Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка иммуномодулирующего действия полиоксидония в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза

На правах рукописи

Гейн Оксана Николаевна

ОЦЕНКА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИОКСИДОНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-БИОЛОГИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ ПРОНИКАЮЩЕГО РАНЕНИЯ

ГЛАЗА

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск-2004

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Черешнева Маргарита Владимировна

кандидат медицинских наук, доцент Шилов Юрий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Цейликман Вадим Эдуардович доктор медицинских наук Гусев Евгений Юрьевич

Ведущая организация: ГНЦ - Институт иммунологии Минздрава РФ, г. Москва

Защита состоится " нИПЛт Й 2004 г., в //часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ" по адресу: 454092, Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ"

Автореферат разослан

" диМии} 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор

Телешева Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проникающее ранение глаза является одной из главных причин снижения и потери зрения (Р.А. Гундорова и др., 1986). Как и при травме другой локализации (В.Н. Александров, Л.К. Тухватулина, 1991; Е.А. Вагнер и др., 1980; 1985; И.И. Долгушин и др., 1989; Ю.И. Зимин, 1980; Ю.И. Зимин и др., 1985; B.C. Кожевников и др., 1990; В.А. Черешнев и др., 1997; Н.А. Шилова, 1995), при проникающем ранении глаза развивается состояние иммунодепрессии (Е.И. Волик, 1992, 2000; Р.А. Гундорова и др., 1996; М.В. Черешнева, Ю.Е. Горячев, 1989; М.В. Черешнева и др., 2000). В ранее проведенных клинических исследованиях установлено, что при проникающем ранении глаза развивается вторичная недостаточность клеточного звена иммунной системы, повышение поглотительной активности фагоцитирующих клеток на фоне выраженной депрессии их микробицидного потенциала, дисим-муноглобулинемия (Е.И. Волик, 2000; М.В. Черешнева и др., 2000). Особенностью ранения глаза является возможность аутоиммунных повреждений здорового глаза (Л.Т. Архипова, 1987; 1995). Это предполагает включение в комплексную терапию наряду с антибиотиками и противовоспалительными препаратами иммунодепрессантов, в частности, глюкокортикоидов (Л.Т. Архипова, Г.П. Захарова, 1997), способных усугублять иммуносупрессивное действие самой травмы.

В связи с этим встает проблема целенаправленной иммунокоррекции с использованием препаратов, избирательно воздействующих на конкретные звенья иммунной системы и не оказывающих побочных эффектов (A.M. Борисова и др., 1998; Р.В. Петров и др., 1983; 1995; Р.М. Хаитов, 1976; 1988; B.C. Ши-ринский, 1990; B.C. Ширинский, Е.А. Жук, 1991). К таким препаратам можно отнести отечественный иммуномодулятор полиоксидоний, который является синтетическим высокомолекулярным соединением, обладающим выраженной иммунотропной активностью. По данным авторов препарата, полиоксидоний оказывает активирующее влияние на функции фагоцитирующих клеток, гуморальный и клеточный иммунный ответ у мышей, снижает выраженность экспериментального иммунодефицита, индуцированного введением гидрокортизона или циклофосфамида, и проявления вторичной иммунной недостаточности при клинических испытаниях (А.В. Некрасов и др., 1997; Р.В. Петров и др., 1998; 2000). Учитывая, что направленность действия иммуномодуляторов в условиях нарушения функций иммунной системы может существенно отличаться в зависимости от конкретной формы патологии и/или при комбинации их с другими лекарственными препаратами, перед использованием их в терапии необходима дополнительная оценка их действия в экспериментально-биологических моделях патологических процессов н а этапе д в последующем в клинике (B.C. Ширинский и др., 200 ) fAfeWÄ^fi^j^iMlf ось це-

СПете^вт ц ,

оэ мои**яЦ b

лесообразным исследовать иммуномодулирующие эффекты полиоксидония при экспериментальном проникающем ранении глаза.

В течение травматического процесса, развития воспаления с последующей регенерацией важную роль играют фагоцитирующие клетки - гранулоци-ты и мононуклеарные фагоциты. Изменения функций этих клеток в периферической крови при травме могут быть связаны как с факторами системной регуляции, так и с динамикой местных реакций (И.И. Долгушин и др., 1989; В.А. Черешнев и др., 1997). Однако при травматическом повреждении глаза функции этих типов клеток, в частности, гранулоцитов изучены недостаточно. Учитывая участие стрессорных реакций в изменениях функций иммунной системы при травме и ведущую роль в них не только глюкокортикоидов, но и катехола-минов (П.Д. Горизонтов и др., 1983; Ю.И. Зимин, 1980; 1985; Ю.И. Шилов, Д.В. Ланин, 2001; Ю.И. Шилов, Е.Г. Орлова, 2000; I.J. Elenkov et al, 1999; 2000; K.L. Madden, D.L. Felten, 1995; B. McEwen et al., 1997), представлялось необходимым оценить влияние полиоксидония на некоторые проявления общего адаптационного синдрома при проникающем ранении глаза и на изменения чувствительности к адренергической регуляции фагоцитирующих клеток.

Цель работы — изучение иммуномодулирующего действия полиоксидония в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза.

Основные задачи

1. Изучить влияние полиоксидония на стрессорные и травматические изменения функций циркулирующего пула фагоцитирующих клеток, гематологических показателей, массы и клеточности центральных и периферических органов иммунной системы, концентрации глюкозы крови в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза на фоне разных схем терапии.

2. Оценить влияние полиоксидония на развитие травматического воспаления и репаративные процессы при проникающем ранении глаза в условиях разных схем терапии.

3. Исследовать влияние адренергических соединений и теофиллина на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови в системе in vitro в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза в условиях введения полиоксидония.

Научная новизна. Впервые изучены иммуномодулирующие эффекты полиоксидония при экспериментальном проникающем ранении глаза, его влияние на течение травматического воспаления и процессов регенерации при данной форме патологии.

Установлено, что полиоксидоний изменяет динамику показателей функций фагоцитирующих-клеток крови при проникающем ранении глаза, оказывает антистрессорный эффект, отменяя развитие стрессорной гипергликемии, ги-

перплазии костного мозга. Включение полиоксидония в состав комплексной терапии приводит к частичному нивелированию депрессии микробицидного потенциала фагоцитов и гиперактивации поглотительной активности нейтро-филов и моноцитов, а также лейкопении в сравнении с животными, получавшими только стандартную терапию. Совместное использование полиоксидония с препаратами стандартной терапии, в частности с глюкокортикоидами, позволяет компенсировать их неблагоприятные эффекты.

Установлено, что введение полиоксидония в комплексе или изолированно способствует оптимизации воспалительного процесса в тканях глаза по параметрам наименьшей инфильтрации зоны повреждения и процессов регенерации. Наиболее благоприятным по формированию структурированной рубцовой ткани является использование полиоксидония в комплексе со стандартной терапией.

В ранний травматический период (через 180 мин после ранения глаза) выявлено усиление ингибирующего или Р-адренергического действия адренер-гических соединений и угнетающего эффекта теофиллина in vitro на суммарную фагоцитарную активность лейкоцитов. Включение полиоксидония в стандартную терапию повышает чувствительность фагоцитирующих клеток к р-адренергической регуляции.

Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане работа расширяет существующие представления о роли фагоцитирующих клеток и механизмах их регуляции при травматическом повреждении глаза. Результаты исследования дополняют имеющиеся представления об имму-номодулирующем действии полиоксидония в условиях нарушений функций иммунной системы при проникающем ранении глаза. Обоснована возможность включения полиоксидония в стандартную терапию для оптимизации течения травматического воспаления и репаративных процессов при проникающем ранении глаза.

В практическом плане работа имеет существенное значение для обоснования назначения полиоксидония с целью коррекции иммунных нарушений, а также стимуляции репаративных процессов при проникающем ранении глаза.

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета (614600, г. Пермь, ул. Букирева, 15).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение полиоксидония в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза изменяет динамику показателей функций фагоцитирующих клеток периферической крови, отменяет некоторые отрицательные эффекты глюкокортикоидов, входящих в стандартную терапию, нивелирует отдельные стрессорные и травматические нарушения.

2. Включение полиоксидония в комплексную терапию оптимизирует течение травматического воспаления и процессов регенерации по параметрам наименьшей инфильтрации зоны повреждения иммунокомпетентными и неспецифическими эффекторными клетками, а также по структуре рубца.

