Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка иммуномодулирующего действия профеталя при экспериментальном проникающем ранении глаза

На правах рукописи ФАЙЗРАХМАНОВ Ринат Рустамович ^

ОЦЕНКА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПРОФЕТАЛЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПРОНИКАЮЩЕМ

РАНЕНИИ ГЛАЗА

14 00 36 - аллергология и иммунология

Автореферат на соискание уче! кандидата медицинских

Екатеринбург - 2007

003070414

Работа выполнена в лаборатории иммунофизиологии Института иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Черешнева Маргарита Владимировна Гаврилова Татьяна Валерьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Гусев Евгений Юрьевич Чистякова Гузель Нуховна

Ведущая организация: ГНЦ - Институт иммунологии ФМБА России, Москва

Защита состоится 24 мая 2007 г в_часов на заседании диссертационного совета

Д 004 027 01 при Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу 620041, г Екатеринбург, ул Первомайская, 91 Факс (343) 374-00-70

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г Екатеринбург ул С Ковалевской, д 22/20), с авторефератом - на сайте Института иммунологии и физиологии УрО РАН - http //www lip uran ru

Автореферат разослан «Д5 » апреля 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор

И А Тузанкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Феномен иммунной привилегированности глаза привлекает внимание современных исследователей [Архипова JIТ, 2000, 2006, Слепова ОС и др, 2005, Гундорова РА и др, 2006, Черешнева MB и др, 2006, Martm-Fontecha A et al, 2003, Novak N et al, 2003, Streilem J, 2003, Yanoff M et al, 2004] При проникающем ранении глаза (ПРГ) развивается комплекс типовых изменений в иммунной системе, в том числе системных [Архипова JI Т, 2000, 2006, Слепова ОС и др , 2005], являющихся общими для травмы в целом, несмотря на ограниченный по объему характер повреждения В частности, при ПРГ как у человека, так и у животных важную роль играют стрессорные изменения в иммунной системе [Черешнева MB и др, 2006] и развитие синдрома вторичной комбинированной иммунной недостаточности [Волик Е И , 2000, Черешнева М В , 2000, Гаврилова Т В и др, 2005]

Одним из подходов к иммунокоррекции является включение наряду с антибиотиками, стероидными и нестероидными противовоспалительными средствами современных отечественных иммуномодуляторов [Архипова JT Т, 2000, Волик Е И, 2000, Черешнева М В, 2000, Гаврилова Т В, 2006] Среди них перспективен отечественный препарат «Профеталь» (далее профеталь), действующее вещество которого - сывороточный белок альфа-фетопротеин (АФП) [Родионов СЮ и др, 1997, Черешнев В А и др , 2004] В настоящее время он положительно зарекомендовал себя при лечении заболеваний, протекающих с иммунными нарушениями [Родионов СЮ и др 1997, 2006, Черешнев В А и др, 2003, 2004] Показано, что в системе in vitro профеталь усиливает дифференцировку и цитотоксическую активность NK-клеток, дифференцировку и экспрессию костимулирующих молекул дендритными клетками [Гаврилова Т В , 2006, Лебединская О В, 2006] Однако многие аспекты механизма иммуномодулирующего действия профеталя остаются неизученными Дальнейшее исследование характера изменений иммунной системы при ПРГ и

разработка патогенетически обоснованных методов их коррекции определяют актуальность данной проблемы

Цель работы - исследовать характер изменений иммунной системы и их коррекцию профеталем при экспериментальном проникающем ранении глаза

Основные задачи

1 Оценить эффект действия проникающего ранения глаза и профеталя в варианте монотерапии и при комбинации со стандартной терапией на процессы антителогенеза, выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа, клеточность органов лимфомиелоидного комплекса

2 Исследовать влияние проникающего ранения глаза и действие профеталя на фагоцитарную активность клеток лимфатических узлов, периферической крови и брюшной полости

3 Изучить воздействие проникающего ранения глаза и профеталя на частоту выявления антител в плазме периферической крови к аутоантигенам тканей глаза

4 Исследовать изменение содержания альфа-фетопротеина в плазме периферической крови экспериментальных животных в зависимости от схем введения профеталя

5 Оценить морфологическую картину травматического воспаления при проникающем ранении глаза в условиях разных схем введения профеталя

Научная новизна. В экспериментальной модели ПРГ крыс популяции \Vistar исследованы особенности течения травматического воспаления, изменения иммунной системы, влияние на них нового отечественного иммунотропного препарата профеталя при разных схемах введения

В работе впервые установлено при введении профеталя в комплексе со стандартной терапией уровень АФП в плазме крови животных ниже, чем в варианте монотерапии, что указывает на необходимость учета взаимодействия профеталя с препаратами стандартной терапии Показана возможность снижения профеталем

выраженности аутосенсибилизации Установлено, что в условиях как изолированного, так и комбинированного введения препарата животным с ПРГ наблюдается угнетение антителообразования и степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)

Впервые выявлено, что введение профеталя отменяет ряд эффектов стандартной терапии на функции фагоцитирующих клеток, приводит к повышению интегральных показателей моноцитарного фагоцитоза и числа моноцитов крови при отсутствии влияния на поглотительную активность нейтрофилов и эозинофилов периферической крови, наблюдается активация поглотительной способности перитонеальных мононуклеарных фагоцитов и увеличение их количества, а также стимуляция фагоцитарной активности тучных клеток, в регионарном лимфатическом узле снижаются показатели суммарной фагоцитарной активности клеток

Впервые обосновано восстановление тканевых дефектов за счет репаративной регенерации при использовании профеталя как в монотерапии, так и при комбинированном введении с другими препаратами

Теоретическая н практическая значимость работы. В теоретическом плане исследования существенно расширяют представления о роли иммунной системы в патогенезе ПРГ и дополняют сведения об иммунотропном действии профеталя в условиях индуцированного изменения функций иммунной системы при данном виде патологии показана высокая иммуномодулирующая активность препарата

В практическом плане полученные результаты демонстрируют перспективность дальнейшего изучения возможности использования профеталя для коррекции иммунных нарушений при аутоиммунных заболеваниях глаза

Виедреиие в практику. Основные положения диссертации используются при чтении лекций студентам, магистрам, аспирантам биологического факультета Пермского государственного университета Фрагменты работы вошли в материалы

доклинического испытания профеталя и были представлены в Фармакологический комитет РФ для получения разрешения на его производство

Основные положения, выносимые на защиту

1 Проникающее ранение глаза вызывает ряд изменений иммунной системы, включая стимуляцию гуморального и кпеточноопосредованного иммунного ответа, модуляцию функций фагоцитирующих клеток, регенеративной активности зоны повреждения, провоцируя развитие аутоиммунного ответа к тканям глаза

2 Применение стандартной терапии, экстраполированной со схем, используемых в клинике у пострадавших с проникающим ранением глаза, усугубляет развитие дисфункции иммунной системы при сохранении воспалительной инфильтрации и Рубцовых изменений в поврежденной ткани

3 Включение профеталя в комплексную патогенетическую терапию травматических и стрессорных изменений функций иммунной системы оптимизирует течение воспалительного процесса при экспериментальном проникающем ранение глаза

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на VI Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» 1СЕР - 2005 (Пермь-Казань-Пермь, 2005), Российском научном симпозиуме «Цитокины Стволовые клетки Иммунитет» (Новосибирск, 2005), VIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), IV Евро-Азиатской конференции по офтальмохирургии (Екатеринбург, 2006), X Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2006), V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых «Иммунитет и аллергия от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006)

Диссертационная работа апробирована и обсуждена на заседании научной проблемной комиссии по аллергологии и иммунологии ИИФ УрО РАН (г Екатеринбург, 2007)

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 13 печатных работах, в том числе 4 публикации (3 статьи, 1 материалы конференции) в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ИИФ УрО РАН, является частью исследований по теме «Иммунологическая регуляция физиологических функций в норме и при патологических процессах» (номер госрегистрации 01 120 0411946) Выполнение работы поддержано грантами для молодых ученых УрО РАН, Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и интеграционного проекта фундаментальных исследований, проводимых в УрО РАН совместно с СО и ДВО РАН «Коррекция стрессорных и травматических нарушений функций иммунной системы в экспериментальной модели проникающего ранения глаза»

