Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оценка гетерогенности субпопуляции лимфоцитов-регуляторов клеточного иммунитета методом лимитирующих разведений

Г Б ОД министерство здравоохранения и медицинской

прошшшнноста российской федерации

КАЛИНИЧЕНКО Татьяна Викторовна

оценка гетерогенности субпопуляции лшющггов- регуляторов клеточного иммунитета методом лимитирушщ разведений.

14.00.36 - Аллергология и шшунология

диссертации не соискание ученой степени кандидате медицинских наук

институт юшнологин

На правах рукописи

Автореферат

Москва - 1994

Раоота выполнони в Институте Оиоорганичэской химик им. М.М.Шемякина и Ю. А.Овчинникова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор И. 11. Дозыоров.

Научный консультант: кандидат биологических наук В. В» Свнрцавская.

Официальные оппоненты: академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А. А. Яршщн,

доктор медицинских наук а. а. Иванов.

Ведущее учреждение: Ыедико-генетическиЯ научный центр РАМН.

* — . '' — Защита диссертации состоится ¿¿-¿сб. 199^ г.

в 14.00 на заседании диссертационного совета Л 074.09.01

•при Институте иммунологии Министерства здравоохранения

и медицинской промышленности Российской Федерации по адресу:

115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, к. 2.

С диссертацией мокно ознакомиться в оиолиотеке Института иммунологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного сорота доктор медицинских неук

Л. С. Саславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

актуальность темы исследования.

Иммунный ответ включает в себя различные типы эффекторных механизмов, кавдый из которых наиболее эффективен в отношении определенных патогенов. Выбор типа иммунного ответа зависит от вида патогена. Внеклеточные патогены чаще вызывают формирование гуморального ответа, а внутриклеточные - в основном, клеточного. Ошибки в выборе типа иммунного ответа могут привести к серьезным последствиям для организма. Так, .например, при микобактериозе (таком как лепрозоя и туберкулез) и при паразитарных инфекциях (лейшмания) в норме сильный клеточно-опосредованннй иммунный ответ приводит к выздоровлению. Тогда как, формирование преимущественно гуморального . отеэтв неспособно локализовать инфекцию. Следовательно, развитие адекватного антигену иммунного ответа имеет принципиальное значение для организма, что требует наличия тонкой регуляции. За последние несколько лет были получены данные о том, что субпопуляции Т лимфоцитов, секретирущие различные спектры лимфокинов, играют решающую роль в регуляции эффекторных функций. Были охарактеризованы две большие группы лимфокинов, активность одной из которых коррелирует с проявлением гиперчувствителытости замедленного типа,.а другой - с гуморальным ответом. Каким образом осуществляется выбор типа формирующегося иммунного ответа пока не установлено окончательно, однако, влачительное количество полученных данных свидетельствует в пользу гипотезы о необходимом участии в этом процессе субпопуляций Т хелперов (Т хелперов I и ? хелперов 2), секретирующих различные спектры лимфокинов. Т хелперы I (Тх1) и Т хелперы 2 (Тх2) не различаются* фенотипически, являясь СБ4+ клетками у человека и ЬЗТ4+ у мышей. Это осложняет изучение их роли . в формировании того или иного иммунного ответа и их взаимодействия между собой. Появление новых подходов, позволяющих оценить какой тип Т хелперов активируется и насколько, несомненно будет полезно при изучении формирования иммунного ответа в норме и при различных патологиях;

Из выше "сказанного следует, что изучение клеточных взаимодействий является актуальной задачей современной иммунологии. •. В норме существует активный динамический баланс между ¡елеточными и V.

гуморальными процессами, при патологии происходит сдвиг в ту или иную сторону, и в атом случав снижается эффективность работы иммунной системы. На современном этапе многое пока остается неясным, однако информация об изменения! состояния иммунитета важна и необходима для понимания механизмов патологии и путей коррекции иммунитета.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью данной работы является изучение взаимодействий на клональном уровне субпопуляций Т лимфоцитов-регуляторов иммунного ответа на ашюантиген методом лимитирующих разведений.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1) Подобрать оптимальные условия иммунизации спленоцктов in vlvu и In vitro, время культивирования и схему постановку эксперимента в лимитирующих разведениях (ЛР), позволяющие оценивать на клональном уровне гетерогенность субпопуляцяй и регулирующие взаимодействия между ними.

2) Разработать метод количественной оценки гетерогенности, используя мотсда математического моделирования.

3) Идентифицировать, взаимодействие каких клеточных субпопуляций определяет развитие иммунного ответа на аллоантиген в условиях ЛР:

а) определить фенотип пролиферирувдих клеток' методами удаления из клеточной суспензии тех или иных субпопуляции;

.6) провести идентификацию субпопуляций эффекторов, используя активаторы аденилатциклазы: холерный токсин и форсколин, а также глккокор^ккоиды (дексаметазон), подавлявшие продукцию цитокинов и пролиферацию суопопуляции Т хелперов I;

в) оценить характер изменений кривой доза-аффект при различных типах иммунного ответа: на аллоантиген, на овальбуюш й на опухолевый антиген.

