Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Фенотипическая характеристика активационных и цитотоксических маркеров лимфоцитов при различных формах гломерулонефритов

005008010

СИТКИНА КСЕНИЯ ВИКТОРОВНА

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АКТИВАЦИОННЫХ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОВ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 9 ЯНВ 2012

Казань - 2012

005008010

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, Цибулькин

профессор Анатолий Павлович Научный консультант: кандидат медицинских наук,

доцент Хасанова Миляуша Ильясовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Мустафин Илыпат Ганиевич доктор медицинских наук профессор Белопухов Валерий Матвеевич

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегоро-ская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится </&> ¿Ю-е^ффаЛкР 2012 г. в 1<0 часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. (420012, Россия, Татарстан, г. Казань, ул. Бутлерова, 49).

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. (420012, Россия, Татарстан, г. Казань, ул. Бутлерова, 49).

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Залялютдинова Л.Н

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Широкая распространенность заболевания почек, и в частности хронического гломерулонефрита, закономерным исходом которого является развитие хронической почечной недостаточности, ведет к поиску методик диагностики заболеваний почек (Mason, 1994; Wardle E.N., 1996; Hotta О., 1998; Nangaku M., 2005; Salama A.D., 2005; Caudy A.A., 2007). Несмотря на понимание многих аспектов патогенеза гломерулонефрита, многие клинические и патогенетические моменты остаются нерешенными. Первые работы по изучению роли иммунокомпетентных клеток в развитии патологии почек стали появляться в конце восьмидесятых годов, и носили экспериментальных характер (Lin Ching-Yuang et al., 1989).

Доказано что, иммунокомпетентные клетки обеспечивают как регуляцию гуморального иммунитета, так и являются эффекторами клеточного ответа, следовательно, от их функционального состояния зависит продукция цитокинов, антител, функциональная активность эффекторного (цитотоксического) звена клеточного иммунитета (Cockwell Р., 1999; Xiao H., 2002; Wu J., 2002). Современные положения предполагают участие не только активированных цитотоксиче-ских субпопуляций лимфоцитов, но и других субпопуляций лимфоцитов в развитии хронических поражений почек иммунной природы (Bohle А., 1996; Huang X.R., 1997; Nikolic-Paterson D.J., 1997; Li S., 1998; Tipping P.G., 2006). Рассматривая гломерулонефриты как имму-новоспалительное заболевание, представляет интерес изучить не только количественные показатели клеточного иммунитета, а, прежде всего экспрессию активационных и эффекторных маркеров, маркеров ранней и поздней активации, маркеров регуляторных клеток (Sakat-sumi M., 2001; Wang Y., 2001; Reynolds J., 2002; Wolf D., 2005; Yates J., 2008; Glassock R.J., 2009). Важным является сопоставление клинических данных, оценки морфологических изменений и характеристики основных популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови с оценкой их активности.

Цель исследования: выявить характер изменения экспрессии ведущих активационных и эффекторных маркеров лимфоцитов периферической крови больных мезангиопролиферативным гломеруло-нефритом с анализом их соответствия клинической и морфологической картинам заболевания.

Задачи исследования:

1. Выявить выраженность изменения содержания ведущих лимфоцитарных субпопуляций у больных с различными по тяжести формами гломерулонефрита.

2. Оценить в исследуемых группах больных характер изменения уровня Т лимфоцитов с регуляторной активностью как фактора, подавляющего развитие аутоиммунных заболеваний.

3. Проанализировать наличие взаимосвязи между уровнем активации СЭ4+ клеток эффекторов, а также степенью активации Т-лимфоцитарных субпопуляций и тяжестью изучаемой патологии.

4. Оценить возможность участия обнаруженных фенотипиче-ских субпопуляционных лимфоцитарных сдвигов в патогенезе хронических форм мезангиопролиферативного гломерулонефрита

Научная новизна.

1. Впервые на одних группах больных с морфологической характеристикой степени тяжести поражения почек проведен анализ результатов исследования расширенной панели фенотипической характеристики популяционного-субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови больных с различными формами мезангипро-лиферативного гломерулонефрита.

2. Впервые Т-лимфоцитопения, определяющая выраженность лимфопении, у больных мезангиопролиферативным гломерулонеф-ритом, была охарактеризована по соотношению СБЗ+4+ и СЭЗ+8+ субпопуляций Т-лимфоцитов с последующей оценкой степени выраженности их активации по С069+ и Н1л\1Ж+ маркерам.

3. Впервые проанализировано состояние субпопуляции основных Т-клеток регуляторов аутоиммунных процессов (С04+25ь'+) у больных с различными формами мезангиопролиферативного гломерулонефрита.

4. Нами впервые доказано изменение дифференцировки наивных С04+ Т-лимфоцитов с изменением соотношения ТЬ регуля-торные /ТЬ эффекторные субпопуляции С04+ Т-лимфоцитов.

Личный вклад автора заключается в выполнении всех этапов диссертационной работы: постановке цели и задач исследований, разработке программы и методики их выполнения, изучении и анализе литературы, сборе и обработке фактического материала, формулировании научных положений и выводов.

Практическая значимость.

1. Оценка популяционно-субпопуляционного лимфоцитарно-

го фенотипа у больных мезангиопролиферативным гломерулонефри-том позволит судить о возможной тяжести течения нефрита.

