Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Анализ межклеточных взаимодействий ... Т лимфоцитов старых и молодых мышей методом лимитирующих разведений

о л т>

{гггягшрсш) здрлвоохрмшгп и ьзпдаягга

ПРСПЯЗЕ2Ш0СП1 РООСГПСТП СШШРЩЗ

со

роостшэ гоодАРСгшапшп шжшпгстя упг^зсшгт

'ЛПАГЗ НЗППГЗТСЧ11ЦХ Еппндгшшшшс Т ГС1-0ШГТ03 СТАРШ П ШХОШХ опт 15ЕГШЕ1 Л22ШгРУКЦИХ РАЯЩЕЕЯ.

14 00.36 - Аллергология и иимуиогогнл

Автореферат диссертация па соискание ученой степени кандидата кэшшинских наук

сп

На правах рукописи

оо

КАСПЕИГОТО Шагзг£!р Шгштрсгйч

йзсква - 1994

Работа выполнена в Институте биоорганической хиыии им. Ц. U. Шемякина и 10. А. Овчинникова РАЯ

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор И. И Дозморов

Официальные оппоненты: доктор медицииских наук А. Д. Черноусов доктор биологических наук И. В. Мирошниченко

Ведущее учреждение: Институт вакцин и сыворотов им. И. Л Ызчникова

Завита диссертации состоится " " 1995 г.

в 14 часов на заседании Специализированного ученого совета К. 064. 1406 Российского государственного медицинского университета по адресу: 117869, Москва. ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно оанакоксгться в библиотеке Российского государственного аедицинского университета.

Автореферат разослан и " 1995 г.

Учеиьй секретарь Специализированного совета к. и. н., доцент

Т. Е. Кузнецова

- 1 "

(ШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

актуальность тшш пссшрвтш

Проблема возрастного иммунодефицита является одной из наиболее острых в современной иммунологии. Лолгое время снижение иммунного статуса в процессе старения связывали только с возрастной инволюцией тимуса, то есть с. уменьшением общего числа Т лимфоцитов. Однако в дальнейшем было показано, что при старении нарушается и нормальное соотношение между суйпопуляцияки Т клеток: снижается относительное количество Т хелперов и увел, швается число Т супрессоров, что ведет к угнетению Т зависимых иммунных реакций. В последствии, исследования возрастных иаменегчй регуляции иммунного ответа привелй к пониманию в иммунологии старения первостепенной рол;; нарушений качест ,а иммунорегуляции. Возрастные изменения "эегуляторных взаимодействий продемонстрированы на уровне различных субпопуляций лимфоцитов, продуцируемых ими лиыфоки-нов и антител. Наряду с этим, накоплены свидетельства об увеличении относительного члела долгоживуиих Т клеток памяти при старении. Однако, этот пул клеток рассматривается в большинстве.случаев лишь как субпопуляция, обеспечивающая максимально эффективный ии-иунный ответ на антиген, хотя многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о возникновении возрастного иммунодефицита на фоне увеличения общего числа высокоспецифичных клеток памяти. Вопрос же о возможном влиянии этих долгоживущих лимфоцитов на состояние и реагада наивных, высокопотенциалыш клеток пршегя-чески не изучен. Это связано прежде всего с отсутствием методических подходов, -позволяющих вычленить эффекты, обусловленные долгомивушей и наивной клеточными популяциями в процессе их активации. Поэтому разработка'таких подходов и анализ взаимодействий Т клеток памяти и'наивных Т клеток является актуальной задачей, позволяющей не только прояснить механизмы формирования возрастного иммунодефицита, но н выявить новые способы его коррегаш.

Нами показано, что подобный тип взаимодействий можно оценивать, используя модифицированный метод лимитирующих разведений с применением специальной ыагеызтической модели.

ЦШЪ 2!СОЩО£ШШа

Палью санной работы является изучение взаимодействий субпопуляций непримирозанных Т лимфоцитов у старых и молодых мышей мето-

лом лимитирующих разведений.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Оценить взаимосвязь термы нелинейных ¿-образных .зависимостей, выявляющихся при определении частоты клеток-предшественников -.методом лимитирующих разведений, с воарастом экспериментальных животных.

С. Раз работ е.: ь математическую модель взаимодействия Т клеток памяти и наивных Т клеток, культивируемых в условиях лимитирующих разведений.

3. Идентифицировать клеточные субпопуляции, взаимодействие которых приводит к формированию г-обраэкой кривой доза-эффект в ответе на митогея.

а) определить фенот.ш пролиферирующих клеток методами, удаления из клеточной суспензии тех или иных субпопуляций;

б) разделить клетки-ответчики по чувствительности к ионошщи-ну и исследовать КонА ответ для отдельных полученных фракций;

в) показать наличие супрессорных влияний между полученными фракциями клеток.

4. Изучить механизмы взаимодействия субпопуляций, определяющих форму исследуемой кривой доза-эффект.

