Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Остеопротективное действие эналаприла и лозартана при экспериментальном остеопорозе и переломах на его фоне

На правах рукописи

Гудырев Олег Сергеевич

ОСТЕОПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭНАЛАПРИЛА И ЛОЗАРТАНА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОСТЕОПОРОЗЕ И ПЕРЕЛОМАХ НА ЕГО ФОНЕ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

* Г С Г ГТ

Курск-2008

003458760

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович доктор медицинских наук, профессор Дубровин Григорий Менделевич

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Резников Константин Михайлович кандидат медицинских наук Корнеев Марат Маулудович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится « Л » Р^РсИ? 2009 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан « 23 » <^<?ксу£ р^) 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашин Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. «Остеопороз (ОП) - системное заболевание скелета, характеризующееся снижением массы кости в единице объема и нарушением микроархитекгоники костной ткани, приводящими к увеличению хрупкости костей и высокому риску их переломов». Данное определение ОП было сформулировано,на международных конференциях в Копенгагене (1990) и Гонконге (1993) и в настоящее время является общепринятым.

В основе развития остеопороза лежит дисбаланс между двумя основными процессами костного ремоделирования: костной резорбцией и костеобразованием (Насонов E.JI., 1998; Беневоленская Л.И., 2003). Важным звеном в патогенезе остеопороза является снижение кровоснабжения кости (Alagiakrishnan К., 2003), приводящее к торможению активности и уменьшению количества остеобластов, а также к усиленной деятельности остеокластов.

ОП занимает четвертое место по значимости вслед за сердечнососудистыми, онкологическими заболеваниями и сахарным диабетом (Дедов И.И., 2002). Поэтому ВОЗ провозгласила первое десятилетие XXI века «Декадой костей и суставов».

Однако статистические данные свидетельствуют не только о росте заболеваемости ОП, но и о неуклонном увеличении числа его осложнений -остеопоротических переломов (Михайлов Е.Е., 1999). По прогнозам экспертов, к 2050 году в мире частота одних только переломов шейки бедра, связанных с ОП, возрастет с 1,7 млн. до 6,3 млн. случаев в год (по данным «Osteoporosis in the European Community»).

Для успешной консолидации перелома также большое значение имеет васкуляризация костных отломков (Burkhardt R., 1987; Alagiakrishnan К., 2003). Чем значительнее нарушение кровоснабжения отломков, тем условия для сращения перелома менее благоприятны и тем медленнее протекают процессы репаративной регенерации кости.

Значительную роль в поддержании процессов костного ремоделирования, а также репаративной регенерации костной ткани играет кровоснабжение кости. Остеопоротические переломы, возникая на фоне структурных, количественных и качественных изменений в костной ткани, требуют иных подходов к лечению, чем повреждения костей у здоровых лиц. Как известно, строение микроциркуляторного русла костной ткани существенно отличается от морфологии сосудистого русла остальных тканей организма. Костные микрососуды имеют только эндотелий и не имеют мышечного и соединительнотканого слоев. Таким образом, именно эндотелий опосредует всю гуморальную регуляцию обмена между остеобластами, остеокластами и кровью.

В то же время в доступной литературе мы не нашли сведений о том, чтобы кто-либо использовал эндотелий костных сосудов как мишень фармакологического воздействия при остеопорозе и переломах на его фоне.

В условиях повреждения тканей активируются процессы неоангиогенеза. Одним из основных условий для нормального протекания ангиогенеза является повышение проницаемости эндотелия, что преимущественно связывают с

действием оксида азота (N0) (Брошусь В.В., 2003; Грибкова И.В., 2002; Napoli С., 2001). Главным механизмом регуляции процессов неоангиогенеза является высвобождение ангиогенных факторов, источником которых могут быть эндотелиальные, тучные клетки, макрофаги и другие клетки. Под действием ангиогенных факторов происходит активация эндотелиоцитов и миграция их за пределы базальной мембраны с формированием ответвлений основных сосудов (Шляхто Е.В., 2002; Kureishi Y., 2000).

Таким образом, одной из причин ухудшения регионарного кровоснабжения является эндотелиальная дисфункция (ЭД) (Мартынов А.И., 2005; Небиеридзе Д.В., 2004; Шестакова М.В., 2001), которая посредством негативного влияния на микроциркуляцию может приводить к нарушению процессов остеогенеза и остеорепарации, вызывая тем самым ряд остеологических заболеваний, в том числе и остеопороз.

Увеличение частоты остеопороза и его осложнений показывает, что в настоящее время нет надежных методов медикаментозного лечения и профилактики этого заболевания. В современной патогенетической терапии остеопороза не уделяется должного внимания препаратам, обладающим положительным влиянием на кровоснабжение костной ткани. Это указывает на актуальность исследования остеопротективного действия препаратов с доказанными положительными эндотелиотропными эффектами.

Номер государственной регистрации темы - 01.2.007 05271.

Цель исследования. Провести оценку остеопротективного действия эналаприла и лозартана и их влияния на процессы репаративной регенерации костной ткани при переломах проксимального метафиза бедренной кости на модели остеопороза, вызванного билатеральной овариэктомией.

Задачи исследования:

1. Оценить развитие экспериментального генерализованного остеопороза при билатеральной овариэктомии в эксперименте с использованием результатов измерения микроциркуляцни в костной ткани, функциональных сосудистых проб и гистоморфометрического исследования.

2. Изучить остеопротективное действие ингибитора АПФ эналаприла на модели билатеральной овариэктомии.

3. Изучить остеопротективное действие блокатора АТ1-рецепторов лозартана на модели билатеральной овариэктомии.

4. Оценить качество репаративных процессов в костной ткани при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального метафиза бедренной кости с использованием результатов измерения микроциркуляции в межотломковой зоне и рентгенологического исследования.

5. Изучить влияние ингибитора АПФ эналаприла на качество репаративных процессов при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального метафиза бедренной кости.

6. Изучить влияние блокатора ATI-рецепторов лозартана на качество репаративных процессов при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального метафиза бедренной кости.

Научная новизна исследования. В работе впервые показано, что через восемь недель после билатеральной овариэктомии развивающийся генерализованный остеопороз характеризуется значительным снижением уровня микроциркуляции в проксимальном метафизе бедренной кости, отрицательной динамикой морфологических показателей, наличием тесной прямой зависимости между величиной кровоснабжения кости и шириной костных трабекул в ней.

Кроме того, обнаруживаются изменения соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиалыюй дисфункции (КЭД), рассчитанного по результатам лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) в костной ткани.

Впервые продемонстрировано, что эналаприл и лозартан, вводимые в дозах 0,5 мг/кг и б мг/кг соответственно крысам ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в течение восьми недель после билатеральной овариэктомии, обладая эндотелиопротективным действием, эффективно предотвращали снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани. Тем самым изучаемые препараты способствовали замедлению истончения костных трабекул в губчатой костной ткани и предотвращению возникновения микропереломов трабекул, то есть обладали остеопротективным действием. Достоверно более выраженным действием обладал лозартан.

Было обнаружено, что консолидация экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости через двенадцать недель после билатеральной овариэктомии протекает на фоне снижения кровоснабжения зоны перелома по сравнению с переломами бедра у крыс без остеопороза.

Впервые показано, что эналаприл и лозартан, вводимые в дозах 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно крысам ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в течение восьми недель после билатеральной овариэктомии и еще в течение четырех недель после моделирования и остеосинтеза перелома, увеличивали показатели микроциркуляции в межотломковой зоне проксимального метафиза бедренной кости выше таковых у крыс с переломами бедра без остеопороза. Достоверно более выраженным воздействием на уровень кровотока в зоне перелома обладал лозартан. Оба исследуемых препарата статистически значимо увеличивали частоту сращения экспериментальных остеопоротических переломов.

Научная новизна подтверждается получением двух патентов РФ, двумя заявками на получение патентов РФ и двумя рационализаторскими предложениями.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность применения ингибитора АПФ эналаприла и блокатора АТ1-рецепторов лозартана для коррекции остеопоротических изменений костей скелета, а также для улучшения качества консолидации переломов при генерализованном остеопорозе. В эксперименте доказано, что использование исследуемых препаратов позволяет нормализовать изменения соотношений сосудистых

реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), предотвратить уменьшение кровоснабжения костной ткани при остеопорозе и остеопоротических переломах, а также добиться замедления отрицательной динамики морфометрических показателей кости и значительно увеличить количество ' положительных результатов сращения переломов на фоне остеопороза.