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 185 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных экспериментальных исследований, заключения, выводов В диссертации 3 рисунка, 39 таблиц Прилагаемый список литературы включает 313 наименования (204 отечественных и 109 зарубежных)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на 116 крысах-самцах популяции Wistar массой 237,7±3,6 г

Проведены две серии исследований в оригинальной экспериментальной модели проникающего ранения глаза у крыс [Черешнева MB и др , 1999]

В I серии эксперимента (51 крыса) изучали действие профеталя* на иммунный ответ ко ксеногенному антигену и функции фагоцитирующих клеток Под местной анестезией 2% раствором новокаина в специально сконструированном приспособлении-фиксаторе микролезвием наносили проникающее ранение правого глаза 41 животному. Сформированы экспериментальные группы 1-я (п=10) - ПРГ и введение 0,85% раствора NaCl, 2-я (п=11) - ПРГ со стандартной терапией, экстраполированной со схем, используемых в клинике (ампициллин 12,5 мг/кг массы тела, гентамицин 1,5 мг/кг, диклофенак натрия 0,5 мг/кг - два раза в день, дексаметазон 0,1 мг/кг-один раз в день), 3-я (п=10) — ПРГ со стандартной терапией и профеталем, 4-я (п=10) - ПРГ с введением профеталя Последний в 3-й и 4-й группах вводили в дозе 1 мкг/кг массы тела ежедневно по одной инъекции Контролем служили нетравмированные животные 5-й группы (п=10), которые получали по тем же схемам 0,85% раствор NaCl Введение препаратов подкожно начинали через 365 мин после нанесения травмы и продолжали ежедневно в течение 13 суток Для моделирования локального иммунного ответа на 9-е сутки после нанесения травмы всех животных сенсибилизировали эритроцитами барана (108 клеток вводили подкожно в подошвенную поверхность правой стопы) На 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена (109 эритроцитов барана подкожно в правую стопу) Животных выводили из эксперимента на 14-е сутки методом декапитации под эфирным наркозом Оценивали гуморальный ответ по числу антителообразующих клеток (АОК) в регионарном, по отношению к месту иммунизации, (правом подколенном) и отдаленном (левом подколенном) лимфатических узлах, селезенке методом локального гемолиза в геле агарозы [Jerne N, Nordin А, 1963], выраженность иммунного воспаления при реакции ГЗТ путем регистрации толщины

* Выражаю благодарность дмн СЮ Родионову за любезно предоставленный препарат профеталь

(инженерным микрометром) опытной и контрольной стопы [То1сЫ Е е1 а1, 1997], число ядросодержащих клеток (ЯСК) в органах лимфомиелоидного комплекса Оценивали фагоцитарную активность клеток регионарного лимфатического узла [БМоу 1и й а1, 2001], перитонеальных фагоцитов [Шилов Ю.И , Ланин Д В , 2001] и лейкоцитов периферической крови [Каплин В Н , 1996, БМоу 1и , Ог1оуа Е , 2003] по отношению к формалинизированным эритроцитам барана

Исследование патоморфологических изменений глаз проводили совместно с зав. лабораторией морфологии ИИФ УрО РАН, кмн СЮ Медведевой по методике В Н Архангельского [1957] Морфометрическую оценку гистологических срезов осуществляли с помощью окулярной стереометрической сетки Г Г Автандилова [2002] Определяли количество клеток и плотность волокон в 0,01 ммг сетки Митотическую активность многослойного плоского эпителия (МПЭ) роговицы глаза оценивали по митотическому индексу в

Во II серии эксперимента исследовали влияние профеталя на наличие аутоантител (АТ) в плазме периферической крови к аутоантигенам тканей глаза и уровень АФП в плазме крови крыс в условиях разных схем введения препарата ПРГ наносили 50 животным, которые были разделены на 5 групп по 10 в каждой 1-я группа - ПРГ и введение 0,85% раствора ЫаС1 в течение 29 суток, 2-я - ПРГ со стандартной терапией (схема аналогична использованной в I серии эксперимента) в течение 13 суток, 3-я — ПРГ со стандартной терапией в течение 13 суток и введением профеталя в течение 29 суток, 4-я - ПРГ с введением профеталя в течение 29 суток, 5-я — ПРГ со стандартной терапией и введением профеталя в течение 13 суток Профеталь вводили в дозе 1 мкг/кг массы тела один раз в день утром Введение всех препаратов подкожно начинали через 365 мин после нанесения травмы Контролем служили интактные животные (6-я группа, п=10) Образцы крови получали из сосудов хвоста на 30-е сутки после ПРГ АТ определяли методом твердофазного иммуноферментного

анализа (ИФА)* с ' оценкой результатов в полуавтоматическом режиме на анализаторе MultiscanPlus («Labsystems», Finland) по изменению оптической плотности относительно контрольного образца согласно инструкции производителя [Яковлева В Г, Сибиряк С В , 1999, 2000] Концентрацию АФП определяли совместно с к б н Е Г Орловой методом ИФА (тест - система ИФА-АФП-1 фирмы «AJIKOP БИО», Санкт-Петербург, Россия) с использованием «сэндвич»-варианта по инструкции производителя

Статистический анализ результатов проводили методами описательной статистики, однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного критерия Дункана (post-hoc Duncan's test) для множественного сравнения между группами Результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±ш) Данные по числу АОК с учетом их log-нормального распределения перед проведением дисперсионного анализа предварительно преобразовывали в значения loglO для количества АОК [Лозовой ВП и др, 1989] Для оценки достоверности различий, связанных попарно данных, применяли вариант i-критерия Стьюдента, критерий у2 Для исследования статистической связи между наличием AT в периферической крови к антигенам тканей глаза и схемой проводимой терапии использовали критерий %2

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияпие профеталя па иммунный ответ ко ксеногенному антигену и функции фагоцитирующих клеток при экспериментальном проникающем ранении глаза

Влияние профеталя на гуморальный иммунный ответ Наибольшие изменения выявляются в регионарном лимфатическом узле У животных с ПРГ наблюдается

* Выражаю благодарность дмн, профессору С В Сибиряку за любезно предоставленные тест-системы

стимуляция гуморального иммунного ответа с достоверным увеличением числа АОК Введение одного профеталя или препаратов стандартной терапии угнетает образование антителопродуцентов, при их комбинации усиления иммунодепрессивного эффекта воздействий не обнаружено В отдаленном лимфатическом уме статистически значимых изменений количества АОК на фоне всех экспериментальных воздействий не определяется Изменение антителопродукции на территории регионарного лимфатического узла свидетельствует о локальном характере иммунного ответа При введении профеталя число АОК в селезенке достоверно снижается в сравнении с показателями травмированных животных Суммации депрессивных эффектов стандартной терапии и профеталя не выявляется

Влияние профеталя на клеточноопосредованный иммунный ответ В группе животных с ПРГ наблюдается стимуляция реакции ГЗТ Введение препаратов стандартной терапии приводит к выраженному угнетению реакции ГЗТ, сходный, но менее выраженный эффект выявлен при введении профеталя При комбинированном использовании профеталя и препаратов стандартной терапии степень выраженности угнетения реакции ГЗТ нарастает по сравнению с введением одного профеталя и достоверно не отличается от показателей животных, получавших только стандартную терапию

Влияние профеталя на клеточность органов лимфомиелоиЬного комплекса При ПРГ у крыс в регионарном лимфатическом узле в сравнении с отдаленным значительно увеличивается клеточность (р<0,05) Подобные изменения, по-видимому, связаны с рекрутированием иммунокомпетентных клеток и их пролиферацией in situ [Drayson М et al, 1981, Martm-Fontecha A et al, 2003] Стандартная терапия значительно снижает число ЯСК Направленность действия профеталя аналогична, но суммации эффекта при комбинированном воздействии не наблюдается Изменения клеточности отдаленного лимфатического узла отсутствуют В селезенке обнаружено снижение клеточности (р<0,05) у животных, получавших профеталь в комплексе со стандартной