4) Изучить механизмы взаимодействия субпопуляций, определяющих форму исследуемой кривой доза-эффект:

а) оценить влияние лим&жинов, продуцируемых вторыми эффекторами на пролиферацию первых;.

б) показать влияние экзогенных М-2 и ИЛ-4 на пролиферацию неразделенных лимфоцитов в ЛР условиях;

в) оценить частоты продуцентов М-2 среди клеток первых в

- з -

вторых эффекторов; . . ...............

г), оценить, влияние на пролиферацию неразделенных лимфоцитов эндогенно продуцируемых интерферона-гамма и ИЛ-Ю.

Б) Применить предложеншй метод количественной и качественной оценки клеточных взаимодействий на,клональном уровне для анализа лимфоцитов больннх с аутоиммушшм заболеванием' (pemphigus vulgaris), ... . , , : .

научная новизна. , . ..

; В результата проведенной работы разработан метод анализа клеточных взаимодействий на клональном уровне. Показано, что нелинейная s-ооразная зависимость доза-эффект,,, получаемая в условиях лимитирующих ..разведений, , является следствием взаимодействия двух типов' клеток,, в отличие от " общепринятой гипотезы, считающей, что такая нелинейность формируется за счет взаимодействия трех клеточных суопопуляций, одна * из которых является субпопуляцией клеток-супрессоров. Определен' фенотип клеток,., формирующих нелинейную s-образную кривую' (ЛР-кривую), полученную методом лимитирующих разведений при пролиферативном ответе спленоцитов мышей на аллоантиген.

. В.данной работе установлено , что ¿'' формировании ответа на эллоантиген участвуют субпопуляции Т хелперов I и Т хелперов 2. Достоверно показано, что одним из механизмов их взаимодействия в используемой экспериментальной модели, является секреция супрессиругоих факторов - лимфокдаов. На основе этого положения была создана и,экспериментально подтверждена'математическая модель клеточных взаимодействий С ' помощью модели описаны' кривые доза-эффект, определен« частоты клеток-эффекторов и количественные характеристики, отражающие их взаимодействия.

Было показано, что лимфоциты' периферической крови (ЛПК) человека при поликлональной активация в ЛР условиях также способны формировать нелинейную S-образнув кривую доза-эф^к^,' как и лимфоциты мышей, т.е. на клональном уровне выявляются различные суопопуляций лимфоцитов. Найденч отличия между здоровыми донорами и частью больных pemphigus vulgaris в способности отвечать на КонА в ЛР условиях.

•Таким образом, суммируя результаты представленной

диссертационной работы, можно сказать, что предложен новый метод колрчестьенкой и качественной оценки клеточных взаимодействий на клональном уровне, позволяющий оценивать степень активности различных клеточных ростков Т хелперного ответа в норме и при патологии, не выявляемые с помощью обычных методов.

практическое значение работы.

Практическое значение работы заключается в том, что разработанный метод количественной оценки клеточных взаимодействий на клональном уровне можно применять для решения разнообразных иммунологических проблем при ряде патологических состояний, связанных с нарушением регуляторных процессов.

8 настоящее время в экспериментальной и клинической иммунологии все большую значимость приобретают исследования, направленные на поиск механизмов иммунных патологий и способов избирательного воздействия на отдельные суопопуляиии клеток иммунной системы, задействованных в этих процессах. Предложенный метод количественной оценки клеточных взаимодействий Т хелперов можно использовать для диагностики дисбаланса иммунной системы в сторону клеточного или гуморального ответа и изучать механизмы иммунных патологий. Этот же метод позволяет исследовать действие иммуномодулирувдих препаратов на клональном уровне, с помощью которых можно добиться коррекции процессов регуляции и межклеточной кооперации.

апробация работы.

Материалы . диссертации доложены на 12 Европейском Иммунологическом Конгрессе (Барселона, Испания, 1994), на i-oft Объединенной Конференции Международной Ассоциации аллергологии и клинической иммунологии и Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии (Стокгольм, Швеция, 1994), на межлабораторнов конференции Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и К). А. Овчинникова РАН (Москва, 1994).

публикации.

По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе 2 статьи в центральной печати.'

структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (глава I), материалов и методов (глава 2), результатов

исследований (глава 3), обсуждения полученных данных (глава 4), выводов, приложения и списка литература. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков, таблиц, в приложении представлена математическое обоснование модели, на основании которой создана компьютерная программа расчета качественных и количественных характеристик . взаимодействия субпопуляций клеток на клональнон уровне в лимитирующих разведениях. Список литературы включает источников, из .которых иностранных.

содержание работы. материалы и методы исследования. '

*ыш. Использованы самки инбредных линий- Balb/o и С57В1/6 в возрасте 6-12 недель, полученные из питомника "Столбовая" (Российская Академия Медицинских Наук).

Лимфоциты периферической крови (ЛПК) человека: В работе били использованы ЛПК 7 здоровых доноров и 12 больных истинной пузырчаткой. Лимфоциты, выделяли из венозной гепаринизированной крови (25 БД гепарина на I мл крови) общепринятым методом в градиенте плотности фиколла-верографина.