Результаты исследования позволяют рекомендовать проведение целенаправленных клинических испытаний эналаприла и лозартана при системном остеопорозе, а также остеопоротических переломах костей скелета.

Внедрение результатов исследования. Материалы диссертационного исследования, касающиеся остеопротективной активности эналаприла и лозартана, а также положительного влияния указанных препаратов на качество сращения переломов костей скелета при системном остеопорозе, используются в лекционных курсах кафедр фармакологии и травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии КГМУ.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены на 72 итоговой межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2007), заседании Курского регионального отделения ассоциации травматологов-ортопедов России (Курск, 2007), VI Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям)» (Ярославль, 2007), конференции «Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов» (Курск, 2008), II Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2008), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008).

Апробация диссертации проведена на межкафедральной научно-практической конференции кафедр фармакологии, травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 2, гистологии, цитологии и эмбриологии, анатомии, НИИ Экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе две из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, выносимые на защиту:

1. Через восемь недель после билатеральной овариэкгомии у самок крыс линии Вистар развивается нарушение функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани, сопровождающееся увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного по результатам лазерной допплеровской флоуметрии в кости. Как следствие, значительно ухудшается кровоснабжение костной ткани, что приводит к развитию генерализованного остеопороза, проявляющегося истончением и микропереломами костных трабекул.

2. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг на модели билатеральной овариэктомии имеют выраженное эндотелиопротективное действие, снижая коэффициент эндотелиапьной дисфункции до уровня интактных животных; предотвращают снижение уровня микроциркуляции в костной ткани бедра, удерживая его на значениях, не отличающихся от интактных крыс; обладают статистически значимым остеопротективным действием, проявляющимся в замедлении истончения костных трабекул и предотвращении возникновения в них микропереломов. Более выраженными остеопротективными свойствами обладает лозартан.

3. Сращение экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости у самок крыс линии Вистар протекает на фоне снижения значений микроциркуляции в кости по сравнению с переломами бедра у крыс без остеопороза, что отрицательно сказывается на результатах их консолидации и приводит к увеличению числа неудовлетворительных исходов консолидации - несращению переломов.

4. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг повышают показатели микроциркуляции в зоне перелома проксимального метафиза бедренной кости до значений, достоверно превышающих таковые у крыс с экспериментальными остеопоротическими переломами, а также увеличивают количество положительных результатов консолидации остеопоротических переломов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 233 источника, из которых 87 отечественных и 146 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 36 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование генерализованного остеопороза, переломов бедренной кости и последующего остеосинтеза переломов. Опыты проводили на 222 самках белых крыс линии Вистар массой 200-300 г. Для моделирования системного остеопороза крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг и проводили операцию билатеральной овариэктомии (Stimpel М., 1995). Развитие генерализованного остеопороза оценивали через восемь недель (на 57 день) после проведения овариэктомии.

С целью моделирования перелома бедренной кости крысу наркотизировали (хлоралгидрат 300 мг/кг) и производили операционный доступ к проксимальному метафизу бедра. Затем с помощью стерилизованных бокорезов на метафизарную зону бедренной кости воздействовали внешней нагрузкой, перпендикулярной оси бедра, до возникновения в кости поперечного перелома (рационализаторское предложение № 1793-07 от 05.10.2007 г. «Способ моделирования метафизарных переломов у мелких лабораторных животных»).

В дальнейшем для фиксации и стабилизации перелома производили его остеосинте'з по следующей методике. Со стороны эпифиза бедра вдоль оси кости через кортикальный слой последней вводили спицу Киршнера диаметром 1 мм, соответствующим диаметру костномозгового канала кости. При продвижении спица проводилась через ткань метафиза, зону перелома и, достигая дистапьного эпифиза, прочно фиксировалась в костно-мозговом канале кости. Фрагмент спицы, выстоящий за пределы проксимального эпифиза кости, загибался под углом 90 градусов и коротко скусывался бокорезами с целью предупреждения повреждения спицей мягких тканей и миграции фиксатора (рационализаторское предложение № 1794-07 от 05.10.2007 г. «Способ остеосинтеза метафизарных переломов у мелких лабораторных животных»). После моделирования перелома и проведения остеосинтеза операционная рана послойно ушивалась капроновыми нитями. Результаты консолидации перелома анализировали через четыре недели (на 29 день) после моделирования и остеосинтеза перелома.

Измерение микроциркуляции в костной ткани и проведение функциональных сосудистых проб. Уровень микроциркуляции оценивали в ткани проксимального метафиза бедренной кости. Для этого после наркотизации (хлоралгидрат 300 мг/кг) и доступа к проксимальному метафизу бедра животное размещали и фиксировали на предложенном нами столике (патент РФ № 62512 от 27.04.2007 г. «Стол для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных»). После засверливания в проксимальном метафизе бедра отверстия глубиной 2,5-3 мм в него с целью стабилизации датчика, используемого для измерения микроциркуляции в кости, вводили предложенный нами стержень-кондуктор (патент РФ № 62505 от 27.04.2007 г. «Канюлированный стержень-кондуктор для проведения экспериментальных измерений»).

Для получения данных о состоянии микроциркуляции в кости использовали оборудование производства компании Biopac systems: полиграф МР100 с модулем LDF100C и инвазивным датчиком TSD144.

После измерения внутрикостного уровня микроциркуляции, не изменяя положения датчика, проводили пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВД) в ответ на болюсное внутривенное введение раствора ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг (Laursen J.B., 1997) и эндотелийнезависимую вазодилатацию (ЭНВД) в ответ на болюсное внутривенное введение раствора нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг (Галаган М.Е., 1991).

Регистрация и обработка результатов ЛДФ производилась с помощью программы AcqKnowledge версии З.8.1., значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕ).

Гистоморфометрическая оценка изменений, происходящих прп генерализованном остеопорозе и его коррекции. Для подтверждения развития генерализованного остеопороза и в комплексной оценке эффективности исследуемых препаратов проводили морфологическое исследование костной ткани проксимальных метафизов бедренной и плечевой костей, а также тел поясничных позвонков. Материал фиксировали в 10%

растворе формалина с последующей проводкой, заливкой в парафин и окрашиванием гематоксилин-эозином (Г-Э). Предметные стекла с гистологическими препаратами подвергали световой микроскопии при помощи микроскопа Leica СМЕ (увеличение хЮО: объектив хЮ, окуляр хЮ) и производили фотографирование костных балок цифровым фотоаппаратом Olympus SP-350 с разрешением 3264x2448 пикселей путем сопоставления объектива фотокамеры и окуляра микроскопа.

Для проведения гистоморфометрии костной ткани использовали программу ImageJ версии 1.39, предварительно откалиброванную следующим образом. Используя то же оборудование, что и для получения фотографий костных трабекул, сфотографировали «линейку» длиной 1 мм на прозрачной подложке. Измерив в программе ImageJ «линейку» в пикселях, приняли расстояние в 1425 пикселей равным 1 мм. В дальнейшем измеряли ширину костных трабекул и выражали ее в микрометрах.

Обоснование доз и дизайн эксперимента. Для изучения остеопротективного действия нами были выбраны препараты, эндотелиопротективное действие которых было доказано в ходе ранее проведенных исследований в лаборатории кардиофармакологии НИИ ЭМ КГМУ: эналаприла малеат и лозартан калия (Гладченко М.П., 1999; Корокин М.В., 2006; Кочкаров В.И., 2006).

Ингибитор АПФ эналаприла малеат («Рениприл» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск) и блокатор ATI-рецепторов лозартан калия («Блоктран» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск) использовали в дозах 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное эндотелиотропное действие данных препаратов в экспериментах, ранее проведенных в нашей лаборатории. При изучении влияния препаратов на развитие остеопороза и заживление остеопоротических переломов вводили их ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно на киселе из 1% крахмального раствора в течение восьми и двенадцати недель соответственно. Животные, не подвергавшиеся лечению, получали по той же схеме кисель из 1% крахмального раствора.

