалительных процессах, при острой патологии и травматической болезни (Зурочка A.B., 1991; Студеникина Ю.Н., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Злакоманова О.Н., 2002; Долгушин И.И. и др., 2006). Не менее важна роль фагоцитов при аллергопатологии, в частности, бронхиальной астме. Однако в формировании данного заболевания часто важную патогенетическую роль играет инфекционное звено, что, с одной стороны, может поддерживать активность аллергического воспаления, а, с другой стороны, аллергическое заболевание при длительном течении (или лечении) приводит к изменениям иммунного статуса по типу вторичной иммунной дисфункции, клиническим проявлением которой являются рецидивирующие хронические воспалительные заболевания. С точки зрения клинико-лабораторной оценки, такие поражения иммунной системы являются наиболее сложными для верификации иммунологического диагноза (Федосеева В.Н. и др., 2004) и требуют индивидуальной тактики ведения больного и иммунокоррекции этих состояний, где важную роль играют именно фагоциты, обеспечивающие первую линию защиты от инфекции и играющие немаловажную роль в поддержании аллергического воспаления в различных органах и системах. Таким образом, формирование инфекционной зависимости у этих больных БА происходит в результате воздействия различных инфекционных агентов; первые клинические проявления или обострения течения БА связаны с воздействием инфекционных факторов, а улучшение состояния возникает после снижения патогенного влияния инфекционного агента. В настоящее время очевидна необходимость диагностики активной и скрытой инфекции у таких больных, так как это тесно связано с выбором адекватной терапии, что определяет актуальность и служит обоснованием цели настоящего исследования.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение характера изменений хемотаксической и фагоцитарной функции нейтрофилов периферической крови у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой на фоне изменения иммунного статуса в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания.

Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить состояние фагоцитарного звена иммунной системы у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания.

2. Определить характер хемотаксической активности фагоцитов на причинно-значимые аллергены, бактериальные хемоаттрактанты, С5а фрагмент системы комплемента и естественный цитокиновый комплекс у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания.

3. Провести сравнительное исследование состояния лабораторных параметров лимфоцитарного и гуморального звеньев иммунитета у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания.

4. Определить уровень спонтанной и индуцированной продукции цитокинов у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания для оценки состояния регуляторного звена иммунной системы.

Положения, выносимые на защиту

1. У больных атопической и смешанной бронхиальной астмой наблюдается угнетение фагоцитарной функции и снижение резерва кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови независимо от фазы процесса.

2. У больных атопической бронхиальной астмой наблюдается феномен хемотаксической деактивации при воздействии причинно-значимого аллергена при отсутствии метаболической активации нейтрофилов в зоне хемотаксического ответа, а у больных смешанной бронхиальной астмой - при воздействии инфекционного агента - взвеси суточной культуры Staphylococcus aureus штамм «Cowan 209» - на фоне активации неспецифических эстераз как в фазе обострения, так и в фазе клинической ремиссии.

3. При иммунофенотипировании лимфоцитов у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой отмечается снижение числа клеток, экспрессирующих активационные рецепторы, независимо от фазы заболевания.

4. У больных атопической бронхиальной астмой в стадии обострения по сравнению с группой больных атопической бронхиальной астмой в фазе клинической ремиссии увеличивается соотношение CD4+/CD8+. У больных смешанной бронхиальной астмой в стадии ремиссии по сравнению с группой практически здоровых лиц снижается соотношения CD4+/CD8+. У больных смешанной бронхиальной астмой в стадии обострения по сравнению с группой пациентов, находящихся в стадии клинической ремиссии, повышается соотношение CD4+/CD8+ за счет увеличения количества СВ4-позитивных лимфоцитов на фоне снижения уровня CD8+ клеток.

5. У больных атопической и смешанной бронхиальной астмой, независимо от фазы заболевания, отмечаются однонаправленные изменения в продукции цитокинов: снижение продукции IL lß и IFNy и увеличение продукции IL4 и ILIO в фазе ремиссии при относительном снижении IL4 в фазе обострения.

Научная новизна

Впервые определен характер хемотаксической активности нейтрофилов на причинно-значимый аллерген у больных атопической и смешанной БА в фазы клинической ремиссии и обострения заболевания. Изучен хемотаксический ответ на бактериальный хемоаттрактант, С5а фрагмент комплемента и естественный цитокиновый комплекс, что позволило выяснить некоторые особенности формирования ответа фагоцитарных клеток у таких больных и выявить значимость этих нарушений в формировании данной патологии. Кроме того, изучены лабораторные показатели иммунной системы: иммунофенотип лимфоцитов, фагоцитарные свойства, кислородзависимый метаболизм, лизосомальная активность, миграционные характеристики нейтрофилов периферической крови, гуморальное звено иммунитета, цитокиновый статус у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в зависимости от фазы клинической ремиссии или обострения заболевания.