3. В раннем травматическом периоде выявляется ингибирующая или Р-адренергическая направленность действия адренергических соединений in vitro на суммарную фагоцитарную активность лейкоцитов. Включение полиоксидо-ния в комплексную терапию повышает чувствительность фагоцитирующих клеток к Р-адренергической регуляции.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены на I и II межрегиональных конференциях молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" (Пермь, 1999; 2002), VII Международном конгрессе по иммунореабилитации "Аллергия, иммунология и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие", Нью-Йорк, США, 2001; XI Международном конгрессе иммунологов, Стокгольм, Швеция, 2001; IV конгрессе РААКИ "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофар-макологии", Москва, 2001; I и II конференциях иммунологов Урала (Екатеринбург, 2001; Пермь, 2002). По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы.

Диссертационная работа апробирована на расширенном заседании научной проблемной комиссии по аллергологии и иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и рекомендована к защите.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 203 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов (3 главы), обсуждения, выводов. В диссертации 32 рисунка и 18 таблиц. Список литературы включает 321 источник, из них 235 отечественных и 86 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на 49 крысах-самцах популяции Wistar массой 200,5±6,6 г.

Проникающее ранение правого глаза наносили животным 4-х опытных групп в специально сконструированном приспособлении-фиксаторе с помощью микролезвия в области лимба (пограничная область между склерой и роговицей). При этом происходило ранение роговицы, склеры, сосудистого тракта. После травмы во всех случаях наблюдалось истечение внутриглазной жидкости и стекловидного тела. В некоторых случаях имело место повреждение хрусталика, истечение крови в переднюю камеру и стекловидное тело. Крысы 1-й группы (11 животных) не получали терапии. Животным 2-й группы (10 крыс) до 12 дня травматического периода проводили стандартную терапию, экстра-

полированную со схем, используемых в клинике (Л.Т. Архипова, Р.А. Гундоро-ва, 1992; Р.Л. Гундорова, 1992; М.В. Черешнева, 2000), и включавшую дексаме-тазон по 0,1 мг/кг массы тела 1 раз в день утром, ампициллин по 12500 ЕД/кг массы тела 2 раза в день, гентамицин по 1,5 мг/кг массы тела 2 раза в день, дик-лофенак натрия по 0,5 мг/кг массы тела 2 раза в день. Животные 3-й группы (10 крыс) получали стандартную терапию в сочетании с полиоксидонием (0,1 мг/кг через 7 ч, а также на 2-е, 4-е, 6-е и 8-е сутки после ранения). Крысам 4-й группы (10 животных) вводили только полиоксидоний. Все препараты вводили подкожно. Их введение начинали через 7 ч после травмы, поэтому динамика показателей до этого времени (объединенный исходный фон, 180 и 360 мин после травмы) проанализирована в объединенной группе (различий между группами, использованными для объединения, в указанные сроки по /-критерию Стьюден-та не выявлено). Образцы крови забирали из сосудов хвоста до нанесения травмы (показатели исходного фона, служившие контролем для всех исследований крови), через 180 мин, 360 мин, на 1-е, 2-е, 3-й, 5-е, 7-е и 12-е сутки после ранения. Контроль количества эритроцитов в крови показал отсутствие статистически значимых изменений этого показателя.

На 12-е сутки эксперимента животных всех групп выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом, определяли массу тела животных, тимуса, селезенки, надпочечников, готовили клеточные суспензии органов лимфомиелоидного комплекса. Для получения макропрепаратов глазного яблока и последующего приготовления гистологических препаратов обоих глаз головы каждого животного фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина. Дополнительным контролем для оценки состояния органов лимфо-миелоидного комплекса и патоморфологических исследований глаз служили интактные животные.

Вся работа проводилась на забуференной среде (ЗС - среда 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES, рН=7,36). Для оценки фагоцитарной активности клеток периферической крови использовали метод В.Н. Каплина с соавт. (1992) в модификации (Ю.И. Шилов и др., 1997). Смешивали 25 мкл ге-паринизированной крови и 25 мкл формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ, 200x10* эритроцитов/мл ЗС). Результаты учитывали после 20-минутной инкубации при микроскопически на мазках, окрашенных по Романовскому. Рассчитывали комплекс показателей, предложенных ранее (Ю.И. Шилов и др., 1997,1998).

Для оценки кислородозависимой микробицидности фагоцитирующих клеток крови использовали спектрофотометрический вариант теста с нитроси-ним тетразолием (НСТ-тсст) (СМ. Гордиенко, 1983) в модификации (Ю.И. Шилов, Е.Г. Орлова, 1997; 2000).

Концентрацию глюкозы крови определяли с помощью стандартного глю-

козооксидазного метода (А.И. Аникин, Ю.В. Родионов, 1992).

Клеточность органов лимфомиелоидного комплекса оценивали общепринятыми методами.

Исследование патоморфологических изменений глаз проводили совместно с доцентом кафедры патологической анатомии Пермской государственной медицинской академии МЗ РФ, к.м.н. Т.Б. Пономаревой по методике, разработанной В.Н. Архангельским (1957). Срезы готовили серийно, толщиной 5-7 микрон, окрашивали гематоксилином и эозином. При морфометрическом исследовании определяли клеточность шварты между фиброзной капсулой и радужкой (фиброзно-радужная шварта) в зоне формирования рубца с помощью сетки Г.Г. Автандилова. Подсчет клеток производили по общепринятой методике (Г.Г. Автандилов, 1990). Рассчитывали сумму эмигрирующих при воспалении клеток, к которым относили полинуклеарные лейкоциты и лимфоциты, не включая гистиоциты, так как последние могут иметь местное происхождение, либо быть потомками мигрирующих из крови моноцитов; учитывали общее количество клеток воспалительного инфильтрата. Последний показатель отражает интенсивность клеточных реакций при травматическом воспалении в целом. С помощью микрометрической линейки измеряли толщину роговицы травмированных (область рубца) и контрольных глаз в периферической зоне. Контрольные глаза были взяты у интактных животных.

Влияние адренергических соединений и теофиллина на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови оценивали в системе in vitro до нанесения травмы, затем через 180 мин и 1 сутки после нее. Использовали: аго-нист всех типов адренорецепторов адреналина гидрохлорид (0,1 и 1 мкг/мл), 0-адренергический агонист с преимущественным действием через Рг-адрено-рецепторы тербуталина сульфат ("бриканил", ASTRA, Венгрия, 10"* М), ингибитор фосфодиэстеразы - теофиллин (Sigma, США, ЗмМ). Выбор концентраций основывался на ранее проведенных исследованиях (Ю.И. Шилов и др., 1998; А.А. Ярилин, 1985; A. Shore et al., 1978; R.N. Spengler et al, 1994). К 25 мкл крови добавляли 12,5 мкл препарата, приготовленного на ЗС. В контрольные пробы вместо препаратов вносили 12,5 мкл ЗС. Пробы инкубировали 1 ч при 370С, затем добавляли 12,5 мкл ФЭБ (200х106/млна ЗС) и инкубировали 20 мин при 37°С. Результаты учитывали микроскопически.

Статистический анализ результатов проводили с использованием непарного /-критерия Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при /г<0,05. Результаты во всех таблицах и на рисунках представлены в виде средней арифметической и се стандартной ошибки

Наряду с традиционными методами для анализа выраженности влияния адренергических соединений и теофиллина на фагоцитарную активность лейкоцитов экспериментальных животных в системе in vitro использовали матрич-

ный метод, первоначально предложенный для оценки иммунного статуса (СП. Златев, И.Д. Димитров, 1991). Рассчитывали суммарные нормированные индексы изменения фагоцитарной активности определенного типа лейкоцитов, равные средней арифметической нормированных показателей фагоцитарного числа, процента истинных фагоцитов и абсолютного числа истинных фагоцитов, которые, в свою очередь, кратны стандартному отклонению от контроля с пре-инкубацией клеток в среде. Нормированный доверительный интервал для соответствующих индексов при р=0,05 составлял ±0,467 для п=20 и ±0,715 для п=10.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Иммуномодулирующие эффекты полиоксидония в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза

Ввиду того, что изменения абсолютных параметров фагоцитоза связаны не только с изменениями фагоцитарной активности самих клеток, но и их числа в крови, исследована динамика абсолютного числа нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов, а также лимфоцитов периферической крови экспериментальных животных. Установлено, что через 180 мин после нанесения травмы у всех животных развивался абсолютный нейтрофильный лейкоцитоз (рис. 1, А), который у животных, не получавших терапии, сохранялся в течение первых 3-х суток с нормализацией к 5-м. Во 2-й и 3-й группах практически на протяжении всего эксперимента отмечено развитие более продолжительного и выраженного нейтрофильного лейкоцитоза, что, вероятно, связано с действием дексаметазо-на. Полиоксидоний в составе стандартной терапии не отменял эффектов данного препарата, однако на 2-е сутки эксперимента несколько нивелировал выраженность нейтрофильного лейкоцитоза по сравнению со 2-й группой животных (р<0,05). У животных, получавших один полиоксидоний (4-я группа), выраженность и продолжительность нейтрофильного лейкоцитоза уменьшались.

