Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка изменения функций иммунной системы и коррекция миелопептидами в ранний период проникающего ранения глаза (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

БЕРКАСОВА Наталия Леонидовна

ОЦЕНКА ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИЙ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И КОРРЕКЦИЯ МИЕЛОПЕПТИДАМИ В РАННИЙ ПЕРИОД ПРОНИКАЮЩЕГО РАНЕНИЯ ГЛАЗА

(экспериментальное исследование)

14 00 36 - аллергология и иммунология 14 00 16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск 2008

ооз

17 123

003171231

Работа выполнена в лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, г Пермь

Научные руководители:

доктор медицинских наук

Гаврилова Татьяна Валерьевна

кандидат медицинских наук, доцент

Шилов Юрий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Цейликман Вадим Эдуардович

доктор медицинских наук, профессор

Фролов Борис Александрович

Ведущая организация: ГНЦ РФ "Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства"

Защита состоится "¿3" WOHJ 2008 г в i О часов

на заседании диссертационного совета Д 208 117 03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" по адресу 454092, г Челябинск, ул Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию".

Автореферат разослан "Л dU&J 2008 г Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Л Ф Телешева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иммунная система играет важную роль в патогенезе воспалительного процесса поврежденного глаза (Flueckiger F et al, 2005, Li Z et al, 2006, 2007, Okada Y et al, 2007, Petrescu MS et al, 2007) Иммунная привилегированность органа зрения и его устойчивость к повреждающему действию различных факторов определяется особенностями его местной организации и системных механизмов ответа на антиген (Novak N et al, 2003, Streilem J W , 2003, Kaplan H J, Streilein J W, 2007, Henry J et al, 2007) Проникающее ранение глаза служит примером ограниченного по объему повреждения, при котором развиваются не только локальные реакции с нарушением механизмов иммуносупрессии непосредственно в органе зрения, но и выявляются признаки вторичной иммунной недостаточности (Архипова JIT и др, 1999, Черешнева MB и др , 2001,2004а, 2006, Слепова О С , 2005)

Кроме того, особенностью ранения органа зрения является возможность аутоиммунных повреждений здорового глаза (Архипова JIТ, 1987, 2006, Гун-дорова Р А, 2006) Это предполагает обязательное включение в комплексную терапию помимо антибактериальных и противовоспалительных препаратов иммунодепрессантов, в частности глюкокортикоидов (Архипова Л Т, Захарова Г П , 1997, Flueckiger F et al, 2005, Lim L et al, 2006) В настоящее время существует проблема поиска препаратов, избирательно действующих на конкретные звенья иммунной системы и не оказывающих побочных эффектов (Сепиа-швили Р И , 2002, Хаитов Р М , Пинегин Б В , 2001) Для оптимизации течения процессов регенерации при травматическом воспалении и коррекции изменения функций иммунной системы перспективным представляется подход с включением в комплексную терапию наряду с вышеуказанными препаратами отечественных иммуномодуляторов (Черешнева MB и др , 2001, 2004а, 2006, Гаврилова Т В , 2002, 2006) Показано, что при совместном введении препаратов стандартной терапии и полиоксидония при экспериментальном ранении глаза отмечается наименьшая степень реактивных изменений в тканях и более упорядоченное компактное бессосудистое строение рубцовой ткани, значительно снижается воспалительная клеточная инфильтрация зоны повреждения (Черешнева MB и др, 2004) Положительные результаты отмечены и при включении миелопида в комплексное лечение пациентов с ранением глаза (Во-лик Е И, 2000, Черешнева М В , 2000) Последний представляет собой натив-ную смесь иммунорегуляторных пептидов костного мозга - миелопептидов (МП), выделенных из активной фракции надосадочной жидкости культуры клеток костного мозга млекопитающих (Петров РВ , Михайлова А А, 1969, Михайлова А А , 1978, 1988, 2001, 2005, Петров Р В и др, 2000, 2004, 2005) В середине 1990-х гг выделены, идентифицированы и синтезированы индивидуальные миелопептиды Показано, что МП-1 регулирует иммунной ответ, МП-2 тормозит рост опухолей, МП-3 модулирует активность макрофагального звена

иммунитета, МП-4, МП-5 и МП-6 обладают дифференцировочной активностью.

В связи с тем что в клинических условиях не всегда удается четко дифференцировать нарушения, вызванные самой травмой, и изменения, развивающиеся в результате лечения, представлялось целесообразным в эксперименте исследовать изменения функций иммунной системы и влияние на них миело-пептидов в ранний травматический период проникающего ранения глаза

Цель работы - исследование изменений функций иммунной системы и возможности их коррекции миелопидом и миелопептидами МП-1 и МП-3 в ранний период проникающего ранения глаза в эксперименте Задачи исследования

1 Оценить изменение антителообразования, выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа, клеточности органов лимфомиелоидного комплекса при проникающем ранении глаза и включении в экспериментальную терапию миелопептидов

2 Исследовать изменение фагоцитарной активности клеток регионарного лимфатического узла, периферической крови и брюшной полости у экспериментальных животных

3 Оценить морфологическую картину травматического воспаления при проникающем ранении глаза в условиях разных схем введения миелопептидов

Научная новизна. В экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза крыс популяции \Vistar в ранний травматический период выявлены новые закономерности течения травматического воспаления и изменения функций иммунной системы в условиях введения отечественного им-муномодулятора миелопида, иммунорегуляторных пептидов МП-1 и МП-3 при разных схемах терапии

Показано, что миелопептиды отменяют ряд эффектов травмы и стандартной терапии на функции фагоцитирующих клеток периферической крови, модулируют функции перитонеальных мононуклеарных фагоцитов и фагоцитарную активность регионарного по отношению к месту иммунизации лимфатического узла Включение в патогенетическую терапию травмированных животных миелопида и МП-1 нивелирует депрессию антителообразования, вызванную травмой и применением препаратов стандартной терапии, но не отменяет супрессию реакции гиперчувствителыюсти замедленного типа у травмированных животных при введении тимусзависимого ксеноантигена

Впервые показана способность миелопида и МП-3 уменьшать воспалительную инфильтрацию в зоне повреждения и стимулировать регенерацию в ранние сроки травматического воспаления органа зрения

Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане исследования значительно расширяют представления о типовых изменениях функций иммунной системы при проникающем ранении глаза и дополня-

ют сведения о действии миелопептидов в ранний период данного вида патологии в условиях разных схем экспериментальной патогене гической терапии Обоснована способность миелопептидов регулировать регенерацию при травматическом воспалении

В практическом плане полученные результаты демонстрируют перспективность дальнейшего изучения возможности использования миелопептидов для коррекции иммунных нарушений при проникающем ранении глаза в ранний травматический период.

Внедрение в практику. Основные положения диссертации используются в лекционных курсах "Иммунология", "Экспериментальные модели в патологии", "Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия" кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета ГОУ ВПО "Пермский государственный университет", при чтении лекций студентам, ординаторам, врачам на кафедре офтальмологии ГОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия им акад Е А Вагнера"

Положения, выносимые на защиту

1 В раннем периоде проникающего ранения глаза развивается супрессия антителообразования и реакции гиперчувствительности замедленного типа Введение препаратов стандартной терапии усиливает депрессию антителообразования, включение в терапию травмированных животных миелопида и МП-1 нивелирует угнетение антителогенеза Совместное применение миелопептидов с препаратами стандартной терапии не отменяет супрессию реакции гипсрчув-ствителыюсти замедленного типа у травмированных животных при введении тимусзависимого ксеноантигена

2. Миелопептиды не отменяют снижение клеточности регионарного и отдаленного лимфатических узлов, селезенки и тимуса, вызванное препаратами стандартной терапии при проникающем ранении глаза Миелопид способствует повышению числа эритробластов, миелобластов и зрелых клеток гранулоци-тарного ростка костного мозга

3 Миелопептиды отменяют ряд эффектов травмы и стандартной терапии на функции фагоцитирующих клеток периферической крови, модулируют функции перитонеальных монопуклеарных фагоцитов и фагоцитарную активность клеток регионарного по отношению к месту иммунизации лимфатического узла

4 Включение миелопида и МП-3 в комплексную терапию приводит к снижению воспалительной клеточной инфильтрации в рубце и перифокальных тканях, ускоряет формирование зрелых волокнистых структур в рубце, способствует эпителизации зоны повреждения роговицы при проникающем ранении глаза.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены и обсуждены на Объединенном иммунологическом форуме, Екатерин-

