Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование эндотелио- и остеопротективных эффектов некоторых антиоксидантов

На нравах рукописи

484ЮЧЛ.

Стабровская Надежда Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОТЕЛИО- И ОСТЕОПРОТЕКТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ НЕКОТОРЫХ АНТИОКСИДАНТОВ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курск-2011

з 1 г.;;.? 2011

4841842

Работа выполнена на базе Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Покровский Михаил Владимирович Дубровин Григорий Менделевич

Провоторов Владимир Яковлевич Демидова Марина Александровна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

2011 г. в /■¿¿а а

Защита состоится « / ^ » ¿Л^/*у ь-С/ЛЛ^) 2011 г. в / А ✓ б^часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета.

Пашин Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) и остеопороз (т.е. снижение костной массы и нарушения микроархитектоники кости) являются основными проблемами здравоохранения в мире, распространенность которых растет с возрастом. Социально-экономическое бремя для общества от остеопороза и ССЗ огромно. Остеопоротические переломы и проявления ССЗ являются основными в структуре заболеваемости и преждевременной смертности у пожилых. Более того, женщины в постменопаузе имеют больший риск развития одновременно и остеопороза, и ССЗ. Фактически, как только женщина достигает возраста менопаузы, риск развития обоих заболеваний значимо увеличивается (Marcovitz P.A., Nran H.H., Franclin В .A. et al., 2005).

В течение многих лет считалось, что остеопороз и ССЗ являются независимыми хроническими заболеваниями, распространенность которых увеличивается с возрастом. Но все больше находится свидетельств того, что между ними существует прямая связь. Например, минеральная плотность кости (МПК) обратно пропорциональна кальцификации коронарных артерий и/или аорты (Makovey J., Chen J.S., Hayward С. et al., 2009) и прямо пропорциональна уровню холестерина липопротеинов высокой плотности.

Клинические популяционные исследования также выявили связь между ССЗ и остеопорозом. Например, высокая скорость потери костной массы характерна для больных сахарным диабетом, у которых тоже выражены сосудистые нарушения (Белых O.A. и др., 2005).

Потенциальная связь между этими хроническими заболеваниями имеет значимые последствия для здоровья многих людей с ССЗ и остеопорозом.

В последние годы публикуется много экспериментальных и клинических работ, посвященных роли эндотелиальной дисфункции (ЭД) в возникновении и прогрессировании ряда заболеваний сердечно-сосудистой системы (атеросклероз, гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца (ИБС), инфаркт миокарда и др.).

На сегодняшний день в коррекции эндотелиальной дисфункции перспективным считают использование препаратов, оптимизирующих клеточный энергообмен, уменьшающих содержание липопероксидов в сосудистой стенке и крови и увеличивающих биодоступность NO за счет «улавливания» свободных радикалов кислорода (Голиков А.П. и соавт., 2003).

В связи с этим на сегодняшний день немаловажной задачей является поиск, разработка и изучение новых препаратов антиоксидантной терапии, способных предупреждать и лечить болезни человека.

В настоящее время проводится широкий поиск и тестирование свойств и активности различных новых ингибиторов свободных радикалов и их смесей. Примером таких антиоксидантов являются производные 3-оксипиридина (мексидол, эмоксипин, проксипин и ряд других), которые широко используются как в клинической, так и в экспериментальной медицине. Производные 3-оксипиридина, с одной стороны, относятся к классу шестичленных азотистых гетероциклов, с другой - к простейшим гетероциклическим аналогам ароматических фенолов. В связи с этим они проявляют антиоксидантные и антирадикальные свойства, обладают широким спектром воздействия на различные .механизмы регуляции метаболической активности клеток.

Также многочисленные экспериментальные исследования показали, что резвератрол наряду с гиполипидемической, антиоксидантной, эстрогенной, антиагрегационной активностью обладает также кардиопротективной и эндотелиотропной активностью в опытах in vitro. Эндотелиотропная активность резвератрола обусловлена активацией фермента eNOS (Leikert J.F., 2002; Naderali Е.К.,2000).