2. Снижение субпопуляции Т-регуляторных клеток у больных с мезангиопролиферативным нефритом может свидетельствовать о неблагоприятном течении процесса с развитием нефротического синдрома.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Т-лимфоцитопения является основой прогрессирующей лимфопении у больных мезангиопролиферативным гломерулонефри-том (с преимущественным снижением уровня СБ4+ Т-лимфоцитар-ной субпопуляции) по мере нарастания тяжести заболевания.

2. На фоне Т-лимфоцитопении по мере увеличения тяжести заболевания возрастала фракция активированных Т клеток.

3. Характер изменения уровня Т-лимфоцитов с регуляторной активностью (ХЮ4+25+ы) в исследуемой группе больных отображает тяжесть поражения почек.

4. Нарушение дифференцировки СБ4+ наивных клеток с увеличением процента образования Т-лимфоцитов с эффекторной активностью было типичным для исследуемой патологии и усиливалось с нарастанием тяжести заболевания.

5. Выраженность популяционно-субпопуляцинных изменений лимфоцитарного фенотипа у больных мезангиопролиферативным гломерулонефритом сочеталась как с тяжестью поражения, так и со степенью лимфоцитарной инфильтрации почек.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: научно-практической конференции «Лабораторная Медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2010); научно-практической конференции молодых ученых Приволжского федерального округа с международным участием (Казань, 2010); на VIII Российской конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010); совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики, кафедры урологии и нефрологии ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Казань, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных

работ, в том числе 5 научных статей, опубликованных в ведущих научных журналах, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц, рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, Зх глав собственных результатов, обсуждения полученных данных и заключения, выводов, практических рекомендаций. Список использованной литературы включает 20 публикаций отечественных авторов, и 150 публикаций зарубежных авторов.

Содержание работы Материалы и методы обследования.

Нами было исследовано 43 пациента с первые выявленным хроническим гломерулонефритом. Пациенты проходили обследование в отделении нефрологии ГАУЗ БСМП №2, г. Казани, в отделении трансплантации почки ГАУЗ РКБ МЗ РТ, г. Казани в период с 2002 по 2010 гг.

Все пациенты во время обследования не подвергались медикаментозной терапии. На основании клинико-лабораторных и морфологических данных нами были выделены 2 группы больных хроническим гломерулонефритом: первую группу (1-я группа) составили 33 пациента с мезангиопролиферативным гломерулонефритом с изолированным мочевым синдромом, вторую группу (2-я группа) составили 10 человек с мезангиопролиферативным гломерулонефритом с нефротическим синдромом. В 1-й группе средний возраст составил 34,04±2,5 лет, а во 2-й группе больных 34,25±5,3 лет. Из 33 пациентов из 1-й группы 13 пациентов составили женщины, 20 - мужчины. Во 2-й группе соотношение мужчин и женщин составляло 9:1.

Для исследования выраженности повреждения почек мы приняли условные критерии степеней оценки пролиферативных изменений в клубочках почек. При оценке степени повреждения клубочкового аппарата почек, мы оценивали распространенность пролиферативных изменений в клубочках. Очаговые изменения до 40% оценивались как 1 балл, очаговые от 40 до 80% - 2 балла, диффузные изменения более 80% поврежденных клубочков - 3 балла. Также оценивали распространенность пролиферативных изменений в отдельных клубочках. Сегментарные изменения - в 1 балл, частично сегментарные в сочета-

нии с глобальными повреждениями в 2 балла, глобальное повреждение клубочков - как 3 балла. И третьим критерием оценки были экстракапиллярные проявления, наличие которых оценивалось при обнаружении полулуний и синехий. Повреждение от 1 до 25% оценивалось на 1 балл, от 25 до 50% - 2 балла, свыше 50% - 3 балла. Таким образом, максимальное количество баллов в исследуемых группах могло достигать 9 баллов. А также ввели дополнительный критерий количественного учета степени выраженности лимфоидной инфильтрации в интерстиции почки. Отсутствие инфильтрации интерстиция оценивалось как 0 баллов, инфильтрация, захватывающая до 25% интерстиция - оценивалась на 1 балл, от 25 до 50% интерстиция - 2 балла, свыше 50% - 3 балла.

Контрольную группу составили 50 клинически здоровых лиц в возрасте от 18 до 56 лет. Все обследуемые лица не имели хронических заболеваний, признаков острых заболеваний на момент обследования, имели отрицательные результаты тестирования на маркеры гепатитов и антитела к ВИЧ.

Всем пациентам проводилось иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии с использованием диагностической панели, включая стандартные, ак-тивационные и цитотоксические маркеры (маркеры популяций Т и В лимфоцитов, Th, Тс популяции, NK клетки и активированные NK клетки, NKT, кроме того активационные маркеры, такие как CD25, CD69, HLADR). Для количественного определения субпопуляций лимфоцитов периферической крови использовался проточный ци-тофлюориметр FACS Calibur BD (USA).

Пункционную биопсию почки осуществляли всем пациентам под ультразвуковым контролем с помощью одноразовой биопсийной иглы 14 GA фирмы «Gallini» (Италия). Окраска гистологических срезов проводилась по следующим методикам: геметоксилин-эозином, по Ван-Гизону, серебрением по Джонсу-Моури, с помощью Шифф-йодной реакции (ШИК). Клинические исследования. Для определения показателей гемоглобина, эритроцитов, СОЭ, лейкоформулы, биохимических показателей крови использовались стандартные методики.