а) оценить влияние ИЛ-10 на взаимодействие клеток при поиск! добавления в культуры антител к ИЛ-10;

б) показать влияние экзогенного ИЛ-2 на степень супрессоряого эффекта;

в) исследовать форму ЛР-кривой в аутологичной смешанной культуре лимфоцитов без добавления митогена;

г) показать влияние адгезивных клеток на взаимодействие исследуемых популяций 1 лимфоцитов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

- £ результате проведенной работы показано, что нелинейная 2-"бразная зависимость доза-эффект, получаемая в условиях лимитирующих раэведе.чий, является следствием взаимодействия двух непри-мированных субпопуляций Т лимфоцитов. Определен'фенотип этих суб-. популяций.

. В представленной работе установлено. что в формировании пролиферативного ответа на митоген и в аутологичной смешанной

- з -

культуре лимфоцитов участвуют субпрпулянии наивных Т клеток и Т клеток памяти. ¿Показано. что при совместном культивировании Г клетки памяти с/пресс и руга пролиферацию наивных Т клеток, и одним из механизмов этого супрессорного эффекта является синтез Т клетками памяти ЯЛ-10. Этот цитокин снижает синтез ИЛ-2 наивными клетками.

В работе покгзано, что в аутологичной смешанной культуре лим-(Ьошггов на пролиферацию Т клеток памяти влияют адгезивнее клетки, которые при низких дозах супрессируют Т клеточный ответ, а при высоких дозах - стимулируют. Установлено, что влияние адгезивных клеток на Т клетки-предшественники зависит от присутствия в них субпопуляции депдриткых клеток.

Таким образом, впервые с поиопью метода лимитирующих разведе-Н1.Д об^арукено супрессорное влияние Т клеток памяти на наивныэ Т клетки, и выявлены некоторые из механизмов этой супрессии.

ПРД1Ш1ЧЕШК? ЗИАЧЙШВ.

Полученные результаты свидетельствуют о существенной роли долголтупего пула Т клеток памяти в формировании возрастного иммунодефицита. Эти данные дополняют современные представления о, причинах функциональной регрессии иммунной системы в процессе старения. Предложенный методический подход к исследованию взаимодействий двух клеточных популяций с чомощьв метода лимитирующих разведений расширяет экспериментальные воемсжности изучения иммунных реакций непримированных лимфоцитов как у нормальных, так и у иммунодефишгтных организмов. Выявленные механизмы ингибируюдего влияния Г клеток памяти на наивные Т клетки могут являться основой для поисков новых путей и средств икмунокоррекции. направленных на сшюениэ супрессирущего действия долгояивушей популяции Т лимфоцитов.

ДПРСЕШЯ РАЕОШ.

Материалы диссертации додояеш на 8 Мэддународном иммунологическом конгрессе ('Будапешт, 1992), на Интернациональной конференции по регуляции продукции лимфокинсз (Мельбурн, 1993), на Международной иммунологической конференции (Сеул, 1993), на 12 Европейском юлйунологическом конгрессе (Барселона, 1994), на межл&бо-раторной конференции Института биоорганической химии им. ¡1Я Шэ-

- J -

мякина и Kl А. Овчинникова РАН ( Москва, 1994).

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опУбдикоьано т работ.

СТРУКТУРА M ШЬЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литоратуры (глава 1), материалов и методов (глава 2). результатов исследований i глава 3), обсуждения полученных данных ( глааа 4),

выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на_

страницах машинописного текста, содержит _ рисунков. _ таблиц- в приложениям представлено математическое обоснование модели, на основании которой создана компьютерная программа расчета качественных и количественных характеристик взаимодействия субпопуляций клеток на клоныдьном уровне в условиях лимитирующих разведений. Список литературы включает _источников, из которых

_иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Кыш. Использованы самки инбредных линий BALB/c, СВА и гибриды (CBA/J*C57BL/6)Fl в возрасте 2-3 мес. полученные из питомника "Столбовая" (Российская Академия Медицинских Наук), а также старье (24-26 мес.) мыши (CBA/J*C57BL/6)F1 из вивария института Биоорганической Химии им. Шемякина tl)L и Овчинникова Ю. А..

Условий культивирования. Клеточные суспензии были получены из гомогената селезенки. Клетки культивировались при 37°С, 5Z COiB полной питательной сгеде (ПО) на основе RPMI 1640, содержащей 10Х инактивированной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота »Минск), 2 , шМ L-глутамина, 50 мг/мл гентамицина (все из Flo* Laboratories, UK). 5х10*6 M 2-меркаптоэтанола (Sigma Chemical Co. , St. Louis. MO. USA).

Умаление субпопуляций лимфоцитов путей munie trie нт-опос ре диванного цитолиза.