бург, 2004, VI Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды 1СЕР-2005", Пермь-Казань-Пермь, 2005, IX, X, XI Международной Путинской школе-конференции молодых ученых, Пущино, 2005, 2006, 2007, IV, V, VI Конференциях иммунологов Урала, Уфа, 2005, Оренбург, 2006, Ижевск, 2007, Научно-практической конференции "Иммунология вчера, сегодня, завтра", Пермь, 2005, Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н Н Кеворкова "Иммунитет и аллергия от эксперимента к клинике", Пермь, 2006, Всероссийской научно-практической конференции "Офтальмоиммунология итоги и перспективы", Москва, 2007, Региональной конференции молодых ученых с международным участием "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии", Пермь, 2007 Основные положения диссертации изложены в 20 печатных работах Объем и структура диссертации. Диссертация представляет собой рукопись па русском языке объемом 197 страниц машинописного текста Состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, содержащего 188 источников на русском и 165 на иностранном языках Работа иллюстрирована 43 таблицами и 6 рисунками

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований по теме "Механизм им-муномодулирующих эффектов гормонов, продукция которых изменяется на фоне экологического воздействия" (номер госрегистрации 01 9 70 009927). Исследования поддержаны грантами РФФИ 06-04-48897, 06-04-49001, 08-04-00424-а и 08-04-00517-а, Программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" и Интеграционного проекта фундаментальных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с СО РАН "Коррекция стрессорпых и травматических нарушений функций иммунной системы в экспериментальной модели проникающего ранения глаза"

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. Экспериментальные исследования выполнены на 114 крысах-самцах популяции \Vistar средней массой 216 г

В оригинальной экспериментальной модели проникающего ранения глаза (ПРГ) у крыс (Черешнева М В и др, 2000) исследовали действие травмы и миелопептидов на иммунный ответ к тимусзависимому ксеноантигену, функции фагоцитирующих клеток и локальных реакций при травматическом воспалении Проникающее ранение правого глаза наносили животным 8 опытных групп в специально сконструированном приспособлении-фиксаторе с помощью микролезвия в области лимба (пограничная область между склерой и роговицей) под местной анестезией 2% раствором новокаина При этом происходило ранение роговицы, склеры, сосудистого тракта Сформированы следующие экспериментальные группы 1-я (п=19) - ПРГ и введение изотоническою рас-

твора хлорида натрия, 2-я (п=10) - ПРГ со стандартной терапией, 3-я (п=10) -ПРГ со стандартной терапией и введением миелопида, 4-я (п=10) - ПРГ со стандартной терапией и введением МП-1, 5-я (п=10) - ПРГ со стандартной терапией и введением МП-3, 6-я (п=10) - ПРГ с введением миелопида, 7-я (п=10)

- ПРГ с введением МП-1, 8-я (п=10) - ПРГ с введением МП-3 Контролем служили нетравмированные крысы 9-й группы (п=25), которые получали изотонический раствор хлорида натрия Миелопептиды вводили по 0,06 мг/кг внутри-брюшинно через 6 ч, на 2-е и 4-е сутки после нанесения травмы* Дозы миело-пептидов и схема их введения обоснованы ранее в работах Р В Петрова и А.А Михайловой (Петров Р В и др , 1999,2000) Стандартная терапия экстраполирована со схем, используемых в клинике (Черешнева MB и др , 2000), и включала ампициллина натриевую соль 12,5 мг/кг массы тела, гентамицина сульфат 1,5 мг/кг, диклофенак натрия 0,5 мг/кг - два раза в день, дексаметазон 0,1 мг/кг

- один раз в день, все препараты вводили подкожно. Для моделирования локального иммунного ответа через 7 ч после нанесения травмы всех животных сенсибилизировали эритроцитами барана (ЭБ) (108 клеток вводили подкожно в подошвенную поверхность правой стопы) На 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена (109 клеток ЭБ подкожно в правую стопу, в левую контрольную стопу - 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия) Выбор схемы иммунизации основывался на экспериментальных данных по исследованию зависимости выраженности иммунного ответа от дозы и способа введения антигена мышам (Гусев Е Ю , 1996) и крысам (Кеворков Н Н и др, 1993, Shilov Ju I etal, 2001) Животных выводили из эксперимента на 5-е сутки методом декапитации под эфирным наркозом Оценивали гуморальный ответ по числу антителообразующих клеток (АОК) в регионарном по отношению к месту иммунизации (правом подколенном) и отдаленном (левом подколенном) лимфатических узлах, селезенке методом локального гемолиза в геле агарозы (Jeme N К , Nordin А А , 1963), выраженность иммунного воспаления при реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) - путем регистрации толщины (инженерным микрометром) опытной и контрольной стопы (Toichi Е et al, 1997), изменение числа ядросодержащих клеток (ЯСК) в органах лимфо-миелоидного комплекса Оценивали показатели миелограммы (Козинец И А и др, 2002) Исследовали фагоцитарную активность клеток регионарного лимфатического узла (Shilov Ju I. et al, 2001), лейкоцитов периферической крови (Каштан ВН, 1996, Shilov Jul, Orlova EG, 2003), перитонеальных фагоцитов (Шилов Ю И, Ланин Д В , 2001) по отношению к формалинизированным ЭБ

После энуклеации глазные яблоки животных обезвоживали в спиртах восходящей крепости Материал заливали в парафиновые блоки Готовили се-

Выражаю благодарность д м н , профессору А А Михайловой за любезно представленные миелопептиды

рийные срезы толщиной 3-5 микрон, окрашивали гематоксилином и эозином, на коллагеновые волокна - по Ван-Гизону, на эластические волокна - по Вей-герту Исследование патоморфологических изменений глаз проводили совместно с зав лабораторией морфологии Института иммунологии и физиологии УрО РАН, к м н С Ю Медведевой йене того же института, к м и Н Б Крохиной Измерения проводили при 10 случайных наложениях сетки на структуры рубца и околорубцовую ткань За единицу площади принимали 0,01 мм2 окулярной стереометрической сетки Г Г Автандилова Оценивали количество (плотность) коллагеновых и эластических волокон, фибробластов, клеток воспалительного инфильтрата в рубце, количество макрофагов, лимфоцитов, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов, плазматических клеток в прилежащих к рубцу тканях в единице площади Митотическую активность многослойного плоского эпителия (МПЭ) роговицы глаза в контрольной и опытных группах животных определяли по митотическому индексу, который выражали в 7оо.

Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики, дисперсионного анализа, апостериорного критерия Дункана (post-hoc Duncan's test) и LSD-теста для множественного сравнения между группами Результаты в большинстве таблиц и рисунков представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±ш) Данные по числу АОК с учетом их log-нормального распределения предварительно преобразовывали в значения logi0 для количества АОК (Лозовой ВП и др, 1989) Целесообразность подобного преобразования подтверждена предварительным анализом распределения логарифмированных и исходных значений

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на иммунный ответ к тимусзависимому ксеноантигену в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза

Изменение выраженности антителообразования

Наибольшие изменения в условиях использованной схемы иммунизации с увеличением числа АОК выявлены в регионарном лимфатическом узле (табл 1) В отдаленном лимфатическом узле количество АОК приближается к значениям неиммунизированных животных, данный показатель в селезенке существенно ниже, чем при развитии системного иммунного ответа (Кеворков Н Н и др, 1993) В ранний травматический период у животных с ПРГ (1-я группа) выявлено снижение абсолютного (см табл 1) и относительного числа АОК в регионарном лимфатическом узле, относительного количества АОК в отдаленном лимфатическом узле и селезенке (р<0,05, данные не приводятся) Введение препаратов стандартной терапии (2-я группа) приводит к выраженной супрессии гуморального иммунного ответа в исследуемых органах (см табл 1) Применение миелопида или МП-1 совместно с препаратами стандартной терапии (3-я и 4-я группы) отменяет супресснвное действие последней на антшелообра-

Таблица 1

Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на число АОК и ЯСК в регионарном и отдаленном лимфатических узлах, селезенке

Груп- Экспериментальное Регионарный лимфатический узел Отдаленный лимс шическийузел Селезенка