Иммунизация жытеa. Balb/p мши были иммунизированы внутривенно 60 млн. сшшноцятов C57BL/6, облученных дозой в 2000 рад. Через неделю мышей ра с табулировали облученными In vitro спленоцитами C57BL/6 (106кл/мшь). Для формирования, гуморального иммунного ответа мышей линии C57DL/6 иммунизировали внутрибршинно OA ' ("Slgjna", США) в концентрации 100 мкг/мышь. Для изучения иммунного ответа на опухолевый антиген мышей линии C57BL/6 иммунизировали внутривенно облученными 2000 . рад клетками тимомы EL-4, имешей сингенный генотип. Клетки селезенки иммунных животных извлекали на 14 сутки после иммунизации. ж

Клеточные культуры. Культивирование спленоцитов мышей или ЛПК человека проводили в круглодонных 96-луночных планшетах ("Llnbro", США ) в питательной среде (ПС) на основе RPMI 1640, дополненной 10% сыворотки плода коровы (Мийск), инактивированной нагреванием, Z мМ L-глутамина, 50 мкг/мл линкоцина, ("Plow Laboratories", Шотландия),

50 мкМ 2-меркалтоэтанола rsigma", США). Клетки культивировали в атмосфере с б» содержанием С02 при 37°С.

Метод лимитирующих разведений. Клетки селезенки, выделенные из мышей на 14 день после иммунизации аллогенными клетк .ми селезенки мышей C57BL/6, или ..'векевыделенные ЛПК отмывали солевым раствором, ¿абуференноы фосфатами (ФБ), переводили в свекую ПС и, после подсчета числа жизнеспособных клеток, рассевали их в круглодонные 96-луночные планшеты в объеме 100 мкл. Микрокультуры со спленоцитами мышей содержали различное число отвечающих клеток (24 повтора для какдого разведения), 5х104облучекных 2000 рад аллогешшх фвддершх спленоцитов мышей линии C57BL/6 и 100 ед/мл рекомоинантного человеческого 1ЛЛ-2 (Санг-Петербургский Университет, Россия). Микрокультуры с ЛПК человека содержали различное число отвечающих клеток, стимулированных КонА ( 5мкг/мл). Активаторы аденилат циклазы использовали в концентрациях 10 нг/мл холерного токсина ("Sl^ma", США) или I мкМ форсколина CCalblochem", США). При изучении гуморального ответа примированные ОА In vivo спленоциты анализировали в условиях ЛР на сингенном фидцэрном слое с добавлением в культуры ■растворимого ОА в концентрации 100 мкг/мл. Культуры инкубировали в течении 3 суток при 37°с, 51 С02- За 6 часов до окончания инкубации в культуры добавляли 'МТТ или £3Ш-тимидин ("Amersham", Англия). В контрольные культуры вносили те же компоненты за исключением клеток-ответчиков. Позитивными считали культуры, превышаодие среднее значение контрольных культур плюс За.

Удаление сурпопуляций. лимфоцитов путем комплемент-опосредованного циколиза. Для удаления из суспензии лимфоцитов субпопуляций клеток, несущих на поверхности меморан маркеры ihyi ,2+, 1<ЭТ4+ и Lyt2+, Оыл использован двойной комплемент-опосредованный цитолиз. Спленоциты ресуспендироввли до концентрации БхЮ /мл в среде RPMI 1640 с гедасом, содержащей рабочее разведение антител к мембранным маркерам. Клетки инкубировали при 4°0 в течении 30 мин., периодически осторожно ветра' !вая. Затем клетки осаадали центрифугированием и ресуспендировали в среде, содержащей нетоксичную сыворотку кролика в качестве комплемента в разведении 1:10. Клетки инкубировали при 37°С в течении 45 мин., периодически осторожно встряхивая, затем осаадали центрифугированием и дважды

отмывали средой, содержащей 5* сыворотки. Жизнеспособность определяли с помощью тританового синего.

Удаление суСпопуляции IgS* лимфоцитов путем двойного пишшнга Для удаления из су лензии лимфоцитов, несущих на поверхности мембран рецепторы к igQ, использовали метод адсорбирования лимфоцитов на поверхности пластика, нагруженного антителами к IgQ. Использовали полистироловые чашки Петри 100x15 мм для бактериологических целей «Ленинградский завод медицинских полимеров). В каждую чашку вносили по 8 мл ФБ, содержащего 10 мкг/мл очищенных иммуносорбцией антител к IgQ, и оставляли на ночь при 4°С для адсорбции антител на поверхности пластика. После удаления из раствора неприлипших антител чашки дважды обмывали ФБ и вносили в каждую чашку по 5 мл ФБ с 0.2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) <Serva, США )• и оставляли на 30 мин. при комнвтной температуре, для снижения неспецифической сорбции клеток. Однократь^ обмывали чаики 10 мл ФБ и вносили в каждую чашку по 2хЮ7клеток, суспендированных в 4 мл 46 о 0.2% БСА. Инкубировали 45 мин. при комнатной температуре в атмосфер* С02> По истечении половины срока инкубации содержимое чашек осторожно перемешивали круговым движением. Неприлипшиа клетки ресуспендироЕали легким круговым движением и сливали. Пеннинг проводили дважды.