Статистическая обработка результатов исследования. Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel версии 10.0 при помощи средств пакета анализа. «Описательная статистика» применялась для нахождения среднего значения (М) показателей и ошибки среднего (ш). «Двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями» использовался для сравнения соответствующих показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего р<0,05. Зависимость между различными параметрами внутри одной группы оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона (г), а также посредством построения точечных диаграмм с проведением линий регрессии. Ввиду невозможности применения критерия х2 (ожидаемые значения таблицы сопряженности 2x2 были менее пяти), для оценки достоверности различий между долями использовали двусторонний вариант точного критерия Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Комплексная оценка развития генерализованного остеопороза в эксперименте с использованием результатов измерения микроциркуляции в кости, функциональных проб и гистоморфометрического исследования.

Результаты ЛДФ позволили констатировать достоверно более низкий уровень микроциркуляции в костной ткани у крыс через восемь недель после овариэктомии (п=42) по сравнению с интактными животными (п=30) (рис. 1).

Рис. 1. Показатели микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных.

В ответ на системное введение ацетилхолина и нитропруссида наблюдали снижение микроциркуляции с последующей нормализацией показателей кровотока (рис. 2). Так, уменьшение уровня микроциркуляции при проведении пробы ЭЗВД в группе интактных животных в среднем составило 46,7±3,8% от исходных показателей, в группе крыс с экспериментальным остеопорозом -38,9±3,8%. При проведении реакции ЭНВД уровень микроциркуляции в группе интактных крыс снизился в среднем на 29,0±3,5% от исходного значения, в группе животных с генерализованным остеопорозом - на 27,3±5,3%. г

Основным недостатком оценки результатов данных проб явилось то, что степень снижения микроциркуляции во многом определяется исходным уровнем кровотока в метафизе бедренной кости. Поэтому для объективной оценки развития нарушения функции эндотелия при генерализованном остеопорозе рассчитывали КЭД на основе данных ЛДФ в кости. Для этого -определяли площади прямоугольных треугольников над кривыми восстановления микроциркуляции после проведения реакций ЭЗВД и ЭНВД. При этом за меньший из катетов треугольника принимали абсолютную величину падения уровня микроциркуляции, за больший - время восстановления и стабилизации показателя микроциркуляции. Площади треугольников выражали в уловных единицах (усл. ед.). КЭД рассчитывался как отношение площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение нитропруссида к площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение ацетилхолина (рис. 2). В группе интактных животных получили КЭД=1,3±0,2, в группе крыс с экспериментальным остеопорозом КЭД=2,4±0,2 (рис. 3).

Рис. 2. Динамика уровня микроциркуляции в костной ткани при проведении функциональных сосудистых проб.

Примечание. 1 - реакция ЭЗВД у интактных крыс; 2 - реакция ЭНВД у интактных крыс; 3 - реакция ЭЗВД у крыс после билатеральной овариэктомии; 4 - реакция ЭНВД у крыс после билатеральной овариэктомии.

□ Интактные Я Остеопороз

Рис. 3. Значения КЭД по данным ЛДФ в костной ткани метафиза бедра. Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных.

После измерения уровня микроциркуляции в костной ткани бедренной кости и проведения функциональных сосудистых проб производился забор костного биоматериала для проведения гистологического исследования.

Генерализованные остеопоротические изменения в костях скелета были гистологически подтверждены у всех крыс через восемь недель после овариэктомии: наблюдалось истончение костных трабекул (рис. 4). Кроме того, в отдельных гистологических препаратах отмечались микропереломы костных трабекул (рис. 5). О прижизненном возникновении микропереломов судили по прорастанию соединительной ткани в месте перелома трабекулы.

Рис. 4. Морфологическая картина срезов костей скелета (окр. Г-Э, ув. 100). Примечание. 1,2 — проксимальный метафиз бедра у интактной крысы и крысы с остеопорозом; 3, 4 - проксимальный метафиз плеча у интактной крысы и крысы с остеопорозом; 5, 6 - тело поясничного позвонка у интактной крысы и крысы с остеопорозом.

Рис. 5. Микроперелом костной трабекулы (1) (окр. Г-Э, ув. 400).

Объективной мерой оценки развития генерализованного остеопороза через восемь недель после билатеральной овариэктомии стало достоверное уменьшение средней ширины костных трабекул во всех изучаемых локализациях (рис. 6). Так, средняя ширина костной трабекулы у крыс с экспериментальным остеопорозом в проксимальном метафизе бедра была меньше показателя интактных животных на 36,8%. Та же тенденция наблюдалась в проксимальном метафизе плеча: средняя ширина костной трабекулы у интактных животных превышала таковую у крыс с остеопорозом на 37,8%. Наиболее ярко патологические процессы были выражены в телах поясничных позвонков крыс с генерализованным остеопорозом. Как известно, процессы костного ремоделирования протекают быстрее в губчатой кости, нежели в кортикальной, а тело позвонка в большей степени состоит именно из спонгиозной костной ткани. Различие между группами животных в средней ширине костной трабекулы в данной локализации составило 43,7%.

120 100 80

мкм 60 40 20 0

Рис. 6. Средняя ширина костных трабекул в группах интактных крыс и животных с генерализованным остеопорозом в различных локализациях. Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных.

Изучая индивидуальные показатели микроциркуляции и средней ширины костной трабекулы в проксимальном метафизе бедренной кости в обеих группах животных, обратили внимание на наличие определенной зависимости между двумя указанными параметрами. Для подтверждения наличия таковой зависимости рассчитали коэффициент корреляции Пирсона (г) между уровнем микроциркуляции и средней шириной костной трабекулы в обеих группах. Кроме того, для сравнения парных значений в группах построили точечные диаграммы зависимости ширины костных трабекул от уровня регионарной микроциркуляции и провели на диаграммах линии регрессии.

Получили следующие значения: в группе интактных животных г=0,7, в группе крыс с остеопорозом г=0,6. Данные значения коэффициента свидетельствуют о наличии достаточно тесной прямой зависимости между уровнем микроциркуляции и средней шириной костной трабекулы в проксимальном метафизе бедра у крыс в обеих группах.

Точечные диаграммы подтвердили наличие прямой зависимости между изучаемыми параметрами в каждой группе и позволили более наглядно визуализировать имеющиеся закономерности (рис. 7).

Бедро Плечо Тело позвонка

□ Интаетные ■ Остеолороэ

Рис. 7. Диаграммы зависимости ширины костных трабекул от значений регионарной микроциркуляции.

Примечание. 1 - в группе интактных крыс; 2 — в группе крыс с остеопорозом.

Таким образом, через восемь недель после проведения билатеральной овариэктомии у самок белых крыс линии Вистар развивается системная эндотелиальная дисфункция, частным проявлением которой является нарушение функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани. Свидетельством этого является увеличение коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного по результатам проведения ЛДФ в костной ткани.

Как следствие этого, отмечается значительное ухудшение регионарного кровотока в костной ткани, приводящее к дисбалансу процессов костного ремоделирования и в конечном счете возникновению и развитию генерализованного остеопороза, сопровождающегося истончением костных трабекул и возникновением в них микропереломов. Подтверждением данному положению служит наличие прямой тесной зависимости между уровнем микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости и шириной костных трабекул в данной локализации у крыс.

Это позволило нам прийти к выводу о значительной роли нарушения функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани в развитии генерализованного остеопороза. Следовательно, являлось актуальным исследование остеопротективного действия наиболее часто применяемых в настоящее время препаратов с доказанной эндотелиотропной активностью.

2. Изучение остеопротективного действия ингибитора АПФ эналаприла и блокатора АТ1-рецепторов лозартана при экспериментальном генерализованном остеопорозе.

Было обнаружено, что эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан 6 мг/кг эффективно предотвращали снижение уровня регионарного кровотока в костной ткани бедра, сохраняя значения микроциркуляции на уровне интактных крыс. Результаты ЛДФ в группах крыс, получавших эналаприл (п=35) и лозартан (п=35), достоверно не отличались от таковых у интактных животных (р=0,252 и р=0,926 соответственно) и не различались между собой (р=0,181), а также достоверно отличались от показателей в группе крыс с остеопорозом (рис. 8).