Данное исследование посвящено изучению эндотелио- и кардиопротективных, а также остеопротективных свойств нового производного 3-оксипиридина - этоксидола и фитоалексина резвератрола.

Номер государственной регистрации темы - 01.2.009 52877.

Цель исследования: оценить эндотелио- и остеопротективное действие антиоксидантов этоксидола и резвератрола: эндотелиопротективное действие в сравнении с аскорбиновой кислотой на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и остеопротективное действие в сравнении с препаратом кальций-ДЗ Никомед при гипоэстрогениндуцированном остеопорозе.

Задачи исследования:

1. Изучить эндотелио- и кардиопротективные эффекты этоксидола при L-NAME-индуцированном дефиците NO в эксперименте по физиологическим, биохимическим и морфологическим показателям.

2. Изучить эндотелио- и кардиопротективные эффекты резвератрола при L-NAME-индуцированном дефиците N0 в эксперименте по физиологическим, биохимическим и морфологическим показателям.

3. Изучить эндотелио- и кардиопротективные эффекты аскорбиновой кислоты при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците N0 в эксперименте по физиологическим, биохимическим и морфологическим показателям.

4. Изучить остеопротективное действие этоксидола на модели билатеральной овариэктомии.

5. Изучить остеопротективное действие резвератрола на модели билатеральной овариэктомии.

6. Изучить остеопротективное действие препарата кальций-ДЗ Никомед на модели билатеральной овариэктомии.

Научная новизна. В работе впервые показано, что новое производное 3-оксипиридина этоксидол в дозе 25 мг/кг оказывает эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной МО-дефицитной ЭД, выражающееся в нормализации экдотелийзависимого расслабления и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД).

Продемонстрировано, что этоксидол в дозе 25 мг/кг оказывает выраженное кардиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной МО-дефицитной ЭД, выражающееся в предотвращении повышения адренореактивности и снижения миокардиального резерва.

Установлено, что этоксидол в дозе 25 мг/кг предотвращал увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов, вызванное Ь-МАМЕ-индуцированной МО-дефицитной ЭД.

Выявлено, что по выраженности эндотелио- и кардиопротективного действия исследованные антиоксиданты расположились в следующей последовательности: резвератрол > этоксидол > аскорбиновая кислота.

Обнаружено, что через восемь недель после билатеральной овариэктомии развивающийся генерализованный остеопороз характеризуется значительным снижением уровня микроциркуляции в проксимальном метафизе бедренной кости, отрицательной динамикой морфологических показателей, наличием тесной прямой зависимости между величиной кровоснабжения кости и шириной костных трабекул в ней.

При этом впервые продемонстрировано, что остеопротективньш действием обладали резвератрол 2 мг/кг и кальций-ДЗ Никомед в дозе 85,7 мг/кг; наиболее выраженным действием обладал резвератрол; препараты эффективно предотвращали снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани. Этоксидол в дозе 12,5 мг/кг на модели билатеральной

овариэктомии через восемь недель после билатеральной овариэктомии у крыс не обладал остеопротективным действием.

Научная новизна подтверждается 3 положительными решениями по заявкам на получение патентов РФ.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность применения препарата этоксидол для коррекции L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что препарат позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид натрия (эндотелийнезависимая вазодилатация), предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессию NO-синтетазы), а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и адренореактивность).

Экспериментально доказано, что введение нового производного 3-оксипиридина этоксидола вызывает коррекцию NO-дефицитной эндотелиальной дисфункции.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания препарата этоксидол при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

Внедрение результатов научных исследований. Результаты работы используются в лекционных курсах кафедры фармакологии ГОУ ВПО КГМУ, кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ГОУ ВПО БелГУ и кафедры фармакологии, клинической фармакологии и фармации медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет».