Статистический анализ. Исходные данные подвергались математического обработке на персональном компьютере в программе Excel, а также с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows. В независимых выборках использован t-критерий

Стьюдента и критерий хи-квадрат с поправкой Йейтса (для качественных признаков); непараметрический корреляционный анализ Спирмена.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Сравнивая морфологические данные в группах больных, следует отметить, что в 1-й группе - морфологические изменения характеризовались пролиферативными изменениями преимущественно очагового характера, в отличие от 2-й группы. Изменения отдельных клубочков в 1-й группе были сегментарными. Наблюдалась умеренная пролиферация мезангиальных клеток. Обнаружены склеротические изменения стромы почки во всех образцах. Тубулоинтерстициальные изменения в большинстве случаев варьировали от минимальных до выраженных, которые характеризовались интерстициальным склерозом с атрофией канальцев, дегенеративными изменениями эпителия канальцев.

Во 2-й группе морфологические изменения в ткани почек были диффузными. Изменения отдельных клубочков были глобальными. Пролиферация мезангиальных клеток была более выражена, чем в группе с изолированным мочевым синдромом. Наблюдалось расширение мезангиальных полей за счет увеличения числа мезангиальных клеток и накопления мезангиального матрикса. Степень выраженности изменений в интерстиции почек в данной группе была также более выраженной, нежели у пациентов из 1-й группы. Показатель выраженности гломерулярных изменений в 1-й группе больных составил 3.28±0.26 баллов, в то же время во 2-й группе больных данный показатель был равен 4,1 ±0,36 балла. Специальному исследованию мы подвергли характер и степень выраженности инфильтрации лимфоцитами интерстиция почек больных, поскольку подобные изменения отражают, прежде всего, характер возможных влияний клеточного звена иммунитета. Выраженность, преимущественно лимфоидной инфильтрации интерстиция в двух группах была разной. В 1-й группе больных степень инфильтрации интерстиция была минимальной и составила 0,68±0,15 балла, во 2-й группе больных она была достоверно выше (р<0,05) и составила 1,8±0,21 балла.

Следовательно, морфологические признаки инфильтрации ин-терстициального пространства почек больных в 1-й группе и 2-й группе, отражали степень выраженности инфильтративных измене-

ний интерстиция почечной ткани и имели не только количественные, но и качественные отличия в случаях гломерулонефритов с нефроти-ческим синдромом.

Общепризнано, что гломерулонефриты могут протекать мало-симптомно и не иметь ярко выраженной клинической картины. В то же время во 2-й группе заболевание проявлялось наличием отеков нефротического типа у 7 из 10 пациентов.

Изменения клинико-лабораторных показателей в исследуемых группах больных коррелировали с тяжестью течения заболевания. Со стороны показателей периферической крови во 2-й группе по сравнению с 1-й группой пациентов достоверно более низкой была концентрация гемоглобина крови, уровень которого соответствовал легкой форме анемии, что достаточно типично для хронических заболеваний почек.

Со стороны белой крови основными изменениями в обеих группах больных были признаки лейкопении, нарастающей по мере утяжеления заболевания (таблица 1). Наблюдаемому снижению количества лейкоцитов соответствовала лимфопения со снижением числа лимфоцитов до уровня 1,45±0,08х109/л в 1-й группе больных и с нарастанием изменений до 1,18±0,05хЮ9/л во 2-й группе больных, что в обоих случаях было достоверно ниже контрольных значений. Лимфопения нашла свое отражение и в показателях лейкоформулы со снижением процента лимфоцитов. При этом снижение процентного содержания лимфоцитов также было более выражено во 2-й группе больных.

Таблица 1

Показатели общего анализа периферической крови _в группах больных МезПГН_

Показатель Группы

контрольная (п=50) первая (МезПГН ИМС) (п=33) вторая (МезПГН НС) (п=10)

Гемоглобин г/л 132,9±1,04 133.0±3,20 118±5,34а/в

Эритроциты 10 /л 4,5±0,11 4,42±0,13 3,80±0,19а/в

Лейкоциты х 109/л 6,45±0,143 5,38±0,24а 5,32±0,29а

Лимфоциты % 30.2±0.98 27.01±0.87 22.55±1.37а

Абс. лимфоциты х 107л 1,95±0,09 1,45±0,08а 1,18±0,05а

СОЭ мм/час 14,22±0,34 16,78±2,44 29,33±3,67а

р<0.05 а - по сравнению с контролем, в — между исследуемыми группами.

Классическими проявлениями мезангипролиферативного гломе-рулонефрита являются изменения в анализах мочи, которые связаны, прежде всего, с первичным поражением клубочков, а при ряде форм и канальцевого аппарата почек. Изолированный мочевой синдром проявлялся изменениями осадка мочи, минимальной протеинурией и гематурией. В случае же нефротического синдрома изменения в показателях включали в себя более богатый мочевой осадок и выраженное изменение удельного веса мочи. Удельный вес мочи был достоверно снижен в группе с нефротическим синдромом по сравнению с 1-й группой больных и составил 1007,89±0,28. Полученные данные свидетельствовали о наличии у больных во 2-й группе серьезных нарушений концентрационной способности почек, степень выраженности которой отражала характер морфологических изменений со стороны канальцевого аппарата почек в этой группе больных.