□ Интактные Ш Оствопороз В ОП+Эналаприл 0,5 мг/кг И ОП+Лозартан 6 мг/кг

Рис. 8. Влияние эналаприла и лозартана на показатели микроциркуляции в проксимальном метафизе бедренной кости у крыс.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

Было выявлено, что эналаприл и лозартан приводили пропорции между площадями треугольников над кривыми восстановления уровня микроциркуляции в кости в ответ на введение нитропруссида и ацетилхолина к таковым у интактных животных (рис. 9). Тем самым изучаемые препараты достоверно снижали КЭД до значений 1,6±0,1 и 1,5±0,2 соответственно, тогда как в группе животных с остеопорозом он составлял 2,4±0,2.

в костной ткани при проведении функциональных проб.

Примечание. 1 - реакция ЭЗВД у крыс, получивших эналаприл 0,5 мг/кг; 2 - реакция ЭНВД у крыс, получавших эналаприл 0,5 мг/кг; 3 - реакция ЭЗВД у крыс, получавших лозартан 6 мг/кг; 4 - реакция ЭНВД у крыс, получавших лозартан 6 мг/кг.

При световой микроскопии срезов костей скелета у крыс, получавших лечение, обнаружили сохранение структуры костной ткани и большую ширину костных трабекул, чем у крыс с остеопорозом, не получавших лечения, во всех исследуемых локализациях. Выявили, что эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан 6 мг/кг препятствовали снижению средней ширины костной трабекулы до уровня животных с экспериментальным остеопорозом в исследуемых локализациях, однако средняя ширина трабекул не достигала значения интактных крыс (рис. 10). Так, эналаприл и лозартан также оказывали статистически значимое влияние на среднюю ширину костных трабекул во всех изучаемых локализациях: эналаприл увеличивал ширину трабекул в среднем на 29,5%, лозартан - на 45,9% по сравнению с крысами, страдающими остеопорозом.

Рис. 10. Влияние эналаприла и лозартана на значение средней ширины костной трабекулы через восемь недель после билатеральной овариэктомии.

Примечание. 1 — в проксимальном метафизе бедренной кости; 2 - в проксимальном метафизе плечевой кости; 3 - в телах поясничных позвонков; * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных; ** - р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

В группах крыс, получавших исследуемые препараты, нами также было выявлено и подтверждено наличие прямой зависимости между уровнем микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедра и средней шириной костной трабекулы в данной зоне (рис. 11). Коэффициент корреляции Пирсона (г) между указанными параметрами у крыс, получавших эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, составил 0,4, у получавших лозартан в дозе 6 мг/кг - 0,8.

регионарной микроциркуляции.

Примечание. 1 - в группе крыс, получавших эналаприл 0,5 мг/кг; 2 - в группе крыс, получавших лозартан 6 мг/кг.

Таким образом, эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг через восемь недель после билатеральной овариэктомии, обладая эндотелиопротективным действием (что выражалось в усилении эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции по данным ЛДФ до уровня интактных животных), эффективно предотвращали снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани.

Это позволило поддержать на адекватном уровне процессы костного ремоделирования при развивающемся генерализованном остеопорозе, свидетельством чего явилось замедление истончения костных трабекул в губчатой костной ткани и предотвращение возникновения микропереломов трабекул. При этом достоверно более выраженным остеопротективным действием обладал лозартан 6 мг/кг.

Основываясь на положении о том, что опосредованно через улучшение регионарного кровотока в костной ткани эналаприл и лозартан благотворно влияют на процессы костного ремоделирования, в дальнейших исследованиях нами изучено влияние данных препаратов на качество консолидации экспериментальных остеопоротических переломов.

3. Изучение влияния ингибитора АПФ эналаприла и блокатора АТ1-рецепторов лозартана на качество консолидации экспериментальных остеопоротических переломов.

Результаты ЛДФ в группах крыс с экспериментальными переломами показали, что при сращении переломов на фоне генерализованного остеопороза (п=20) средний уровень микроциркуляции в межотломковой зоне был достоверно ниже, чем у крыс без остеопороза (п=20) (рис. 12).

При оценке зоны перелома проксимального метафиза бедра выявили, что у большинства крыс в обеих группах через четыре недели после перелома отмечались признаки формирования костной мозоли, однако наблюдались и неудовлетворительные исходы - несращение переломов (рис. 13).

Рис. 12. Уровень микроциркуляции в межотломковой зоне проксимального метафиза бедра через четыре недели после моделирования и синтеза перелома. Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой животных с переломом бедра.

□ Перелом бедра

■ Остеопоротический перелом бедра

Перелом бедра 16; 80%

Остеопоротический перелом бедра 12; 60%

4; 20% 8; 40%

□ Сращение перепома В Несращение перелома

Рис. 13. Результаты консолидации экспериментальных переломов проксимального метафиза бедра через четыре недели после моделирования, а также примеры рентгенограмм сращения и несращения переломов.

Установили, что эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан 6 мг/кг через четыре недели после экспериментального остеопоротического перелома проксимального метафиза бедренной кости у крыс положительно влияли на средний уровень микроциркуляции в межотломковой зоне (рис. 14).

О Перелом бедра

■Остеопоротический перелом бедра

В Остеопоротический перелом бедра +Эналаприл 0,5 мг/кг И Остеопоротический перелом бедра +Лозартан 5 мг/кг

Рис. 14. Влияние эналаприла и лозартана на показатели микроциркуляции в межотломковой зоне через четыре недели после моделирования перелома. Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой животных с переломом

бедренной кости;

- р<0,05 по сравнению с группой крыс

остеопоротическим переломом бедренной кости.

При этом у крыс, получавших эналаприл 0,5 мг/кг (п=20), превышение среднего уровня микроциркуляции над таковым у животных с переломами бедра без остеопороза статистической значимости не имело (р=0,088). В свою очередь, среднее значение микроциркуляции в зоне перелома у крыс, получавших лозартан 6 мг/кг (п=20), было достоверно выше такового у крыс с переломами бедренной кости без остеопороза (р=0,0001) и выше, чем у крыс, получавших эналаприл 0,5 мг/кг (р=0,007).

При изучении результатов консолидации переломов обнаружили, что в результате введения исследуемых препаратов крысам через четыре недели после моделирования переломов отмечался лишь один неудовлетворительный результат: в группе крыс, получавших эналаприл 0,5 мг/кг, у одного из 20 животных наблюдалось несращение перелома. У крыс, получавших лозартан 6 мг/кг, сращение переломов наблюдалось в 100% случаев (рис. 15).

Остеопоротический перелом бедра + Эналаприл 0,5 мг/кг 19; 95%

Остеопоротический перелом бедра + Лозартан 6 мг/кг 20; 100%

1 ; 5% 0; 0%

□ Сращение перелома ■ Несращение перелома Рис. 15. Влияние эналаприла и лозартана на качество консолидации экспериментальных переломов проксимального метафиза бедра через четыре недели после их моделирования и остеосинтеза.

Таким образом, консолидация экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости у самок крыс линии Вистар через двенадцать недель после билатеральной овариэктомии протекает на фоне снижения кровоснабжения зоны перелома, что, несомненно, негативно отражается на результатах сращения переломов, приводя к значительному увеличению числа неудовлетворительных исходов.

Эналаприл 0,5 мг/кг и лозартан 6 мг/кг, вводимые крысам в течение двенадцати недель после билатеральной овариэктомии, увеличивали показатели микроциркуляции в межотломковой зоне проксимального метафиза бедренной кости выше таковых у интактных крыс с переломами бедра. Достоверно более выраженным воздействием на уровень кровотока в зоне перелома обладал лозартан 6 мг/кг. Тем самым исследуемые препараты достоверно увеличивали частоту сращения экспериментальных переломов.