Стнаартхьса метод оценки ИЛ-2. 60 мкл ИЛ-2 содержащего супернатанта из микрокультур с ЛПК человека были добавлены к 50 мкл питательной среды с 2* JO3 CTLI.-2 клеток (ИЛ-2-зависимые цитотоксические Т лимфоциты, предоставленные Dr. M.F.RaJewsky, Germany). Клетки культивировали 20 часов (37°С, Ъ% со2) в 96-луночннх планшетах. Уровень пролиферации сш>2, измеренный по включению МТТ, строго указывал на уровень активности ШГ-2 в пробах.

Колориметрический метод определения пролхирерируютх клеток. После завершения культивирования в кахдую лунку вносили по 10 мкл маточного раствора МТТ (Sigma, JSA) с концентрацией 5 мг/мл и инкубировали планшеты б часов при 37°с в атмосфере 5« С02. Затем планшеты центрифугировали (5 мин, 200g), супернатант удаляли резким встряхиванием планшета дном BEspx и к осажденным клеткам добавляли 50 мкл диметилсульфоксида (РЕАХИМ, Россия). Планшеты встряхивали 1Б иин. до полного растворения кр;..галлов формазана. оптическую

плотность измеряли при длине волны 540 нм, используя прибор Tltertek Multlskan MG (Flow Laboratories).

результаты и обсуждение.

Предметом данной работы являлось изучение взаимодействий между функциональными субпопуляцияыи Т лимфоцитов из селезенки мышей линии Baib/c в иммунном ответе не спленодиты мышей С57В1/6. Модифицированиям методом лимитирующих разведений (ЛР) с учетом нелинейности оценивали частоту пролиферации функционально различных клеток-предаествешшков по числу активных клонов. В отличйи от традиционно принятой модели одноударного процесса в ЛР, отражающегося в линейной зависимости логарифма неотвечаицих лунок от концентрации клеток-ответчиков, нами были получены нелинейные зависимости в виде S-образных кривых, характерных для процессов, в которых участвуют 2-3 субпопу ляшш клеток (рис. 1-4). Появление нелинейности несет в себе дополнительную информацию о клеточных взаимодействиях, т. к. отражает процессы регуляции развития иммунного ответа на уровне единичных клеток.

Судествование S-оСразннх кривых обычно объясняется наличием трех различных суопопуляций с противоположными взаимоисключающими активностями. Как видно из рисунка I, S-образную кривую можно разбить на три участка: I и 3 участки с негативным наклоном и 2-ой - с позитивным. Считается, что 1-ый участок является результатом пролиферации клеток-предиественников, чувствительных к действию супрессоров (участок 2), в 3-ий - результат пролиферации предшественников, .резистентных к действию супрессоров.

Однако, на настоящий момент накоплено достаточно данных, показывающих, что существует большое количество обратных связей между различными субпопуляшяда клеток. Супрессируодее влияние может осуществляться не только непосредственно клетками-су пре ссорами, как считали ранее, но и через растворимые факторы, вырабатываемые самими Г хелперами, например, ?а счет продукции интерферона-гамма, иодавляавдга пролиферацию Т хелперов 2. Исходя из этого, мы предположили, что появление нелинейных ЛР-зависимостей может являться следствием взаимодействия не трех, а двух субпопуляций лимфоцитов. На основе этого предположения была построена математическая модель, позволящая оценивать частоты

клеток-предшествешшков, а так же ряд других характеристик клеточных взаимодействия на клональном уровне. Аналогичным -бразом в ЛР система были проанализированы взаимодействия субпопуляций периферических лшфоц..тов человека в норме и при аутоиммунном заболевании (pemphigus vulgaris). .

1. Фенотип пролиферпрувдих клеток, ответственных за формирование S-оОразных ЛР-кривых.

Основные эксперименты проводили в отработанной экспериментальной модели иммунного ответа, позволяющей хорошо выявлять нелинейность в координатах метода ЛР. In vivo мышей линии Balb/o иммунизировали спленоцигами С57В1/6 (5*107 кл/мышь), облученных 200'' рад. Через неделю мышей рестимулировали облученными In vitro спленоцитами С57В1/6 (Ю6 кл/мышь), еще через неделю из них выделяли клетки селезенка и брали их в качестве ответчиков в систему ЛР_

Удаление комплемент-опосредованным цитотоксическим лизисом или. пеннингом различных субпопуляций лимфоцитов из популяции неразделенных спленоцитов имгиннх мышей показало, что пролиферирующие клетки являются Thy t,2+, L3T44, и IgG~, Lyt2~. Удаление Thy 1,2¥ или L3T44" суйпопуляции приводило к практически полной отмене пролиферации лимфоцитов (РисЛ А), а удаление IgG+ или Lyt2+ субпопуляцки приводило к сдвигу всей кривой влево (Рис.1 В), по всей видимости, без изменения соотношения частот ГШ и ПЛ2, что происходит за счет увеличения удельного содержания этих клеток среди спленоцитов после обрвботки. Естественно предположить, что взаимодействуицими субпопуляциями, формирующими ЛР кривую, являются предшественники Т хелперов, так как именно для этой субпопуляции характерен полученный фенотип. На настоящий момент считается общепризнанным, что суОпопуляция Т хелперов не является гомогенной, а делится еще ча две субпопуляции - Г хелперов 1 (Гх1) и Т хелперов 2 (Тх2), для которых общим предшественником является популяция с фенотипом Т хелперов О (ТпО). Таким образом, полученная S-образная кривая формируется, по всей видимости, за счет пролиферации предшественников Тх! и Тх2.