Для удаления из суспензии лимфоцитов субпопуляций клеток, несущих на поверхности ыекбран маркеры Thyl.2 , L3T4+ и Lyt2+, был использован двойной комплемент-опосредованный цитолиз. Спленоциты pecyci.лидировали до концентрации 5x10®/ил в среде RPMI 1640 с ге-

лесом, содержащей рабочее разредение антител к мембранным маркерам. Клетки инкубировали при 4°С в течении 30 мин.. периодически встряхивая. Затем клетки осаждали центрифугированием и ресуспен-дировали в среде, содержащей нетоксичную сыворотку кролика в качестве комплемента в разведении 1:10. Клетки инкубировали при 37°С в течении 45 мин. , периодически осторожно встряхивая, затем осаждали центрифугированием и дважды отмывали средой, содержащей 5Х сыворотки. Жизнеспособность определяли с помощью трипанового синего.

Удаление с $-6 популяций /?+■ лимфоцитов путем двойного пэннинга.

Для удаления из суспензии лимфоцитов, несущих на поверхности мембран рецепторы к le, использовали метод адсорбирования лимфоцитов на поверхности пластика, нагруженного антителами к 1г. Ис-пользсрал:' пэ/лстиролсвые чашки Петри iwjxl5 мм для бактериологических целей (Ленинградский завод медицинских полимеров). В каждую чашку вносили по 8 мл фосфатного буфера (ФБ), содержащего 10 мкг/мл очищенных икмуносорбцией антител к le, и оставляли на ночь при 4°С для адсорбции антител на поверхности пластика. После удаления из раствора непрнлипших антител чаши дважды обмывали ФБ и вносили в кадаую чашу по Б мл ФБ с 0. 2% бычьего сывороточного альбумина (ВСА) (Serva, США) и оставляли на 30 мин. при комнатной температуре для снижения неспецифической сорбции клеток. Однократно обмывали чаша 10 мл ФБ и вносили в каждую чашку по 2х10т клеток, суспендированных в 4 мл ФБ с 0.2Z БСА. Инкубировали 45 мин. при 4еС. По истечении половины срока инкубации содержимое чашек .осторожно перемешивали круговым движением. Неприлипшие клетки ресуспендировади лёгким круговым движением и сливали. 11эн-нинг проводили дважды.

Разделе/я® наивный Т клеток и Т клеток памяти в градиенте Плотности перко ла.

Выделение проводили согласно методике, описанной ранее. Т клетки, в концентрации 20-80x10* клеток/мл инкубировали в RPMI 1640 с 2 мкМ нономишна (Calbiochem, La Jolla, СА) 20 минут при 37®С. 1 мл этой клеточной суспензии разделяли с помощью центрифугирования 13100 об./мин.., 10 мин. яри 24°С) в градиенте плотности

- б -

перкола i концентрация перкола 50%. 60S. 70Z, BOX и 90Z; 1 мл на ступень градиента). Каждая ступень.градиента содержала изотонический соленой раствор с 2 мкМ иономишна. Клетки собирали из лн-терфаз, трижды отмывали в ФВ. Содержание Thyl .2+ клеток во фракциях оценивали с помощью проточного цитсфлуориметра EPICC-Elite (Coultronlcs, France). В экспериментах использовались пулирован-ные фракции <150-60, содержащие наивные Т. клетки, и С80-90, содержащие Т клетки памяти. При совместном культивировали« клеток фракций 060-60 и 390-80 пролиферация оценивалась с помощью включения ЩТ (Sigma).

Выделение адгезивных клеток.

Тимошты или спленошты культивировали в чашках Петри. 1 чао при 37°С в среде RPMI 1640. После удаления неприлипших клеток в чашки добавляли по 5 мл ФБ Сеэ кальция и магния и культивировали 15 мин. при 37°С. Адгезивные клетки удаляли с поверхности пластика мягкой резиновой трубочкой и отмывали дважды средой RPMI 1640. Полученные адгезивные клетки облучали дозой 2000 рад и использовали в экспериментах в качестве стимуляторов.

Выделение дендритных клеток

.Процесс выделения проводили по методике, описанной ранее. Селезенки мышей разрезали на небольшие фрагменты, трижды отмывали в ФБ с гепесом и 57. инактивированной сывороткой плода коровы для удаления больших и малых фрагментов стромы. После этого обрабатывали коллагеназой <1 мг/мд, Boshrlnger-Mannhelm, West Gerreiny), а затем ЭДТА для освобождения максимального количества дендритных клеток. Клетки с малой плотностью выделяли центрифугированием в среде с медаэамином. Полученные клетки с малой плотностью'обра-' батывали смесью моноклональных антител, покрывающих недендритные клетки, которые затем удаляли с помощью покрытых антителами к 1к парамагнитных бус. Смесь используемых антител представляла собой титрованные концентрации следующих моноклональных антител: ан-th-CD3, КТ-1.1; анти-С04, GK-1.5; анти-Thyl. 2, 30-Н12; ан-ти-JL-2R3, РС61; анти-Qr-l, RB6BC5; анти-Мас -la. М1/70.15; анти-макрофагальный F4/80 антиген, F4/80; анти-БАЗбБ2; антиэритроид, TER119; анти-FcR 11, 2.402. Чистота выделения дендритных клеток

равнялась 60-80Х. что бьшо показано иммунооерментным окрашиванием с анти-класс II ГКГ и N418 моноклональными антителами и проточной штометрией.