ВЫВОДЫ

1. Через восемь недель после билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Вистар развивается нарушение функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани, свидетельством чего является увеличение коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного по результатам лазерной допплеровской флоуметрии в костной ткани, до 2,4±0,2 по сравнению с 1,3±0,2 у интактных животных. Значительно ухудшается регионарный кровоток в костной ткани (61,5±3,7 ПЕ по сравнению с 100,5±4,4 ПЕ у интактных крыс), что приводит к развитию генерализованного остеопороза, сопровождающегося истончением костных трабекул в среднем на 39,4% и возникновением в них микропереломов.

2. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг на модели билатеральной овариэктомии имеет выраженное эндотелиопротективное действие, проявляющееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до 1,6±0,1, предотвращает снижение уровня микроциркуляции в костной ткани бедра, удерживая его на значениях, не отличающихся от интактных крыс (93,3±4,5 ПЕ), а также, увеличивая ширину костных трабекул в среднем на 29,5% по сравнению с группой крыс с остеопорозом и предотвращая возникновение микропереломов, обладает остеопротективным действием.

3. Лозартан в дозе 6 мг/кг на модели билатеральной овариэктомии, обладая выраженным эндотелиопротективным действием, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции до 1,5±0,2; препарат эффективно предотвращает снижение показателей кровотока в костной ткани бедра, удерживая его на уровне интактных животных (100,0±2,3 ПЕ), и имеет более выраженное остеопротективное действие, чем эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, увеличивая ширину костных трабекул в среднем на 45,9%.

4. Консолидация экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости у самок крыс линии Вистар по сравнению с аналогичными переломами у крыс без остеопороза протекает на фоне сниженного уровня микроциркуляции в костной ткани (69,7±5,9 ПЕ по сравнению с 87,6±6,3 ПЕ), что негативно отражается на результатах сращения переломов, приводя к увеличению вдвое числа неудовлетворительных исходов консолидации.

5. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг увеличивает показатели микроциркуляции в зоне перелома проксимального метафиза бедренной кости до значений, превышающих показатели у крыс с экспериментальными остеопоротическими переломами, а именно до 102,2±5,4 ПЕ, а также увеличивает количество положительных результатов консолидации остеопоротических переломов.

6. Лозартан в дозе 6 мг/кг повышает показатели микроциркуляции в зоне перелома проксимального метафиза бедренной кости до 123,1±5,0 ПЕ, что превышает соответствующие показатели не только у крыс с остеопоротическими переломами, но и у животных с переломами бедренной кости без остеопороза. Влияние лозартана на показатели микроциркуляции в зоне перелома бедра у крыс превосходит аналогичное воздействие эналаприла. Лозартан в дозе 6 мг/кг увеличивает количество положительных результатов консолидации остеопоротических переломов до 100%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Уровень микроциркуляции в костной ткани у крыс в норме и при экспериментальном остеопорозе / В.Ю. Чердаков, А.И. Маяков, О.С. Гудырев // Межрегиональная научно-практическая конференция студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (22-24 ноября 2006 г., г. Саратов). - Саратов: СГМУ, 2006. - С. 121.

2. Уровень микроциркуляции в надкостнице и костной ткани у крыс в норме и при экспериментальном остеопорозе / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, А.И. Маяков, В.Ю. Чердаков // 72-я научная конференция КГМУ «Университетская наука: взгляд в будущее» (5-6 февраля 2007 г., г. Курск). -Курск: КГМУ, 2007. - Т. 2. - С. 193-195.

3. Уровень микроциркуляции в костной ткани в норме и при экспериментальном остеопорозе у крыс / А.И. Маяков, В.Ю. Чердаков, О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон // III заочная электронная межвузовская научная конференция «Эндотелиальная дисфункция и сердечно-сосудистая патология» (2007 г., г. Курск). - Курск: КГМУ, 2007. - С. 9-10.

4. Микроциркуляторные изменения в надкостнице и костной ткани у крыс с экспериментальным остеопорозом / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, М.В. Покровский, Г.М. Дубровин // Кубанский научный медицинский вестник. - 2007. - № 1-2 (94-95). - С. 179-181.

5. Гудырев, О.С. Уровень микроциркуляции в костной ткани у крыс в норме и при экспериментальном остеопорозе / О.С. Гудырев, А.И. Маяков,

B.Ю. Чердаков // 72-я итоговая межвузовская научная конференция студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (17-18 апреля 2007 г., г. Курск). - Курск: КГМУ, 2007. - Т. 1. - С. 95.

6. Пат. 62505 Российская Федерация, МПК7 А61В 17/68. Канюлированный стержень-кондуктор для проведения экспериментальных измерений / Файтельсон A.B., Гудырев О.С., Дубровин Г.М. и др.; заявители и патентообладатели Файтельсон A.B., Гудырев О.С. - № 2006144474/22; заявл. 13.12.06; опубл. 27.04.07, Бюл. № 12.-3 е.: ил.

7. Пат. 62512 Российская Федерация, МПК7 A61D 3/00. Стол для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных / Файтельсон A.B., Гудырев О.С., Дубровин Г.М. и др.; заявители и патентообладатели Файтельсон A.B., Гудырев О.С. - № 2006144475/22; заявл. 13.12.06; опубл. 27.04.07, Бюл. № 12. -4 е.: ил.

8. Микроциркуляторные нарушения при экспериментальных остеопоротических переломах / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, Е.Б. Артюшкова, Т.Г. Покровская // VI Международная конференция «Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям)» (10-13 июня 2007 г., г. Ярославль). - Ярославль, 2007.-С. 101.

9. Перспективы изучения микроциркуляции в костной ткани в поиске новых звеньев патогенеза остеопороза / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский, Г.М. Дубровин // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2007. - № 3. - С. 17-20.

10. Роль нарушения микроциркуляции в костной ткани в развитии остеопороза / О.С. Гудырев, А.И. Маяков, В.Ю. Чердаков, Н.Ю. Коклина // II Международная научная конференция молодых ученых-медиков (21-22 февраля 2008 г., г. Курск). - Курск: КГМУ, 2008. - Т. I. - С. 32-34.

11. Нарушение микроциркуляции в костной ткани как звено патогенеза остеопороза / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский и др. // XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (14-18 апреля 2008 г., г. Москва). - Москва, 2008. - С. 616.

12. Поиск новых подходов к лечению остеопороза: экспериментальное исследование / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский и др. // Всероссийская научно-практическая конференция «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (29-30 апреля 2008 г., г. Курск). - Курск: КГМУ, 2008. -

C. 151-153.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 17.12.2008 г. Подписано в печать 18.12.2008 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 59А Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Актуальность исследования

Остеопороз (ОП) — системное заболевание скелета, характеризующееся снижением массы кости в единице объема и нарушением микроархитектоники костной ткани, приводящими к увеличению хрупкости костей и высокому риску их переломов». Данное определение ОП было сформулировано на международных конференциях в Копенгагене (1990) и Гонконге (1993) и в настоящее время является общепринятым [22, 73].

В основе развития остеопороза лежит дисбаланс между двумя основными процессами костного ремоделирования: костной резорбцией и костеобразованием [52, 73]. Важным звеном в патогенезе остеопороза, особенно иммобилизационного, является снижение кровоснабжения кости [109, 193], приводящее к торможению активности и уменьшению количества остеобластов, а также к усиленной деятельности остеокластов.

В настоящее время ОП является одним из наиболее частых и тяжелых заболеваний скелета, этиологические и патогенетические аспекты которого представляются не до конца изученными [5, 52, 55]. По мнению ВОЗ ОП занимает четвертое место по значимости вслед за сердечно-сосудистыми, онкологическими заболеваниями и сахарным диабетом [22]. Поэтому в конце XX века возникла идея организации борьбы с этим патологическим состоянием, а ВОЗ провозгласила первое десятилетие XXI века «Декадой костей и суставов».

Однако статистические данные свидетельствуют не только о росте заболеваемости ОП, но и о неуклонном увеличении числа его осложнений -остеопоротических переломов [50]. По прогнозам экспертов к 2050 году в мире частота одних только переломов шейки бедра, связанных с ОП, возрастет с 1,7 млн. до 6,3 млн. случаев в год (по данным «Osteoporosis in the European Community»). Показатели смертности в течение первого года после такого перелома составляют от 12 до 40% (по данным National Osteoporosis

Foundation). У половины больных, выживших после перелома бедра, значительно снижается качество жизни, каждый третий больной утрачивает способность к самообслуживанию, нуждается в длительном постоянном уходе и внушительных материальных затратах на лечение и реабилитацию.