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых КГМУ (Курск, 20092010), III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010), XVII Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии; травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии; клинической фармакологии; внутренних болезней № 2; анатомии человека; биоорганической химии;

инфекционных болезней и эпидемиологии; мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф; нормальной физиологии им. профессора A.B. Завьялова; общей химии; фармакогнозии и ботаники; НИИ экологической медицины КГМУ.

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе четыре из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, выносимые на защиту:

1. Этоксидол, резвератрол и аскорбиновая кислота оказывают эндотелио-и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, выражающееся в уменьшении коэффициента эндотелиальной дисфункции, снижении адренореактивности, предотвращении исчерпания миокардиального резерва, нормализации биохимических маркеров и морфометрических показателей кардиомиоцитов и сосудистой стенки.

2. Через восемь недель после билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Вистар развивается снижение микроциркуляции костной ткани, сопровождающееся увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного по результатам лазерной допплеровской флоуметрии в кости. Как следствие, значительно ухудшается кровоснабжение костной ткани, что приводит к развитию генерализованного остеопороза, проявляющегося истончением и микропереломами костных трабекул.

3. Резвератрол в дозе 2 мг/кг и кальций-ДЗ Никомед в дозе 85,7 мг/кг на модели билатеральной овариэктомии через восемь недель ежедневного назначения проявляли остеопротективное действие; наиболее выраженным эффектом обладал резвератрол, препарат эффективно предотвращал снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани. Этоксидол в дозе 12,5 мг/кг через восемь недель после билатеральной овариэктомии у крыс не обладал остеопротективным действием.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 234 источника, из которых 83 отечественных и 151 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 26 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250300 г. Животные были разделены на 8 групп (п=10). N-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг. На 8 день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей гемодинамики; болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и аппаратно-программного комплекса "Bioshell". Проводили функциональные сосудистые пробы путем внутривенного введения растворов ацетилхолина (40 мкг/кг) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Покровский М.В. и соавт., 2005-2010).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика P23ID "Gould", США, АЦП L-154 и аппаратно-программного комплекса "Bioshell" регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность - внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 110"5 моль/л, из расчета ОД мл на 100 г (Меерсон Ф.З., 1980).

2. Нагрузка сопротивлением - пережатие восходящей аорты на 30 сек (Меерсон Ф.З., 1980).

3. 3-минутная гипоксия с последующей реоксигенацией (Пашин E.H.,

1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов N0, позволяющая проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и

нитритов. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Чувствительность метода на приборе Labsystems Multiskan МСС/340 составляет 1,7 мкМ. Для колориметрического определения нитрит-иона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0,05% раствор N-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида в 30% уксусной кислоте). Для приготовления раствора хлористого ванадия 400 мг VCU растворяли в 50 мл IN HCl.

Суммарную концентрацию нитратов и нитритов, N0* определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящим в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaN02 в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой.

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца. Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использованы окраски гематоксилином Pero и эозином для выявления ранних повреждений кардиомиоцитов, по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция. При морфометрии сердца использован метод определения диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова.

Моделирование генерализованного остеопороза

Опыты проводили на самках белых крыс линии Вистар массой 200-300 г. Для моделирования системного остеопороза крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг и проводили операцию билатеральной овариэктомии (М. Stimpel, W.S. Jee, Y. Ма et al., 1995). Развитие генерализованного остеопороза оценивали гистоморфометрически через восемь недель (на 57-й день) после проведения овариэктомии, при этом группой сравнения служили интактные животные, которым была проведена операция ложной овариэктомии (ЛО).

Измерение уровня микроциркуляции в кости. Уровень микроциркуляции оценивали в ткани проксимального метафиза бедренной кости. Для этого после наркотизации (хлоралгидрат 300 мг/кг) производили хирургический доступ к

проксимальному метафизу бедра. После засверливания отверстия глубиной 2,5-3 мм в проксимальном метафизе бедра в него вводили датчик, используемый для измерения микроциркуляции. Для получения данных о состоянии микроциркуляции в кости использовали оборудование производства компании Biopac systems: полиграф МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и инвазивным датчиком TSD144. Регистрация и обработка результатов ЛДФ производилась с помощью программы AcqKnowledge версии З.8.1., значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕ).