терапией (3-я группа), в сравнении с травмированными крысами (1-я группа) В костном мозге и тимусе стандартная терапия приводит к снижению числа ЯСК (р<0,05) по сравнению с травмированными животными (1-я группа) У крыс, получавших один профеталь и в комбинации со стандартной терапией, выявляется достоверное возрастание количества ЯСК по отношению не только к показателям животных, получавших одну стандартную терапию, но и к крысам 1-й и 5-й (контроль) групп Профеталь полностью отменяет уменьшение клеточности тимуса, вызванное стандартной терапией (3-я группа в сравнении со 2-й) При введении профеталя достоверно увеличивается клеточность тимуса в сопоставлении с нетравмированными крысами При исследовании миелограммы у крыс с ПРГ отмечено достоверное повышение числа эозинофилов, лимфоцитов, хотя суммарного изменения клеточности данного органа не было При введении препаратов стандартной терапии прослеживается депрессия образования клеток в костном мозге относительно травмы (р<0,05 2-я группа к 1-й) снижение числа эозинофилов, базофилов, лимфоцитов Профеталь как в монотерапии, так и при комбинации с препаратами стандартной терапии повышал число клеток моноцитарного, нейтрофильного (рис 1), эозинофильного рядов, количество лимфобластов, лимфоцитов и плазматических клеток, в монотерапии - число клеток эритроидного ряда Подобные изменения характеризуют данный препарат как средство, активирующее иммунопоэз

Изменение фагоцитарной активности клеток регионарного лимфатического узла При ПРГ изменений относительных и абсолютных показателей фагоцитоза в регионарном лимфатическом узле не происходит Препараты стандартной терапии снижают число макрофагов относительно контроля и ПРГ, абсолютные и относительные интегральные показатели суммарной фагоцитарной активности макрофагов Введение профеталя вызывает депрессию фагоцитарной активности по абсолютным значениям (рис 2) Подобный эффект связан с уменьшением в регионарном лимфатическом узле количества клеток, обладающих фагоцитарной

Рис. 1. Влияние травмы, профеталя н стандартной терапии на количество клеток

моноритарного, нейтрофкльною рядов, лимфондных клеток костного мозга.

Примечание. Здесь и нв рио.2—5 * - /'<0,05 к контролю (5-й группе); # -/><0,05 к 1-й группе, а -/КО ,05 ко 2-й группе. Но оси абсцисс - группы животных: 1 - ПРГ, 2 — ПРГ+стандаргная терапия, 3 — ПРГ+ стандартная тсрапипрофсталь, 4 — ПРГ+профеталь, 5 - контроль. По оси ординат - числи ЯСК х 106 / костный Мозг бедренной кости.

Рис. 2. Влияние травмы, профеталя н стандартной терапии на показатели суммарной фагоцитарной активности клеток регион арного лимфатического узд».

Примечание. По оси ординат на А и Б - абсолютные показатели х 10* / орган.

активностью. Относительно травмы про ф сталь супрессирует фагоцитоз преимущественно за счет снижения количества макрофагов с низкой и средней фагоцитарной активностью (захвативших 1 - 4 объекта).

Изменение количественного состава и фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови. В поздний трав магический период (14-е сутки) у крыс с ПРГ выявляется активация поглотительной способности моноцитов периферической крови. Препараты стандартной терапии вызывают развитие моноци гонении, лимфонении, увеличение числа молодых форм нейтрофилов (рис. 3), Изменение фагоцитарной активности клеток проявляется в активации нейтрофилышго фагоцитоза, депрессии фагоцитарной активности моноцитов н эозинофилов. При введении профегаля в периферической крови обнаружены моноцнтоз, активации фагоцитарной активности моноцитов (процент фагоцитоза) (рис. 4), повышение их вклада в суммарный фагоцитоз, отмена действия препаратов стандартной терапии: возрастание абсолютного количества лимфоцитов, снижение уровня палочкоядерных нейтрофилов и их фагоцитарной активности в сравнении с крысами 2-й группы.

Рис. 3. Влнмннс травмы, профеталя и стандартной терапии на абсолютные показатели количественного состава лейкоцитов периферической крови.

Примечание, По оси ординат - число лейкоцитов в 1 мкл крови.

Изменение показателей фагоцитарной активности перитонеалъных клеток. При ПРГ изменений, относительных и абсолютных показателей фагоцитоза клеток брюшной полости не происходит. Препараты стандартной терапии значительно снижают количество мононуклеариых фагоцитов, фагоцитарную активность данного пула клеток, фагоцитарную активность нойтрофильных гранулоцитов, тучных клеток.

Рис. 4. Влияние травмы, профеталя и стандартной терапии на показатели суммарной фагоцитарной активности моноцитов периферической крови.

Примечание. По оси ординат на А и Б - абсолютные показатели на 1 мкл крови.

Профеталь уменьшает количество лимфоцитов, повышает фагоцитарную активность мононуклеарных фагоцитов (рис. 5), тучных клеток, уменьшает показатели фагоцитарной активности перитонеальных гранулоцнтов. При этом выявляются отмена депрессивного действия глюкокортикоидом в составе стандартной терапии на количество мононуклеарных фагоцитов, изменение направленности фагоцитарной активности данного типа клеток, более выраженное супрессивное дейстние на фагоцитарную активность нейтрофкльных 1ранулоцитов, чем при монотерапии профеталем.

Полученные результаты указывают на разное влияние профеталя на фагоцитарную активность моноцитов периферической крови и их потомков -перитонеальных мононуклеарных фагоцитов и фагоцитирующих клеток регионарного лимфатического узла. Это, по-видимому, объясняется изменением активации клеток системы мононуклеарных фагоцитов и направленностью их дифференцировки, которые во многом определяются природой активирующих сигналов и цитокиновым

Рис. 5. Влн яви е травмы, про фетиш я и стандартной терапии на показатели суммарной фагоцитарной активности перитояеальных мононуклеариых фагоцитов.

Примечание. По оси ординат на Л - абсолютное число объектов фагоцитоза хЮ6/ брюшная полость.

м икр о окру жен кем [Geissmann F, и др., 2003; Rotta G, et ab, 2003; Rhen Т., Cidlowski J., 2005].

2. Влияние ирофеталя на наличие антител к аутоантшенам тканей глаза н уровень альфа-фетопротенна в периферической крови экспериментальных

животных

Влияние профеталя на наличие антител к аутоантигенам тканей таза. У интактных животных в плазме крови AT к аутаантигенам тканей глаза не выявляются. У крыс с ПРГ частота обнаружения AT к корнеальному белку ВСР-54, а-кристаллину хрусталика и ретииальному S-антигену составляет для каждого из антигенов 30%. Положительные результаты на наличие AT одновременно ко всем трем антигенам обнаружены только у 20% животных; к одному антигену AT определялись у 50% животных, последнее достоверно отличается от контроля (/>=0,001). Эти факты могут свидетельствовать о формировании аутосенсибилизации и являться прогностически неблагоприятными [Слепова О.С., 1991]. В группе животных, получавших препараты стандартной терапии, появление AT к ретииальному S-антигену отмечено я 30% случаев, к а-кристаллину - в 20% и к корнеальному белку ВСР-54 - в 20%.

Положительные результаты на наличие АТ одновременно ко всем трем антигенам определились только у 10% животных, к одному ангигену АТ определились у 50% животных, последнее достоверно отличается от контроля (р=0,001)

Введение профеталя как в варианте монотерапии, так и в комплексе со стандартной терапией приводит к снижению интенсивности аутосенсибилизации, что ведет к исчезновению достоверных отличий от контроля Так, при монотерапии профеталем в течение 29 суток у 10% травмированных крыс обнаружены АТ против корнеалыгого белка ВСР-54, у 10% - против Б-антигена и у 20% - против а-кристаллина хрусталика Обнаружение АТ к одному антигену у 20% животных, что достоверно не отличается от контроля, а также отсутствие АТ одновременно ко всем антигенам является положительным результатом При введении и профеталя, и препаратов стандартной терапии в течение 13 суток только у 20% животных выявлены АТ к ВСР-54, у 20% - к а-кристаллину и у 10% - к Б-антигену Общее число животных с положительными реакциями на обнаружение АТ к одному антигену на 30 сутки эксперимента составило 30% (р>0,05 к б-й группе) Наиболее эффективно совместное введение профеталя в течение 29 суток и препаратов стандартной терапии В этом случае АТ против корнеального белка ВСР-54 выявлялись у 20% крыс, против а-кристаллина - у 10 %, АТ против Э-антигена не определялись, АТ к одному антигену - у 30% (р>0,05 к 6-й группе) Одновременно ко всем антигенам АТ не найдены ни в одном случае, как и у интактных животных