па воздействие число АОК число ЯСК число АОК число ЯСК число АОК число ЯСК

на орган, на орган, на орган, на орган, на орган, на орган,

Ь&о (хЮ6) 1о&о (хЮ6) (х10^

1 ПРГ 2,9926*0,0944+ 20,012,1 1,046Ш,1083 12,9*1,7 2,0046±0,0914 1893,5*204,7

(983) 9,4*1,8*" (11,14) (101,1)

2 ПРГ+сгавдархная 2,5333*0,2817** 0,4226*0,1285** 7,4*1,б2 1,7145*0,1978* 1057,2*207,4*

терапия (342) (2,65) 5,4*0,/ (51,8) 1126,8*313,8*

3 ПРГ+миелопид+ 8,9*2,4*" 1,0181*0,0931" 2,1273*0,1693

сгавдаршая терапия (1852) 9,4*1,7*# (10,43) 53*0,5* (134,1)

4 ПРГ+МП-1+ 3,2332*0Д108а 1,0862*0,175^ 2,0642*0,1636 1080,8*162,5*

станд артная терапия (1711) (12,20) (115,9) 1120,0*162,0*

5 ПРГ+МП-3+ 2,9758*0,2082* 103*2,4* # 0,9456*0,2175" 7,4*1,2* 1,9475*0,1669

стандартная терапия (946) (8,82) (88,6)

6 ПРГ+миепопцд 3,4804*0,1083'" 0,8344=Ш,1106а 12,2*2,1 2,0393*0,1210 2012,4*208,5*

(3023) (6,83) (109,5)

7 ПРГ+МП-1 3,1862*0,0956" 26,5^2,8' 1,2703*0,1825а 17,9±4,2*а 1,6923*0,0897* 15%,8*194,7

(1536) (18,6) (49,2)

8 ПРГ+МП-3 3,0330*0,1191а 19,7±2,4а 0,9932*0,114Г 9,9*1,0 1,8709*0,1453" 1560,4*208,1

(1079) (9,85) (74,3)

9 Контроль 3,5053*0,0923 19,3*33 1,1824*0,0820 9,ШЗ 2,2496*0,0828 1321,1*103,5

(3201) (15,22) (177,7)

Примечание В скобках указана средняя геометрическая числа АОК (антилогарифм из средней арифметической 1о§ю числа АОК) Здесь и в табл 2-4 * - р<0,05 по критерию Дункана и ЬБО-тесту по отношению к животным 9-й группы, * - то же к 1-й группе,а - то же ко 2-й группе, + - /><0,05 только по ЬБО-тесту к животным 9-й группы,г - то же к 1-й группе

зование Миелопид в варианте монотерапии (6-я группа) восстанавливает интенсивность антителообразования в регионарном лимфатическом узле до уровня контрольных животных

Изменение интенсивности реакции гиперчувствительности замедленного типа

У травмированных животных всех групп, за исключением 7-й, выявлено угнетение воспалительного ответа при реакции ГЗТ (табл 2) У крыс, получавших МП-1 без стандартной терапии (7-я группа), обнаружена отмена иммуно-супрессивного действия травмы Хотя достоверных различий степени выраженности иммунного воспаления у животных, получавших препараты, по сравнению с крысами 1-й группы не выявлено, отсутствие стимулирующего действия миелопептидов на развитие этой формы клеточноопосредованного иммунного ответа не является недостатком данной группы иммуномодуляторов Ведущую роль в иммунопатологии глаза играют преимущественно реакции Thl-типа с развитием грануломатозного воспаления (Архипова JIТ , 2006, Streilein J W, 2003, Novak N et al, 2003) Отсутствие выраженной активации реакции ГЗТ при данной патологии является положительным фактом Полученные результаты согласуются с клиническими исследованиями других сотрудников нашего коллектива при включении миелопида в комплексное лечение пострадавших с ПРГ в отличие от пациентов, получавших только стандартную терапию, сохраняется снижение пролиферативного ответа лимфоцитов, индуцированного фитогемагглютинином (Чуприна В В и др , 2007) Обсуждая получен-

Таблица 2

Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на выраженность реакции ГЗТ

Групп-па Экспериментальное воздействие Интенсивность иммунного воспаления при оценке по толщине стопы

разность, мм индекс реакции, %

1 ПРГ 0,355+0,03Г 7Д30±0,570+

2 ПРГ+сгацдартпая терапия 0,270*0,026* 5,786*0,823*

3 ПРГ+миелопид+сгацпзршая терапия 0,230+0,026* 4,962+0,576*

4 ПРГ+МП-1+стаццаргная терапия 0,255+0,026* 5373+0,626*

5 ПРГ+МП-З+спи шдргная терапия 0,250+0,017* 5,436+0386*

6 ПРГ+миелопвд 0,260+0,056* 5,744+1346*

7 ПРГ+МП-1 0345+0,047 7,734+1,078

8 ПРГ+МП-3 0,275+0,033* 6,003±0,762*

9 Кошрсшь 0,456+0,043 9,146+0,778

ные результаты, необходимо отметить, что супрессия антителообразования и ГЗТ выявлена нами при сенсибилизации животных через 7 ч после нанесения травмы Ранний травматический период при экспериментальном ПРГ соответствует, с одной стороны, периоду ранней иммуносупрессии при механической травме по классификации ИИ Долгушина с соавт (Долгушин ИИ и др, 1989), а с другой - совпадает по времени со стадией тревоги общего адаптационного синдрома (Selye Н, 1937) Повышение уровня глюкокортикоидов на этой стадии направлено на ограничение по механизму отрицательной обратной связи физиологических последствий избыточного повышения провоспалитель-ных цитокинов - IL-ip, IL-la, TNF-a, TNF-P, IL-6 (Корнева E А и др , 1978, Корнева EA, Шекоян В A, 1982, Рыбакина ЕГ, 2001, Фролов Б А, 2006, Besedovsky НО et al, 1975, 1986, 1996, 2000, 2007, Munck A et al, 1984, 1994, Sapolsky R M et al, 2000) В других исследованиях сотрудников нашего коллектива обнаружена активация антителообразования и ГЗТ при сенсибилизации на 9-е сутки ПРГ (Черешнев В А и др., 2007)

Изменение числа ядросодержащих клеток лимфатических узлов, селезенки, тимуса и костного мозга

В регионарном лимфатическом узле всех животных в сравнении с отдаленным наблюдается значительное увеличение клеточности Подобные изменения, по-видимому, связаны с рекрутированием иммунокомпетентных клеток и их пролиферации т situ (Drayson МТ et al, 1981, Martin-Fontecha A et al, 2003)

При введении препаратов стандартной терапии развивается выраженное снижение числа ЯСК в регионарном, отдаленном лимфатических узлах, селезенке (см табл 1) и тимусе (табл 3) Этот эффект, по-видимому, связан с вклю-

Таблица 3

Влияние травмы, стандартной терапии и миелопентидов и на клеточное гь тимуса, костного мозга бедренной кости

Груп- Экспериментальное Число ЯСК (*106)

па воздействие тимус костый мгаг

1 ПРГ 105,53x8,30 207,20+36,24

2 ПРГ+crai щар! ия терапия 24,50+4,50"* 105,10+22,79*

3 ПРГ+мислопид+сгапдарлш терапия 26,6215,42** 167,10+32^9

4 ПРГ+МП-1+сгацларпш терапия 33,54+9,12"* 137,60+33,97

5 ПРГ+МП-З+сгандаргаая терапия 31,52+10,82** 98,32i22,87z

6 ПРГ+миелопвд 129,54+23,85а 227,10+52,7(f

7 ПРГ+МП-1 132,76+21,6(? 207,80+43^8

8 ПРГ+МП-3 171,28+20,46" 228,50+40,50?