Поражения базальной мембраны клубочкового аппарата и пролиферация мезангия сопровождались повышением проницаемости и увеличенной фильтрацией, а затем и потерей низкомолекулярных белковых фракций крови. Суточная потеря белка с мочой была достоверно выше в группе больных с нефротическим синдромом и составила 5,7±0,38 г/сутки по сравнению с 1,09±0,13 г/сутки при изолированной патологии. Содержание белка в разовой утренней порции мочи во 2-й группе соответствовало суточной потере белка и составило 0.97±0,14, и было увеличено по сравнению с показателями в 1-й группе. Полученные различия в исследуемых группах находили отражение в различиях морфологической картины.

У больных с нефротическим синдромом наблюдалась высокая потеря белка с мочой. Как известно, прежде всего, происходит потеря низкомолекулярных белков альбуминов. Неудивительно поэтому, что у больных из 2-й группы была отмечена выраженная гипоальбумине-мия, достигающая средних значений 28.40±0.65 г/л, при 38.86±0.67 г/л в группе больных с изолированным мочевым синдромом. Описанные изменения нашли отражение в концентрации общего белка, уровень которого был снижен в группе с нефротическим синдромом до 57.83±0.72 г/л по сравнению с 70,35±0,96 г/л в 1-й группе больных (р<0,05).

Выраженность гиперхолестеринемии во 2-й группе составляла 6,85±0,26 ммоль/л по сравнению с нормальными популяционными значениями <5,18 ммоль/л. Выявленная нами гиперхолестеринемия во 2 группе больных является одним из классических симптомов, ко-

торые составляют развернутую картину клиники нефротического синдрома. Изменения уровней холестерина в 1-й группе больных были не выраженными, концентрация холестерина составляла 4,94±0,19 ммоль/л.

Азотовыделительная функция почек оценивалась по уровням средних показателей креатинина и мочевины. В 1-й группе данные показатели не уходили за рамки верхних популяционных значений нормы и составили 106,44±5,92 мкмоль/л и 5,79±0,32 моль/л, правда у отдельных больных концентрация креатинина была уже увеличена. Нарушение азотовыделительной функции почек мы наблюдали преимущественно во 2-й группе, что проявлялось достоверным повышением уровня креатинина до 166,44±24,43 мкмоль/л (р<0,05) и в меньшей степени повышением уровня мочевины до 10,88±2,28 моль/л.

Нарушения выделительной функции наиболее часто связаны со снижением фильтрационной способности почек, что оценивается по скорости клубочковой фильтрации. Уже в 1-й группе больных отмечалось снижение скорости клубочковой фильтрации до 77,6±4,69 мл/мин., что свидетельствовало о наличии нарушений функции почек. Во 2-й группе скорость клубочковой фильтрации была снижена значительно и в среднем составила 39,8±2,7 мл/мин.

Таким образом, и клинико-лабораторные изменения при изучаемых формах гломерулонефрита одновременно с морфологией повреждений свидетельствовали о том, что мезангипролиферативный гломерулонефрит с нефротическим синдромом представляет не только более тяжелую, но и имеющую качественные отличия форму про-лиферативной патологии почек.

Как мы уже отметили, мезангиопролиферативный гломерулонефрит относится к числу классических форм аутоиммунной патологии. Несомненный интерес представляла возможность обнаружить конкретные признаки разницы в регуляторных механизмах аутоиммунных реакций, которые могли бы отразить различия в тяжести течения сравниваемых форм. Исходя из вышеперечисленных различий в проявлении клинико-морфологических изменений у больных ме-зангиопролиферативным гломерулонефритом с изолированным мочевым синдромом и нефротическим синдромом, мы предположили возможность наличия патогенетических особенностей развития и поддержания заболевания.

Подтверждением этому было отсутствие классических призна-

ков воспаления в виде лейкоцитоза в обеих группах. Лейкопения во многом была связана с первичным уменьшением общего количества лимфоцитов, степень которого нарастала с утяжелением формы заболевания. Отталкиваясь от общего изменения в виде лимфопении, возрастающей по мере утяжеления патологии, мы на первом этапе рассмотрели соотношение в периферической крови больных основных Т- и В-популяций и стандартных субпопуляций СБ4+ и СБ8+ Т-лимфоцитов. Результаты исследования показали, что лимфопения была отражением преимущественно Т-лимфопении. Мы выявили снижение количества клеток с фенотипом СБЗ+19- в абсолютных значениях до 1021,0±54,0х103/л (р<0,05) клеток в 1-й группе. Во 2-й группе снижение содержания данной популяции клеток было выражено более значительно и составило 786,0+48,0x103/л клеток (таблица 2). Хорошо известно, что Т-лимфоцитарная популяция клеток периферической крови относится к числу клеток с высокой миграционной способностью, причем эта миграция связана с миграцией в ткани и органы. В обычных условиях воспалительной реакции Т-лимфоци-ты выполняют защитную функцию, в то же время, в условиях развития аутоиммунных реакций они реализуют иммунопатологические реакции.