При исследовании статистической связи между наличием АТ в периферической крови к антигенам тканей глаза и схемой проводимой терапии при ПРГ применен критерий у2 Установлено, что расчетное значение х2р= 23,439 (сумма расчетных элементов), табличное значение х2т " 18,307 Так как > %2Т, то .анализируемые признаки статистически зависимы при уровне значимости, равной 0,05 Результаты демонстрируют зависимость между разными схемами применения профеталя при ПРГ и наличием в периферической крови антител к антигенам тканей глаза (корнеалыюму

протеину ВСР-54, а-кристаллину хрусталика и S-антигену сетчатки) Существенным представляется факт максимального защитного эффекта в отношении формирования иммунного ответа к S-антигену сетчатки - наиболее «увеитогенному» белку глаза

Уровень алъфа-фетопротеина в периферической крови Средняя концентрация АФП через 24 ч после 30-й инъекции профеталя в дозе 1мкг/кг составила 4,677 мкг/мл (р=0,000053 к 6-й группе) При введении профеталя в комбинации с препаратами стандартной терапии средняя концентрация АФП через 24 ч после 30-й инъекции профеталя составила 2,883 мкг/мл (р=0,000204 к 6-й группе,р=0,010266 к 4-й), через 2 недели после 14-й инъекции профеталя - 2,499 мкг/мл (р=0,000682 к 6-й группе,/»=0,003135 к 4-й) В условиях введения профеталя в комплексе со стандартной терапией уровень АФП примерно в 1,6 раза ниже, чем в варианте монотерапии Это может быть частично связано с действием дексаметазона, который, как и другие глюкокортикоиды, обладает мощным катаболическим эффектом [Gruneich J , Diamond S , 2007, Holland W, Brozimck J et al, 2007] Сохранение повышенного уровня концентрации АФП в течение 2 недель после прекращения введения профеталя (5-я ipynna) косвенно указывает на депонирование белка в организме и эффект материальной кумуляции, что важно для поддержания иммуномодулирующего действия препарата в условиях терапии 3. Патоморфологическая характеристика травматического воспаления глаза и влияние профеталя па процессы регепсрацпи при экспериментальном

проникающем ранении глаза При гистологическом исследовании глаз на 14-е сутки после ПРГ у животных без лечения, а также получавших стандартную противовоспалительную и антибактериальную терапию, наблюдается восстановление тканевого дефекта через реализацию «аварийного» механизма рубцевания, документированного гистологическими и морфометрическими методами исследований У животных, которым проводилась стандартная терапия, ответом на повреждение является

достоверное увеличение количества дифференцированных функционально активных фибробластов по сравнению с группой без лечения Формируется рубцовая ткань на фоне умеренного экссудативного воспаления

При введении животным одного профеталя и его комбинации с препаратами стандартной терапии замедляется формирование грубой рубцовой ткани с повышением митотической активности МПЭ (р<0,05 к 1-й и 2- й группам), приводящей к ранней эпителизации зоны повреждения, определяется снижение интенсивности процессов образования коллагеновых и эластических волокон, о чем свидетельствует уменьшение их плотности в рубце (р<0,05 к 1-й и 2-й группам) У животных, получавших только профеталь, снижение интенсивности процессов фибриллообразования происходит на фоне более выраженного экссудативного воспаления Полученные данные свидетельствуют, что профеталь, как в варианте монотерапии, так и в составе комплексного лечения, стимулируя пролиферативную активность клеток МПЭ, приводит к ранней эпителизации зоны повреждения, одновременно замедляет процессы фибриллообразования, что блокирует развитие грубого рубца и индуцирует процессы восстановления тканевых дефектов

Таким образом, проведенные исследования существенно расширяют и дополняют представления о роли иммунной системы в патогенезе ПРГ и механизме действия профеталя в условиях индуцированного изменения функций иммунной системы при данном виде патологии (рис 6)

Рис. 6. Механизм действия нрофеталя в патогенетической терапия проникающего ранения глаза.

ВЫВОДЫ

1 Проникающее ранение глаза вызывает ряд изменений иммунной системы, включая развитие аутоиммунного ответа к тканям глаза, усиление выраженности локального клеточноопосредованного и гуморального иммунного ответа на ксеноантиген, фагоцитарной активности моноцитов периферической крови, повышение количества эозинофилов и лимфоцитов в костном мозге, на фоне восстановления дефекта повреждения через рубцевание

2 Применение стандартной терапии не снижает вероятность развития аутоиммунных реакций, одновременно приводит к угнетению клеточноопосредованного и гуморального иммунного ответа, уменьшению числа эозинофилов и базофилов в костном мозге, активации нейтрофильного и угнетению макрофагального фагоцитоза при сохранении выраженности воспалительной инфильтрации и фиброзных изменений в поврежденной ткани

3 Применение при проникающем ранении глаза одного профеталя отменяет стимуляцию антителообразования и уменьшает степень выраженности реакции ГЗТ, при комплексной терапии сохраняются эффекты, вызванные препаратами стандартной терапии

4 Профеталь повышает количество лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов и эритроцитов в костном мозге как при монотерапии, так и в комплексе с препаратами стандартной терапии, отменяет супрессивное действие последних на общую клеточность костного мозга и тимуса

5 Применение одного профеталя и его комбинации со стандартной терапией оказывает разнонаправленное действие на функцию фагоцитов повышает фагоцитарную активность моноцитов, макрофагов, мастоцитов, не влияет на поглотительную способность нейтрофилов и эозинофилов крови, снижает поглотительную активность фагоцитов реагирующего лимфатического узла и перитонеальных гранулоцитов

6. Введение одного профеталя и его комбинации с препаратами стандартной терапии снижает частоту выявления антител в плазме крови травмированных животных к аутоантигенам тканей глаза ретинальному Б-антигену, а-кристаллину и белку роговицы ВСР-54, при максимальном защитном эффекте по отношению к Б-антигену - наиболее «увеитогенному» белку глаза При введении профеталя с препаратами стандартной терапии уровень альфа-фетопротеина в плазме крови ниже, чем в варианте монотерапии, что указывает на необходимость учета их взаимодействия

7 Введение одного профеталя как и совместно с препаратами стандартной терапии индуцирует репаративную регенерацию, замедляя раннее формирование грубой рубцовой ткани, ускоряет эпителизацию зоны повреждения

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в иаучиых изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1 Гаврилова ТВ Иммунокоррекция при проникающем ранении глаза в эксперименте /ТВ Гаврилова, В А Черешнев, Р Р Файзрахманов и др // Вестник Уральской медицинской академической науки — 2005 — № 4 - С 5-7

2 Гаврилова Т В Особенности морфофункционального состояния структур глаза при различных схемах терапии проникающего ранения с включением профеталя / Т В Гаврилова, Р Р. Файзрахманов, М В Черешнева и др // Вестник Уральской медицинской академической науки - 2006 - № 1 - С 40-45

3 Файзрахманов Р Р Иммуномодулирующее действие профеталя в экспериментальной модели проникающего ранения глаза / Р Р Файзрахманов, Т В Гаврилова, М В Черешнева и др // Вестник Уральской медицинской академической науки -2006 -№3(1) - С 251—253

4 Гаврилова ТВ Иммуномодулирующие эффекты профеталя в модели локального иммунного ответа к эритроцитам барана при проникающем ранении глаза

крыс / Т В Гаврилова, Р Р Файзрахманов, М В Черешнева и др // Медицинская иммунология -2006 -Т 8 -№2-3 -С 128-129 Публикации в других изданиях

5 Черешнев В А Отечественные иммуномодуляторы в коррекции стрессорных нарушений функций иммунной системы при проникающем ранении глаза / В А Черешнев, Т В. Гаврилова, Р Р Файзрахманов и др // Иммунология вчера, сегодня, завтра Сб науч тр -Пермь -2005 -С 14-20

6 Гаврилова Т В Зависимость направленности изменения иммунного ответа при экспериментальном проникающем ранении глаза от срока травматического повреждения / ТВ Гаврилова, Н Л Беркасова, Р Р Файзрахманов и др // Иммунология вчера, сегодня, завтра Сб науч тр — Пермь — 2005 - С 20-28