Метол лииитирукаих разведений.

а) поликдоналъная акгив&цт

Предшественники митоген-активированных пролиферирующих клеток исследовались методом, предложенным Chen с соавторами (1982) и дополненным Miller (1984). Отвечающие клетки были использованы от молодых (3 мес) и старых (24-26 мес) мышей (CBA/J*C57BL/6)F1. Наддая микрокультура содержала о. 5х104облученных (2000 рад) син-генньх >спленоиитов молодой мили, 3 мкг/мл Кон А, ПС с 37. суперна-танта КонА-стимулированкых крысинных спленоиитов и различное число отвечающих клеток. Клеткк инкубировались 5-8 суток (37"С, 5 X CQi) обьемои 200 мкл в 06-луночных планшетах. Пролиферация оценивалась по включению [ЗШтимидина .который был внесен ь пробы ва 18 часов до окончания культивирования (0.5 мкКю в пробу). "Позитивными" считались пробы , имеющие оптическую плотность выше, чем сумма среднего Фонового значения и трех стандартных отклонений. За фоновые значения брали микрокультуры, содержащие только фидер- ■ ные клетки.

б) аутоззогтная смешанная культура лимфоцитов

Микрокультуры содержали различное число отвечающих клеток (24

пробы для каждого разведения), 105облученных С2000 рад) скнгенных фидерных клеток и 5% крысиного КонА-супернатанта, как источник IL-2. Клетки были культивированы в обшзм объеме 200 мкл в 9б-лу-ночных панелях в течении Б. суток при 37*0. 5% СО,. После культивирования определялось включение СЗГОтимидина.

Математическая обработка, результатов.

Вычисления проводились согласно методу описаному ранее (Fazekas de Groth,-1982) и включали в себя определение: 'уравнения регрессии методом максимального правдоподобия, уровня линейности, соответствия полученных зависимостей распределению Пуассона и, как следствие, определение частоты клеток-предшественников с 95% доверительными интервалами.

Колориметрический метод определения пролиферирующх клеток,.. После завершения культивирования 10 мкл 5мг/мл раствора МГТ' (Sitcma) в ФБ было добавлено в микрокультуры, которые после этого инкубировались 4-6 часов (37*0, 57. C0t). Затем планшеты ценгрифу-

тировались (5 мин. 200g), супернатаят удалялся, и к осажденным клеткам добавлялось 100 мкл ДМСО. После растворения кристаллов фармазаьа измерялась оптическая плотность при 540 ни , , используя прибор Titertek Multiskan МС (Flow'Laboratories).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Предмегом данной работы являлось изучение взаимодействий между Функциональными субпопуляциями Т лимфоцитов из селезенки неп-римированных молодых и старых мывей линий СБА, Balb/c и гибридов ICBA/J*CS7BL/6)F1.

С помощью метода лимитирующих разведений i ЛР) оценивали частоту пролиферации функционально различных клеток-предвественников по числу активных клонов. Нами бьш получены линейные зависимости логарифма неотвечающих лунок от концентрации клеток-ответчиков iJIP-кривая) для клеток, выделенных из селезенки юлодых шеей. В отличие от этого, для спленоцитов старых мышей в сходных условиях культивирования были обнаружены нелинейные ЛР-кривые Z-обравного типа, что характерно дал процессов, в которых участвуют 2-3 субпопуляции клеток. Показано, что появление нелинейности несет в себе дополнительную информацию о клеточных взаимодействиях, ток как отражает процессы 'регуляции развития иммунного ответа на уровне единичных клеток.

2-образные зависимости обычно объясняют наличием трех различных субпопуляций с противоположными взаимоисключающими активностями. Считается, что первый участок Z-образной кривой с негатив-' ным наклоном является результатом пролиферации клеток предшественников, чувствительных к действию сулреосоров. .Последние обуславливают снижение числа Отвечающих лунок на участок« с позитивным наклоном, второй участок с негативным наклоном - результат пролиферации предшественников, резистентных к действию супрессоров. Недавно показано, что Z-образная кривая при галогенной стимуляции может описываться взаимодействием только двух субпопуляций Т клеток с хеллерньш фенотипом. В атом случае сулресси-рующее влияние может осуществляться черев растворимые факторы, вырабатываемые самими Т хелперами, например, за счет продукции интерферона-гамма, подавляющего пролиферацию Т хелперов 2. В наших экспериментах с поликяокадьной активацией клеток Z-образные

- о -

ЛР-кривые бьши характерны для спленоштов старых мышей, что наводит на мысль о возрастном накоплении в Т клеточном нуле 'двух функционально отличных популяций лимфоцитов. Ка основе этого предположения была построена математическая модель, позволяющая оценивать частоты клеток-прэдшестзенников. С помощью такого подхода был выявлен фенотип двух функционально разнородных .-популяций Т клеток и исследованы механизмы их взаимодействия.