9 Контроль 132,95+5,85 159,40+22,81

чением в ее состав дексаметазона, поскольку глюкокортикоиды вызывают перераспределение лимфоцитов, индуцируют их апоптоз, супрессируют антиген-независимую дифференцировку Т- и В-лимфоцитов и их взаимодействие при иммунном ответе (Ярилин А А, 1998, Хаитов Р М, 2001) Миелопептиды не влияют на выраженность действия стандартной терапии У крыс, не получавших стандартной терапии, введение миелопида (6-я группа) приводит к повышению числа ЯСК в селезенке, а МП-1 - в отдаленном лимфатическом узле (см табл 1) Количество ЯСК в костном мозге бедренной кости снижается у крыс 2-й группы, получавших стандартную терапию, в сравнении с животными 1-й группы (см табл 3) Этот эффект сохраняется при дополнительном введении МП-3 (5-я группа), но не выражен при сочетании с миелопидом или МП-1 (3-я и 4-я группы)

Изменение количественного состава клеток костного мозга

При анализе показателей миелограммы обращает на себя внимание повышение в костном мозге клеток эритроидного и лимфоидного ряда (рис 1), количества митозов клеток гранулоцитарного и моноцитарного ряда (р<0,05, данные не приводятся) у крыс с ПРГ без лечения (1-я группа) Увеличение количества лимфоидных клеток в костном мозге, возможно, связано с ранее описанной при стрессе миграцией в этот орган Т-лимфоцитов, зависящей от экспрессии р-адренорецепторов (Зимин Ю И, 1983, Дыгай А.М и др , 1989, 1992, Гольдберг Е Д и др, 2004) Препараты стандартной терапии снижают суммарное количество клеток эритроидного и лимфоидного ряда у травмированных животных 2-й группы Миелопид в условиях изолированного введения (6-я группа) повышает число эритробластов и миелобластов, базофилов и эозино-филов Применение МП-3 у травмированных животных (8-я группа) достоверно повышает абсолютное число базофилов, эозинофилов и моноцитов

Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на функции фагоцитирующих клеток

Изменение фагоцитарной активности клеток регионарного лимфатического узла

Учитывая, что иммунный ответ при использованной схеме иммунизации развивается преимущественно на территории регионального лимфатического узла, представлялось целесообразным оценить суммарную фагоцитарную активность клеток данного органа Фагоцитарной активностью обладают как макрофаги, так и незрелые дендритные клетки, морфологические и гистогенетиче-ские различия между которыми не явны (особенно для дендритных клеток моноцитарного происхождения), поэтому невозможна их дифференциация при морфологическом учете результатов фагоцитоза (Н.08епг\уа^ М е1 а1, 2002, Тппйе В е1а1, 2005) По нашим данным, при ПРГ без введения препаратов повышается суммарное число макрофагов и дендритных клеток в регионарном лимфатическом узле ^<0,05, данные не приводятся), стимулируется активность

123456789

Рис. 1. Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на показатели миелограммы.

По оси ординат: число клеток набедренную кость; по оси абсцисс: группы животных. Здесь и на рис. 2-6, 10: * -¿><0,05 по критерию Дункана и ЬвО-тесту по отношению к животным 9-й группы; * - то же к 1-й группе;а - то же ко 2-й группе;4 - р<0,05 только по ЬвО-тесту к животным 9-й группы;г - то же к 1-й группе; " - то же ко 2-й группе.

фагоцитов (рис. 2), и не меняется количество лимфоидных клеток (/;>(),05; данные не приводятся). Введение препаратов стандартной терапии вызывает снижение абсолютного количества лимфоидных клеток (р<0,05 по ЬЯО-тесту по отношению к 1-й группе, данные не приводятся), суммарное число макрофагов и дендритных клеток (р<0,05 по критерию Дункана и Ь80-тесту по отношению к 1-й группе, данные не приводятся). У всех животных, получавших препараты стандартной терапии как по отдельности, так и в комбинации с миелопептида-ми, снижаются показатели суммарной фагоцитарной активности клеток регионарного лимфатического узла (см. рис. 2).

Миелопептиды не изменяют эффекты стандартной терапии на число фагоцитирующих клеток и их поглотительную активность. В условиях применения только миелопида (6-я группа) снижается абсолютное число фагоцитирующих клеток (см. рис. 2) и повышенное при ПРГ суммарное число макрофагов и дендритных клеток лимфатического узла (р<0,05 по Ь8Г)-тесту по отно-

1

# I

filil

Mill

о

X

123456789

3 |0"

л 1

23456789

§ 0,8

8 0,6 ЕС

1 0,4

О °'2

о

а

а

123456789

Рис. 2. Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на показатели суммарной фагоцитарной активности клеток регионарного лимфатического узла.

По оси абсцисс: группы животных.

шению к 1 -й группе, данные не приводятся) до уровня нетравмированных животных. У животных, получавших только МП-1 (7-я группа), наблюдается увеличение абсолютного числа макрофагов и дендритных клеток и количества участвующих и не участвующих в фагоцитозе клеток лимфатического узла по сравнению с контрольными животными (данные не приводятся). Таким образом, миелопептиды в варианте монотерапии проявляют способность восстанавливать показатели количественного состава и фагоцитарной активности клеток регионарного лимфатического узла, но не отменяют эффекты стандартной терапии.

Изменение количественного состава и фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови

У животных с ПРГ без лечения в периферической крови обнаружен ней-трофильный лейкоцитоз (рис. 3) и увеличение поглотительной активности ней-трофилов, в то время как изменения количества и фагоцитарной активности моноцитов и эозинофилов по параметрам относительного и абсолютного числа поглощенных формалинизированных ЭБ не выражены (табл. 4). Нейтрофиль-ный лейкоцитоз является tie только реакцией на повреждение, но и характерным проявлением стресса (Юшков Б.Г. и др., 1999), а изменение функции этих клеток при травме могут быть связаны с факторами системной регуляции и динамикой местных реакций (Кокряков В.Н. и др., 2002; Долгушин И.И. и др., 2006; Маянский А.Н., 2007). Введение препаратов стандартной терапии травмированным животным приводит к снижению абсолютного числа лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов (см. рис. 3), что может объясняться присутствием в ее составе дексаметазона. Абсолютные и относительные параметры фагоцитар-

8000

6000

4000

2000

0

1000

750

500

250

0

+ #+ +

2000

1500

1000

500

0

_ т- -г

и##

27000

22000

17000

12000

7000

123456789 123456789 "123456789 123456789

Нейтрофилы Моноциты Эозинофилы Лимфоциты

Рис. 3. Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на абсолютные показатели количественного состава лейкоцитов периферической крови.

По оси ординат: число клеток в 1 мкл крови; по оси абсцисс: группы животных.

ной активности нейтрофилов периферической крови у животных, получавших только стандартную терапию, в сравнении с крысами, не получавшими терапии, снижаются (см. табл. 4). Фагоцитарная активность моноцитов у животных 2-й группы понижается по сравнению с крысами 1-й группы только по абсолютным параметрам (см. табл. 4), что связано с уменьшением их количества (см. рис. 3). Имеет место значительное угнетение фагоцитарной активности эо-зинофилов (см. табл. 4).

При совместном введении препаратов стандартной терапии с миелопепти-дами моноцитопения и эозинопения сохраняются (см. рис. 3). У крыс, получавших совместно со стандартной терапией миелопид или МП-3, отмечается снижение числа нейтрофилов в сравнении с травмированными животными, не получавшими терапии. Все исследованные миелопептиды не влияют на выраженность супрессивного действия стандартной терапии на фагоцитарную активность нейтрофилов и эозинофилов периферической крови (см. табл. 4). Снижение абсолютных показателей моноцитарного фагоцитоза, вызванное введением препаратов стандартной терапии, отменяется миелопидом.

При введении МП-1 без препаратов стандартной терапии отмечается повышение количества моноцитов, а при применении одного МП-3 снижается в сравнении с крысами 1-й группы количество эозинофилов (см. рис. 3). При введении одного миелопида отменяется травматическое повышение нейтрофиль-ного фагоцитоза (см. табл. 4). У крыс, получавших МГ1-1 или МП-3 без препаратов стандартной терапии, травматическая активация нейтрофильного фагоцитоза сохраняется. При введении МП-3 без препаратов стандартной терапии отмечается снижение абсолютных параметров фагоцитарной активности эозинофилов в сравнении с крысами 1-й группы, а введение одного МП-1 приводит к выраженному увеличению фагоцитарной активности моноцитов.