7 Гаврилова Т В Влияние профеталя на выраженность реакции ГЗТ и гуморальный иммунитет при экспериментальном проникающем ранении глаза / Т В Гаврилова, Р Р Файзрахманов, М В Черешнева и др // Проблемы загрязнения окружающей среды (1СЕР-2005) Тез докл VI Междунар конф - Пермь -2005 -С 61-61

8 Черешнев В А Стрессорные и травматические нарушения функций иммунной системы и их коррекция / В А Черешнев, Т В Гаврилова, Р Р Файзрахманов и др // Проблемы загрязнения окружающей среды (1СЕР-2005) Тез докл VI Междунар конф - Пермь -2005 - С 106-106

9 Черешнев В А Отечественные иммуномодуляторы в коррекции стрессорных и травматических нарушений функций иммунной системы / В А Черешнев, Т В Гаврилова, Р Р Файзрахманов и др // От экспериментальной биологии к привентивной и интегративной медицины Сб тр Междунар междисциплинарного симп - Новосибирск - 2005 - С 72-73

10 Гаврилова ТВ Оценка иммуномодулирующего действия профеталя при экспериментальном проникающем ранении глаза /ТВ Гаврилова, Р Р Файзрахманов,

М В Черешнева и др // Матер IV Евро-Азиатской конф по офтальмохирургии -Екатеринбург - 2006 - С. 114 - 115

11 Гаврилова Т В Исследование зависимости изменения уровня иммунного ответа от срока травматического повреждения при экспериментальном проникающем ранении глаза /ТВ Гаврилова, Н.Л Беркасова, Р Р Файзрахманов // Биология - наука XXI века Тез докл X Междунар Пущинской школы-конф молодых ученых — Пущино -2006 -С 128-128

12 Гаврилова ТВ Иммуномодулирующее действие профеталя при локальном иммунном ответе в экспериментальной модели проникающего ранения глаза /ТВ Гаврилова, Р Р Файзрахманов, М В Черешнева и др // Матер V Конф иммунологов Урала - Иммунология Урала -2006 -№1(5) - С 5-6

13. Гаврилова ТВ Влияние альфа-фетопротеина на гуморальное и клеточноопосредованное звенья иммунитета при проникающем ранении глаза в эксперименте /ТВ Гаврилова, Р Р Файзрахманов, М В Черешнева и др // Матер VI Всероссийской школы офтальмолога - 2007 - С 257 - 262

Список основных сокращений

AT

- аутоантитела

- альфа- фетопротеин

- антителообразующая клетка

- гиперчувствительность замедленного типа

АФП

АОК

ГЗТ

ИФА

- иммуноферментный анализ

- оптическая плотность среды

ОП

ПРГ ЯСК

- проникающее ранение глаза

- ядросодержащие клетки

- Р-корнеальный протеин (P-corneal protein)

- кластер дифференцировки (cluster of differentiation)

- нормальные киллеры (normal killer)

ВСР-54

CD

NK

ФАЙЗРАХМАНОВ Ринат Рустамович

ОЦЕНКА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПРОФЕТАЛЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПРОНИКАЮЩЕМ

РАНЕНИИ ГЛАЗА

14 00 36- аллергология и иммунология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Екатеринбург - 2007

Подписано в печать 04 04 07 г Формат 60x84 1/16 Уел печ л 1,4 Тираж 100 экз Заказ № 98

Размножено с готового оригинал - макета в типографии "Уральский центр академического обслуживания" 620219, г Екатеринбург, ул Первомайская, 91

Актуальность проблемы. Феномен иммунной привилегированности глаза привлекает внимание современных исследователей [Архипова Л.Т., 2000, 2006; Слепова О.С. и др., 2005; Гундорова Р.А. и др., 2006; Черешнева М.В. и др., 2006; Martin-Fontecha A. et al., 2003; Novak N. et al., 2003; Streilein J., 2003; Yanoff M. et al., 2004]. При проникающем ранении глаза (ПРГ) развивается комплекс типовых изменений в иммунной системе, в том числе системных [Архипова Л.Т., 2000, 2006; Слепова О.С. и др., 2005], являющихся общими для травмы в целом, несмотря на ограниченный по объему характер повреждения. В частности, при ПРГ как у человека, так и у животных важную роль играют стрессорные изменения в иммунной системе [Черешнева М.В. и др., 2006] и развитие синдрома вторичной комбинированной иммунной недостаточности [Волик Е.И., 2000; Черешнева М.В., 2000; Гаврилова Т.В. и др., 2005].

Одним из подходов к иммунокоррекции является включение в терапию наряду с антибиотиками, стероидными и нестероидными противовоспалительными средствами современных отечественных иммуномодуляторов [Архипова JI.T., 2000; Волик Е.И., 2000; Черешнева М.В., 2000; Гаврилова Т.В., 2006]. Среди них перспективен отечественный препарат «Профеталь» (далее профеталь), действующее вещество которого -сывороточный белок альфа-фетопротеин (АФП) [Родионов С.Ю. и др., 1997; Черешнев В. А. и др., 2004]. В настоящее время он положительно зарекомендовал себя при лечении заболеваний, протекающих с иммунными нарушениями [Родионов С.Ю. и др. 1997, 2006; Черешнев В.А. и др., 2003, 2004]. Показано, что в системе in vitro профеталь усиливает дифференцировку и цитотоксическую активность NK-клеток, дифференцировку и экспрессию костимулирующих молекул дендритными клетками [Гаврилова Т.В., 2006; Лебединская О.В., 2006]. Однако многие аспекты механизма иммуномодулирующего действия профеталя остаются неизученными.

Дальнейшее исследование характера изменений иммунной системы при ПРГ и разработка патогенетически обоснованных методов их коррекции определяют актуальность данной проблемы.

Цель работы - исследовать характер изменений иммунной системы и их коррекцию профеталем при экспериментальном проникающем ранении глаза.

Основные задачи

1. Оценить эффект действия проникающего ранения глаза и профеталя в варианте монотерапии и при комбинации со стандартной терапией на процессы антителогенеза, выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа, клеточность органов лимфомиелоидного комплекса.

2. Исследовать влияние проникающего ранения глаза и действие профеталя на фагоцитарную активность клеток лимфатических узлов, периферической крови и брюшной полости.

3. Изучить воздействие проникающего ранения глаза и профеталя на частоту выявления антител в плазме периферической крови к аутоантигенам тканей глаза.

4. Исследовать изменение содержания альфа-фетопротеина в плазме периферической крови экспериментальных животных в зависимости от схем введения профеталя.

5. Оценить морфологическую картину травматического воспаления при проникающем ранении глаза в условиях разных схем введения профеталя.

Научная новизна. В экспериментальной модели ПРГ крыс популяции Wistar исследованы особенности течения травматического воспаления, изменения иммунной системы, влияние на них нового отечественного иммунотропного препарата профеталя при разных схемах введения.

В работе впервые установлено: при введении профеталя в комплексе со стандартной терапией уровень АФП в плазме крови животных ниже, чем в варианте монотерапии, что указывает на необходимость учета взаимодействия профеталя с препаратами стандартной терапии. Показана возможность снижения профеталем выраженности аутосенсибилизации. Установлено, что в условиях как изолированного, так и комбинированного введения препарата животным с ПРГ наблюдается угнетение антителообразования и степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

Впервые выявлено, что введение профеталя отменяет ряд эффектов стандартной терапии на функции фагоцитирующих клеток, приводит к повышению интегральных показателей моноцитарного фагоцитоза и числа моноцитов крови при отсутствии влияния на поглотительную активность нейтрофилов и эозинофилов периферической крови; наблюдается активация поглотительной способности перитонеальных мононуклеарных фагоцитов и увеличение их количества, а также стимуляция фагоцитарной активности тучных клеток; в регионарном лимфатическом узле снижаются показатели суммарной фагоцитарной активности клеток.

Впервые обосновано восстановление тканевых дефектов за счет репаративной регенерации при использовании профеталя как в монотерапии, так и при комбинированном введении с другими препаратами.

Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане исследования существенно расширяют представления о роли иммунной системы в патогенезе ПРГ и дополняют сведения об иммунотропном действии профеталя в условиях индуцированного изменения функций иммунной системы при данном виде патологии: показана высокая иммуномодулирующая активность препарата.

В практическом плане полученные результаты демонстрируют перспективность дальнейшего изучения возможности использования профеталя для коррекции иммунных нарушений при аутоиммунных заболеваниях глаза.