1. Особенности пролиферахчвных лр-кривых спленоцитов старых млаей при кнтогенкой стимуляции.

Основная часть экспериментов была проведена с митоген-активированными спленоцитоми молодых и старых мышей. Используемая экспериментальная модель позволила выявить нелинейность ЛР-кривой для спленоцитов старых мышей, в то время как спленоциты молодых диеотных характеризовалась линейной ЛР-зависимсстью, что указывает на их функциональную однородность (Рис. 1А). Мы предположили, что полученная для старь»: мышей г-обрззная ЛР-кривая является ре-вультатом взаимодействия двух субпопуляций предшественников про-лиферирующих клеток (ПК1 и ПК2). Субпопуляция ПК1 характеризуется высокой пролиферативной активностью и имеет одноударную кинетику, в то время как субпопуляшя ПК2 содержит клетки с низкой пролиферативной активностью, которые способны супрессировать клетки ПК1 в совместных культурах. С помошью математической модели Ыт рас-читаны частоты ГШ и и их индивидуальные активности. Анализируя полученные результаты, мы пришли к выводу, что субпопуляция ПК1 старых спленоцитов функционально тождественна митоген-активированным спленоцитам молодых мышей, в то время как клетки ПК2 выявляются лишь в Т клеточном пуле старых мышей.

Для субпопуляции ЛК2 характерна мультиударная кинетика, поэтому мы предположили, что при изменении условий культивирования модно более четко оценивать разницу между иролифеоацией двух исследуемых популяций. Из рисунка 2 видно, что уменьшение сроков культивирования до 4 суток приводит к усилению нелинейности и. наоборот, увеличение сроков культивирования до 8 суток приводит к спрямлению ЛР-кривой. Это связано, по-видимому, с тем, что клетки 'субпопуляции ПК2 в силу мультиударности своей кинетики не способны за короткий срок культивирования произвести достаточное количество потомков, чтобы эти микрокультуры регистрировались как по-

О 100 200 300 400

Рис. 1 Анализ пролиферации ыитоген-активированнш: спленоцитов, выделенных из молодых (Зшс. )(о) и старых (24мес.)(«) швай (CBA/J*C57B1/6)F1 с помощью метода лимит ируиаих разведений. Для каждой клеточной концентрации использовались 72 пробы.

tl« «AU V« tMtif tAtramnmfri ( iмш / «immA WWM Ai riVil4VUi|AAmMI l, 1ЦМ / IHbJf f

По оси Y: доля отрицательных лунок (отаед.)

ложительнке. При увеличении сроков культивирования количество потомков ПК2 клеток возрастает, и микрокультуры становятся позитивными.

2. Оокоткп пралиферкруетэя шюток, огветстЕщшда &а формирование Z-обрагшък кривых у старых t&esaS.

Удаление комплемент-опосредованным цитотоксическим лизисом Thyl,2+ или L3T4+ субпопуляций приводило к полной отмене пролиферации лимфоцитов С Рис. ЗА), а удаление Lyt2+ субпопуляции не вди-

о 200 400 600 600 тоо 200 300 400

Рис.2 Экспериментальные ЛР-кривые пролиферации спленоцитов старых мьгай (СВА/,1*С67В1/6Ш в ответ на КонА при 4-Б (А) и при 6-8 (В) сутках культивирования.

Ш оси X концентрация (кл. /лунку)

По-оси У: доля отрицательных лукок (отн.ед.)

яло на форму ЛР-кривой (Рис. ЗВ). Анализ пролиферации 1&- клеток, выделенных с помощью пеннинга, выявил сдвиг ЛР-кривой влево без изменения ее формы, что происходит, по всей •видимости, за счет увеличения удельного содержания отвечающие клеток среди спленоцитов после обработки.

Таким образом, обе субпопуляции про лифе рируюшх клеток имеют фенотип ТЬу1,2+» 1314+, Ьуи-, ¡8-, что указывает на их принадлежность к Т хелперам.

3. Различия прожфэраташгоЛ актквшети наивных Т клэтоп и Т ккяш памяти п отеэт 1а ютогоннуи стимуляция.