У всех животных через 180 мин после ранения глаза развивался абсолютный моноцитоз, который оставался выраженным и через 360 мин (рис. 1, Б). Начиная с 5-х суток, во всех группах животных отмечено развитие моноцито-пении, которая, возможно, связана с активной эмиграцией моноцитов в очаг повреждения. Полиоксидоний не влиял на динамику числа моноцитов в эти сроки.

Через 180 мин после травмы у всех животных развивалась абсолютная эозинопения (рис. 1, В). В группе животных, не получавших терапии, абсолютное число эозинофилов достоверно не отличалось от показателей контроля на 1-5-е сутки, но на 7-е сутки вновь развивалось их снижение. Таким образом, для проникающего ранения глаза характерно развитие двух волн эозинопении -ранней (регистрируемой через 180 мин после травмы) и поздней (7-е сутки).

А

Б

В

Рис. 1. Динамика абсолютного числа нейтрофилов (А), моноцитов (Б) и эози-нофилов (В). По оси абсцисс: К - показатели контроля (объединенный исходный фон), 180' и 360' - показатели объединенной группы через 180 и 360 мин после ранения; 1,2,3, 5,7,12 - срок после ранения в 1-й, 2-й, 3-й и 4-й группах, сутки. По оси ординат: число клеток в 1 мм3 крови. 1-1-я группа, 2 - 2-я группа, 3 - 3-я группа, 4 - 4-я группа. * -р<0,05, # -р<0,01, ## -р<0,001 к контролю; а-р<0,05,Ь-р<0,01,с-р<0,001 к 1-й группе.

Рис.2. Измените общего числа лейкоцитов (А) и абсолютного числа лимфоцитов (Б). Остальные обозначения те же, что и на рис. 1.

У животных, получавших стандартную терапию (2-я группа), эозин опения развивалась на 1-е, 5-е, 7-е и 12-е сутки, т.е. для них характерно наличие более продолжительной поздней эозинопении (5-12-е сутки), что, по-видимому, связано с включением в стандартную терапию дексаметазона. Различия между 1-й и 2-й группами были достоверны на 12-е сутки (р<0,05). Введение полиоксидо-ния в комплексе со стандартной терапией (3-я группа) не изменяло выраженности и продолжительности эозинопении. У животных, получавших один полиок-сидоний, выявлено более раннее развитие второй волны эозинопении, где она статистически достоверно выражена на 5-е и 7-е сутки травмы.

У животных, получавших стандартную терапию, в отличие от 1-й группы на 1-е, 5-е, 7-е и 12-е сутки развивалась абсолютная лейкопения (рис. 2, А). При комбинации полиоксидония со стандартной терапией (3-я группа), выраженность лейкопении несколько нивелировалась, снижение общего числа лейкоцитов отмечено только на 5-е и 7-е сутки. При введении одного полиоксидония (4-я группа) развитие лейкопении отмечено на 5-е и 7-е сутки. Необходимо от-

метить, что лейкопения у крыс была обусловлена абсолютной лимфопенией (рис. 2, Б). Развитие лимфо- и лейкопении во 2-й и 3-й группах может быть связано с эффектами синтетического глюкокортикоида - дексаметазона.

До начала терапии у всех животных наблюдалась значительная активация нейтрофильного фагоцитоза как по абсолютным, так и по относительным показателям через 180 и 360 мин после ранения (рис. 3). Увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов через 180 и 360 мин после повреждения может быть связано не только с развитием травматического воспаления, но и опосредовано развитием стрессорных реакций, так как однотипные изменения ранее выявлены и в моделях острого стресса (Ю.И. Шилов, СВ. Гейн, 1999; Ю.И. Шилов, Е.Г. Орлова, 1997).У животных, не получавших терапии, абсолютные показатели нейтрофильного фагоцитоза оставались повышенными в течение первых 3-х суток. На фоне стандартной терапии наряду с увеличением абсолютных показателей нейтрофильного фагоцитоза на 1-е, 2-е, 3-е и 7-е сутки, выявлено снижение его относительных параметров на 5-е сутки. Более длительный нейтро-фильный лейкоцитоз (рис. 1, А) и увеличение абсолютных параметров нейтрофильного фагоцитоза (рис.3, А) связаны, вероятно, с включением в стандартную терапию дексаметазона. Диссоциация между относительными и абсолютными показателями фагоцитоза может быть обусловлена как выходом из костного мозга относительно незрелых нейтрофилов, так и эмиграцией наиболее функционально активных нейтрофилов в очаг травматического воспаления. Полиоксидоний в составе стандартной терапии отменял активацию нейтрофильного фагоцитоза по абсолютному числу захваченных объектов фагоцитоза на 3-й и 7-е сутки, приводил к снижению на 5-е и 12-е сутки эксперимента интегрального относительного параметра - фагоцитарного числа. При введении одного полиоксидония нивелировалось увеличение абсолютных параметров нейтрофильного фагоцитоза на 2-е и 3-й сутки эксперимента, а на 12-е сутки выявлено их снижение. Наиболее существенные различия по абсолютным показателям между 2-й и 3-й группами выявлены на 2-е сутки травмы. Полиокси-доний в этот срок отменял эффект стандартной терапии.

Через 180 мин после травмы наблюдалась активация моноцитарного фагоцитоза по абсолютным показателям (рис. 4, А), связанная с развитием моно-цитоза (рис. 1, Б). Однако с 5-х суток развивалось снижение фагоцитарной активности моноцитов по абсолютным параметрам. Снижение фагоцитарной активности моноцитов и моноцитопения в конце первой недели после ранения глаза, вероятно, обусловлены активной миграцией мононуклеарных фагоцитов в очаг травматического воспаления, а также уменьшением их выхода из костного мозга. На фоне стандартной терапии на 1-е и 2-е сутки после травмы отмечена активация моноцитарного фагоцитоза по относительным показателям и на 2-е сутки - по абсолютным, что, вероятно, связано с эффектами дексаметазона.

А

Б

Рис. 3. Изменения показателей фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови при проникающем ранении глаза. По оси ординат: на А - абсолютное число захваченных объектов фагоцитоза в 1 мкл крови, на Б - фагоцитарное число. Остальные обозначения те же, что и на рис.1.

Эго предположение подтверждается ранее проведенными исследованиями, в которых выявлено увеличение относительных показателей моноцитарного фагоцитоза через 24 ч после однократного введения животным гидрокортизона в дозе 50 мг/кг (Д.В. Ланин, 2001). Полиоксидоний в 3-й группе отменял избыточную активацию моноцитарного фагоцитоза на 1-е и 2-е сутки по относительным показателям, вызванную стандартной терапией (р<0,0\ по отношению ко 2-й группе), что связано, вероятно, со способностью полиоксидония стимулировать миграционную способность мононуклеарных фагоцитов (Р.В. Петров и др., 2000).

До начала терапии отмечено увеличение фагоцитарной активности эози-нофилов в относительном выражении (рис. 5, Б), что наряду с активацией нсй-трофильного и моноцитарного фагоцитоза в ранние сроки сходно со сдвигами, наблюдаемыми при стрессе (Ю.И. Шилов, Е.Г. Орлова, 2002). Наиболее существенные изменения эозинофильного фагоцитоза выявлены под действием стандартной терапии, включающей глюкокортнкоиды. На 1-е сутки после трав-

Б

Рис. 4. Изменения показателей фагоцитарной активности моноцитов периферической крови при проникающем ранении глаза. По оси ординат: на А - абсолютное число захваченных объектов фагоцитоза в 1 мкл крови, на Б - фагоцитарное число. Остальные обозначения те же, что и на рис. 1.