Внедрение в практику. Основные положения диссертации используются при чтении лекций студентам, магистрам, аспирантам биологического факультета Пермского государственного университета. Фрагменты работы вошли в материалы доклинического испытания профеталя и были представлены в Фармакологический комитет РФ для получения разрешения на его производство.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Проникающее ранение глаза вызывает ряд изменений иммунной системы, включая стимуляцию гуморального и клеточноопосредованного иммунного ответа, модуляцию функций фагоцитирующих клеток, регенеративной активности зоны повреждения, провоцируя развитие аутоиммунного ответа к тканям глаза.

2. Применение стандартной терапии, экстраполированной со схем, используемых в клинике у пострадавших с проникающим ранением глаза, усугубляет развитие дисфункции иммунной системы при сохранении воспалительной инфильтрации и рубцовых изменений в поврежденной ткани.

3. Включение профеталя в комплексную патогенетическую терапию травматических и стрессорных изменений функций иммунной системы оптимизирует течение воспалительного процесса при экспериментальном проникающем ранении глаза.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на VI Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» ICEP - 2005 (Пермь - Казань - Пермь, 2005); Российском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовые клетки. Иммунитет» (Новосибирск, 2005); VIII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006); IV Евро-Азиатской конференции по офтальмохирургии (Екатеринбург, 2006); X Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2006); V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006).

Диссертационная работа апробирована и обсуждена на заседании научной проблемной комиссии по аллергологии и иммунологии ИИФ УрО РАН (г. Екатеринбург, 2007).

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 13 печатных работах, в том числе 4 публикации (3 статьи, 1 материалы конференции) в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ИИФ УрО РАН, является частью исследований по теме «Иммунологическая регуляция физиологических функций в норме и при патологических процессах» (номер госрегистрации 01.120.0411946). Выполнение работы поддержано грантами для молодых ученых УрО РАН, Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и интеграционного проекта фундаментальных исследований, проводимых в УрО РАН совместно с СО и ДВО РАН «Коррекция стрессорных и травматических нарушений функций иммунной системы в экспериментальной модели проникающего ранения глаза».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 185 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных экспериментальных исследований, заключения, выводов. В диссертации 3 рисунка, 39 таблиц. Прилагаемый список литературы включает 313 наименования (204 отечественных и 109 зарубежных).

149 ВЫВОДЫ

1. Проникающее ранение глаза вызывает ряд изменений иммунной системы, включая развитие аутоиммунного ответа к тканям глаза, усиление выраженности локального клеточноопосредованного и гуморального иммунного ответа на ксеноантиген, фагоцитарной активности моноцитов периферической крови, повышение количества эозинофилов и лимфоцитов в костном мозге, на фоне восстановления дефекта повреждения через рубцевание.

2. Применение стандартной терапии не снижает вероятность развития аутоиммунных реакций, одновременно приводит к угнетению клеточноопосредованного и гуморального иммунного ответа, уменьшению числа эозинофилов и базофилов в костном мозге, активации нейтрофильного и угнетению макрофагального фагоцитоза при сохранении выраженности воспалительной инфильтрации и фиброзных изменений в поврежденной ткани.

3. Применение при проникающем ранении глаза одного профеталя отменяет стимуляцию антителообразования и уменьшает степень выраженности реакции ГЗТ; при комплексной терапии сохраняются эффекты, вызванные препаратами стандартной терапии.

4. Профеталь повышает количество лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов и эритроцитов в костном мозге как при монотерапии, так и в комплексе с препаратами стандартной терапии, отменяет супрессивное действие последних на общую клеточность костного мозга и тимуса.

5. Применение одного профеталя и его комбинации со стандартной терапией оказывает разнонаправленное действие на функцию фагоцитов: повышает фагоцитарную активность моноцитов, макрофагов, мастоцитов; не влияет на поглотительную способность нейтрофилов и эозинофилов крови; снижает поглотительную активность фагоцитов реагирующего лимфатического узла и перитонеальных гранулоцитов.

6. Введение одного профеталя и его комбинации с препаратами стандартной терапии снижает частоту выявления антител в плазме крови травмированных животных к аутоантигенам тканей глаза: ретинальному S-антигену, а-кристаллину и белку роговицы ВСР-54, при максимальном защитном эффекте по отношению к S-антигену - наиболее «увеитогенному» белку глаза. При введении профеталя с препаратами стандартной терапии уровень альфа-фетопротеина в плазме крови ниже, чем в варианте монотерапии, что указывает на необходимость учета их взаимодействия.

7. Введение одного профеталя, как и совместно с препаратами стандартной терапии, индуцирует репаративную регенерацию, замедляя раннее формирование грубой рубцовой ткани, ускоряет эпителизацию зоны повреждения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие дисфункции иммунной системы при травме является одной из тяжелых и требующих коррекции форм иммунной патологии, характеризующейся следующими типовыми изменениями: системным выбросом провоспалительных цитокинов (IL-la и р, IL-6, TNF-a и TNF-p, хемокинов и пр.), который индуцирует развитие острофазного ответа, нейроэндокринных изменений (повышение выброса кортикотропин-рилизинг гормона, АКТГ, глюкокортикоидов, адреналина, изменение экспрессии Р-адренорецепторов) и других реакций при участии центральной нервной системы; активацией хемотаксиса и эмиграции неспецифических эффекторных и иммунокомпетентных клеток в зону травматического воспаления, их реакциями, направленными на устранение повреждения и регенерацию тканей; развитием ранней травматической иммунодепресии, связанной со стрессом, токсемией микробного и тканевого происхождения; переключением цитокинового профиля с Thl на Th2 тип, связанным с повышением уровня глюкокортикоидов и катехоламинов [Черешнев В.А. и др., 2006].

Подобные изменения характерны для механической травмы в целом, при этом выраженность иммунных сдвигов определяется тяжестью и объемом повреждения [Вагнер Е.А. и др., 1990; Черешнев В.А. и др., 1997; Юшков Б.Г. и др., 2001]. При ПРГ, учитывая ограниченный характер повреждения, развитие системных реакций не столь очевидно [Архипова Л.Т., 2000, 2006; Слепова О.С. и др., 2005]. Тем не менее, при этой патологии выявлено развитие не только локальных реакций, но и синдрома вторичной комбинированной иммунной недостаточности [Волик Е.И., 2000; Черешнева М.В., 2000; Черешнева М.В. и др., 2001, 2004; Гаврилова Т.В. и др., 2005]. При травме глаза возможно развитие аутоиммунных реакций [Слепова О.С. и др., 2005; Архипова Л.Т., 2006; Yanoff М. et al., 2004], характеризующихся иммунным воспалением второго нетравмированного глаза. Развитие подобных реакций зависит от ряда факторов: характера травмы, ее тяжести, локализации, степени повреждения тканей глаза и других, т.е. от пускового фактора, от путей миграции антигенов и особенностей состояния иммунной системы организма.

Другим типовым нарушением функций иммунной системы при травме глаза является развитие синдрома вторичной иммунной недостаточности. Значительная выраженность последнего связана со стрессорными реакциями вследствие утраты информационно важного органа [Черешнева М.В. и др., 2006].

Наряду с первичной микрохирургической обработкой ПРГ и проведением стандартной терапии, обязательно включающей антибиотики, нестероидные противовоспалительные препараты и глюкокортикоиды, рекомендуется назначение в ранние сроки иммуномодуляторов, например, полиоксидония, миелопида [Архипова Л.Т., 2000; Волик Е.И., 2000; Черешнева М.В. и др. 2000, 2004, 2006; Гаврилова Т.В., 2006]. В последнее время в клинической практике при заболеваниях, протекающих с аутоиммунным компонентом, положительно зарекомендовал себя отечественный препарат - профеталь [Родионов С.Ю. и др. 1997, 2006; Черешнев В.А. и др., 2003, 2004], действующим компонентом которого является сывороточный белок альфа-фетопротеин (АФП) [Родионов С.Ю. и др., 1997; Черешнев В.А. и др., 2004, Родионов С.Ю., 2005], основная биологическая роль которого состоит в регуляции иммунных реакций при процессах репродукции [Абелев Г.И.,1989; 1994; Родионов С.Ю. и др., 1997; Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2002; 2003; Bartha J., Comino-Delgado R., 1999; Feuchtbaum L., Currier R., 2000; Lazarevich N., 2000; Mizejewski G., 2001].