Учитывая тот Факт, что нелинейность ЛР-кривой характерна для пролиферативного ответа старых спленоцитов, мы предположили, что субпопуляции Ш1 и ПК2 могут являться наивными Т клетками и Т клетками памяти соответственно. Для проверки этой гипотезы мы разделили в градиенте плотности перкола с иономицином Т клетки

Рис.3 Анализ пролиф?рации спленоцитов старьсс шзей (СВА/,1*С57В1/6)Р1 в ответ на КонА метолом лимитирухшх разведений. А) Пролиферация неразделенной популяции спленоцитов (в) и ТЬу1-(А). ЬЗТ4-(°) субпопуляций, выделенных комплемент-зависимым цитолизом. В) Пролиферация популяции Ее разделенных спленоцитов (•). субпопуляции, такхе выделенной цитоли-

зом (о) и Iвг- субпопуляции, подученной после удаления 1к+ клеток пеннингоы (*).

По оси X концентрация (кл./лунку)

По оси У: доля отрицательных лунок (отн, ел.)

старых мышей по- чувствительности к кальцию на две фракции: 390-80, содержащую кальций-чувствительные Т лимфоциты, и 160-60 с кальций-резистентными клетками. Известно, что фракция 460-80 включает клеточные популяции с фенотипом ТТ|у1,2+, ЬЗТ4+,- Ргр-1-, С045НА+В+, которые имеют функциональные свойства наивных Т клеток. В отличии от этого, фракция 460-60 содержит ТЬу1,2+, ЦЗТ4+-, Рер-1+, С045К> клетки, слабо отвечающие на митоген и сильно реагирующие на антигенную стимуляцию. Фенотип и функциональные свой-

ства указывают на принадлежность клеток «60-60 к Т клеткам памяти.

Разделив спленоциты на Фракции ДОО-вО и £60-60. мы исследовали их пролиферагивну» активность с помощью метода ЛР. Для клеток фракции <Ю0-80 ЛР-кривые не отличались от распределения Пуассона, что указывает на одноударную кинетику (Рис. 4А). И наоборот, ЛР-кривые для клеток фракции <160-60 были нелинейными, что является следствием мультиударности процесса. Когда же клетки обеих фракций смешивались в пропорции 1:1. Сила получена Z-образ-ная кривая, аналогичная ЛР-кривым, которые были характерны для экспериментов с неразделенными спленоцитами (Рис. 4В).

Взаимодействие Ф90-8О и Í60-60 клеток можно также выявить в другой экспериментальной модели (Рис. 4С). Во все микрокультуры, кроме контрольных, было добавлено по 100 клеток иа фракции <Ю0-80 н различное количество клеток из фракции <260-60. Наблюдалось уменьшение пролиферации в лунках с 25-100 клетками ФбО-бО, что указывает на супрессорное влияние этих клеток на клетки фракции ФЭ0-80; и усиление пролиферации при 100-200 460-60 меток, что, очевидно, связано с собственной пролиферацией кальций-ре.зистент-лых клеток.

4. Шхшшзмы пза1~оЕойстшгэ наивных Т клоток к Т гслотвд

гаютн.

Предполагая, что Z-образная кривая в нашей экспериментальной системе является результатом взаимодействия наивных Т клеток и Т клеток памяти, мы попытались выявить механизмы этих взаимодействий.

Известно, что Т клетки памяти синтезируют относительно высокий уровень ИЛ-10, и способность этих клеток синтезировать ИЛ-10 увеличивается с возрастом. Кроме того, недавно показан ингибирую-ций эффект ИЛ-10-на клеточную пролиферацию. Исходя из этого, мы предположили, что ЮМ0 может являться одним из сунрессорных факторов при взаимодействии наивных Т клеток и Т клеток памяти. Добавление антител к ИЛ-10 (SXC-1) в лунки, где cOé Т клеточные популяции культивировались совместно, привело к ослаблению супрессорного эффекта (Рис. 5). Аналогичные результаты были получены в другой экспериментальной системе (Рис. 6). К 5000 клеток из суб-популяшш Í90-80 было добавлено одинаковое количество сингенных

О К9 400 МО

Рис. 4 ЛР-Елгипл ¡трСш^рацпЯ фракций клеток старых ыьсгп, выделенных б помощью центрифугирования в градиенте плотности перкола с иономишшом. А) Пролиферация фракшш С90-80 (о) и «50-60 (« ). В) Пролиферация сшск клеток «¡90-80 и 460-60 в соотношении 1:1

Пэ оси X: концентрация (кл. /лунку) Ш оси У: доля отрицательных лунок (отн. ед.) . С) ЛР-кривая при культивировании постоянного количества клеток «90-80 (пунктирная линия) и различных концентраций клеток 460-60 (в).

По оси X концентрация клеток 860-60( кл. /лунку) По оси У: доля отрицательных лунок (отн. ед.)

О 100 200 300 400

Рис. 6 ЛР-анализ пролиферации 400 клеток фракции 090-60 и различного количества клеток 46060 с добавлением антител к ШЫО («) и бее антител (о). 5

По оси X концентрация клеток Ф60-60(кл./лунку) По оси У: доля отрицательных лунок 1отн.ед.)