Таблица 4

Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови

Груп- Экспериментальное Нейтрофилы Моноциты Эазинофилы

па воздействие относительное абсолкшюе число относительное абсолютное число относительное абсолютное число

число объектов, объектов, погло- чисто объектов, объектов, погло- чиаго объектов, объектов, погло-

поглощенных щенных неетро- поглощенных щенных моноци- поглощенных щенных эозино-

одним филами1мкл одним тами! мкл одним филами 1 мкл

нейгрофилом крови моноцитом крови эозипофилом крови

I ПРГ 134±0,07* 7805,7±1149,7* 0,92±0,06 505,42±101,17 1,18±0,09 1479,90±241,86

2 ПРГ+стацдаргаая 0,78±0,06* 3075,4±496,2# 0,89±0,07 117,78±3739* 0,83^0,142 336,69±81,45**

терапия

3 ПРГ+миелопид+ 0,96*0,06* 3375,8±561,7* 1,17±0Д7+ 257,16±89Д2 0,86±0,1Г 242,83*54,52**

ставдзршая терапия

4 ПРГ+МП-1+ 0,70±0,06* 33693±518,1# 0,85±0,16 130Д5±63,79# 0,6Ш,10*+ 235,71*61,58**

стандартная терапия

5 ПРГ+МП-3+ 0,65±0,10* 16963=^283,6 1Д4±0Д5*2 195,82±60,74г 0,73±0,1(Г+ 214,51*42,81**

стандартная терапия

6 ПРГ+миепопид 0,79*0,09* 34452±511,9# 0,97±0,06 445,91±51,80№ 1,07±0Д4 971,96*209,49

7 ПРГ+МП-1 1Д2±0,09*а 5229,2±900,0а+ 1,40±0,14**а 10323&±228,60**" 1,05*0,11 1174,61+224,03а

8 ПРГ+МП-3 1,27±0,08*а 6326,0±1597,4а+ 0,94±0,10 399,13±61,70 1,05*0,10 800,46*239,02*

9 Контроль 0,87*0,05 3239,7±351,2 0,8<Ж),06 371,61*77,25 1,01*0,072 124436±202,76

Таким образом, показана способность миелопида и МГГ-3 отменять активацию фагоцитарной активности нейтрофилов в условиях ПРГ при их применении в варианте монотерапии Миелопид нивелирует супрессивное действие препаратов стандартной терапии на фагоцитарную активность моноцитов периферической крови

Изменение показателей фагоцитарной активности перитонеальных клеток

Установлено, что у животных с ПРГ без лечения выраженные изменения количественного состава перитонеальных клеток и их фагоцитарной активности отсутствуют (рис 4-6) Введение только препаратов стандартной терапии приводит к снижению числа перитонеальных лимфоцитов, мононуклеарных фагоцитов и тучных клеток, депрессии поглотительной активности мононуклеарных фагоцитов и тучных клеток Аналогичные эффекты описаны при введении нетравмированным крысам гидрокортизона (Shilov Ju I et al, 2005) Известно, что глнжокортикоиды регулируют взаимодействие моноцитов и нейтрофилов с эндотелием посткапиллярных венул, модулируя на генетическом уровне при участии ядерных транскрипционных факторов АР-1 и NF-кВ экспрессию молекул клеточной адгезии, хемокинов и провоспалительных цитоки-нов (Pitzalis С et al, 2002, Rhen Т, Cidlowski J A, 2005) Снижение числа перитонеальных мононуклеарных фагоцитов может быть следствием модуляции процессов миграции их из костного мозга в кровеносное русло и ткани (McEwen BS et al, 1997, Pitzahs С et al, 2002) Рядом авторов показано участие тучных клеток не только в развитии воспаления за счет выброса содержимого гранул, синтеза медиаторов воспаления и провоспалительных цитокинов, но и в фагоцитозе (Daeron М et al, 1993, 1994, Malaviya R et al, 1994, Marshall J S , 2004) Количество мастоцитов кожи снижается под действием глюкокортикои-дов, этот эффект опосредуется через рецепторы к стволовоклеточному фактору (Гущин И С , 1998, Finotto S et al, 1997) Поэтому выявленные в настоящей работе эффекты стандартной терапии могут быть связаны с включением в ее состав дексаметазона

Миелопептиды восстанавливают показатель относительного числа объектов фагоцитоза, захвачешшх мононуклеарными перитонеальными клетками (см рис 6) Введение МП-1 в комплексе с препаратами стандартной терапии повышает абсолютные параметры поглотительной активности мононуклеарных фагоцитов по сравнению с животными, получавшими только последнюю (см рис 5) Миелопид в варианте монотерапии повышает абсолютные показатели фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов за счет увеличения их количества (см рис 4, 5), приводит к увеличению абсолютных показателей суммарной фагоцитарной активности перитонеальных клеток по отношению ко всем сравниваемым группам (р<0,05, данные не приводятся)

х106 6

123 4 56789 Мононуклеарные фагоциты

О

+ #1

123456789

I 2 3 456 7 8 9 Лимфоциты

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Нейтрофильные Тучные клетки гранулоциты

Рис. 4. Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на абсолютные показатели клеточного состава перитоиеального смыва.

По оси ординат: число клеток в расчете на всю брюшную полость; по оси абсцисс: группы животных.

х10

150

100

50

0

12 3 4 5 6 7 8 9 Мононуклеарные фагоциты

123456789 Тучные клетки

2 3 4 5 6 7 8 9 Нейтрофильные гранулоциты

Рис. 5. Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на абсолютное число объектов фагоцитоза, поглощенных перитонеальными клетками.

По оси ординат: абсолютное число захваченных объектов фагоцитоза в расчете на всю брюшную полость; по оси абсцисс: группы животных.

Таким образом, миелопептиды способны восстанавливать до уровня, наблюдаемого у нетравмированных крыс, количество и поглотительную активность перитонеальных клеток, нивелировать эффекты препаратов стандартной терапии на фагоцитарную активность мононуклеарных фагоцитов.

Мононуклеарные Нейтрофильные Тучные клетки

фагоциты гранулоциты

Рис. 6. Влияние травмы, стандартной терапии и миелопептидов на относительное число объектов фагоцитоза, поглощенных перитонеальны-ми клетками.

По оси ординат: фагоцитарное число; по оси абсцисс: группы животных.

Патоморфологическая характеристика травматического воспаления при проникающем ранении глаза на фоне разных схем введения миелопептидов

При макроскопическом и гистологическом исследовании нетравмирован-ных левых глаз у животных всех групп структурные изменения отсутствуют. Полная эпителизация зоны повреждения малодифференцированным эпителием обнаружена у животных, получавших препараты стандартной терапии совместно с миелопидом или МП-3, а также миелопид в варианте монотерапии (рис. 7). В результате морфометрических исследований зоны повреждения установлено, что различные терапевтические подходы при ПРГ оказывают влияние на соотношение структурных элементов рубца (рис. 8). Максимальное снижение воспалительной инфильтрации в рубце наблюдается у крыс, получавших миелопид или МП-3 в сочетании с препаратами стандартной терапии, а также при введении только МП-3 (см. рис. 8). Степень выраженности этого действия при введении одного миелопида сопоставима с эффектом стандартной терапии, а при применении МП-3 превышает ее. При совместном введении миелопида и МП-3 с препаратами стандартной терапии выявляется наиболее выраженное увеличение суммарного количества коллагеновых и эластических волокон в рубце (см. рис. 8). У крыс, получавших МП-1 совместно с препаратами стандартной терапии, а также только миелопид и МП-3, плотность коллагеновых и эластических волокон сопоставима с аналогичным показателем у животных, получавших только стандартную терапию. Количество фибробластов в рубцовой ткани у крыс, получавших стандартную терапию, снижается (см. рис. 8). Введение миелопида и МП-1 совместно с препаратами стандартной терапии не изменяет эф-

•• V УЯ К- ж-т ' -У.-

V . »Л •'<

- . "

• А •

♦л а.

л 1

У * '

с.

' '-.А.-' ■

А - без терапии: формирование грубого васкуляризированного роговично-скле-рального рубца без эпителизации с выраженными признаками экссудативного воспаления и инфильтрации полиморфо-нуклеарными лейкоцитами, х200.

Б - стандартная терапия и миелопид: полная эпителизация зоны повреждения малодифференцированным эпителием, волокнистая соединительная ткань с продольной ориентацией коллагеновых волокон, в инфильтрате определяются лимфоциты и плазмоциты в небольшом количестве, х 150.

В - стандартная терапия и МП-3: полная эпителизация рубца малодифференцированным эпителием, рыхлая соединительная ткань с функционально активными фибробластами, минимальные признаки экссудативного воспаления и инфильтрации, х200.

Г - миелопид: полная эпителизация малодифференцированным эпителием, волокнистая соединительная ткань с очаговой продольной ориентацией коллагеновых волокон, в слабо выраженном воспалительном инфильтрате прилежащих к рубцу тканей преобладают лимфоциты, х160.