В связи с вышеизложенным, актуальным явилось проведение исследования характера изменений иммунной системы и их коррекции профеталем при экспериментальном проникающем ранении глаза.

В качестве экспериментального подхода выбрана модель локального иммунного ответа, развивающегося при подкожной иммунизации крыс эритроцитами барана. Развитие иммунного ответа при ПРГ оценивали по числу АОК в регионарном и отдаленном лимфатических узлах, селезенке; уровню антител в плазме крови; степени выраженности воспаления при реакции ГЗТ; изменению фагоцитарной активности клеток регионарного лимфатического узла. Проанализировано изменение фагоцитарной активности клеток периферической крови и брюшной полости.

Полученные данные можно свести к следующим положениям. При проникающем ранении глаза наблюдается: усиление степени выраженности клеточноопосредованного и гуморального иммунного ответа на эритроциты барана в условиях использованной схемы иммунизации; активация реакции ГЗТ, развитие локального иммунного ответа с преимущественным увеличением числа АОК, повышение клеточности в регионарном лимфатическом узле;

- повышение количества эозинофилов и лимфоцитов в костном мозге;

- увеличение абсолютного числа лимфоидных клеток в регионарном лимфатическом узле;

- слабая активация фагоцитарной активности моноцитов периферической крови;

- восстановление тканевого дефекта через реализацию «аварийного» механизма рубцевания.

На фоне применения стандартной терапии при проникающем ранении глаза отмечается:

- угнетение клеточноопосредованного и гуморального иммунного ответа на эритроциты барана; депрессия реакции ГЗТ, снижение числа антителопродуцентов, клеточности регионарного (правого подколенного) лимфатического узла, числа ЯСК тимуса, костного мозга, но не селезенки;

- уменьшение числа эозинофилов и базофилов в костном мозге;

- снижение количества лимфоидных клеток в регионарном лимфатическом узле относительно травмы, макрофагов относительно контроля и ПРГ без терапии, относительных и абсолютных интегральных показателей суммарной фагоцитарной активности;

- развитие нейтрофильного лейкоцитоза, моноцитопении, лимфопении, активация нейтрофильного фагоцитоза, депрессия фагоцитарной активности моноцитов, и эозинофилов;

- депрессия числа и фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов, фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов относительно контроля, тучных клеток относительно травмы;

- формирование рубца с преобладанием соединительнотканного компонента, включающего коллагеновые волокна и фибробласты с признаками функциональной активности, обширную васкуляризацию, сохранение признаков экссудативного воспаления в рубцовой ткани.

На фоне введения профеталя в составе комплексной терапии выявляется:

- отсутствие изменений степени выраженности иммунодепрессивного действия стандартной терапии на гуморальный иммунный ответ, клеточность регионарного лимфатического узла и селезенки, депрессия реакции ГЗТ, отмена супрессивного действия стандартной терапии на клеточность тимуса и костного мозга;

- отмена супрессивного действия стандартной терапии на число эозинофилов, моноцитов в костном мозге, увеличение суммарного числа нейтрофильных гранулоцитов;

- снижение количества лимфоидных клеток регионарного лимфатического узла в сравнении с травмой и фагоцитирующих клеток в сравнении с контролем и травмой без лечения, депрессия фагоцитарной активности макрофагов относительно контроля, снижение фагоцитарного числа относительно травмы;

- моноцитоз, увеличение фагоцитарной активности моноцитов, повышение их вклада в суммарный фагоцитоз в периферической крови, отмена вызванных препаратами стандартной терапии снижения абсолютного количества лимфоцитов, повышения уровня палочкоядерных нейтрофилов и показателей нейтрофильного фагоцитоза до уровня контроля;

- уменьшение количества лимфоцитов в брюшной полости, активация фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов, тучных клеток, отмена супрессивного действия стандартной терапии на фагоцитоз мононуклеаров, более выраженное супрессивное действие на фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов, чем при монотерапии профеталем;

- снижение угрозы развития аутосенсибилизации организма;

- индуцирование репаративной регенерации, замедление раннего формирования грубой рубцовой ткани, ускорение эпителизации зоны повреждения.

На фоне введения профеталя в варианте монотерапии отмечается:

- угнетение антителообразования и степени выраженности реакции ГЗТ, отмена увеличения клеточности регионарного лимфатического узла, повышение клеточности костного мозга при отсутствии изменений числа ЯСК в селезенке и тимусе по сравнению с ПРГ;

- увеличение суммарного числа нейтрофильных клеток за счет промиелоцитов и нейтрофильных метамиелоцитов, повышение уровня эозинофилов, моноцитов, лимфоцитов костного мозга;

- уменьшение количества лимфоидных клеток в регионарном лимфатическом узле относительно травмы, а также фагоцитирующих клеток относительно контроля и ПРГ, депрессия фагоцитарной активности;

- развитие моноцитоза, активация фагоцитарной активности моноцитов (процент фагоцитоза), повышение их вклада в суммарный фагоцитоз относительно контроля, снижение относительных показателей фагоцитарной активности нейтрофилов относительно травмы в периферической крови;

- снижение количества лимфоцитов, показателей фагоцитарной активности перитонеальных гранулоцитов, повышение поглотительной способности мононуклеарных фагоцитов, тучных клеток брюшной полости;

- снижение угрозы развития аутосенсибилизации организма;

- индуцирование репаративной регенерации, замедление раннего формирования грубой рубцовой ткани, ускорение эпителизации зоны повреждения.

Обсуждая полученные результаты в целом, важно отметить, что в поздний травматический период (14-е сутки) при экспериментальном проникающем ранении глаза отсутствуют изменения гемограммы, наблюдается повышение числа эозинофильных гранулоцитов и лимфоидных клеток в костном мозге, относительных показателей фагоцитарной активности моноцитов периферической крови. Подобные изменения в системе костный мозг - кровь обусловлены развитием общего адаптационного синдрома, а также остаточным влиянием стрессорных факторов. При использованной схеме иммунизации развитие антителообразования, в основном, наблюдается в регионарном лимфатическом узле. Повышение клеточности регионарного узла наблюдается, в основном, за счет увеличения числа лимфоидных клеток. Количество макрофагов, их фагоцитарная активность в лимфатическом узле, брюшной полости приближается к показателям контроля. При гистологическом исследовании выявляется формирование рубца с преобладанием соединительнотканного компонента, включающего коллагеновые волокна и фибробласты с признаками функциональной активности, обширную васкуляризацию, а также сохранение признаков экссудативного воспаления в рубцовой ткани.

У животных, получавших стандартную терапию, изменение иммунологических показателей обусловлено действием глюкокортикоидов. Так, выявляются классические гематологические изменения: лимфопения, моноцитопения, нейтрофильный лейкоцитоз [Горизонтов П.Д. и др., 1983; Воронина Н.П., 1989; Юшков Б.Г. и др., 1999; Selye Н., 1937; McEwen В. et al., 1997], а также выраженная активации нейтрофильного фагоцитоза, угнетение фагоцитарной активности моноцитов, увеличение удельного вклада нейтрофилов и снижение вклада моноцитов и эозинофилов в суммарную фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови. Подобные изменения выявляются в костном мозге: снижение количества эозинофильных и базофильных гранулоцитов, лимфоидных клеток. Иммунодепрессивный эффект стандартной терапии в регионарном лимфатическом узле характеризуется угнетением и гуморального, и клеточноопосредованного иммунитета, снижением клеточности органа преимущественно за счет макрофагов. Выраженное влияние на макрофагальные клетки проявилось снижением относительных и абсолютных показателей суммарной фагоцитарной активности клеток регионарного лимфатического узла. Изменения в брюшной полости характеризуются снижением абсолютного числа и фагоцитарной активности перитонеальных мононуклеарных фагоцитов, удельного вклада этого типа клеток и нейтрофильных гранулоцитов в суммарную фагоцитарную активность. Противоположная направленность действия стандартной терапии, в состав которой входит глюкокортикоид, на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови и брюшной полости объясняется изменением процессов созревания фагоцитирующих клеток в костном мозге, выхода в кровеносное русло и эмиграции в ткани [Spencer R., Miller А., 1991; McEwen В., Biron С., 1997]. При гистологическом исследовании выявлено формирование рубца с преобладанием соединительнотканного компонента, включающего коллагеновые волокна и фибробласты с признаками функциональной активности, обширную васкуляризацию, сохранение признаков экссудативного воспаления в рубцовой ткани.