Для успешной консолидации перелома также большое значение имеет васкуляризация костных отломков [109, 193]. Всякий перелом трубчатой кости сопровождается повреждением мягких тканей; при этом повреждаются сосуды и нервы, проникающие в кость со стороны надкостницы. Чем больше повреждение питающих сосудов и надкостницы, то есть значительнее нарушение кровоснабжения отломков, тем условия для сращения перелома менее благоприятны, и тем медленнее протекают процессы репаративной регенерации кости.

Значительную роль в поддержании на адекватном уровне процессов костного ремоделирования, а также репаративной регенерации костной ткани играет кровоснабжение кости. Переломы у пациентов, страдающих остеопорозом, возникая на фоне структурных, количественных и качественных изменений в костной ткани, требуют иных подходов к лечению, чем повреждения костей у здоровых лиц.

Как известно, строение микроциркуляторного русла костной ткани существенно отличается от морфологии сосудистого русла остальных тканей организма. Костные микрососуды имеют только эндотелий и не имеют мышечного и соединительнотканого слоев. Таким образом, именно эндотелий опосредует всю гуморальную регуляцию обмена между остеобластами, остеокластами и кровью.

В то же время в доступной литературе мы не нашли сведений о том, чтобы кто-либо использовал эндотелий костных сосудов как мишень фармакологического воздействия при остеопорозе и переломах на его фоне.

В условиях повреждения тканей активируются процессы неоангиогенеза. Одним из основных условий для нормального протекания ангиогенеза является повышение проницаемости эндотелия, что преимущественно связывают с действием оксида азота (NO) [8, 20, 177]. Повышение проницаемости сосудов необходимо для выхода белков плазмы крови, что приводит к образованию фибриновой основы для последующей миграции эндотелиоцитов. Главным механизмом регуляции процессов неоангиогенеза является высвобождение ангиогенных факторов, источником которых могут быть эндотелиальные клетки, тучные клетки, макрофаги и другие клетки. Под действием ангиогенных факторов происходит активация эндотелиоцитов и миграция их за пределы базальной мембраны с формированием ответвлений основных сосудов [83, 205].

Таким образом, одной из причин нарушения регионарного кровоснабжения является дисфункция эндотелия [25, 57, 82]. Следовательно, дисфункция эндотелия посредством нарушения микроциркуляции может приводить к нарушению процессов остеогенеза и остеорепарации, вызывая тем самым ряд остеологических заболеваний, в том числе и остеопороз.

Увеличение частоты остеопороза и его осложнений показывает, что в настоящее время нет надежных методов медикаментозного лечения и профилактики этого заболевания. Современная патогенетическая терапия остеопороза традиционно включает препараты, стимулирующие костеобразование, замедляющие костную резорбцию и препараты многопланового действия [26, 53, 67, 81], но не уделяется никакого внимания препаратам, обладающим положительным влиянием на кровоснабжение костной ткани. Это указывает на актуальность исследования остеопротективного действия препаратов с доказанными положительными эндотелиотропными эффектами.

Номер государственной регистрации темы - 01.2.007 05271.

Цель исследования

Провести оценку остеопротективного действия эналаприла и лозартана и их влияния на процессы репаративной регенерации костной ткани при переломах проксимального метафиза бедренной кости на модели остеопороза, вызванного билатеральной овариэктомией.

Задачи исследования

1. Оценить развитие экспериментального генерализованного остеопороза при билатеральной овариэктомии в эксперименте с использованием результатов измерения микроциркуляции в костной ткани, функциональных сосудистых проб и гистоморфометрического исследования.

2. Изучить остеопротективное действие ингибитора АПФ эналаприла на модели билатеральной овариэктомии.

3. Изучить остеопротективное действие блокатора ATI-рецепторов лозартана на модели билатеральной овариэктомии.

4. Оценить качество репаративных процессов в костной ткани при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального метафиза бедренной кости с использованием результатов измерения микроциркуляции в межотломковой зоне и рентгенологического исследования.

5. Изучить влияние ингибитора АПФ эналаприла на качество репаративных процессов при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального метафиза бедренной кости.

6. Изучить влияние блокатора ATI-рецепторов лозартана на качество репаративных процессов при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального метафиза бедренной кости.

Научная новизна

В работе впервые показано, что через восемь недель после билатеральной овариэктомии развивающийся генерализованный остеопороз характеризуется значительным снижением уровня микроциркуляции в проксимальном метафизе бедренной кости, отрицательной динамикой морфологических показателей, наличием тесной прямой зависимости между величиной кровоснабжения кости и шириной костных трабекул в ней.

Кроме того, обнаруживаются изменения соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), рассчитанного по результатам лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) в костной ткани.

Впервые продемонстрировано, что эналаприл и лозартан, вводимые в дозах 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно крысам ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в течение восьми недель после билатеральной овариэктомии, обладая эндотелиопротективным действием, эффективно предотвращали снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани. Тем самым изучаемые препараты способствовали замедлению истончения костных трабекул в губчатой костной ткани и предотвращению возникновения микропереломов трабекул, то есть обладали остеопротективным действием. Достоверно более выраженным действием обладал лозартан.

Было обнаружено, что консолидация экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости через двенадцать недель после билатеральной овариэктомии протекает на фоне снижения кровоснабжения зоны перелома по сравнению с переломами бедра у крыс без остеопороза.

Впервые показано, что эналаприл и лозартан, вводимые в дозах 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно крысам ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в течение восьми недель после билатеральной овариэктомии и еще в течение четырех недель после моделирования и остеосинтеза перелома, увеличивали показатели микроциркуляции в межотломковой зоне проксимального метафиза бедренной кости выше таковых у крыс с переломами бедра без остеопороза. Достоверно более выраженным воздействием на уровень кровотока в зоне перелома обладал лозартан. Оба исследуемых препарата статистически значимо увеличивали частоту сращения экспериментальных остеопоротических переломов.

В ходе исследования были разработаны вспомогательные лабораторные инструменты, а также рационализированы некоторые манипуляции.

Научная- новизна подтверждается получением двух патентов РФ (патент РФ № 62505 от 27.04.2007 г. «Канюлированный стержень-кондуктор для проведения экспериментальных измерений»; патент РФ № 62512 от 27.04.2007 г. «Стол для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных»); Поданы две заявки на получение патентов РФ (заявка № 2008122134 от 02.06.2008 г. «Способ коррекции ; остеопороза и профилактики возникновения остеопоротических переломов эналаприлом»; заявка № 20081221361 от 02.06.2008 г. «Способ коррекции остеопороза и профилактики возникновения остеопоротических переломов лозартаном»). Получены два удостоверения на рационализаторские предложения (рационализаторское предложение № 1793-07 от 05.10.2007 г. «Способ: моделирования метафизарных переломов у мелких лабораторных животных»; рационализаторское предложение № 1794-07 от 05:10.2007 г. «Способ остеосинтеза метафизарных переломов у мелких лабораторных животных»).

Практическая значимость

В работе обоснована эффективность применения ингибитора АПФ эналаприла и блокатора ATI-рецепторов лозартана для коррекции остеопоротических изменений костей скелета, а также для улучшения качества консолидации переломов при генерализованном остеопорозе. В- эксперименте доказано, что использование исследуемых препаратов позволяет нормализовать изменения соотношений сосудистых реакций^ на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), предотвратить уменьшение кровоснабжения костной' ткани при остеопорозе и остеопоротических переломах, а также добиться замедления отрицательной динамики морфометрических показателей кости и значительно увеличить количество положительных результатов сращения переломов на фоне остеопороза.

Результаты исследования позволяют рекомендовать проведение целенаправленных клинических испытаний эналаприла и лозартана при системном остеопорозе, а также остеопоротических переломах костей скелета.

Внедрение результатов научного исследования

Материалы диссертационного исследования, касающиеся остеопротективной активности эналаприла и лозартана, а также положительного влияния указанных препаратов на качество сращения переломов костей скелета при системном остеопорозе, используются в лекционных курсах кафедр фармакологии и травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии КГМУ.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на 72 итоговой межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2007), заседании Курского регионального отделения ассоциации травматологов-ортопедов России (Курск, 2007), VI Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям)» (Ярославль, 2007), конференции «Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов» (Курск, 2008), II Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2008), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008).