Таблица 2

Популяционная и субпопуляционная характеристика лимфоцитов

периферической крови у больных МезПГН

Маркеры Группы

контрольная (п=50) первая (МезПГН ИМС) (п=33) вторая (МезПГН НС)(п=10)

СБЗ+19- х10 /л 1350,0+25,0 1021,0+54,0а 786,0+48,037"

СБЗ-19+ х103/л 185,0+30,0 155,0+10,0 124,0+7,0а

СБЗ+4+ х103/л 777,0+23,0 639,0+63 355,0+11,0*

СБЗ+8+ х103/л 518,0+52,0 367,0+17,0^ 434,0+40,0

СБ4+8+ х103/л 22,0+4,0 55,0+29,0а 56,0+21,0а

СБЗ-16+56+ х103/л 218,0+40,0 205,0+21,0 192,0+12,0

4/8 1,46+0,03 1,65+0,06 0,84+0,04а

р<0.05 а - по сравнению с контролем, в - между исследуемыми группами.

Данный подход позволил нам предположить, что Т-лимфопения у больных обеих групп во многом была связана с возможной миграцией Т-лимфоцитарной популяции. В таком случае при форме с неф-ротическим синдромом количество мигрирующих Т-клеток превы-

шало таковое в 1-й группе. Возможной миграцией Т-лимфоцитов в первично пораженные почки можно было бы логично объяснить соответствие степени выраженности Т-лимфопении уровню лимфоид-ной инфильтрации интерстиция почек у больных мезангипролифера-тивным гломерулонефритом. Патогенетическая потенция таких клеток при аутоиммунных поражениях почек целиком соответствовала тяжести клинико-лабораторных проявлений заболевания.

В состав популяции СВЗ+19- Т-лимфоцитов как составные части входят две большие субпопуляции, которые маркируются как СЭЗ+4+ и СОЗ+8+ субпопуляции. Особый интерес имеет соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов в анализируемых группах. Сравнение популяционных показателей у больных 1-й группы с контрольными цифрами свидетельствует о том, что Т-лимфопения в этой группе практически целиком была связана со снижением уровня СБЗ+8+ субпопуляции. Абсолютное содержание субпопуляции СОЗ+4+ Т-лимфоцитов в 1-й группе больных хотя и снижалось, но последнее было статистически недостоверным. Во 2-й группе больных при наличии не достаточно выраженного уменьшения количества клеток с фенотипом СБЗ+8+ мы выявили значительное, более чем в два раза по сравнению с 1-й группой, уменьшение количества СБЗ+4+ Т-лимфоцитов.

Таким образом, в 1-й группе больных Т-лимфопения преимущественно сочеталась с СОЗ+8+ субпопуляционной лимфопенией. В то время, как у больных во 2 группе мы не обнаружили признаков значительного снижения субпопуляции СВЗ+8+, а наиболее значимые изменения были связаны со снижением СБЗ+4+ субпопуляции Т лимфоцитов. У больных 1-й группы, по-видимому, в процессе развития заболевания основную роль играют цитотоксические клетки СОЗ+8+ и поражение почечной ткани связано с их миграцией. В то время как при развитии заболевания с нефротическим синдромом более важную роль играет вовлечение в процесс СБЗ+4+ клеток с параллельным снижением и СЭЗ+8+ субпопуляции Т лимфоцитов.

Наиболее выраженным агрессивным потенциалом среди мигрирующих субпопуляций Т-лимфоцитов обладают предварительно активированные клетки. Поэтому мы сравнили в двух анализируемых группах больных частоту встречаемости в периферической крови активированных Т-лимфоцитарных клеточных субпопуляций. Как мы уже отмечали, наиболее распространенными маркерами для оценки степени активации клеток являются СБ69 как маркер ранней актива-

ции, и НЬАОЯ как маркер поздней активации клеток. В 1-й группе больных мы выявили значительное повышение содержания лимфоцитов экспрессирующих маркеры, как ранней (С069), так и поздней (НЬАБЯ) активации, более чем в два раза превышающие показатели контрольной группы. Коэффициент активации, как показатель соотношения СОЗ+НЬАОК+/СОЗ+НЬА1Ж"+ СБЗ+НЬА1Ж+, позволил нам наглядно оценить процессы активации иммунокомпетентных клеток (таблица 3). Коэффициент активации Т-лимфоцитов в 1-й группе больных был увеличен до 0,179±0,01 по сравнению с 0.104±0.02 в контрольной группе.

Таблица 3

Активационные маркеры лимфоцитов периферической крови

у больных МезПГН

Маркеры Группы

контрольная (п=50) первая (МезПГН ИМС) (п=33) вторая (МезПГН НС) (п=10)

СБЗ+69+ % 0.92±0.15 5,08±0,16а 4,48±0,27а

х103л 18,0±3,0 73,0±5,0а 53,0±5,0а/в

СБ4+69+ % 1.06±0.19 2,77±0,13а 2,28±0,20а

хЮ'/л 21,0±4,0 40,0±3,0а/в 27,0±3,0

СБ8+69+ % 0.78±0.23 2,52±0,08а 2,27±0,17а

х103/л 16,0±3,0 36,0±3,0а 27,0±3,0а

СОЗ+НЬАОЯ+ % 7.60±1.31 11,19±0,69а 16,92±1,07а

хЮ'л 148,0±40,0 160,0±16,0

СБ8+НЬА1Ж+ % 5.62±0.93 8,16±0,56 14,98±0,97а/в

х103л 109,0±25,0 115,0±11,0

Коэффициент активации 0.104±0.02 0,179±0,01 0,250±0,01а

р<0.05 а - по сравнению с контролем, в - между исследуемыми группами.