При введении профеталя травмированным животным в периферической крови определяется повышение количества моноцитов, активация моноцитарного фагоцитоза, увеличение удельного вклада моноцитов в суммарную фагоцитарную активность. Анализируя показатели миелограммы, обращает на себя внимание повышение клеток моноцитарно-макрофагального ряда в костном мозге. Общее повышение клеточности костного мозга при введении профеталя в монотерапии и совместно с препаратами стандартной терапии обусловлено увеличением количества эозинофильных гранулоцитов, лимфоидных клеток. Механизм увеличения количества лимфоидных клеток в костном мозге у животных с введением одного профеталя характеризуется повышением числа лимфобластов, лимфоцитов и плазматических клеток, в то время как у крыс с ПРГ без лечения наблюдается увеличение только числа лимфоцитов. Последнее возможно связано с повышенной миграцией Т-лимфоцитов в костный мозг, описанной для многих экстремальных состояний [Зимин Ю.И., 1979, 1980, 1983; Гольдберг Е.Д. и др., 1991; Дыгай A.M. и др., 1989,1992; Хлусов И.А. и др., 1993].

Полученные в настоящей работе результаты указывают на выраженные отличия действия профеталя на фагоцитарную активность моноцитов периферической крови и их потомков - перитонеальных мононуклеарных фагоцитов и фагоцитирующих клеток регионарного лимфатического узла. Действие профеталя в регионарном лимфатическом узле проявляется угнетением антителообразования и степени выраженности реакции ГЗТ, снижением клеточности регионарного лимфатического узла. Снижение клеточности регионарного лимфатического узла наблюдается за счет макрофагов, именно поэтому снижение фагоцитоза происходит только за счет абсолютных показателей. Такое избирательное действие профеталя связано с его способностью снижать макрофагальное звено в количественном эквиваленте в зоне максимальной иммунологической атаки [Olinescu A. et al., 1977]. В работах С. Lu [Lu С. et al. 1984], изучающего влияние АФП на фагоцитарную активность макрофагов в зоне иммунного конфликта мышей CBA/J, выявлено прямое подавление активности макрофагов через действие на мембрану клетки. Именно этим и объясняется способность АФП подавлять экспрессию МНС II на мембране фагоцитирующих клеток. Это является одним из главных механизмов действия профеталя, обеспечивающего иммуносупрессию в зоне воспаления.

Тучные клетки являются одними из основных участников воспаления. При этом перитонеальные тучные клетки, являясь субпопуляцией соединительнотканных тучных клеток [Гущин И.С., 1998; Roitt I., Brostoff J.,

Male D., 1996], представляют собой удобный объект для исследования. В работах ряда исследователей показана роль тучных клеток при воспалении [Malaviya R., Ross Е., 1994; Cone R., Wang Y., 1998]. Активность в очаге связана не только с выбросом содержимого гранул, синтезом медиаторов воспаления и провоспалительных цитокинов, но и со способностью к фагоцитозу. Установлено, что тучные клетки не только способны к продукции активных форм кислорода, но и обладают прямой микробицидностью по данным микробиологических исследований с определением числа выживших микроорганизмов по количеству образуемых ими колоний [Malaviya R., Ross Е., 1994]. В брюшной полости действие профеталя характеризуется снижением количества перитонеальных лимфоцитов, фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов, а так же повышением относительных и абсолютных показателей фагоцитарной активности тучных клеток. По мнению Aussel С. [Aussel С, Fehlmann М., 1987], стимулирующее действие АФП на фагоцитарную активность макрофагов невоспалительной ткани связано со способностью АФП повышать уровень ПГЕг. Следствием такой активности является способность белка супрессировать синтез TNF-a и IL-ip [Wang W., Alpert E., 1995]. He исключено, что разнонаправленное действие профеталя связано с перераспределением миграции клеток моноцитарного ряда между регионарным лимфатическим узлом и брюшной полостью, т.е. воспалительной и невоспалительной тканью. Эта точка зрения основывается на важном свойстве АФП - предупреждение иммунного конфликта при беременности, что достигается снижением иммунного ответа в точке максимальной агрессии антигенов. При гистологическом исследовании выявляется снижение формирования грубой рубцовой ткани с эпителизацией зоны повреждения, увеличение митотически делящихся клеток в эпителии, снижение интенсивности процессов фибриллообразования, стимуляция пролиферативной активности клеток многослойного плоского эпителия.

При совместном введении профеталя и препаратов стандартной терапии определяется отмена супрессивного действия последней на клеточность тимуса и костного мозга и отсутствие изменений степени выраженности иммунодепрессивного действия стандартной терапии на гуморальный иммунный ответ, клеточность регионарного лимфатического узла и селезенки. Это соответствовало эффектам действия одного профеталя, но степень выраженности была меньше.

Полученные данные свидетельствуют, что профеталь при экспериментальном ПРГ обеспечивает возможность снижения угрозы развития аутосенсибилизации. Существенным представляется факт максимального защитного эффекта в отношении формирования иммунного ответа к S-антигену, - наиболее «увеитогенному» белку глаза. Подобный механизм защиты альфа-фетопротеином эмбриона действует в системе «мать-плод» [Абелев Г.И., 1994; Шмагель К.В. и др., 2003; Черешнев В.А. и др., 2004].

Завершая обсуждение полученных данных по исследованию профеталя, необходимо еще раз обратить внимание на то, что основной особенностью действия АФП в организме является иммуносупрессорная активность [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2002]. В экспериментальных и клинических исследованиях описана способность данного белка изменять направленность иммунного ответа при ряде аутоиммунных заболеваний [Черешнев В.А., Родионов С.Ю., 2004; Родионов С.Ю., 2006; Matsuura Е., Kang Y., Kitakawa Н. et al., 1999].

В основе действия профеталя лежит способность к супрессии иммунного ответа в зоне максимального воспаления, а также направленное воздействие на поврежденное звено иммунитета, приводящее измененные иммунологические параметры к норме. Полученные данные по исследованию иммуномодулирующих эффектов профеталя, являющегося эндогенным иммунорегуляторным белком, подтверждают, что профеталь реализует свои эффекты по природным механизмам, осуществляет мягкую депрессию иммунного ответа в зоне воспаления, оказывает влияние на течение процессов регенерации, формируя в зоне повреждения «мягкий» рубец через процессы репарации.

Механизм действия профеталя в патогенетической терапии ПРГ представлен на рис. Профеталь включается в коррекцию травматических изменений, снижая формирование грубой рубцовой ткани, стимулируя пролиферацию клеток многослойного плоского эпителия и за счет этого ускоряет эпителизацию зоны повреждения. Все это, в конечном итоге, приводит к индукции репаративной регенерации, замедлению раннего формирования грубой рубцовой ткани, ускорению эпителизации зоны повреждения. Кроме того, у животных, получавших профеталь, понижается образование антител к аутоантигенам тканей глаза, что важно для снижения угрозы развития аутоиммунного повреждения. Профеталь существенно нивелирует поздние стрессорные изменения в иммунной системе, отменяет стимуляцию антителообразования и уменьшает степень выраженности реакции ГЗТ в поздний травматический период, снижает фагоцитарную активность мононуклеарных фагоцитов в регионарном, по отношению к месту иммунизации, лимфатическом узле. Одновременно повышается фагоцитарная активность моноцитов периферической крови и перитонеальных макрофагов. В костном мозге при введении профеталя отмечается повышение числа лимфобластов, лимфоцитов, плазматических клеток, стимуляция в этом органе гранулоцито- и моноцитопоэза, эритропоэза.

Проведенные исследования существенно расширяют и дополняют представления о роли иммунной системы в патогенезе проникающего ранения глаза и механизме иммуномодулирующего действия профеталя в условиях индуцированного изменения функций иммунной системы при данном виде патологии. Результаты данной работы указывают на высокую иммуномодулирующую активность профеталя, демонстрируют перспективность дальнейшего изучения возможности использования профеталя для коррекции иммунных нарушений при аутоиммунных заболеваниях глаза.

Рис. Механизм действия профеталя в патогенетической терапии проникающего ранения глаза