мы у животных 2-й и 3-й групп наблюдались депрессия абсолютных и повышение относительных показателей эозинофильного фагоцитоза (рис. 5, А и Б). В условиях введения одного полиоксидония в 4-й группе животных динамика абсолютных показателей эозинофильного фагоцитоза не отличалась от животных 1-й группы. Однако в составе стандартной терапии полиоксидоний изменял динамику относительных показателей по сравнению со 2-й группой, отменяя их увеличение на 2-е и 7-е сутки эксперимента и нивелируя на 12-е сутки (р<0,05 ко 2-й группе). Следовательно, на параметры эозинофильного фагоцитоза в условиях травмы полиоксидоний оказывал минимальное влияние, хотя в ранее проведенных исследованиях in vitro выявлено активирующее действие этого препарата на фагоцитарную активность эозинофилов (В.А. Черешнев и др., 1999).

Таким образом, при проникающем ранении глаза выявлены фазные изменения иейтрофильного, моноцитарного и эозинофильного фагоцитоза. Полиок-сидоний наиболее существенно определял изменения относительных показате-

<00 I 1 4

300 ]\ I 4 [Лг

200 у\

100 2 Г *ъ • э 7 «р

К180* 360* 1 2 3 5 7 12

1 2 3 5 7 12

Рис. 5. Изменения показателей фагоцитарной активности эозинофилов периферической крови при проникающем ранении глаза. По оси ординат: на Л - абсолютное число захваченных объектов фагоцитоза в 1 мкл крови, на Б - фагоцитарное число. Остальные обозначения те же, что и на рис.1.

лей моноцитарного фагоцитоза, а глюкокортикоиды - эозинофильного.

Несмотря на увеличение в ранний травматический период (180 и 360 мин) суммарного числа участвующих в НСТ-тесте клеток крови при проникающем ранении глаза, их кислородозависимый микробицидный потенциал снижался по абсолютным и относительным показателям НСТ-теста (рис. 6 и 7). У животных, не получавших терапии, абсолютные показатели НСТ-теста были снижены на 1-е и 2-е сутки - в стимулированном (рис. 6, А) и на 3-й сутки — в спонтанном вариантах (рис.6, Б). Относительные показатели НСТ-теста у этих животных были снижены вплоть до 3-го дня эксперимента (рис.7). Стандартная терапия приводила к более выраженному снижению абсолютных и относительных показателей в 1-3-и сутки и развитию второй волны их снижения на 7-е сутки эксперимента. Поскольку снижение относительных показателей НСТ-теста было показано и в ранние сроки острого стресса (Ю.И. Шилов, Е.Г. Орлова, 1997,2000), а также после введения гидрокортизона (Ю.И. Шилов, Д.В. Ланин,

14 А

» т -

0.1 а 0.1

о -- -о

КЧвСЗбО1 12357 12 1 2 3 5 7 12

Рис. 6. Динамика абсолютных показателей НСТ-теста при проникающем ранении глаза у крыс. А - стимулированный вариант; Б - спонтанный вариант НСТ-теста. По осям ординат: абсолютные значения экстинкции при 710 нм из расчета на 25 мкл крови. Остальные обозначения те же, что и на рис. 1.

2001), вероятно, усиление депрессии микробицидного потенциала НСТ-теста на фоне стандартной терапии связано с действием эндогенных глюкокортикоидов и экзогенно вводимого дексаметазона, стимулирующих выход из костного мозга относительно незрелых гранулоцитов. Введение полиоксидония в комплексе со стандартной терапией отменяло снижение абсолютных показателей НСТ-теста в первые трое суток. Депрессия абсолютных параметров НСТ-теста отмечена только на 5-е сутки, однако относительные показатели оставались снижены вплоть до 5-х суток. При введении одного полиоксидония выявлена более выраженная и продолжительная депрессия абсолютных и относительных показателей стимулированного варианта теста по сравнению с 1-й группой (рис. 6, А и 7, А). В спонтанном варианте теста у животных 4-й группы динамика абсолютных показателей была сходна с таковой 3-й группы, снижение относительных показателей было выявлено только на 3-й сутки.

Таким образом, в эксперИхменталыю-биологической модели проникающего ранения глаза выявлены изменения не только количественного состава кле-

Рис. 7. Динамика относительных показателей НСТ-тсста при проникающем ранении глаза у крыс. А - стимулированный вариант, Б - спонтанный вариант. По оси ординат: относительные значения экстинкции, выраженные в условных единицах (на 25х106 фагоцитирующих клеток). Остальные обозначения те же, что и на рис. 1.

ток периферической крови, но и функциональной активности фагоцитирующих клеток. Полиоксидоний оказывал влияние преимущественно на поглотительную активность нейтрофилов и моноцитов, на кислородозависимую микроби-цидность фагоцитирующих клеток в НСТ-тесте. Изменения эозинофильного фагоцитоза большей частью определялись эффектами глюкокортикоидов.

Для дополнительной характеристики стрессорных и травматических изменений иммунной системы при травме глаза и их коррекции полиоксидонием оценивали изменения массы и клеточности органов лимфомиелоидного комплекса, а также уровень глюкозы крови (рис. 8 и 9).

Через 6 ч после ранения у животных всех групп наблюдалось увеличение концентрации глюкозы крови. У животных, не получавших терапии, уровень глюкозы крови оставался повышенным на 1-е, 2-е, 7-е и 12-е сутки эксперимента. У животных, получавших стандартную терапию, гипергликемия была выявлена только на 1-е и 12-е сутки после ранения. Вероятно, введение в комплексе

ммоль/л 10 в

в .

г

ммоль/л

б

8

10

..4

4

2

2

О

о

МвО'ЗвО' 1 г 3 5 7 12

2 3 5 7 12

Рис. 8. Изменение концентрации глюкозы в крови. Остальные обозначения те же, что и на рис. 1.

с другими препаратами дексаметазона по механизму обратной связи модулировало продукцию эндогенных глюкокортикоидов и инсулина в связи с гипергли-кемическим эффектом дексаметазона. Поэтому выраженность стрессорных изменений уровня глюкозы в этой группе, начиная со 2-х суток травмы вплоть до 7-х, была меньшей, чем в 1-й группе. Динамика изменений концентрации глюкозы у животных 3-й группы, получавших полиоксидоний в составе комплексной терапии, была сходна с таковой 2-й группы. Полиоксидоний в 4-й группе животных отменял увеличение концентрации глюкозы крови на протяжении всего эксперимента, что является одним из проявлений его антистрессорного действия.

На 12-е сутки эксперимента у животных, не получавших терапии, выявлено развитие выраженной гиперплазии костного мозга, тимуса, селезенки, гипертрофии надпочечников (рис.9). Гиперплазия костного мозга - характерное проявление стресса (Ю.И. Зимин, 1979,1980), а увеличение клеточности тимуса относится к изменениям, специфичным для травмы (Е.А. Вагнер и др., 1984). На фоне стандартной терапии увеличение клеточности костного мозга отменялось, развивалось выраженное снижение числа ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке. При введении полиоксидония в составе комплексной терапии большинство этих изменений сохранялось. Уменьшение клеточности тимуса и селезенки, вероятно, связано с совместными эффектами эндогенных глюкокор-тикоидов и синтетического глюкокортикоида дексаметазона, входящего в состав стандартной терапии. Подтверждением этому является отмена по механизму обратной связи развития гипертрофии надпочечников, как во 2-й, так и в 3-й группе. В настоящее время доказано, что способность глюкокортикоидов-вызывать снижение клеточности и массы тимуса и селезенки связана с экспрессией на их клетках специфичных к глюкокортикоидам рецепторов ф. Armanini

А Б В Г

Рис. 9. Изменение показателей клеточности органов лимфомиелоидного комплекса и массы надпочечников при проникающем ранении глаза у крыс. А -клеточность тимуса, Б - клеточность селезенки, В - клеточность костного мозга, Г - масса надпочечников. По оси ординат - число ядросодержатих клеток на орган. По оси абсцисс - К - контроль (интактные животные), 1-1-я группа, 2 - 2-я группа, 3-3-я группа, 4 - 4-я группа. Остальные обозначения те же, что на рис. 1.

et al, 1988; В. McEwen et ai, 1997; A.H. Miller et al., 1990). Введение одного по-лиоксидония в 4-й группе животных приводило к выраженной гиперплазии тимуса, что согласуется с данными об активирующем действии препарата на Т-лимфоцитарное звено иммунной системы (Р.В. Петров и др., 2000).