- 1 о -

О 100 400 1600 ша 0 too ЧОО 1800 6400

Рис.1. Качественный анализ пролиферации спленоцитов мышей Balb/c, иммунизированных аллоантигеном ln vivo, методом лимитирующих разведений. А) Пролиферация неразделенной популяции спленоцитов (0) и Thyl~(0), L3T4" (д) субпопуляций, выделенных комплемент-зависимым цитолизом. В) Пролиферация популяции неразделенных спленоцитов (О), iyt2" субпопуляции, выделенной также цитолизом (•) и IgC" субпопуляции .полученной после удаления IgG+ клеток пеннингом ta). По оси X: концентрация (кл/лунка) По оси У: доля отрицательных лунок (отн. ед.)

2. Избирательное,-влияние на пролиферацию субпопуляций Тх! н Ti2 активаторов аденилагциклазы и глюкокортикоидов.

Для проверки этой гипотезы, оил проведен ряд экспериментов, в которых избирательно" активировали или подавляли функции TxI и Тх2. Посколько, на настоящий момент не определена фенотипичоская разница между суопопуляциями Txi и Тх2, то использовали функциональные различия между ними. Одно из основных различий между' этими суопопуляциями. связано по-видимому, с различными биохимическими путями передачи сигнала активации. Субпопуляш'ч Гх1 активируется преимущественно через протеин киназшШ С путь (ШС-путь), тогда как в активации Тх2 участвуют, другие ферменты. Для идентификации какие из Г xq леров соответствуют первым и вторым эффекторам были

- i 1 -

100 400 1800 мое

Рис.2. ЛР-анализ пролиферации не"азделешшх иммунных спленоцитов мышей Balb/c,

A) иммунизированных аллоантигеком 1г viro, в отсутствии (0) и в присутствии 10 нг/мл холерного токсина (•) или 1мкМ форсколина (Д);

По оси X: концентрация (кл/лунка)

По оси У: доля отрицательных лунок (отн. ед.)

B) Изменение соотношений частот пролиферации предшественников первой < □ ) и второй ( Ш ) субпопуляций, расчиташше с помощью математической модели..

По оси X: К - в отсутствии ингибиторов, ХТ - в присутствии ХТ, ФОР - в присутствии форсколина

По осу У: доли частот (отн. ед.), высчитанные по формуле

фг

использованы следующие подхода. Во-первых, известно, что активаторы аденилатциклазы - холерный токсин (XI), фзрсколин■ (ФОР), и др., ингибируют пролиферацию и продукцию Ш-2 Т хелперами I. Добавлении XT или ФОР, практически но влияющих на функции Тх2, г ЛР-культуры приводило к снижэ' ю пролиферации ( и соответственно частоты) ^имущественно вторых эффекторов, которыми, в' таком случае, являются Txl (Рис.2). Полученные результаты наблюдались как при активации спленоцитов in vivo, так и In vitro.

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что субпопуляция первых эффекторов функционально похожа на субпопуляцию Тх2, пролиферация которой менее зависит от накопления цАМФ, а субпопуляция вторых эффекторов похожа на Txl, так как супрессируется в присутствии активаторов аденилатциклазы.

3. Влияние различных типов антигенов на характер ЛР-кривой.

Кроме различий в путях активации Txl и Тх2 различаются также и по той помощи, которую они оказывают в формировании ответа на клеточный и гуморальный антигены. Так, Txl регулируют формирование клеточного иммунитета, а Тх2, соответственно, гуморального.

На основе этого отличия была сделана попытка выяснить характер изменений ЛР-к^йвой при различных типах иммунного ответа: на гуморальный растворимый антиген овальоумин (OA) и клеточный стимул - опухолевый ангагея. Спленоциты мышей C57BL/6, предварительно проиммунизировашвд' OA in vivo или in vitro, брали для анализа в условиях ЛР на .сингенном фидцерном слое, в присутствии растворимого OA. Для анализа ответа на опухолевый антиген использовали клетки мышей той же линии, проиммунизированных in vivo или in vitro и повторно реиммунизированных в условиях ЛР облученными опухолевыми клетками сингенного мшаам C5TBL/6 генотипа тимомы EL-4.

При ответе на OA • (Рис.3) наблюдали выраженную пролиферацию первых эффекторов, отражающуюся в хорошо выре енном первом пике S-образной ЛР кривой. То есть, как это было показано и с использованием активаторов аденилатциклазы, первой пролиферирукщей субпопуляции соответствуют Тх2, так как именно Тх2 оказывают помощь В. клеткам при ответе на OA. Причем, было доказано, что при удалении

90 200 1600 6400 23900

Рис. 3. Зависимость доза-эф!вкт при ответе на различные типы антигенов.

А) Ответ ln vivo примированных овальбумином сшюноцитов на ОА в условиях лиштирувдих разведений (о). Ответ спленоцитов мышей линии C57BL/6, иммунизированных -<n vivo облученными 2000 рад клетками линии ЕХ-4, на мембрашо-ассоциированный опухолевый антиген тимомы EL-4 (в).