Д - стандартная терапия и МП-1: отсутствие эпителизации рубца, рыхлая соединительная ткань с дезориентацией коллагеновых волокон и обильной вас-куляризацией, формирование воспалительной гранулемы, инфильтрат воспалительно-регенераторный, в прилежащей к рубцу ткани - признаки экссудативного воспаления, х160.

Рис. 7. Данные световой микроскопии зоны повреждения глаза крыс.

фекта последней. МП-3 отменяет влияние стандартной терапии. Введение миелопида, МП-1 и МП-3 в варианте монотерапии приводит к еще более выраженному снижению числа фибробластов.

При исследовании клеточного состава околорубцовой зоны выявлено снижение числа гранулоцитов за счет иейтрофилов у животных, получавших стандартную терапию, в сравнении с 1 -й группой (рис. 9). Существенное снижение количества 1*ранулоцитов (иейтрофилов и эозинофилов) выявляется у крыс, которым вводили миелопид или МП-3. При совместном их введении с препаратами стандартной терапии супрессивный эффект последней существенно усиливается. Количество макрофагов в околорубцовой зоне значительно снижается при введении одного МП-3, а также миелопида и МП-3 совместно с препаратами стандартной терапии. МП-1 на число гранулоцитов и макрофагов влияния не оказывает. Количество лимфоцитов в перифокалыюй зоне под действием стандартной терапии увеличивается. Миелопид в комплексе со стандартной терапией отменяет эффект последней и снижает число лимфоцитов в инфильтрате, хотя при введении одного миелопида количество лимфоцитов существенно повышается. Увеличение числа лимфоцитов наблюдается также и при введении одного МП-1. Увеличение количества плазматических клеток отмечается только при введении МП-1 совместно с препаратами стандартной терапии.

Митотический индекс МПЭ роговицы второго нетравмированного глаза составляет 4,60+1,20 %о и не отличается от данного показателя интактных крыс (9-я группа). У животных с ПРГ без лечения митотический индекс МПЭ роговицы глаза в области рубца повышается в 2,6 раза по сравнению с аналогичным показателем у интактных животных, в 2,2 раза по отношению к нетравмиро-

В

80

60

40

20

25

20

15

10

2 3 4 5 6 7

# % и

П 1 £

11 ш

12 3 4 5 6 7 8

25

20

15

10

0

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 8. Количественная характеристика структурных элементов рубцовой ткани при травме, введении миелопептидов и препаратов стандартной терапии (в 0,01мм2): А - коллагеновые и эластические волокна, Б -фибробласты, В - клетки воспалительного инфильтрата.

Здесь и на рис. 9 по оси ординат: число волокон или клеток в 0,01 мм2; по оси абсцисс: группы животных; " -¿><0,05 по критерию Дункана и Ь80-тесту по отношению к животным 1-й группы; "-тоже ко 2-й группе.

А 3

2,5 2

1,5 1

0,5

0

12345678 12345678 12345678

Г 3 -

2,5 2 -

1,5

1

0,5 0 -

Рис. 9. Количественная характеристика структурных элементов в прилежащих к рубцу тканей при травме, введении миелопептидов и препаратов стандартной терапии (в 0,01мм2): А - гранулоцнты, Б - нейтрофи-лы, В - эозинофилы, Г - макрофаги, Д - лимфоциты, Е - плазматические клетки.

ванным глазам (рис. 10). Под действием миелопида, а также его в комплексе со стандартной терапией митотическая активность МПЭ снижается на 20% и на 13% соответственно по сравнению с аналогичным показателем животных 1-й группы (при этом достоверные отличия от митотической активности у крыс 9-й группы отсутствуют). При включении в комплексную терапию МП-1 и МП-3 митотический индекс у травмированных крыс достоверно повышается в 2,3 раза и в 2,5 раза соответственно по сравнению с данным показателем 1-й группы. Аналогичный эффект наблюдается и при изолированном введении миелопептидов: митотический индекс МПЭ повышается в 2 раза при введении МП-1 и в 1,7 раза при применении МП-3 по сравнению с митотическим индексом травмированных животных без лечения.

Таким образом, при проникающем ранении глаза применение миелопида и МП-3 в комплексе с препаратами стандартной терапии приводит к более выраженному снижению экссудатквного воспаления в рубце и прилежащих тканях, повышает количество фибробластов и зрелых волокнистых структур, спо-

30

15

0

* *

а а #

* I

т

а #

I

Рис. 10. Митотическая активность многослойного плоского эпителия роговицы при проникающем ранении глаза, введении препаратов стандартной терапии и миело-пептидов.

По оси ординат: митотическая активноаъ, %<,; по оси абсцисс: группы животных.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

собствует зпителизации зоны повреждения; при изолированном введении мие-лопида происходит полное закрытие раневого дефекта роговицы малодиффе-ренцированным МПЭ со снижением митотической активности клеток в ранний период травматического воспаления.

Выявленные в настоящей работе изменения при включении миелопепти-дов в различные схемы терапии при проникающем ранении глаз позволяют предложить следующий механизм их действия (рис. 11).

Рис. 11. Механизм действия миелопептидов в ранний травматический период при проникающем ранении глаза.

В целом проведенные экспериментальные исследования расширяют представления о роли иммунной системы в патогенезе проникающего ранения глаза и демонстрируют способность миелопептидов ускорять регенерацию, оптимизировать воспаление и нивелировать стрессорные изменения в иммунной системе, снижая степень выраженности ранней иммуносупрессии за счет нормализации антителообразования

ВЫВОДЫ

1. В ранний травматический период проникающего ранения глаза у экспериментальных животных развивается супрессия антителопродукции и реакции гиперчувствительности замедленного типа, активация фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови, повышается число клеток эрит-роидного ростка костного мозга и фагоцитарная активность клеток регионарного лимфатического узла

2 Включение в патогенетическую терапию при проникающем ранении глаза миелопида и МП-1 отменяет угнетение антителообразования при травме и введении препаратов стандартной терапии, но не отменяет супрессию реакции гиперчувствительности замедленного типа

3 Миелопид, как комплекс пептидов костного мозга, стимулирует образование не только бластных форм эритроидного, миелоидного ростков костного мозга, но и, в частности, увеличивает количество базофилов и эозинофилов в костном мозге крыс с проникающим ранением глаза

4 Миелопид и МП-3 нивелируют активацию иейтрофильных фагоцитов при проникающем ранении глаза и супрессивное действие препаратов стандартной терапии на фагоцитарную активность клеток периферической крови, миелопид в варианте монотерапии повышает суммарное число и фагоцитарную активность макрофагов и дендритных клеток регионарного лимфатического узла, одновременно все миелопептиды восстанавливают до уровня, наблюдаемого у нетравмированных крыс, количество и поглотительную активность пери-тонеальных клеток

5 У животных, не получавших лечения, на 5-е сутки проникающего ранения глаза зона повреждения характеризуется сегментарной эпителизацией рубца, состоящего из рыхлой соединительной ткани с преобладанием клеточного компонента и признаками экссудативного воспаления В условиях стандартной терапии снижается интенсивность воспалительной инфильтрации в рубце с сохранением ее в перифокальной области с выраженной васкуляризацией, увеличивается плотность волокнистых структур

6 Включение миелопида и МП-3 в комплексную терапию приводит к снижению воспалительной клеточной инфильтрации в рубце и перифокальных тканях, ускоряет формирование зрелых волокнистых структур в рубце, способствует эпителизации зоны повреждения роговицы в ранний период проникающего ранения глаза

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1 Гаврилова, ТВ Миелопегпиды в иммунокоррекщм ироиикаюших ранении пша/Т.В Гаврилова, НЛ Бфкасова, Ю И. Шилов, MB Черешнева, С Ю Медведева // Весш Уральской ме/щцинской академической науки —2005 — № 1 —С 4—10

2 ГавриловаДВ Имму! юкоррекцня i ipn i ipoi шкшощем pai ici гни пша в. жег 1фима ríe / 'Г В Гаврилова, В А Черешнев, ЮН Шилов, MB Черешнева, С.Ю Родионов, СВ Геин, HJI Бфкаоова, РР Фашрахманов//Весш Уральской медицинской академической науки —2005 —№4 -С 5-7

3 Беркаоова, HJI Влияние миелопетидов и стандартной терапии на иммунный ответ и функции фа-гоципфующих клеток при эксперимапалыюм проникающем ранении глаза / НЛ Бфкасова, Т В Гаврилова,ЮЛ Шилов,MB Череишева/ЛЗестн Уралккоймедицшгсшйакэдешческойшуки -2006-№3(1)-С 18-20