Морфологическая и морфометрическая характеристика травматического воспаления и репаративиых процессов при проникающем ранении глаза на фоне разных схем терапии

Патогистологический анализ травмированных глаз через 12 дней после нанесения травмы выявил следующие изменения.

В раневом канале всех изученных глаз формировался рубец (рис. 10). В глазах животных 1-й группы рубец отличался немногочисленными сосудами, обилием клеточных элементов. В раневом канале глаз животных 2-й группы встречались единичные сосуды, преобладали волокнистые структуры над клеточными. Наиболее упорядоченное компактное бессосудистое строение рубцовой ткани с компактным расположением коллагеновых пластин и преобладание волокнистого компонента над клеточным выявлено в глазах животных 3-й группы. В глазах животных 4-й группы отмечалось некоторое замедление процессов заживления по сравнению с глазами крыс 3-й группы, что проявлялось наличием рыхлой рубцовой ткани с незначительным отеком стромы, обилием кератобластов. Таким образом, наименьшая степень реактивных изменений в тканях глаза и более упорядоченное строение рубцовой ткани имели место в

Зона повреждения глаза крысы 1 группы. Формирующийся рубец с выраженной воспалительной инфильтрацией, швар-той; экссудат в задней камере. Гематоксилин и эозин, х80.

_ „ _ _ »»■о * V* V кчл.« * * V Зона повреждения глаза крысы 2 группы. Единичные сосуды, беспорядочно расположенные фибробласты, лимфоциты. Гематоксилин и эозин, х80.

ЛШ- * А< «* ¿г Зона повреждения глаза крысы 3 группы. Формируется рого-вичный рубец с правильным рыхлым расположением рого-вичных пластин, увеличением количества кератобластов, шварты с радужной оболочкой. Гематоксилин и эозин, х160.

Зона повреждения глаза крысы 4 группы. Определяется обилие кератобластов с относительно правильным их расположением, единичные лимфоциты. Сохраняются отек стромы, лимфоидно-клеточная инфильтрация окружающей ткани. Гематоксилин и эозин, х80.

Рис. 10. Патоморфология травмированных глаз.

глазах животных 3-й группы, что подтверждается и данными морфометрии толщины роговицы в рубцовой зоне. Этот показатель у интактных животных (в мкн) составил 151,58±7,08, у крыс 1-й группы - 218,17±24,99 (р<0,05 к интакт-ным), во 2-й группе - 172,43±8,44, в 3-й - 138,83±11,12 (р<0,05 по отношению к 1-й и 2-й группам), в 4-й - 142,8± 12,72 (р<0,05 по отношению только к 1-й группе).

Во всех травмированных глазах определялись выраженные в различной степени шварты паутиноподобного строения с явлениями воспалительной инфильтрации. У животных, не получавших терапии, определялась наиболее выраженная по сравнению с другими группами воспалительная реакция, проявляющаяся в большей инфильтрации шварты клетками (общее количество клеток, приходящихся на единицу площади). Среди последних преобладали эмигрирующие клетки (табл. 1). Минимальное содержание в шварте фибробластов свидетельствует о недостаточности репаративных процессов в роговице. Применение стандартной терапии уменьшало инфильтрацию шварты эмигрирую -щими клетками и несколько нивелировало развитие воспалительного процесса.

Таблица 1

Абсолютное содержание клеток на единицу площади шварты травмированных глаз крыс

Группа Вид клеток Сумма эмиг- Общее коли-

Полиморфо Лимфоциты Гистиоци- Фиброблас- Илазмоци- рирующих чество

нуклеары ты ты Ты клеток" клеток

1-я 5,27±0,52 4,07±0,44 1,87±0,29 1,73±0,33 0,93±0Д5 9,ЭЗ±0,78 13,87±0,77

2-я 0,4010,16* 2,93±0,30' 0,73±0,18* 4,13±0,45" 0,47±0,13 3,33 ±0,3 7* 8,6710,27*

3-я 0л 1,60±0,25"ь 0,47±0,19" 3,93±0,30" 0,20±0,11 1,60±0,25"ь 6,20±0,18*ь

4-я 0,53±0,17ас 3,47±0,34с 0,33±0,13* 5,53±0,31"* 0,40±0,16 4,00±0,32"с 10,2710,4**

Примечания: - указана сумма полиморфопуклеаров и лимфоцитов; а - р<0,05 к 1-й группе, Ь - р<0,05 ко 2-й группе, с - р<0,05 к 3-й группе по непарному /-критерию Стьюдента.

Подобный эффект был отмечен и в глазах животных, получавших один полиок-сидоний. В условиях применения полиоксидония в составе комплексной терапии (3-я группа) отмечена минимальная клеточная инфильтрация шварты. В инфильтрате отсутствовали полиморфонуклеарные лейкоциты, по сравнению с остальными группами достоверно снижалось абсолютное число лимфоцитов. Преобладание у животных 3-й группы в воспалительном инфильтрате шварты фибробластов над другими клетками в относительном выражении при отсутствии полиморфонуклеаров свидетельствует о завершении экссудативной фазы воспаления и переходе к процессу пролиферации клеток соединительной ткани, т.е. к репарации, что подтверждается особенностями морфологической картины этой зоны.

Таким образом, по результатам патогистологического исследования использование полиоксидония в комплексе со стандартной терапией при ранении глаза является более благоприятным для оптимизации процесса воспаления и формирования структурированной рубцовой ткани.

Влияние адренергнческих соединений и теофиллина in vitro на фагоцитарную активность лейкоцитов при проникающем ранении глаза на фоне введения полиоксидония

В ранее опубликованных работах была показана важная роль адренерги-ческих механизмов в иммуномодулирующих эффектах стресса и глюкокорти-коидов (Ю.И. Зимин, 1983; Е.А. Корнева и др., 1978; 1988; Ю.И. Шилов и др., 1998; 2000; 2001). Учитывая развитие при проникающем ранении глаза выраженных стрессорных изменений, представлялось целесообразным оценить участие адренергических механизмов в модуляции функций фагоцитирующих клеток в условиях данного эксперимента. В связи с этим исследованы изменения фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови крыс после 1-часовой преинкубации in vitro с агонистом всех типов адренорецепторов адреналином, (32-адренергическим агонистом тербуталином сульфатом, ингибитором фосфодиэстеразы теофиллином. Как было показано ранее, стимуляция р-адренорецепторов приводит к угнетению, а сс-адренорецепторов - к повышению фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови (Ю.И. Шилов и др., 1998; 2000). Результаты интегральной оценки изменений фагоцитоза с помощью матричного метода представлены в табл. 2.

Установлено, что до нанесения травмы адреналин в концентрации 0,1 мкг/мл оказывал слабо выраженный угнетающий или Р-адренергический эффект на общий лейкоцитарный фагоцитоз, который несколько усиливался через 180 мин после проникающего ранения глаза. Однако на 1-е сутки эксперимента суммарный индекс изменений общего лейкоцитарного фагоцитоза в пробах с адреналином в концентрации 0,1 мкг/мл во всех группах животных не выходил за границы доверительного интервала. В концентрации 1 мкг/мл адреналин оказывал более выраженный по сравнению с меньшей концентрацией адреналина угнетающий эффект на общий лейкоцитарный фагоцитоз до нанесения травмы. Через 180 мин этот эффект усиливался. На 1-е сутки после травмы адреналин в концентрации 1 мкг/мл приводил к выраженной депрессии общего лейкоцитарного фагоцитоза по суммарному индексу во всех группах животных, однако более выраженное угнетение отмечено в 3-й группе животных, получавших по-лиоксидоний на фоне стандартной терапии. Таким образом, с одной стороны, выявлено усиление депрессивного эффекта адреналина в ранний травматический период по сравнению с интактными животными (объединенный исходный фон), с другой - подтверждена зависимость эффекта адреналина in vitro от его

Таблица 2

Суммарные нормированные индексы изменения общего лейкоцитарного фагоцитоза под влиянием адреналина, тербуталина и теофиллина in vitro

Срок исследования Адреналин, Тербуталин, Теофиллин,

0,1 мкг/мл 1 мкг/мл Ю^М ЗмМ

Исходный фон -0,60 -1,41 -1,39 -0,71

180 мин -0,89 -1,90 -1,73 -1,45

1 сутки:

1 группа -0,23 -1,12 0,25 -0,67

2 группа -0,30 -1,13 -0,25 -0,49

3 группа 0,33 -1,89 -1,18 -1,12

4 группа_0j08_-1,56_-0,80_-0,79

Примечание. Жирным шрифтом выделены индексы, выходящие за пределы доверительного интервала. Исходный фон, 180 мин - показатели объединенной группы до нанесения ранения и через 180 мин после него; 1 сутки - срок после ранения в 1-й, 2-й, 3-й и 4-й группах. Анализ изменений отдельных показателей фагоцитоза с помощью обычных статистических подходов детально представлен в диссертации и выявил те же закономерности.