Мезангиопролиферативный гломерулонефрит с нефротическим синдромом представляет собой форму гломерулонефрита с другими патогенетическими механизмами развития. Исходя их наших данных, мы связываем это не только с понижением активности и уменьшением числа С04+25+Ы клеток, которые являются классическим регулятором аутоиммунных процессов, но и с более высокой активацией Т-клеточного звена иммунитета. Степень активации по сравнению с 1-й группой во 2-й группе больных возрастает, и эти данные свидетельствуют об активации аутоиммунного поражения. Степень ранней ак-

тивации была примерно одинакова в обеих группах, однако степень экспрессии маркеров поздней активации была достоверно выше (р<0,01) во 2-й группе. Этот же коэффициент активации был достоверно выше во 2-й группе по сравнению с 1-й группой и составил 0,250±0,01 (р<0,01). Среди клеток эффекторов мы выделили СБ8+ эффекторы с цитотоксической активностью, но в случае мезангио-пролиферативного гломерулонефрита с изолированным мочевым синдромом большее внимание привлекло формирование СБ4+ клеток эффекторов. В последнее время в популяции СБ4+ хелперов выделяется субпопуляция СБ4+ клеток эффекторов, которая характеризуется потерей маркера адгезии СБ62 (рис. 1). То есть потеря Ь-селектинового маркера придает субпопуляции С04+ Т-лимфоцитов новые свойства. Они приобретают потенциальные характеристики ТЫ эффекторов за счет смены синтезируемых цитокинов преимущественно на №N-7 с реализацией функций клеточных форм иммунитета. То есть активация наивных СЕ>4+ Т-лимфоцитов приводит к тому, что происходит дифференцировка этих клеток в клетки эффекторы с потерей способности миграции в лимфоидные органы и приобретением свойств клеток эффекторов, мигрирующих в органы.

С04+621_-

Контрольная группа

Рис. 1. Соотношение СБ4+62Ь+ и СВ4+62Ь- субпопуляций Т-лимфоцитов у здоровых и больных мезангиопролиферативным гло-мерулонефритом.

В нашем исследовании процентное содержание клеток экспрес-сирующих данный фенотип возрастал, следовательно, возрастало содержание СБ4+ клеток эффекторов. Обычно у здоровых доноров эта

субпопуляция является преимущественной, и в нашем случае она составила свыше 75% от общей популяции СБ4+ Т-лимфоцитов (рис. 2). Однако у больных мезангиопролиферативным гломерулонефри-том соотношение СБ62Ь+ и С062Ь-субпопуляций начало быстро изменяться в пользу увеличения СБ4+62Ь-клеток. Нарастание их уровня было пропорционально тяжести форм заболевания: у больных с нефротическим синдромом их содержание превышало 50% суммарного количества СЭ62Ь+ и С062Ъ-клеток, увеличиваясь более чем в 2 раза.

Сй

62 +

т

■.»■-Ж-! -

-!СР

С04462+

СМ462-

да2 С04+

ПЛ-ийм

ю-

Рис. 2. Распределение С062Ь+/+62Ь- субпопуляций СБ4+ Т-лимфоцитов у больного Н. Диагноз мезангиопролиферативный гло-мерулонефрит с изолированным мочевым синдромом.

Интересным было оценить взнос ИКТ (СОЗ+16+56+) и ИК (СВЗ-16+56+) клеток. Количественное содержание N0 клеток у больных 1-й группы было повышено более чем в 2 раза по сравнению с контрольной группой и составило 83,0±9,0х103 /л. В процентном отношении данная субпопуляция также повышалась с 2,03±0,41% в контрольной группе до 5,96±0,57% в группе больных. Число клеток, выполняющих киллерную функцию, и относящихся к СОЗ-16+56+ субпопуляции у больных 1-й группы оставалось неизменным. Во 2-й группе содержание СБЗ-16+56+ субпопуляции было достоверно повышено по сравнению с 1-й группой (р<0,05), однако количественно

содержание было примерно одинаковым в обеих группах. Содержание же ЫКТ клеток достоверно не отличалось от 1-й группы. По-видимому, данные субпопуляции не играют первостепенной роли в развитии данной формы гломерулонефрита. Общее содержание В-лимфоцитов несущих маркер СБ 19+, в группах больных не изменялось. Таким образом, увеличение тяжести поражения почек у больных ассоциировалось с увеличением числа активированных СО 8+ Тс клеток с потенциальными возможностями сдвига в соотношении ТЫ/ТЪ2 популяций хелперов в пользу первых за счет увеличения субпопуляции С04+62Ь- Т-лимфоцитов.

На сегодня одним из наиболее важных регуляторных механизмов развития аутоиммунных процессов в различных органах, в том числе и почках, рассматривается состояние популяции естественных Т-регуляторных клеток (Трег).