4 ГавриловаДВ Мииюиепшда в коррекции слрсах)()ш,к и травмяпнеских измена шй иммунного ответа m гетеролопниый тимусзависимый шгтген при проникающем раиеиии глаза крыс / ТВ Гаврилова, НЛ Бфкасова, ЮЛ Шилов, MB Черешнева, В А Черешней //Доки Академ oí наук. -2007 - Т 412, №5 - С 697-699

5 Беркаоова, НЛ Влияние миелопеггщцов на реиарашвные процессы в ранний пфиод проникающего роне}тягла^НЛБфкасоваД В Гаврилова, МБ Черешнева, СЮ Медведева, НБ Крохина, ЮЛ Шилов, ВА Черешнев//Весш Уральской медицинской академической пауки — 2007 - № 4-С 34-37

6 Бфкасова, НЛ Влияние миелопетидов на иммуииый ответ и морфометрические проявления воспаления при зет гернмег ггалы юм проникающем решении пиза / Ш1 Бфкаоова, ТВ Гаврилова, ЮЛ Шилов, MB Черешнева, СЮ Медведева, НБ Крохина, ВА Чфешиев // Бгдал эшгерим биоп.имед.-2008 -Т 145,№3 - С 313-315

Материалы международных и всероссийских конферевдш

7 Гаврилова, ТВ Влияние миелопетидов на иммунный ответ при экепфимаггальном проникающем ранении глаза / ТВ Гаврилова, НЛ Беркасова, ЮЛ Шилов, MB Черешнева // Объедав га ь ный иммуисиогический (¡юрум Тез докл - Rus. J ImmunoL - 2004 - Vol 9, SuppL 1 — P.242-242

8 Гаврилова, ТВ Иммуномсщулирующее действие миелопепщцов при зкепфимаггалыюм проии-кшощем ранении глаза/ТВ Гаврилова,НЛ Бфкасова//Биология-тука XXI века. Тез. докл IX Межцу!1гфОЩюйПу1щ«1Скойшкш1Ь1-к»1ф молодыхученых — Пущшю,2005 — С 133-133

9 Черешнев, ВА Стреосорные и травмагпмеские нарушения функций иммунной системы и их коррекция/В А Черешнев, ТВ Гаврилова,ЮИ. Шилов,MB Черешиева,СЮ Родионов, ТБ Пономарева, С Ю Медведева, О Л Гейн, С В Геин, Р Р Файзрахмш юв, НЛ Бфкаоова // Проблемы загряз iei uw окружаю! г (ей срс/цл (1СЕР-2005) Тез докл VI Международная конф — Пфмь,2005 — С 106-106

Ю.Гаврилова, ТВ Исследование зависимосш изменения уровня иммунного ответа от qx>Ka травматического повреждения при экепфимешальном проникающем ранении глаза / ТВ Гаврилова, НЛ Бфкасова, РР Файзрахманов // Биолопи - наука XXI века. Тез. докл. X Международной Путинской школы-конф молодых ученых -Пущиио,2006 -С 128-128

11 Бфкасова, НЛ Сравншелыия оценка влияния миелопвдд на процесс травмашческого воспаления в экспфимапально-биспоп-иеской модем проникающего ранения глаза / HJI. Бфкасова // Биология - наука XXI века. Тез. докл XI Международной Пущшюкш школы-конф молодых ученых. -Пущшо,2007 -С 232-232

12 Бфкасова, НЛ Влияние миаюнида на процессы травматического воспаления при проникающем

рана ши глаза / НЛ. Беркасова, Т В Гаврилова, ЮЛ Шилов, МБ Черешнева, С Ю Медведева // Офтальмоиммунология итоги и перспективы Материалы науч.-пракг конф — Москва, 2007. - С 63-65

13-Беркасоиа, Н Л Состоя ше элемешов рубцовой ткани при различных схемах терапии проникающего ранения пиза миелопепщарми / НЛ Беркасова // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии Об науч ст по материалам конф — Екатерш йург-Пермь, 2007 - С 132-134 Публикации в других издаииях 141аврилова, ТВ Влияние миелогада и миелопетвджМП-1, МП-3 на фушщии иммунной системы при экспериментальном проникающем ране! ми глаза /ТВ Гаврилова, НЛ Беркаоова // Сб I иуч тр молодых ученых.—Пермь,2004 - С 139-148 15 Беркасова, НЛ. Иммунсмоцулирующие эффекты миелопетвдов в экспериментально биологической модели проникающего ранения пиза / НЛ Беркаоова // Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии Сб науч ст го материалам студенческой науч. конф -Пермь Изд-воПермск.ун-та,2005 - С93-95 1бЧерешнев, ВА Отечественные иммутюмодулягоры в коррекции сгресоорных и травматических нарушений функций иммунной системы при проникающем ранении пгаза / В А Черешнев, ТВ Гаврилова,КШ Шилов,МБ Черешнева, СЮ Родаоюв,ТБ Пономарева,СЮ Медведева,ОН Гейн, СБ Гейн, РР Файзрахманов, НЛ Беркасова // Иммунология вчера, сегодня и завтра Сб науч. тр - Пермь, 2005 -14-20 17Гаврилова, ТВ, Зависимость направленности изменения иммунного ответа при экспериментальном проникающем ранении пгаза от срока травматического повреждения / ТБ Гаврилова, НЛ Беркасова, РР Файзрахманов//Там же.-С 20-28 18 Гаврилова, ТБ Иммуномещулирующее действие миелопепщдов в эксперимешально-биологической модели проникающего ранения пиза /ТБ Гаврилова, Н Л Беркасова, ЮЛ Шилов, МБ Черешнева // Иммунология Урала.—2005.—№ 1(4) -С 121-122 19Хаврилова, ТВ Иммуномодулирующее действие миезтопетидов в комплексе со егшщэрлной терапией при экспериментальном проникающем ранении пиза / ТБ Гаврилова, НЛ Беркасова, ЮЛ Шилов, МБ Черешнева, В А Чфенл кя//Иммунология Урала. - 2006 - № 1(5) -С 4-5 20-Беркасова, НЛ, Оценка миклической активности многослойного плоского эпителия роговицы пиза при различных схемах терапии проникающего ранения миепопепщпзми / НЛ Беркасова, ТВ Гаврилова, МБ Черешнева, СЮ Медведева, НБ Крохииа, КЖ Шилов, В А Черешнев // Иммунология Урала - 2007 - № 1(6) - С 4-5

Список основных сокращений

АОК - антителообразующие клетки

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

МП - миелопептид

МПЭ - многослойный плоский эпителий

ПРГ - проникающее ранение глаза

ЭБ - эритроциты барана

ЯСК - ядросодержащие клетки

- интерлейкин

"ГШ - фактор некроза опухоли

Беркасова Наталия Леонидовна

ОЦЕНКА ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИЙ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И КОРРЕКЦИЯ МИЕЛОПЕПТИДАМИ В РАННИЙ ПЕРИОД ПРОНИКАЮЩЕГО РАНЕНИЯ ГЛАЗА

(экспериментальное исследование)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 19 05 2008 Тираж 100 экз Уч-изд л 1,0 Формат 60x84 1/16 Набор компьютерный Заказ № 424/2008

Отпечатано в типографии ИД «Пресстайм» Адрес 614025, г Пермь, ул Героев Хасана 105

Актуальность проблемы. Иммунная система играет важную роль в патогенезе воспалительного процесса поврежденного глаза [232, 265, 266, 295, 301]. Иммунная привилегированность органа зрения и его устойчивость к повреждающему действию различных факторов определяется особенностями его местной организации и системных механизмов ответа на антиген [252, 255, 294, 323]. Проникающее ранение глаза служит примером ограниченного по объему повреждения, при котором развиваются не только локальные реакции с нарушением механизмов иммуносупрессии непосредственно в органе зрения, но и выявляются признаки вторичной иммунной недостаточности [12, 136, 159, 161, 162].