концентрации.

Депрессивный эффект р-адренергического агониста тербуталина усиливался в ранний травматический период по сравнению с исходным фоном (табл. 2). На 1-е сутки травмы тербуталин угнетал общий лейкоцитарный фагоцитоз по суммарному индексу только в группах животных, получавших полиоксидо-ний, причем более выражено у крыс 3-й группы, получавших полиоксидоний на фоне стандартной терапии.

Как известно, эффекты стимуляции Р-адренергических рецепторов реализуются через повышение уровня внутриклеточного цАМФ (A.D. Strosberg, 1995). Поэтому представлялось целесообразным оценить влияние теофиллина, вызывающего повышение внутриклеточного цАМФ, на фагоцитарную активность лейкоцитов. Степень угнетения общего лейкоцитарного фагоцитоза под действием теофиллина по суммарному индексу значительно усиливалась в ранний травматический период. На 1-е сутки эксперимента теофиллин угнетал общий лейкоцитарный фагоцитоза по суммарному индексу только в группах животных, получавших полиоксидоний, причем более выражено в группе животных, получавших полиоксидоний в составе комплексной терапии. Таким образом, в эксперименте in vitro отмечена в основном ингибирующая или р-адренергическая направленность действия адренергических соединений и тео-филлина на фагоцитарную активность лейкоцитов крови. Ингибирующие эффекты адренергических соединений и теофиллина усиливались при включении в терапию полиоксидония, это дает основание предполагать, что полиоксидо-

ний повышает либо экспрессию р-адренорецепторов и/либо усиливает транс-дукцию с них регуляторного сигнала. На возможность последнего механизма указывают данные Е. Abraham et ah (2001), показавших, что в условиях острого стресса степень активации CREB (cAMP response element-binding protein) прямо пропорционально зависела от уровня таких провоспалительных цитокинов, как TNF-a и MIP-2, и уменьшалась при блокаде Р-адренорецепторов. Учитывая способность полиоксидония стимулировать in vivo синтез отдельных провоспа-лительных цитокинов, в частности, TNF-a (P.B. Петров и др., 2000), можно предполагать, что Р-адренергические агонисты, должны приводить к более сильной активации CREB, и в результате к более выраженному угнетению фагоцитоза. Не исключена возможность и изменения функциональной экспрессии р-адренорецепторов через киназазы, фосфорилирующие G-протеин-связанные рецепторы (GRK), так как IL-6 и IFN-y способны подавлять экспрессию GRK2, 3, 6 в лейкоцитах, что приводит к усилению чувствительности и активности соответствующих рецепторов и к повышению ответа клетки, в частности, на pV адренергические агонисты (M.S. Lombardi et о/., 2001).

В целом полученные результаты указывают на целесообразность включения полиоксидония в комплексную терапию при проникающем ранении глаза.

ВЫВОДЫ

1. При экспериментальном проникающем ранении глаза крыс выявлены фазные изменения числа нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов периферической крови и их поглотительной активности с развитием депрессии микроби-цидного потенциала фагоцитирующих клеток в тесте с нитросиним тетразоли-ем, а также стрсссорное увеличение уровня глюкозы крови, развитие на 12-е сутки травмы гипертрофии надпочечников, гиперплазии тимуса, селезенки и костного мозга.

2. В течение первых суток травмы на фоне развития триады гематологических признаков стресса (лимфопении, эозинопении, нейтрофильного лейкоцитоза) и моноцитоза отмечены активация поглотительной активности нейтро-филов и эозинофилов, увеличение абсолютных параметров моноцитарного фагоцитоза, а в поздний травматический период (начиная с 5-7-х суток) - снижение абсолютных показателей моноцитарного и эозинофильного фагоцитоза с развитием моноцитопении и эозинопении.

3. В условиях стандартной терапии, включающей дексаметазон, диклофе-нак натрия, ампициллин, гентамицин, выявлены усиление выраженности ней-трофилыюго лейкоцитоза, эозинопении, лимфо- и лейкопении, депрессии ки-слородозависимого микробицидного потенциала фагоцитирующих клеток, активации нейтрофильного фагоцитоза по абсолютным, а моноцитарного и эози-нофильного -по относительным показателям, а также нивелирование гиперпла-

зии костного мозга, развитие гипоплазии тимуса и селезенки.

4. Установлено, что включение полиоксидония в комплексную терапию при проникающем ранении глаза приводило к частичной отмене депрессии ки-слородозависимого микробицидного потенциала фагоцитирующих клеток, избыточного увеличения поглотительной активности нейтрофилов и моноцитов, лейкопении, развивающихся в условиях стандартной терапии.

5. Показано, что введение одного полиоксидония приводило к более выраженному и продолжительному снижению абсолютных показателей микроби-цидного потенциала фагоцитирующих клеток, однако продолжительность снижения относительных показателей НСТ-теста уменьшалась.

6. Полиоксидоний в составе комплексной терапии оптимизировал течение раневого процесса по параметрам наименьшей инфильтрации зоны повреждения и по структуре рубца, способствовал более полному завершению развития клеточных реакций при воспалении, уменьшая содержание в воспалительном инфильтрате эмигрирующих полиморфноядерных лейкоцитов и увеличивая количество фибробластов.

7. В раннем травматическом периоде в системе in vitro выявлена ингиби-рующая или р-адренергическая направленность действия адренергических соединений на суммарную фагоцитарную активность лейкоцитов. Включение по-лиоксидония в комплексную терапию повышало чувствительность фагоцитирующих клеток к Р-адренергической регуляции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

(Баданина О.Н. с 2001 г. имеет фамилию Гейн О.Н.)

1. Баданина О.Н. Динамика показателей гемограммы и НСТ-теста при экспериментальном проникающем ранении глаза на фоне разных схем терапии и иммунокоррек-ции / О.Н. Баданина, СВ. Осотов // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Тез. докл. межвузовской конф. молодых ученых. - Пермь, 1999. - С. 116118.

2. Черешнев В.А. Полиоксидоний как модулятор функций фагоцитирующих клеток при проникающем ранении глаза / ВА. Черешнев, Ю.И. Шилов, М.В. Черешнева, Л.А. Платова, О.Н. Баданина, СВ. Осотов // Int. J. Immunorehabilitation. - 1999. - № 14. -С. 9-9.

3. Черешнева М.В. Изменение функций фагоцитирующих клеток при экспериментальном проникающем ранении глаза / М.В. Черешнева, Ю.И. Шилов, О.Н. Баданина, СВ. Осотов // Науч. сессия Пермск. гос. медицинской академии: Тез. докл. - Пермь, 1999. - С. 207-208.

4. Chereshneva M.V. Alterations of phagocytic cell functions in the experimental animal model of eye injury / M.V. Chereshneva, Ju.I. Shilov, O.N. Badanina, S.V. Osotov // J. Autoimmunity. -1999. - Suppl. - P. 52-52.

5. Chereshnev V.A. Effects of polyoxidonium on phagocytic cell functions. Experimental and clinical estimation of potential inclusion of polyoxidonium in complex therapy in penetrating eye injury / V.A. Chereshnev, Ju.I. Shilov, M.V. Chereshneva, LA. Platova, O.N. Badanina, S.V. Osotov, T.B. Ponomareva// Rus. J. Immunol. - 2000. - Vol. 5, № 1. - P. 39-52.

6. Черешнева М.В. Динамика показателей кислородозависимых механизмов бак-терицидности циркулирующего пула фагоцитирующих клеток в тесте с нитросиним тет-разолием при экспериментальном проникающем ранении глаза / М.В. Черешнева, Ю.И. Шилов, О.Н. Баданина, С В. Осотов // Иммунология. - 2000. - № 1. - С. 26-30.

7. Черешнев ВА. Динамика фагоцитарной активности лейкоцитов и изменения клеточности органов лимфомиелоидного комплекса при экспериментальном проникающем ранении глаза / ВА. Черешнев, Ю.И. Шилов, М.В. Черешнева, О.Н. Баданина // Int. J. Immunorehabilitation. - 2000. - Vol. 2., № 2. - С. 145-153.