На роль Трег аутоиммунных реакций в наибольшей степени претендуют С04+ Т-регуляторные клетки с высокой степенью экспрессии СВ25 маркера. СБ4+25+Ы лимфоциты рассматриваются как клетки, проявляющие супрессивный эффект при заболеваниях аутоиммунной природы. В 1-й группе больных их абсолютное число и процентное содержание увеличились более чем двукратно по сравнению с контрольной группой (рис. 3). В таком случае изменение содержания уровня Трег у 1-й группы больных позволяет предположить, что их увеличение способно было замедлить развитие аутоиммунного процесса и подавить дальнейшую активацию иммунного ответа. Это происходило в виде компенсаторного механизма, ограничивающего дальнейшее развитие иммунопатологического процесса, что нашло свое отражение и в клинико-морфологической характеристике заболевания. Возможно, действие Трег направлено на снижение про-лиферативного потенциала и выраженности лимфоидной инфильтрации и обеспечивало более благоприятный прогноз заболевания. Несмотря на то, что при морфологическом исследовании мы видели достаточно выраженные изменения в ткани почек, процесс развития заболевания тормозился, и функция почек при данном заболевании значительно не страдала. Таким образом, полученные результаты мы должны рассматривать как компенсаторное увеличение Трег со способностью к иммуносупрессии у больных 1-й группы, останавливающее прогрессирование аутоиммунного процесса в почках.

В случае же мезангиопролиферативного гломерулонефрита с нефротическим синдромом - патологии, которая рассматривается на-

ми как более тяжелая форма заболевания одним из основных патогенетических механизмов быстрой прогрессии заболевания, по-видимому, является несостоятельность Трег звена иммунитета. Количество Трег клеток при данной форме не только не увеличивалось, но даже снизилось по сравнению с показателями в 1-й группе (р<0,05). Возможно в связи с отсутствием «тормозящего» эффекта Трег клеток, процесс развития заболевания распространяется глубже, чем при изолированном мочевом синдроме и сопровождается более выраженным повреждением почечной ткани с нарушением азотовыделительной и фильтрационной функций почек, а в последствии развитием анемии, а в последствии развития хронической почечной недостаточности.

СР

25 +

С 025+ 13.37%

ССИ+25+1» 0.27%

;- С04+25+ 19.46%

3®.

10 С04+

Рис. 3. Распределение СБ25+ субпопуляций СВ4+ т лимфоцитов у больного X., диагноз мезангиопролиферативный гломерулонефрит с изолированным мочевым синдромом.

Наши результаты показывают, что изменения в зависимости от тяжести процесса в почках и активности гломерулонефрита коррелируют с тяжестью изменения лимфоцитов периферической крови. Видно, что пролиферативные формы гломерулонефритов проявляющиеся нефрогическим синдромом имеют более тяжелые изменения, что говорит о более выраженных проявлениях аутоиммунных поражений с системной пролиферацией, и менее благоприятным прогнозом. Также суммируя полученные результаты, можно заключить, что ведущими клетками, определяющими тяжесть и прогноз мезангио-пролиферативного гломерулонефрита, являются Т клеточные регуля-торно-эффекторные субпопуляции. Патогенетически важной является

субпопуляция активированных С08+ Тс лимфоцитов, способная усилить выраженность воспалительного процесса в почках при мезанги-опролиферативном гломерулонефрите. Увеличение их содержания и активности ассоциируется с исходным увеличением субпопуляции СБ4+62Ь- Т хелперов с потенциями переключения иммунных реакций на ТЫ тип регуляции через регуляцию синтеза 1Ь'М-у (рис. 4). Одновременно фактором добавочной стимуляции дифференцировки СБ8+ Тс лимфоцитов может быть снижение тормозного влияния естественных Трег за счет выраженного уменьшения их содержания при мезангиопролиферативном гломерулонефрите с нефротическим синдромом. Степень указанных изменений возрастает по мере утяжеления течения мезангиопролиферативного гломерулонефрита.

Рис. 4. Схема предполагаемого участия субпопуляций Т-лимфоцитов в патогенезе развития хронических форм мезангиопролиферативного гломерулонефрита.

Выводы

1. Абсолютная лимфопения в периферической крови больных мезангиопролиферативным гломерулонефритом была обусловлена снижением Т-лимфоцитарной популяции.

2. Выраженность Т-лимфоцитопении возрастала по мере утяжеления основного заболевания, и сопровождалась прогрессивным снижением уровня СБЗ+4+ Т-лимфоцитарной субпопуляции при присоединении нефротического синдрома.

3. Клеточная субпопуляция С04+25ы+, выполняющая функцию Т-регуляторов аутоиммунных реакций, была снижена у больных мезангиопролиферативным гломерулонефритом с нефротическим синдромом и отражала тяжесть патологическрго процесса.

4. Увеличение содержания СБ4+25Ы+ у больных мезангиопролиферативным гломерулонефритом с изолированным мочевым синдромом связано с реализацией их основной регуляторной, препятствующей прогрессированию аутоиммунного процесса.

5. Оба типа мезангиопролиферативного гломерулонефрита характеризовались значительной степенью активации Т-лимфоцитов, выявленной по маркерам С069+ и НЬА011+, с преимущественной выраженностью у пациентов с заболеванием, осложненным нефротическим синдромом.

6. У больных мезангиопролиферативным гломерулонефритом выявлено, ассоциированное с тяжестью процесса, увеличение диффе-ренцировки С04+ Т-лимфоцитов по пути С04+62Ь- селектин отрицательных клеток с эффекторной активностью.

7. Наличие взаимосвязи между выраженностью основных клинико-лабораторных проявлений и степенью интенсивности лим-фоидной инфильтрации с одной стороны и характером сдвигов в составе Т-лимфоцитов, позволяет нам предположить патогенетическую роль последних в качестве фактора осложняющего первичную патологию у больных хроническими формами мезангиопролиферативного гломерулонефрита.