Впервые показано, что при воздействии специфических хемоаттрактантов - взвеси суточной культуры S. aureus штамм «Cowan 209» и специфического аллергена, выявлен феномен хемотаксической деактивации к инфекционному агенту на фоне активации неспецифических эстераз у больных смешанной БА как в фазе обострения, так и в фазе клинической ремиссии, а к причинно-значимому аллергену у больных атопической БА, также независимо от стадии заболевания, при отсутствии метаболической активации нейтрофилов в зоне хемотаксического ответа, что способствует длительному поддержанию аллергического воспаления. Отсутствие феномена хематаксической деактивации при ответе на аллерген у больных смешанной БА, возможно, свидетельствует о перераспределении роли аллергена и микроорганизма в формировании данной патологии в сторону инфекционного агента. Подана заявка на патент РФ «Способ выявления нарушения функции фагоцитов при развитии рецидивирующих инфекционных процессов» № 2007108220.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость результатов исследования состоит в расширении знаний о характере иммунологических нарушений и особенностях функциональной активности нейтрофилов у больных атопической и смешанной БА в фазы клинической ремиссии или обострения заболевания.

Выявленные нарушения хемотаксических реакций нейтрофилов периферической крови и оценка их патогенетического значения, а также зафиксированные разнонаправленные изменения состояния иммунной системы позволят разработать новые методы диагностики нарушений иммунной системы у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой в зависимости от фазы клинической ремиссии или обострения заболевания. На основе исследования разработан метод выявления нарушения функций фагоцитов при развитии рецидивирующих инфекционных процессов.

Апробация работы

Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (г. Санкт-Петербург, 2005, 2006, 2007), Конференции иммунологов Урала (г. Челябинск, 2003; г. Оренбург, 2006). Работа была поддержана грантом Правительства Челябинской области (2004).

Апробация диссертации была проведена на совместном заседании НИИ иммунологии, кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, самостоятельного курса клинической лабораторной диагностики, кафедры иммунологии и аллергологии, ЦНИЛ ЧелГМА (2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации

ВЫВОДЫ

1. У больных атопической и смешанной бронхиальной астмой наблюдается угнетение фагоцитарной функции и снижение резерва кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови, что свидетельствует о снижении их способности отвечать на дополнительную стимуляцию образованием факторов, способствующих завершенному фагоцитозу.

2. У больных атопической бронхиальной астмой наблюдается феномен хемотаксической деактивации при воздействии причинно-значимого аллергена при отсутствии метаболической активации нейтрофилов в зоне хемотаксического ответа, а у больных смешанной бронхиальной астмой - при воздействии инфекционного агента - взвеси суточной культуры St.aureus штамм «Cowan 209» -на фоне активации неспецифических эстераз как в фазе обострения, так и в фазе клинической ремиссии, что способствует длительному поддержанию воспалительного процесса.

3. При иммунофенотипировании лимфоцитов у больных атопической и смешанной бронхиальной астмой отмечается снижение числа клеток, экспрессирующих рецепторы активации, независимо от фазы заболевания.

4. У больных атопической бронхиальной астмой в стадии обострения по сравнению с группой больных атопической бронхиальной астмой в фазе клинической ремиссии увеличивается соотношение CD4+/CD8+ за счет повышения количества CD4+ лимфоцитов при одновременном снижении CD8+ клеток. У больных смешанной бронхиальной астмой в стадию ремиссии по сравнению с группой практически здоровых лиц снижается соотношения CD4+/CD8+, что свидетельствует о формировании дисбаланса клеток иммунной системы с истощением функциональных резервов Т-хелперов. У больных смешанной бронхиальной астмой в стадии обострения повышается соотношение CD4+/CD8+ по сравнению с группой пациентов, находящихся в стадии клинической ремиссии, что характеризует активацию иммунной системы в стадии обострения смешанной бронхиальной астмы, однако, не достигающую ожидаемого уровня, что свидетельствует о сохранении выраженного дисбаланса клеток иммунной системы у данных лиц в период обострения.

5. У больных атопической и смешанной бронхиальной астмой, независимо от фазы заболевания, отмечаются однонаправленные изменения в продукции цитокинов: снижение продукции IL lß и IFNy и увеличение продукции IL4 и ILIO в фазе ремиссии, при относительном снижении IL4 в фазе обострения, что свидетельствует о выраженной направленности иммунного ответа по Th2 типу, имеющейся даже в ремиссию заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для углубленной дифференциальной диагностики атопической и смешанной БА рекомендуется определять хемотаксис нейтрофилов к причинно-значимому аллергену и персистирующему инфекционному агенту.

2. У больных БА, помимо стандартного обследования иммунного статуса, необходимо оценивать адекватность функционирования систем регуляции иммунного ответа по уровню продукции цитокинов in vitro.