Кроме того, особенностью ранения органа зрения является возможность аутоиммунных повреждений здорового глаза [8, 11, 49]. Это предполагает обязательное включение в комплексную терапию помимо антибактериальных и противовоспалительных препаратов, иммунодепрессантов, в частности глюко-кортикоидов [13, 232, 267]. В настоящее время существует проблема поиска препаратов, избирательно действующих на конкретные звенья иммунной системы и не оказывающих побочных эффектов [131, 148]. Для оптимизации течения процессов регенерации при травматическом воспалении и коррекции изменения функций иммунной системы перспективным представляется подход с включением в комплексную терапию наряду с вышеуказанными препаратами отечественных иммуномодуляторов [34, 35, 159, 161, 162]. Показано, что при совместном введении препаратов стандартной терапии и полиоксидония при экспериментальном ранении глаза отмечается наименьшая степень реактивных изменений в тканях и более упорядоченное компактное бессосудистое строение рубцовой ткани, значительно снижается воспалительная клеточная инфильтрация зоны повреждения [163]. Положительные результаты отмечены и при включении миелопида в комплексное лечение пациентов с ранением глаза [26, 158]. Последний представляет собой нативную смесь иммунорегуляторных пептидов костного мозга - миелопептидов (МП), выделенных из активной фракции надосадочной жидкости культуры клеток костного мозга млекопитающих [104, 105, 110, 111, 116, 117, 118, 120]. В середине 1990-х гг. выделены, идентифицированы и синтезированы индивидуальные миелопептиды. Показано, что МП-1 регулирует иммунный ответ, МП-2 тормозит рост опухолей, МП-3 модулирует активность макрофагального звена иммунитета, МП-4, МП-5 и МП-6 обладают дифференцировочной активностью.

В связи с тем что в клинических условиях не всегда удается четко дифференцировать нарушения, вызванные самой травмой, и изменения, развивающиеся в результате лечения, представлялось целесообразным в эксперименте исследовать изменения функций иммунной системы и влияние на них миело-пептидов в ранний травматический период проникающего ранения глаза.

Цель работы - исследование изменений функций иммунной системы и возможности их коррекции миелопидом и миелопептидами МП-1 и МП-3 в ранний период проникающего ранения глаза в эксперименте.

Задачи исследования

1. Оценить изменение антителообразования, выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа, клеточности органов лимфомиелоидного комплекса при проникающем ранении глаза и включении в экспериментальную терапию миелопептидов.

2. Исследовать изменение фагоцитарной активности клеток регионарного лимфатического узла, периферической крови и брюшной полости у экспериментальных животных.

3. Оценить морфологическую картину травматического воспаления при проникающем ранении глаза в условиях разных схем введения миелопептидов.

Научная новизна. В экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза крыс популяции Wistar в ранний травматический период выявлены новые закономерности течения травматического воспаления и изменения функций иммунной системы в условиях введения отечественного им-муномодулятора миелопида, иммунорегуляторных пептидов МП-1 и МП-3 при разных схемах терапии.

Показано, что миелопептиды отменяют ряд эффектов травмы и стандартной терапии на функции фагоцитирующих клеток периферической крови, модулируют функции перитонеальных мононуклеарных фагоцитов и фагоцитарную активность регионарного по отношению к месту иммунизации лимфатического узла. Включение в патогенетическую терапию травмированных животных миелопида и МП-1 нивелирует депрессию антителообразования, вызванную травмой и применением препаратов стандартной терапии, но не отменяет супрессию реакции гиперчувствительности замедленного типа у травмированных животных при введении тимусзависимого ксеноантигена.

Впервые показана способность миелопида и МТТ-3 уменьшать воспалительную инфильтрацию в зоне повреждения и стимулировать регенерацию в ранние сроки травматического воспаления органа зрения.

Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане исследования значительно расширяют представления о типовых изменениях функций иммунной системы при проникающем ранении глаза и дополняют сведения о действии миелопептидов в ранний период данного вида патологии в условиях разных схем экспериментальной патогенетической терапии. Обоснована способность миелопептидов регулировать регенерацию при травматическом воспалении.

В практическом плане полученные результаты демонстрируют перспективность дальнейшего изучения возможности использования миелопептидов для коррекции иммунных нарушений при проникающем ранении глаза в ранний травматический период.

Внедрение в практику. Основные положения диссертации используются в лекционных курсах "Иммунология", "Экспериментальные модели в патологии", "Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия" кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета ГОУ ВПО "Пермский государственный университет", при чтении лекций студентам, ординаторам, врачам на кафедре офтальмологии ГОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера".

Положения, выносимые на защиту

1. В раннем периоде проникающего ранения глаза развивается супрессия антителообразования и реакции гиперчувствительности замедленного типа. Введение препаратов стандартной терапии усиливает депрессию антителообразования, включение в терапию травмированных животных миелопида и МП-1 нивелирует угнетение антителогенеза. Совместное применение миелопептидов с препаратами стандартной терапии не отменяет супрессию реакции гиперчувствительности замедленного типа у травмированных животных при введении тимусзависимого ксеноантигена.

2. Миелопептиды не отменяют снижение клеточности регионарного и отдаленного лимфатических узлов, селезёнки и тимуса, вызванное препаратами стандартной терапии при проникающем ранении глаза. Миелопид способствует повышению числа эритробластов, миелобластов и зрелых клеток гранулоци-тарного ростка костного мозга.

3. Миелопептиды отменяют ряд эффектов травмы и стандартной терапии на функции фагоцитирующих клеток периферической крови, модулируют функции перитонеальных мононуклеарных фагоцитов и фагоцитарную активность клеток регионарного по отношению к месту иммунизации лимфатического узла.

4. Включение миелопида и МП-3 в комплексную терапию приводит к снижению воспалительной клеточной инфильтрации в рубце и перифокальных тканях, ускоряет формирование зрелых волокнистых структур в рубце, способствует эпителизации зоны повреждения роговицы при проникающем ранении глаза.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены и обсуждены на Объединенном иммунологическом форуме, Екатеринбург, 2004; VI Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды 1СЕР-2005", Пермь-Казань-Пермь, 2005; IX, X, XI Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых, Пущино, 2005, 2006, 2007; IV, V, VI Конференциях иммунологов Урала, Уфа, 2005, Оренбург, 2006,

Ижевск, 2007; Научно-практической конференции "Иммунология вчера, сегодня, завтра", Пермь, 2005; Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора H.H. Кеворкова "Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике", Пермь, 2006; Всероссийской научно-практической конференции "Офтальмоиммунология: итоги и перспективы", Москва, 2007; Региональной конференции молодых ученых с международным участием "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии", Пермь, 2007.

Основные положения диссертации изложены в 20 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация представляет собой рукопись на русском языке объемом 197 страниц машинописного текста. Состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, содержащего 188 источников на русском и 165 на иностранном языках. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 6 рисунками.

158 ВЫВОДЫ

1. В ранний травматический период проникающего ранения глаза у экспериментальных животных развивается супрессия антителопродукции и реакции гиперчувствительности замедленного типа, активация фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови, повышается число клеток эритроидного ростка костного мозга и фагоцитарная активность клеток регионарного лимфатического узла.

2. Включение в патогенетическую терапию при проникающем ранении глаза миелопида и МП-1 отменяет угнетение антителообразования при травме и введении препаратов стандартной терапии, но не отменяет супрессию реакции гиперчувствительности замедленного типа.

3. Миелопид, как комплекс пептидов костного мозга, стимулирует образование не только бластных форм эритроидного, миелоидного ростков костного мозга, но и, в частности, увеличивает количество базофилов и эозинофилов в костном мозге крыс с проникающим ранением глаза.

4. Миелопид и МГТ-3 нивелируют развитие нейтрофильного лейкоцитоза при проникающем ранении глаза; исследованные миелопептиды отменяют ряд эффектов травмы и стандартной терапии на функции фагоцитирующих клеток периферической крови, модулируют функции перитонеальных мононуклеарных фагоцитов и фагоцитарную активность клеток регионарного по отношению к месту иммунизации лимфатического узла.

5. У животных, не получавших лечения, на 5-е сутки проникающего ранения глаза зона повреждения характеризуется сегментарной эпителизацией рубца, состоящего из рыхлой соединительной ткани с преобладанием клеточного компонента и признаками экссудативного воспаления. В условиях стандартной терапии снижается интенсивность воспалительной инфильтрации в рубце с сохранением ее в перифокальной области с выраженной васкуляризацией, увеличивается плотность волокнистных структур.

6. Включение миелопида и МП-3 в комплексную терапию приводит к снижению воспалительной клеточной инфильтрации в рубце и перифокальных тканях, ускоряет формирование зрелых волокнистых структур в рубце, способствует эпителизации зоны повреждения роговицы в ранний период проникающего ранения глаза.