Практические рекомендации

1. Оценка популяционно-субпопуляционного лимфоцитарного фенотипа у больных мезангиопролиферативным гломерулонефритом позволит судить о возможной тяжести течения нефрита.

2. Снижение субпопуляции Т регуляторных клеток у больных с мезангиопролиферативным нефритом может свидетельствовать о неблагоприятном течении процесса с развитием нефротического синдрома

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ситкина К.В. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови при мезангиопролиферативном гломерулонефрите / К.В. Ситкина, М.И.Хасанова, Т.А.Велижинская // Нефрология и диализ. - М., 2007. - №.3. - С. 360-361 (Тез. докл. V конференции Рос-

сийского диализного общества).

2. Хасанова М.И. Фенотип лимфоцитов периферической крови при отдельных формах гломерулонефрита / М.И.Хасанова, К.В. Ситкина, Т.А. Велижинская // Материалы конгресса: Иммунитет и болезни. - М., 2007. - Т. 7. - С. 98.

3. Ситкина К.В. Взаимосвязь степени выраженности проли-феративных процессов при аутоиммунных гломерулонефритах со степенью активации лимфоцитарных субпопуляций / К.В.Ситкина, М.И. Хасанова, А.П.Цибулькин // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т.2. - №2-3. - С. 238.

4. Ситкина К.В. О динамике активационных маркеров на различных субпопуляциях лимфоцитов у больных с гломерулонефрита-ми / К.В, Ситкина //Материалы Республиканской юбилейной научно-практ. конференции: Актуальные вопросы урологии и нефрологии. -Бугульма, 2008. - С. 91-93.

5. Лимфоидные популяции с цитотоксической эффекторной активностью в патогенезе иммунопатологии почек / М.И.Хасанова, К.В. Ситкина, А.П.Цибулькин, Т.А.Велижинская //Вестник уральской медицинской академической науки. - 2009. - №2/1. - С. 178-180.

6. Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови при мембранознопролиферативном гломеруло-нефрите с нефротическим синдромом / К.В.Ситкина, М.И.Хасанова, А.П. Цибулысин, Т.А. Велижинская // Нефрология и диализ. - М., 2009. - №.4. - С. 333 (Тез. докл. VI конференции Российского диализного общества).

7. Ситкина К.В. Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови при мезангиопролиферативном гломерулонефрите с нефротическим синдромом / К.В.Ситкина, А.П. Цибулькин, М.И. Хасанова, Т.А.Велижинская //Сб. научн. трудов: Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофар-макологии. - Казань, 2009. - С. 389.

8. Ситкина К.В. Состояние лимфоидных субпопуляций с цитотоксической активностью у больных с мезангиопролиферативным гломерулонефритом / К.В. Ситкина, Ш.Р.Галеев // Сб. научн. работ молодых ученых КГМА. - Казань, 2008. - С. 134-136.

9. Цибулькин А.П. Популяции клеток периферической крови как показатель выраженности пролиферативных процессов при иммунопатологии почек / А.П.Цибулькин, К.В.Ситкина, М.И.Хасанова // Сб. научн. трудов: Лабораторная медицина в свете Концепции раз-

вития здравоохранения России до 2010 года. - М., 2009. - С. 350-351.

10. Цибулькин А.П. Фенотип лимфоцитов периферической крови больных гломерулонефритом: клинико-морфофункцио-нальные отношения / А.П.Цибулькин, М.И. Хасанова, К.В. Сит-кина // Иммунология. - 2010. - Т.31. - №1.- С. 34-38.

11. Хасанова М.И. Клинико-морфологические показатели и фенотип циркулирующих лимфоцитов у больных мезангиопро-лиферативным гломерулонефритом / М.И.Хасанова, А.П. Цибулькин, К.В. Ситкина // Каз. мед. журнал. - 2010. - Т91. - №5. - С. 599-603.

12. Хасанова М.И. Фенотипическая характеристика лимфоцитов периферической крови больных мезангипролифератив-ным гломерулонефритом с нефротическим синдромом /М.И. Хасанова, К.В. Ситкина, Т.А.Велижинская // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2/1. - С.214-215.

13. Цибулькин А.П. Особенности субпопуляционных лим-фоидных фенотипов у больных мезангипролиферативным гломерулонефритом с изолированным мочевым синдромом / А.П. Цибулькин, М.И. Хасанова, К.В.Ситкина // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2/1. - С.217-218.

14. Цибулькин А.П. Системная лимфоидная активация как фактор степени выраженности пролиферативных процессов у больных хроническими гломерулонефритами / А.П.Цибулькин, М.И. Хасанова, К.В. Ситкина // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2010. - №2/1. - С.227-229.

15. Фенотип лимфоцитов периферической крови у больных с нефротической формой гломерулонефритов / А.П.Цибулькин, М.И. Хасанова, К.В.Ситкина [и др.] // Сб. научн. трудов: Актуальные вопросы нефрологии и заместительной почечной терапии. — Казань, 2011.-С.119-121.

Подписано в печать 29.12.11 Бумага офсетная. Печать ризографическая. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1,16 Уч.-изд. л. 0,9. Тираж 150 экз. Заказ 179/12

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательства Казанского университета

420008, г. Казань, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел. 233-73-59, 292-65-60