Апробация диссертации проведена на межкафедральной научно-практической конференции кафедр фармакологии, травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 2, гистологии, цитологии и эмбриологии, анатомии, НИИ Экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе две из них — в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, выносимые на защиту

1. Через восемь недель после билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Вистар развивается нарушение функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани, сопровождающееся увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного по результатам лазерной допплеровской флоуметрии в кости. Как следствие, значительно ухудшается кровоснабжение костной ткани, что приводит к развитию генерализованного остеопороза, проявляющегося истончением и микропереломами костных трабекул.

2. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг на модели билатеральной овариэктомии имеют выраженное эндотелиопротективное действие, снижая коэффициент эндотелиальной дисфункции до уровня интактных (ложно оперированных) животных; предотвращают снижение уровня микроциркуляции в костной ткани бедра, удерживая его на значениях, не отличающихся от интактных (ложно оперированных) крыс; обладают статистически значимым остеопротективным действием, проявляющимся в замедлении истончения костных трабекул и предотвращении возникновения в них микропереломов. Более выраженными остеопротективными свойствами обладает лозартан.

3. Сращение экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости у самок крыс линии Вистар протекает на фоне снижения значений микроциркуляции в кости по сравнению с переломами бедра у крыс без остеопороза, что отрицательно сказывается на результатах их консолидации и приводит к увеличению числа неудовлетворительных исходов консолидации - несращению переломов.

4. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг повышают показатели микроциркуляции в зоне перелома проксимального метафиза бедренной кости до значений, достоверно превышающих таковые у крыс с экспериментальными остеопоротическими переломами, а также увеличивают количество положительных результатов консолидации остеопоротических переломов.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 233 источника, из которых 87 отечественных и 146 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 36 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. Через восемь недель после билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Вистар развивается нарушение функции эндотелия сосудов микроциркуляторного русла костной ткани, свидетельством чего является увеличение коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного по результатам лазерной допплеровской флоуметрии в костной ткани, до 2,4±0,2 по сравнению с 1,3±0,2 у интактных животных. Значительно ухудшается регионарный кровоток в костной ткани (61,5±3,7 ПЕ по сравнению с 100,5±4,4ПЕ у интактных крыс), что приводит к развитию генерализованного остеопороза, сопровождающегося истончением костных трабекул в среднем на 39,4% и возникновением в них микропереломов.

2. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг на модели билатеральной овариэктомии имеет выраженное эндотелиопротективное действие, проявляющееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до 1,6±0,1, предотвращает снижение уровня микроциркуляции в костной ткани бедра, удерживая его на значениях, не отличающихся от интактных крыс (93,3±4,5 ПЕ), а также, увеличивая ширину костных трабекул в среднем на 29,5% по сравнению с группой крыс с остеопорозом и предотвращая возникновение микропереломов, обладает остеопротективным действием.

3. Лозартан в дозе 6 мг/кг на модели билатеральной овариэктомии, обладая выраженным эндотелиопротективным действием, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции до 1,5±0,2; препарат эффективно предотвращает снижение показателей кровотока в костной ткани бедра, удерживая его на уровне интактных животных (100,0±2,3 ПЕ), и имеет более выраженное остеопротективное действие, чем эналаприл в дозе 0,5 мг/кг, увеличивая ширину костных трабекул в среднем на 45,9%.

4. Консолидация экспериментальных остеопоротических переломов проксимального метафиза бедренной кости у самок крыс линии Вистар по сравнению с аналогичными переломами у крыс без остеопороза протекает на фоне сниженного уровня микроциркуляции в костной ткани (69,7±5,9 ПЕ по сравнению с 87,6±6,3 ПЕ), что негативно отражается на результатах сращения переломов, приводя к увеличению вдвое числа неудовлетворительных исходов консолидации.

5. Эналаприл в дозе 0,5 мг/кг увеличивает показатели микроциркуляции в зоне перелома проксимального метафиза бедренной кости до значений, превышающих показатели у крыс с экспериментальными остеопоротическими переломами, а именно до 102,2±5,4 ПЕ, а также увеличивает количество положительных результатов консолидации остеопоротических переломов.

6. Лозартан в дозе 6 мг/кг повышает показатели микроциркуляции в зоне перелома проксимального метафиза бедренной кости до 123,1±5,0 ПЕ, что превышает соответствующие показатели не только у крыс с остеопоротическими переломами, но и у животных с переломами бедренной кости без остеопороза. Влияние лозартана на показатели микроциркуляции в зоне перелома бедра у крыс превосходит аналогичное воздействие эналаприла. Лозартан в дозе 6 мг/кг увеличивает количество положительных результатов консолидации остеопоротических переломов до 100%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для поддержания гомеостаза кости чрезвычайно важны развитие функционально полноценного микроциркуляторного русла и общее состояние регионарной микроциркуляции в костной ткани. Ухудшение кровоснабжения костной ткани может приводить к развитию таких патологий опорно-двигательного аппарата, как остеонекроз [110], остеомиелит [162] или остеопороз [109, 193]. В состоятельности репарации повреждений костей скелета также играют значительную роль своевременное протекание процессов неоангиогенеза и адекватное кровоснабжение костных отломков, ведь, как известно, в результате травмы опорно-двигательного аппарата происходит неизбежное повреждение питающей сосудистой сети, что приводит к развитию гипоксии окружающих тканей и локальному некрозу, являющихся, кроме прочих, причинами нарушения консолидации переломов [138].

Эндотелий в зрелой сосудистой сети играет центральную регуляторную роль, обеспечивая связь с остальными слоями стенки сосуда и адекватно отвечая на их потребности выделением медиаторов [46]. Таким образом, по нашему мнению эндотелий сосудов костной ткани, являясь неотъемлемой частью кости, во многом определяет состояние регионарной микроциркуляции, а также тем самым отвечает за поддержание гомеостаза в кости.

Данное положение подтверждается работами ряда авторов, утверждающих, например, что VEGF (ключевой регулятор каскада событий, приводящих к формированию и развитию сосудистой системы) играет значительную роль в процессах ремоделирования [115, 186, 198, 228] и репарации повреждений [124, 203, 222] костной ткани. Так, было продемонстрировано, что ингибирование VEGF приводит к увеличению ширины феморальной и тибиальной ростковых зон [233], снижению интенсивности ангиогенеза в ростковых зонах, потере кровеносных сосудов в метафизарной зоне, а также уменьшению образования трабекулярной структуры кости [115, 228] и интенсификации резорбции губчатой костной ткани [155]. При переломах бедренных костей у мышей ингибирование VEGF приводит к уменьшению прорастания кровеносных сосудов, ухудшению минерализации костной мозоли и нарушению перестройки костных трабекул [158, 186, 222, 228]. Напротив, при переломах костей скелета стимуляция эндостального кровообращения в поврежденной кости [191] позволяет мезенхимальным клеткам проникать в область повреждения со стороны эндоста и костного мозга [221] и дифференцироваться в клетки остеобластического ряда с последующим образованием губчатой кости.

На основании изложенного нами была сформулирована гипотеза, согласно которой качество процессов ремоделирования и репаративной регенерации костной ткани находится в прямой зависимости от качества функционирования эндотелия сосудов, определяющего уровень регионарной микроциркуляции в костной ткани. Этой концепции мы придерживались в ходе выполнения наших исследований.

Таким образом, эндотелиальная дисфункция, которая может быть определена как дисбаланс противоположно действующих начал: вазорелаксирующих и вазоконстрикторных, прокоагулянтных и антикоагулянтных, факторов роста и их ингибиторов, - может быть причиной ухудшения кровоснабжения костной ткани, и, следовательно, нарушения процессов костного ремоделирования и репарации повреждений кости.