фидерных клеток и различное ' количество клеток из суСпоиуляцин ■ИЗО-бО. После 3 суток мотивирования оценивалась пролиферация клоток в культурах колориметрическим методом с использованием МГТ. Каждое значение оптической плотности (ОП) определялось сле-дуюишм образом:

ОП - 011 опыта - ОП контроля, где ОП опыта - среднее вначен^е оптической плотности для культур с Фидерными клетками, постоянным количеством (5000) клеток 290-80 и различными концентрациями клеток $60-60;

Щ контроля - .среднее значение оптической плотности для культур с фидерными клетками и различными концентрациями №0-60 клеток.

Из рисунка 6 видно, что .увеличение концентрации вносимых «60-60 клеток приводило к резкому уменьшению ОП. Такой эффект, по всей видимости, являлся следствием сулрессорного влияния Т клеток памяти на наивные Т клетки при совместном культивировании. Однако, добавление в культура антител к ИЛ-10 приводило к .ослаблению супрессорного эффекта, что наблюдалось и ран^е. в системе ЛР. Ш показали, что кроме антител к ИЛ-10 супрессорное влияние клеток фракции 560-60 на клетки ая фракции С80-Р0 в значительной степени ослабляет добавление в культуры рекомбияантного ИЛ--2. Возможно, одним из механизмов уменьшения Т клеточной пролибрации является ингибирование ИЛ-10 процесса синтеза ИЛ-2. Такие данные уже опубликованы недавно в зарубежной печати.

В следующей серии экспериментов мы показали, что если отменить пролиферацию клеток $50-50 с помаа-в ЗЗ-кинугиоЯ инкубации е митоммцином С, то величина супрессорного эффекта не изменяется (Рис. 7). При такой обработке в клетках блокируется синтез ДНК. однако, не изменяется продукция лимфокишэв. Зсли же полностью инактивировать клетки 360-60 обработкой 0. IX раствором парафор-мальдегида, супрессия не выявляется.

Исследуемые нами особенности во взаимодействии Т клеточных субпопуляций оказались характерными не только для мигогеиной активации. Для аутологичной сме: гнной культуры лимфоцитов (СКЛ) без добавления КонА, но е присутствии 5% ИЛ-2-содержащего надосадка стимулированных митогеном крысиных спленоцитов, была получена

Рис. б Анализ прошфэреднн 6000 клеток фракции Ф90-60 к различного гсолнчвотва клэток Œ60-60 бе а добавления экзогенных еэезста (®), о добаалгккэи антител к ШЫО (а), о добавлением рэкоыблнантиого ИЛ-2 (а).

По ос» £ концентрация клзгок £60-60 (кл /лунку) По оси Y: оптичэская плотность ( отн. ед. )

Рис. 7 Анализ пролиферации БООО клеток фракции СЭ0-80 в различного количества предварительно цзобработ&шщх клеток $50-60(о^а'такхв посла обработки последних шгошщиноы С (л ) или параформальдегидоы (•).

По оси X концентрация клеток 260-60 (кл. /лунку) По оси У: оптическая плотность Сотшед.)

0.7 х-

Рис. 8 Ашшэ пролЕфэрадаз сплэцощггов старых югай о ауто-логичной скапаяной культуре диыфоцнтов.

№ оси X ко яда нт радия (кл. /лунку)

По оои У: доля отрицательных лунок (отн. од.)

г-оОрааная кривая в координатах метода . дишшфугаих разведений (Рис.8). Ш предположит, что шханизкы формирования этой кривой являются аналогичными взаимодействию двух клеточных популяций При ответе на митоген: нативных Т клеток и Т клеток памяти.

0 0.7 3 12 50 200 (*103)

Рис. 9 Регуляторное влияние сннгеншл адгеепвнъа клеток се- . лэаевки на пролиферацию 1 лмгфоцитов-ответчиков, добавданнш в ' ыикрокудьтуры в одинаковой конц&нтрадаи (¿00 кв. /лунку). Пут-7ирной линией покаваза прол^ораща Т кдэток без добавлэшк адгевивнщ клеток.

По оси К концентрация сингенных адгевивних клэтокс кд. /лунку) По оси У: доля отрицательных лунок (отн.ед.)

& Влкшиет адгезивных кл&тга на Т клэточгоо Езакаадайвиза Известно, что в смешанной культуре лимфоцитов пролиферация Т клеток зависит от адгевивных клеток (АК), которые способны оказывать как стимулирующая, т„к и супрессируювве действие. Чтобы оценить влияние АК на пролиферацию Т клеток памяти, ш добавляли различные концентрации АК в культуры, содержащие постоянное количество Т клеток (Рис. 9). Количество Т плеток было выбрано 4С0

1.0

0.1 •

0.041

О 0.25 0.5 1.0 «103

¡с. 10 Регуляторам ашшгсэ сингвкнш: депдр.лшх клеток селению на прод!!фэра1рш Т лимфоцитов-ответчиков С4£Ю кл. /лунку). шгсгирноЯ л}шшП* показана прслкфэрацна Т лзмфоштш Сев дошла кия дендритных шэтск.