По оси X: концентрация (кл/лунка)

По оси У: доля отрицательных лунок (отн. вд.)

В) Соотношения частот пролиферации предшествьнников первой (□) и второй (В) суопопуляций в атих ответах, расчитанныв с помощью математической модели.

По оси X: ОА - ответ на овальоумин, EL-4 - ответ на антиген линии EL-4

По оси У": доли частот (отн. ед.)

наннингом из суспензии спленоцитов IgG+ клеток, характер кривой сохранялся (данные не приведены), что говорит о том, что Б лимфоциты (IgG+) не ответственна за "толиферацию в данной экспериментальной системе. При ответе на опухолевый антиген, напротив, наблюдался ответ практически только второй пролиферирукщей суопопуляции ( для которой характерна неодноударная кинетика пролиферации). Это соответствует, как и следовало ожидать, Тх1, регулирующим ответ на опухолевый антиген.

Таким образом, показано, что формирование нелинейной ЛР. зависимости, полученной при анализе пролиферации неразделенных иммунных спленоцитов в ответ на аллоантиген, а также гуморальный и клеточный антигены, обусловлено взаимодействием суОпопуляций Тх1 и Тх2, взаиморегулирувдими пролиферацию друг друга.

4. Механизма взаимодействия суОпопуляций Т хелперов, обуславливающие формирование S-образной кривой в лимитирующих разведениях.

в рамках предложенной гипотезы мы попытались выяснить механизм регуляции клетками активности друг друга. Используя антитела к ИЛ-2 рецептору (7D4), было выявлено, что обе суопопуляции несут на своей поверхности рецептор к ИЛ-2. Поэтому, одним из механизмов может являться конкуренция за ИЛ-2. Однако, это предположение не подтвердилось. Оценивая влияние ИЯ-2, мы пришли к выводу, что ИЛ-2 не является фактором, в результате конкуренции за который подавляется пролиферация первых эффекторов, так как при добавлении избытка ИЛ-2 нелинейность ЛР кривой сохранялась.

Другим возможным механизмом регуляции взаимодействия между первой и второй пролиферирувдими субпопуляциями может быть продукция этими клетками факторов, супрессирунаих действие друг друга. Известно, что интерферон-гамма, секретируемый Txl, ингибирует пролиферацию Тх2. А ЯЛ-10 , продуцируеь i Тх2 подавляет пролиферацию Txl. В соответствии с этим были произведены следующие эксперименты. В культуры алло-иммунных In vitro спленоштов при анализе в лимитирущих разведениях добавляли антитела к ИЛ-ГО (SXC-1) или же к интерферону-гамма (Я4).' В первом случае добавление антител к ИЛ-10 привело к изменению соотношения частот первой и второй пролиферируюшей■ субпопуляциЯ по сравнению с контрольной

. is -

культурой (Рис.4): снижению доли частоты первой и возрастанию доли частоты второй пролиферирушей суопопуляции, что можно интерпритировать как oi.,jhу ингибирувдего эффекта Тх2 на Txl. Добавление антител к интерферону-гамма также привело к сдвигу в соотношёнии частот: к увеличению доли частоты первой пролиферирущей субпопуляции, что в этом случае означает снижение супрессирующего влияния Txl на Тх2.

Таким образом, был сделан вывод, что нелинейная S-образная кривая пролифератмвного ответа, полученная в ЛР, отражает взаимодействия между субпопуляциями Txl и Тх2. Причем, одним из механизмов взаимодействия является взаимная регуляция активности клеточных субпспуляций за счет секретируемых лимфокинов.

Непримированные предшественники CD4+ клеток, секретирукщие лииь ИЛ-2, начинают дифференцироваться в популяцию эффекторных клеток через 4-6 дней культивирования с антигеном. Учитывая данные, полученные Swain с коллегами в системе in vitro, о сравнении функций' аллоантигенспецифических эффекторов, развивающихся в присутствии. ИЛ-2 и ИЛ-4, можно говорить о преимущественном развитии субпопуляций Txl ( в культуре с экзогенным ИЛ-2) или Тх2 ( в культуре с экзогенным ИЛ-4) в зависимости от имеющихся в культуре лимфокинов. Мы применили это положение для нашей модели иммунного ответа в системе In vitro. В качестве аллоантигена для спленоцитов Balb/c мышей использовали облученные 2000 рад клетки селезенки С57В1/6 мышей. Аллоантиген является сильным стимулятором для обеих субпопуляций Т хелперов. Однако, культивирование дифференцирующихся аллоантигенспецифических эффекторов в присутствии ИЛ-2, в с^ном случае, и ИЛ-4, в другом, привели к следующим зависимостям в координатах лимитирующих разведений (рис.5 А) Пролиферация спленоцитов, культивированных с добавлением экзогенного ИЛ-2, после рестимуляции в системе лимитирующих разведений отличается отсутствием S-образного пика и представлена нелинейной зависимостью", отражающей многоударный процесс, что характерно для пролиферации второй эффекторной субпопуляции ПЛ2. Спленоциты из культуры с экзогенным ИЛ-4 давали другую картину пролиферации поел рестимуляции в лимитирующих разведениях (рис.5 А): зависимость аппроксимировалась в линейную, что .говорит об одноударнссти процесса, характерного для первых пролиферируищих эффекторов ПЛ2.