В настоящее время ведется активное изучение препаратов, обладающих эндотелиопротективными свойствами. К сожалению, на данный момент не существует лекарственных средств для специфической коррекции дисфункции эндотелия, в связи с чем внимание исследователей приковано к различным группам препаратов. По нашему мнению наибольшего внимания заслуживают представители ингибиторов АПФ и блокаторов ангиотензиновых рецепторов, а именно эналаприл и лозартан ввиду наиболее частого их применения в клинической практике.

В частности, один из возможных путей протективного влияния ингибиторов АПФ на эндотелиальную дисфункцию связан с восстановлением метаболизма брадикинина: блокада тканевого АПФ приводит не только к уменьшению синтеза АТ-2, но и замедлению деградации брадикинина. Также под действием данных препаратов возможно снижение базальной и инсулин-индуцированной секреции эндотелина-1 и увеличение продукции NO.

Эндотелиопротективное влияние антагонистов ангиотензиновых рецепторов реализуется, по-видимому, за счет блокады ATI-рецепторов, что ведет к уменьшению продукции супероксидных радикалов, снижению степени связывания NO и его накоплению. Так как стимуляция АТ1-рецепторов способствует образованию супероксидов, инактивирующих NO, а стимуляция АТ2-рецепторов приводит к вазодилатации и усилению натрийуреза за счет активации системы брадикинина, NO и цГМФ, то эффект АТ-2 (усиление синтеза или инактивация NO) зависит от того, с какими рецепторами он преимущественно взаимодействует. Поэтому очевидно, что на фоне блокады ATI-рецепторов создаются благоприятные условия для интенсифицированного функционирования свободных АТ2-рецепторов, что приводит к накоплению NO.

С целью проверки соответствия предложенной гипотезы действительности оценивали степень развития эндотелиальной дисфункции сосудов костной ткани и степень развития остеопороза у крыс через восемь недель после билатеральной овариэктомии, а также измеряли уровень микроциркуляции в проксимальном метафизе бедренной кости. Данная модель патологии была выбрана не случайно. Во-первых, в предыдущих исследованиях, проведенных в лаборатории доклинических исследований НИИ Экологической медицины КГМУ, было доказано, что через 6 недель после билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Вистар развивается и в дальнейшем не прогрессирует гипоэстроген-индуцированная дисфункция эндотелия сосудов [37]. Во-вторых, по данным литературы, через восемь недель после билатеральной овариэктомии у половозрелых самок крыс развивается генерализованный остеопороз [152]. Стоит отметить, что автор методики моделирования остеопороза связывает развитие остеопороза с гипоэстрогенным состоянием после овариэктомии, не рассматривая в качестве возможной причины формирования остеопороза эндотелиальную дисфункцию.

Для определения показателей микроциркуляции в костной ткани бедра у крыс использовали полиграф MP 100 производства компании Biopac systems с модулем лазерной, допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и инвазивным игольчатым датчиком TSD144. Для количественного выражения степени развития эндотелиальной дисфункции проводили фармакологические пробы с внутривенным болюсным введением растворов ацетилхолина [161] и нитропруссида [14]. Затем на основании полученных результатов рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) по методике, разработанной в нашей лаборатории [47, 61], как отношение площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение нитропруссида к площади треугольника над кривой восстановления микроциркуляции в ответ на введение ацетилхолина. Развитие остеопороза оценивали посредством проведения гистоморфометрического исследования срезов бедренной и плечевой костей и поясничных позвонков путем измерения ширины костных трабекул.

В результате экспериментов установили, что через восемь недель после проведения операции билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Вистар развивается дисфункция эндотелия * сосудов микроциркуляторного русла костной ткани проксимального метафиза бедренной кости, по-видимому, являющаяся частным случаем развития «системной» гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции и выражающаяся в достоверном увеличении значения КЭД у крыс после билатеральной овариэктомии. Одновременно с этим наблюдалось достоверное снижение среднего уровня микроциркуляции в костной ткани бедра по сравнению с интактными(Л-О) животными. При анализе результатов гистоморфометрии костной ткани обнаружили, что у самок крыс линии Вистар через восемь недель после билатеральной овариэктомии развиваются генерализованные остеопоротические изменения костей скелета, выражающиеся в истончении костных трабекул в бедренных, плечевых костях и поясничных позвонках в среднем на 39,4% (по сравнению с интактными (Л-О) крысами) и появлении микропереломов трабекул. Наибольшие патологические изменения претерпевала губчатая костная ткань тел позвонков. Кроме того, наблюдалось наличие прямой тесной связи между уровнем микроциркуляции и средней шириной костных трабекул проксимального метафиза бедра как у крыс с остеопорозом, так и у интактных (Л-О) животных, свидетельствующее о подтверждении факта активной роли кровоснабжения в процессах костного ремоделирования.

Таким образом, комплекс патологических изменений, обнаруженный через восемь недель после билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Вистар, подтверждает предложенную нами" теорию развития остеопороза: эндотелиальная дисфункция сосудов микроциркуляторного русла костной ткани, ухудшая кровоснабжение кости, принимает участие в разобщении процессов костного ремоделирования и, как следствие, развитии генерализованного остеопороза.

Следовательно, эндотелиотропные препараты в дозировках, оказывающих эффективное эндотелиопротективное действие, теоретически должны оказывать положительное влияние на регионарную микроциркуляцию, а также обладать некоторой остеопротективной активностью. В соответствии с этим было изучено остеотропное действие ингибитора АПФ эналаприла и блокатора ATI-рецепторов лозартана в дозировках 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно, обладающих доказанной эндотелиопротективной активностью [31, 68, 85].

В подтверждение нашей теории эналаприл и лозартан, усиливая эндотелийзависимое расслабление сосудов костной ткани, нормализовали показатели КЭД, приводя их к значениям интактных (JI-0) животных. Изучаемые препараты повышали уровень микроциркуляции в проксимальном метафизе бедра до значений, достоверно не отличающихся от таковых у интактных (Л-О) крыс. Эналаприл и лозартан также оказывали статистически значимое влияние на среднюю ширину костных трабекул во всех изучаемых локализациях: эналаприл увеличивал ширину трабекул в среднем на 29,5%, лозартан — на 45,9% по сравнению с крысами, страдающими остеопорозом. При этом лозартан обладал достоверно более сильным остеопротективным действием, чем эналаприл. Это можно объяснить большей степенью сродства препарата к ренин-ангиотензин-альдостероновой системе.

Следуя логике, вполне корректно предположить, что, если препараты обладают положительным влиянием на процессы костного ремоделирования, они также способны позитивно влиять на репарацию повреждений костей. Для подтверждения этого положения изучали влияние препаратов на заживление экспериментальных переломов проксимального метафиза бедра у крыс.

Выяснили, что по сравнению с переломами у животных без остеопороза заживление остеопоротических переломов бедренной кости у крыс протекает на фоне снижения кровоснабжения зоны перелома, что, несомненно, негативно отражается на результатах сращения переломов. Так, у крыс с остеопоротическими переломами проксимального метафиза бедра число неудовлетворительных исходов консолидации переломов в виде несращения было в два раза больше, чем у животных с аналогичными переломами бедра без остеопороза.

Эналаприл и лозартан на модели остеопоротических переломов увеличивали значения микроциркуляции в межотломковой зоне не только выше соответствующих показателей у крыс с остеопоротическими переломами, но и выше показателей микроциркуляции у животных с переломами без остеопороза. При этом лозартан оказывал более выраженное влияние на кровоснабжение зоны перелома, чем эналаприл. Что касается результатов сращения экспериментальных остеопоротических переломов, то препараты статистически значимо увеличивали количество положительных исходов консолидации, а у крыс, получавших лозартан, сращение переломов наблюдалось в 100% случаев.

Таким образом, ингибитор АПФ эналаприл и блокатор ATI-рецепторов лозартан, оказывая эндотелиопротективное воздействие на эндотелий микроциркуляторного русла костной ткани, эффективно предотвращают снижение регионарного кровоснабжения в костной ткани при остеопорозе и экспериментальных остеопоротических переломах, и, следовательно, обладают остеопротективным действием, заключающимся в положительном влиянии указанных препаратов на процессы костного ремоделирования и остеорепарации.

Из этого следует, что спектр плейотропного действия препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью может быть расширен за счет добавления остеопротективного элемента, что, однако, требует проведения дополнительных исследований.