) оси X: концзитращя сппгвппых дапдритшд ксэтогсС to. /лунку> ) оси У: доля отрицзтехыап лунок (оти. ед.)

веток в лунке, что соответствовало такш концоотрашсш, при ко-эрых проявлялся ЭффЗИТ второй суопопуляции, фунвдшнашго ТОЙ" зственной Т клетюш памяти. Alt обрабатывали шпгадщшюа С, . что зюшчало возможность их собственной пролиферации. Полученные ре-ультаты показали, что ш:зк:з концэнтг шил ЛК приводили к уьэнь-знию количества поаитганьк швфо культур, в то вре»л как усиление йфекта наблшаюсь при больше: лозах АК.

Идя того, чтобы выяснить какие клетки оказывают регуляторно* влияние на Т клеточную пролиферацию, мы применили в качестве стимулирующих клет. с в аутологичной ОКЛ еысоко обогашенную дендрит' нымч клетками IДК) клеточную популяц..л В используемых фракция: концентрация дендритных клеток достигала 60-80Х. Было показано что "оолифератмвный ответ 7 клеток в присутствии сингенных Я принципиально не отличался от ответа на сингенные АК (Рис. <10) Э"-) указывает на то. что именно Ж оказывают регуляторное влияни на пролиферацию Т клеток.

ВШГДЦ

1. Показано, что пролиферативный ответ спленоцитов старых ш шей на мктсгенную стимуляции в условиях лимитирующих разведенк характеризуется нелинейной аависиыостью доза-эффект (ЛР-кривой) Для сп'еноцитов юлодых мышей подучена линейная зависимость до за-зффект.

2. Установлено, что нелинейность Л?-кривой является следст вием взаимодействия двух популяций клеток с фенотипом ТЬу1,2+ ЬЗТ4+, 1.уЬ2-, ¡е-, причем первыми эффекторами, пролифэрируюша: при низких концентрациях клеток, являются наивнкэ Т клетки, I вторыми зффектораш. лролиферируыюши при высоких гюацэнтрашш клеток, являются Т клетки памяти.

а Обнаружено, что Т клетки лашти способны супрессироват: наивные 7 клетки, и одним из механизмов этой супрессии являете: продукция Т клетками памяти ИЛ-10.

4. ¡[¡сказано, -что адгезивные клетки (АК) при низких концэнт рациях способны ингибировать пролифаращга Т клеток паияти, а пр высоких ¡гондантрациях - стимулировать их, причем это связано присутствием дендритних клэток в исследуемой популяшш АК.

- 23 -

отита РАБОТ. ОПУБЛШЕШВШХ ПО таз ШХЕРТАЦГ'.

1. Калиниченко КВ.. Калиниченко Т.Е. Свирюевская Е. В. и loswopoB Я IL. Регуляторов влияние ленлритных клеток в смешанной ■сультурс лимфогггов. Иммунология, 1995, ИЗ, стр. 25-28.

2. I. М. Dozmorov, V. V. Kalinichenko, I. A. Sldorov and f?. A. Miller. Antagonistic Interactions anon? T cell subsets of old mice revealed by Umitinj dilution analysis. Journal of Immunology, 1995, V. 154, N 10, p. 4903-49ia

3. I. Dozmorov, Y. Kalinichenko, Gi Suss and K.Sbortman. Raffulacorv cellular interactions in the primary mixed lymphocyte reaction. Immunol. Lett., 1995, V. 44, N 3, p. 19?-203.

4. A. Sapozhnikov, V. Kalinichenko, I. Dozmorov. In vitro

ant laren-immune bone marrow cells interaction. 8th International Congress of 1ш1,аП01сигу. Budapest, 1992. Abstract book, 14-36.

5. I. It Dozrorov, V. V. Kalinichenko, I. A. Sldorov. Tha investigation of T cell regulatory interactions at the clonal level. Int. Consrress on the Regulation Leukocyte Production and Itrauns Function. Ifelburn, 1S93. Abstract book, 342A.

6. I. Dozmorov, V. Kalinichenko, I. Sldorov, 0. Suss and ICShortman. Regulatory influence of dendritic cells on tha primary mixed lymphocyte reactioa Int. Immunol. Meet., Soul, 1993v Abstract book, 83.

7. 1. Dozmorov, V. Kalinichenko, I Sldorov, 3. Suss end K.5hortman. Functional heterogeneity of dendritic cells аз accessory cells for T lyrphocvte proliferation in vitro. 12th European Immunology Meeting, Barcelona, 1994. Abstract book, p. 53.

yfa'ctoif инояктепьиой техники Of® РАМН

ш , ' ™ I I ■■ I ■ ......

ссдп. к печлтЦ 41A95" тира» ЮОлик