400

1000

JOOO

airo

алло

К AT к IL-10 AT к INF-^

Рис. 4. А) Изменение экспериментальной кривой пролиферативного ответа in vitro иммунизированных алпоантигеном сцленоцитов мышей при рестимуляции в ЛР в отсутствии антител (о), в присутствии в ЛР культурах антител (AT) к ИЯ-Ю (•), в присутствии в ЛР культурах антител к интерферону-гамма (д).

По оси X: концентрация (кл/лунка)

По оси У: доля отрицательных лунок (отн. ед.)

В) Изменения соотношения предшественников первойШ) и второй экспериментальных кривых, описанных выше. По оси X: К - в отсутствии АТ По оси У: доля частот (отн. ед.)

частот пролиферации ( В ) субпопопуляций в

a too 4Ш iaoo им а ioo 400 iaoo в4оо

Рис. 6.-1) Анализ экспериментальных пролифаративкых кривых доза-вффакт после культивирования спленоцитов 10 суток in vitro в присутствии аллоангагвна о добавлением экзогенного VUI-Z (о) или ИЛ-4 (•).

В) Динамика пролиферативного ответа для 4-суточной (о) и.10-суточной (•) клеточных культур, стимулированных in vitro алло-АГ в присутствии ИЛ-4.

По оси X: концентрация (кл/лунка)

По оса У: доля отрицательных лунок (отн. вд.)

Динамика культивирования с №1-4 показывает (Рис.5 В), что на начальных этапах развития (4 дня) в культуре одинаково активны, по-видимому, ., обе субпопуляции, так как наблюдается обычная Б-образная кривая посла рестимуляции в системе лимитирующих разведений. Однако, на Солее поздних сроках (10 суток) происходит спрямление Б-оОразной кр'*вой с приближением еЗ к одноударной, что характерно для процессов с одной активной суопопуляцией.

Для более тщательной селекция Тх1 и Тх2 помимо ИЛ-2 в

- «-

Рис. 6. Воспроизведение 8-образной кривой ( ) пролиферативного ответа при совместном культивировании в лимитирующих разве- ниях иммунных клеток из культуры с экзогенным ИЛ-2 и с экзогенным ИЛ-4, кривые доза-эф$ект для которых приведены на рис.бА. По оси X: концентрация (кл-лушо) По оси У: доля отрицательных лунок (отн. )

первоначальную культуру с авлоентигеном добавили антитела к ИЛ-10 (БХС-1), а вместе с ИЛ-4 добавляли антитела к ;.атерферону-гвмма (Н4). Результаты пролиферации 1п тНго юмунных спленоцитов из этих культур похожи на выше описанные (данные не приведены). 1ак, спленоциты из ИЛ-2+гхс-1 культуры пролиферировали после •рестимуляшш как вторые эффекторы (многоударный процесс), являдшеся по нашим предположениям Тх1 (при добавлении ингибитора

Tri в систему лимитирующих, разведений наблюдали снижение чвстоти пролиферации этой субпопуляцш(данше нэ приведены)!,а клетки из ИЛ-4+Н4 культуры - каи Тх2 (одноударный процесс, практически отсутствие изменений в кривой после добавления ингибитора Txl). При смешивании этих двух субпопуляций в лимитирующих разведениях получили характерную для нашей экспериментальной модели S-образну» кривую (рис.6), что говорит о том, что S-образные кривые могу формироваться двумя субпопуляциями клеток, в отличии от традиционно принятого мнения об участии трех взаимодействующих субпопуляций, -в нашем случав Txl и Тх2.

5,- Особенности пролкферативных ЛР-кривых лимфоцитов периферической крови (ЛПК) больных истинной пузырчаткой (pemphigus vulgaris).

Аналогичные эксперименты, позволяющие оценить активность субпопуляций Т геллеров в мышиной система, были проведены с лимфоцитами периферической крови (ЛПК) человека. Изучали пролиферагивный ответ ЛПК здоровых доноров и больных аутоиммунным заболеванием (pemphigus -ulgarls) в ответ на ыитоген Кон А. Показали,, что в норме наблвдается одноударная зависимость о частотой клеток предаественников 0.3*10 (Рис.7 С). При аутоиммунном заболевании у 5 из 12 больных до начала лечения наблюдали нелинейную S-образную зависимость с выраженным первым пиком (Рис.7 А). У оставшихся 7 больных наблюдали линейные зависимости (Рис.7 В), аналогичные контрольным у здоровых доноров, е несколько большим значением частоты пролиферации ю^ток предшественников 0.7«10~3. Значительной разницы между этими двумя группами по количеству CD4+ клеток и КонА-индуцированной пролиферации в biilK системе не наблюдали. Однако зти две группы больных достоверно различались по уровню продукции ИЛ-2. ЛПК, формирующие в лр условиях S-образную кривую, продуцировали ИЛ-2 в более высоких титрах. Так, индекс стимуляции (ИС) пролиферации Ш~ 2-зависимой клеточной линии CTLL-2, стимулированной 2-х суточными супернатантами КонА индуцированных ЛПК, у доноров был 12-4, х. груша больных о линейным ЛР ответом 13-10, а в груше с нелинейным - 32*11. В сумме по груше последние больные, лучше поддавались лечению глюкокортикоидами и циклоспорином А, одни/с из механизмов

- го

или

В

Рис. 7. Сравнение пролифератившх кривых доаа-эффзкт, образованные ЛПК здоровых доноров (С), группы больных истинной пузырчатк й с погашенным уровнем секреции М-2 (А) и группы больных пузырчаткой с нормальным уровнем секреции ИЛ-2 (В).