8. Баданина О.Н. Влияние полиоксидония на функции фагоцитирующих клеток при экспериментальном проникающем ранении глаза / О.И. Баданина, М.В. Черешнева, Ю.И. Шилов, СВ. Осотов, Т.Б. Пономарева // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. XIV Российской науч. конф. - Челябинск: Южно-Уральское кн. изд-во, 2000. - С 9-10.

9. Шилов Ю.И. Изменения функций циркулирующего пула фагоцитирующих клеток при экспериментальном проникающем ранении глаза на фоне разных схем терапии, включающей полиоксидоний / Ю.И. Шилов, М.В. Черешнева, О.Н. Баданина, СВ. Осотов, Т.Б. Пономарева // Рациональное использование лекарств: Тез. докл. Российской на-уч.-практ. конф. - Пермь, 2000. - Часть 1. - С. 49-50.

10. Черешнев В.А. Изменения функций циркулирующего пула фагоцитирующих клеток при экспериментальном проникающем ранении глаза / В.А. Черешнев, Ю.И. Шилов, М.В. Черешнева, О.Н. Баданина, СВ. Осотов // Второй Российский конгресс по патофизиологии с международным участием "Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы (экспериментальные и клинические аспекты)". Москва, 9-12 октября 2000 г.: Тез. докл. - М.: РГМУ, 2000. - С 158-159.

11. Черешнева М.В. Иммунокоррекция при ранении глаза / М.В. Черешнева, Ю.И. Шилов, О.Н. Баданина, В.А. Черешнев, Н.Н. Кеворков, Т.Б. Пономарева, СЮ. Шилов -Екатеринбург: УрО РАН, 2001.-180 с.

12. Черешнев В.А. Физиология иммунной системы и экология / В.А. Черешнев, Н.Н. Кеворков, Б.А. Бахметьев, СВ. Ширшев, Ю.И. Шилов, К.В. Шмагель, В.А. Демаков, М.В. Черешнева, ИА. Тузанкина, А.В. Осипенко, М.Б. Раев, Л.Б. Королевская, ЕА. Старкова, О.Н. Баданина, И.В. Ширшева// Иммунология. - 2001. - № 3. - С 12-16.

13. Баданина О.Н. Стрессорные изменения функций циркулирующего пула фагоцитирующих клеток в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза крыс / О.Н. Баданина, СВ. Осотов // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: Материалы II Российской копф. молодых ученых с международным участием (Москва, 24-28 апреля 2001 г.). - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - Т. 1. - С 189-189.

14. Баданина О.Н. Влияние полиоксидония на функции циркулирующего пула фагоцитирующих клеток, клеточность органов лимфомиелоидного комплекса в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза / О.Н. Баданина // Там же. - С 188-189.

15. Черешнева М.В. Иммуномодулирующие эффекты полиоксидония в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза / М.В. Черешнева, О.Н. Баданина, Ю.И. Шилов, В.А. Черешнев, Т.Б. Пономарева // Int. J. Immunorehabilitation. -2001. - Vol. 3, ЛЪ 1. - P. 19-19.

16. Черешнев В.А. Иммуномодулирующие эффекты миелопептидов и полиокси-дония при проникающем ранении глаза / ВА. Черешнев, М.В. Черешнева, А.А. Михайлова, Ю.И. Шилов, СВ. Гейн, Т.В. Гаврилова, О.Н. Баданина, СЮ. Шилов, Т.Б. Пономарева // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии: IV Конгресс Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ). 29-31 мая 2001 года: Сб. тр. и Тез. докл. -М., 2001. - Т. 2. - С. 409-409.

17. Черешнева М.В. Иммуномодулирующие эффекты полиоксидоиия в экспериментальной модели проникающего ранения глаза / М.В. Черешнева, Ю.И. Шилов, ВА. Черешнев, О.Н. Баданина // Аллергология и иммунология. - 2001. - Т. 2, № 2. - С. 24-24.

18. Баданина О.Н. Механизмы стрессорных нарушений функций иммунной системы при экспериментальном проникающем ранении глаза / О.Н. Баданина, Ю.И. Шилов, М.В. Черешнева // Проблемы загрязнения окружающей среды-2001: Материалы V Международной конференции. Волгоград-Пермь, 18-25 сентября 2001 г. - Пермь, 2001. - С. 56-56.

19. Баданина О.Н. Стрессорные нарушения функций фагоцитирующих клеток периферической крови в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза / О.Н. Баданина, Ю.И. Шилов, М.В. Черешнева // Иммунология Урала. - 2001. -№ 1(1).-С. 32-32.

20. Chereshnev V.A. Immunoregulatory effects of polyoxidonium in experimental model of penetrating eye injury / V.A. Chereshnev, M.V. Chcreshneva, Ju.I Shilov, O.N. Badanina// Scand. J. Immunol. - 2001. - Vol. 54, Suppl. 1. - P. 115-115.

21. Гейн О.Н. Влияние адренергических соединений и теофиллина на фагоцитарную активность лейкоцитов in vitro при проникающем ранении глаза / О.Н. Гейн, Ю.И. Шилов, М.В. Черешнева // Мед. иммунология. 2002. - Т. 4, № 2. - С.120-120.

22. Гейн О.Н. Изменения функций фагоцитирующих клеток в системах in vivo и in vitro при проникающем ранении глаза / О.Н. Гейн, Ю.И. Шилов, М.В. Черешнева // Иммунология Урала. 2002. - № 1(2). - С. 5-5.

23. Гейн О.Н. Иммуномодулирующие эффекты полиоксидония в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза / О.Н. Гейн // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Материалы межрегиональной конф. молодых ученых (20-22 ноября 2002 г.). - Пермь, 2002. - С. 78-80.

24. Гейн О.Н. Модуляция травматического воспаления полиоксидонием при экспериментальном проникающем ранении глаза / О.Н. Гейн, М.В. Черешнева, Ю.И. Шилов, Т.Б. Пономарева // Иммунология Урала. 2003. - № 1(3). - С. 82-82.

На правах рукописи

Гейн Оксана Николаевна

ОЦЕНКА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИОКСИДОНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-БИОЛОГИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ ПРОНИКАЮЩЕГО РАНЕНИЯ ГЛАЗА

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99

Подписано в печать 22.01.2004. Набор компьютерный Формат 60X100/16 Усл. печ. л. 1,0 Заказ № 19/2004 Тираж 120 экз.

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614000, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к.113, т.(3422) 198-033

Актуальность проблемы. Проникающее ранение глаза является одной из главных причин снижения и потери зрения [62]. Как и при травме другой локализации [4, 28, 30, 73, 85, 87, 101, 192, 224] при проникающем ранении глаза развивается состояние иммунодепрессии [35, 37, 61, 197, 199]. Травма глаза относится к тяжелой патологии, при которой ведущим фактором патогенеза явля--ется нарушение функций иммунной системы [8, 37, 233]. В ранее проведенных клинических исследованиях установлено, что при проникающем ранении глаза развивается вторичная недостаточность клеточного звена иммунной системы, повышение поглотительной активности фагоцитирующих клеток на фоне выраженной депрессии их микробицидного потенциала, дисиммуноглобулинемия [37, 199]. Особенностью ранения глаза является возможность аутоиммунных повреждений здорового глаза [9]. Это предполагает включение в комплексную терапию наряду с антибиотиками и противовоспалительными препаратами им-мунодепрессантов, в частности, глюкокортикоидов [14], которые способны усугублять иммуносупрессивное действие самой травмы.

В связи с этим встает проблема целенаправленной иммунокоррекции с использованием препаратов, избирательно воздействующих на конкретные звенья иммунной системы и не оказывающих побочных эффектов [25, 114, 147, 180, 181, 225, 226]. К таким препаратам можно отнести отечественный имму-номодулятор полиоксидоний, который является синтетическим высокомолекулярным соединением, обладающим выраженной иммунотропной активностью.