По оси X: концентрация (кл/лунка)

По оси У: доля отрицательных лунок (огн. ед.)

Д) Изменения соотношений частот пролиферации клегок-предшественников первой и второй субпопуляций.

Гю оси X: А - для рис.7А, В - для рис.7В, С - для рис. 7G По оси У: доля отрицательных лунок (отн. ед.)

действия которых является подавление секреции ИЛ-2 и подавление экспрессии mRNA ИЛ-2. В группе с линейным ответом в ЛР системе также, однако, часть дольных хорошо поддавалась лечению, хотя случаи обострений, присоединенных инфекций и; резистентности к лечению' наблюдали чаще. Таким образом, предложенный метод теоретически может быть использован для прогнозирования течения лечения. В процессе лечения частоты пволиферирупцих клеток снижались.

Естественно, что интерпретация S-образной зависимости, основанная на мышиной модели, не может быть однозначно перенесена в человеческую систему. Поэтому нельзя без дальнейшего исследования сказать, какие из субпопулядай участвуют в этом процессе. Однако показано, что у части больных пролиферация первой -'убпоп, :яции предшественников лимфоцитов (ГШ) выражена значительно. Корреляция ввличенн первого пика с повышенной продукцией ИЛ-2 позволяет предположить, что именно ШЯ секретируют ИЛ-2. Предложенный в данной работе подход, может сыть применен для дальнейшего изучения взаимодействия субпопуляций лимфоцитов человека на клональном уровне, т. к. выявляет наличие по крайней мера двух субпопуляций в системе'

выводи

1. Показано, что пролиГеративный ответ спленоцитов мышей Balb/c на аллоантиген С57В1/6 в условиях лимитирующих разведений характеризуется нелинейной зависимостью доза-эффект. Клетками эфЕэкторами являются лимфоциты с фенотипом Thyl,2+, L3T4+, lyt2 . Igü

2. Установлено, что в основе изучаемого процесса лежит взаимодействие двух субпопуляций Т хелперов: Т хелперов.I (Txl) и Т хелперов 2 (Тх2), причем в мышиной системе Тх2 соответствуют первым эффекторам, то есть пролифераруют при низких концентрациях клеток, a Txl соответствуют вторым эффекторам, пролиферирувдим при более высоких концентрациях клеток.

3. Обнаружено, что одним из механизмов взаимодействия субпопуляций Т хелперов, обуславливают»! формирование нелинейной кривой в лимитирующих разведениях, является продукция этими

клетками фе торовсупрессирупцр. функции друг друга ¡интерферон-гамма и ИЛ-Ю). ......

; 4. Разработана математическая Модель, учитывающая взаимодействие двух субпопуляций клеток - первых' и ' вторых эффекторов, причем вторые эффекторы подавляют функция первых в "совместных культурах. С помощью предложенной модели были определены количественные характеристики TxI и Тх2, формирующих полученные нами нелинейные зависимости.

5. Показали, что ЛПК человека при поликлональнсй активации в лимитирующих условиях также сп лобны формировать нелинейную кривую доза-эффект, как и лимфоциты мышей, т.е. на клональном уровне выявляется гетерогенность субпопуляций лимфоцитов человека. Выявлена гетерогенность у части больных с аутоиммунным заболеванием pemphigus vulgaris, ЛПК которых продуцировали повышенное количество ИЛ-2.Таким образом, разработанный метод количественной и качественной оцет^та клеточных взаимодействий можно использовать и для анализа взаимодействий лмфоцнтов человека.

список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Калиниченко. Т.В., Дозморов И.Ы., Сидоров И.А., СвирщевскаяЕ.В.. Изучение взаимодействия субпопуляций лимфоцитов мышей методом лимитирующих разведений. Иммунология, 1994, N 5, стр 14-17.

2. Таболин В.А., Повальчук Л.В., Киселева М.В., Павлюк A.C., Калиниченко Т.В., Деверев Д.Н. Некоторые особенности функционирования лимфоцитов пуповинной крови новорожденных. Пе,т'.атрия, 1993. N 4, стр.9-11.

3. Kallnlchenko T.V., S-zlrshchevskaya E.V., Dozmorov I.M.. " helpers 1 and 2 can be recognized by limiting dilution analysis. 1st Meeting between International Association of. Allergology and Clinical Immunology and European Academy of Allergology and

Ollnlcal Immunology. Stockholm, Sweden, 1994. Abstract book, p. 18.

. 4. Kallnlchenko T.V., Svir"hchev8kaya E.V.. Heterogeneity of T helpers eatlmated by limiting dilution ^analysis. 12th Europeanlranonojogy Meeting, Barcelona, Spain, 1994. Abatract book, p.40. "