По/данным авторов препарата, полиоксидоний оказывает активирующее влияние на функции фагоцитирующих клеток, гуморальный и клеточный иммунный ответ у мышей, снижает выраженность экспериментального иммунодефицита, индуцированного введением гидрокортизона или циклофосфамида, и проявления вторичной иммунной недостаточности при клинических испытаниях [132, 143, 146]. Учитывая, что направленность действия иммуномодуляторов в условиях нарушения функций иммунной системы может существенно отличаться в зависимости от конкретной формы патологии и/или при комбинации их с другими лекарственными препаратами, перед использованием их в терапии необходима дополнительная оценка их действия в экспериментально-биологических моделях патологических процессов на этапе доклинических испытаний и в последующем в клинике [227]. Поэтому представлялось целесообразным исследовать иммуномодулирующие эффекты полиоксидония при экспериментальном проникающем ранении глаза.

В течении травматического процесса, развития воспаления с последующей регенерацией важную роль играют фагоцитирующие клетки - гранулоци-ты и мононуклеарные фагоциты. Изменения функций этих клеток в периферической крови при травме могут быть связаны как с факторами системной регуляции, так и с динамикой местных реакций [73, 192]. Однако при травматическом повреждении глаза, функции этих типов клеток, в частности, гранулоци-тов изучены недостаточно. Учитывая участие стрессорных реакций в изменениях функций иммунной системы при травме и ведущую роль в них не только глюкокортикоидов, но и катехоламинов [56, 85, 87, 211, 220, 256, 257, 283, 287], представлялось необходимым оценить влияние полиоксидония на некоторые проявления общего адаптационного синдрома при проникающем ранении глаза и на изменения чувствительности к адренергической регуляции фагоцитирующих клеток.

Цель работы - изучение иммуномодулирующего действия полиоксидония в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза.

Основные задачи 1. Изучить влияние полиоксидония на стрессорные и травматические из-4 менения функций циркулирующего пула фагоцитирующих клеток, гематологических показателей, массы и кпеточности центральных и периферических органов иммунной системы, концентрации глюкозы крови в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза на фоне разных схем терапии.

2. Оценить влияние полиоксидония на развитие травматического воспаления и репаративные процессы при проникающем ранении глаза в условиях разных схем терапии.

3. Исследовать влияние адренергических соединений и теофиллина на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови в системе in vitro в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза в условиях введения полиоксидония.

Научная новизна. Впервые изучены иммуномодулирующие эффекты полиоксидония при экспериментальном проникающем ранении глаза, его влияние на течение травматического воспаления и процессов регенерации при данной форме патологии.

Установлено, что полиоксидоний изменяет динамику показателей функций фагоцитирующих клеток крови при проникающем ранении глаза, оказывает антистрессорный эффект, отменяя развитие стрессорной гипергликемии, гиперплазии костного мозга. Включение полиоксидония в состав комплексной терапии приводит к частичному нивелированию депрессии микробицидного потенциала фагоцитов и гиперактивации поглотительной активности нейтро-филов и моноцитов, а также лейкопении в сравнении с животными, получавшими только стандартную терапию. Совместное использование полиоксидония с препаратами стандартной терапии, в частности с гтококортикоидами, снижает их неблагоприятные эффекты.

Установлено, что введение полиоксидония в комплексе или изолированно способствует оптимизации воспалительного процесса в тканях глаза по параметрам наименьшей инфильтрации зоны повреждения и процессов регенерации. Наиболее благоприятным по формированию структурированной рубцовой ткани является использование полиоксидония в комплексе со стандартной терапией.

В ранний травматический период (через 180 мин после ранения глаза) выявлено усиление ингибирующего или Р-адренергического действия адренергических соединений и угнетающего эффекта теофиллина in vitro на суммарную фагоцитарную активность лейкоцитов. Включение полиоксидония в стандартную терапию повышает чувствительность фагоцитирующих клеток к Р-адренергической регуляции.

Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане работа расширяет существующие представления о роли фагоцитирующих клеток и механизмах их регуляции при травматическом повреждении глаза. Результаты исследования дополняют имеющиеся представления об имму-номодулирующем действии полиоксидония в условиях нарушений функций иммунной системы при проникающем ранении глаза. Обоснована возможность включения полиоксидония в стандартную терапию для оптимизации течения травматического воспаления и репаративных процессов при проникающем ранении глаза.

В практическом плане работа имеет существенное значение для обоснования назначения полиоксидония с целью коррекции иммунных нарушений, а также стимуляции репаративных процессов при проникающем ранении глаза.

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета (614600, г. Пермь, ул. Букирева, 15).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Применение полиоксидония в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза изменяет динамику показателей функций фагоцитирующих клеток периферической крови, отменяет некоторые отрицательные эффекты глюкокортикоидов, входящих в стандартную терапию, нивелирует отдельные стрессорные и травматические нарушения.

2. Включение полиоксидония в комплексную терапию оптимизирует те чение травматического воспаления и процессов регенерации по параметрам наименьшей инфильтрации зоны повреждения иммунокомпетентными и эф-фекторными клетками, а также по структуре рубца.

3. В раннем травматическом периоде выявлена ингибирующая или р-адренергическая направленность действия адренергических соединений in vitro на суммарную фагоцитарную активность лейкоцитов. Включение полиоксидония в комплексную терапию повышает чувствительность фагоцитирующих клеток к Р-адренергической регуляции.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены на конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии", Пермь, 1999; VII Международном конгрессе по иммунореабилитации "Аллергия, иммунология и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие", Нью-Йорк, США, 2001; XI Международном конгрессе иммунологов, Стокгольм, Швеция, 2001; IV конгрессе РААКИ "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", Москва, 2001; I конференции иммунологов Урала, Екатеринбург, 2001; II конференции иммунологов Урала, Пермь, 2002; II конференции молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и .иммунологии", Пермь, 2002. По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы.

Диссертационная работа апробирована на расширенном заседании научной проблемной комиссии по аллергологии и иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и рекомендована к защите.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 203 странице печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов (3 главы), обсуждения, выводов. В диссертации 32 рисунка и 18 таблиц. Список литературы включает 321 источник, из них 235 отечественных и 86 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. При экспериментальном проникающем ранении глаза крыс выявлены фазные изменения числа нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов периферической крови и их поглотительной активности с развитием депрессии микробицидного потенциала фагоцитирующих клеток в тесте с нитросиним тетразоли-ем, а также стрессорное увеличение уровня глюкозы крови, развитие на 12-е сутки травмы гипертрофии надпочечников, гиперплазии тимуса, селезенки и костного мозга.

2. В течение первых суток травмы на фоне развития триады гематологических признаков стресса (лимфопении, эозинопении, нёйтрофильного лейкоцитоза) и моноцитоза отмечены активация поглотительной способности нейтрофилов и эозинофилов, увеличение абсолютных параметров моноцитарного фагоцитоза, а в поздний травматический период (начиная с 5-7-х суток) - снижение абсолютных показателей моноцитарного и эозинофильного фагоцитоза с развитием моноцитопении и эозинопении.

3. В условиях стандартной терапии, включающей дексаметазон, диклофе-нак натрия, ампициллин, гентамицин, выявлены усиление выраженности нёйтрофильного лейкоцитоза, эозинопении, лимфо- и лейкопении, депрессии ки-слородозависимого микробицидного потенциала фагоцитирующих клеток, активации нёйтрофильного фагоцитоза по абсолютным, а моноцитарного и эозинофильного -по относительным показателям, а также нивелирование гиперплазии костного мозга, развитие гипоплазии тимуса и селезенки. 4. Установлено, что включение полиоксидония в комплексную терапию

-ч. при проникающем ранении глаза приводит к частичной отмене депрессии ки-слородозависимого микробицидного потенциала фагоцитирующих клеток, избыточного увеличения поглотительной активности нейтрофилов и моноцитов, лейкопении, развивающихся в условиях стандартной терапии.

5. Показано, что введение одного полиоксидония приводило к более выраженному и продолжительному снижению абсолютных показателей микробицидного потенциала фагоцитирующих клеток, однако продолжительность снижения относительных показателей НСТ-теста уменьшалась.

6. Полиоксидоний в составе комплексной терапии оптимизировал течение раневого процесса по параметрам наименьшей инфильтрации зоны повреждения и по структуре рубца, способствует более полному завершению развития клеточных реакций при воспалении, уменьшая содержание в воспалительном инфильтрате эмигрирующих полиморфноядерных лейкоцитов и увеличивая количество фибробластов.

7. В раннем травматическом периоде в системе in vitro выявлена ингиби-рующая или Р-адренергическая направленность действия адренергических соединений на суммарную фагоцитарную активность лейкоцитов. Включение полиоксидония в комплексную терапию повышало чувствительность фагоцитирующих клеток к p-адренергической регуляции.