Гистоморфометрическая оценка изменений, происходящих при генерализованном остеопорозе и его коррекции. Для подтверждения развития генерализованного остеопороза и в комплексной оценке эффективности исследуемых препаратов проводили морфологическое исследование костной ткани проксимальных метафизов бедренных костей. Материал фиксировали в 10% растворе формалина с последующей проводкой, заливкой в парафин и окрашиванием гематоксилин-эозином (Г-Э). Предметные стекла с гистологическими препаратами подвергали световой микроскопии при помощи микроскопа Leica СМЕ (увеличение хЮО: объектив хЮ, окуляр хЮ) и производили фотографирование костных балок цифровым фотоаппаратом Olympus SP-350 с разрешением 3264x2448 пикселей путем сопоставления объектива фотокамеры и окуляра микроскопа.

Для проведения гистоморфометрии костной ткани использовали программу ImageJ версии 1.43, предварительно откалиброванную следующим образом. Используя то же оборудование, что и для получения фотографий, сфотографировали «линейку» длиной 1 мм на прозрачной подложке. Измерив в программе ImageJ «линейку» в пикселях, приняли расстояние в 1425 пикселей равным 1 мм. В дальнейшем измеряли ширину костных трабекул и выражали ее в микрометрах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование эндотелиопротективной активности этоксидола, резвератрола и аскорбиновой кислоты при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований

Согласно дизайну исследования в контрольной группе животных эндотелиальную дисфункцию моделировали ежедневным внутрибрюшинным

введением в течение 7 суток Ь-МАМЕ в дозе 25 мг/кг. Этоксидол в дозе 25 мг/кг, резвератрол 2 мг/кг и аскорбиновую кислоту 60 мг/кг вводили внутрибрюшинно, в течение 7 суток, в утренние часы. По протоколу на восьмые сутки наркотизированное животное брали в эксперимент.

Результаты влияния этоксидола, резвератрола и аскорбиновой кислоты на показатели артериального давления у наркотизированных крыс с моделированием 1ЖАМЕ-индуцированной патологии представлены на рисунке 1.

На рисунке 1 также представлены результаты функциональных проб на эндотелийзависимое и эндотелийнезависимое расслабление сосудов у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией на фоне лечения исследуемыми препаратами с последующим расчетом КЭД. Обнаружено, что препараты этоксидол 25 мг/кг, резвератрол 2 мг/кг и аскорбиновая кислота 60 мг/кг эффективно снижали КЭД.

Для оценки функциональных возможностей миокарда на фоне изучаемых препаратов у животных с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота проводились нагрузочные пробы.

Как представлено на рисунке 1, использование этоксидола и резвератрола предотвращало повышение адренореактивности у животных с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологии, а также снижало абсолютные цифры ЛЖД на пробе с введением адреналина. Аскорбиновая кислота 60 мг/кг не проявляла протективного действия в ходе проведения функциональной пробы с введением адреналина.

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением (рис. 1) значение прироста ЛЖД к 25-й секунде пережатия восходящей аорты в группе с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 составило 66,0% по отношению к 5-й секунде, тогда как у интактных животных - 83,6%. В группе животных, получавших этоксидол, - 71,4%, резвератрол - 74,4%, аскорбиновую кислоту - 80,1%.

МО-продуцирующая функция эндотелия исследована на основании данных увеличения экспрессии еМОБ и содержания нитрит-ионов (рис. 1). Обнаружено, что использование препаратов этоксидол и аскорбиновая кислота в изученных дозах оказывает статистически значимое максимальное увеличение экспрессии еМОБ. При этом прирост процента экспрессии еЫОЗ от контроля составил 37,5±4,3% и 36,1 ±3,9% соответственно. Использование резвератрола 2 мг/кг не оказывает статистически значимого влияния на увеличение экспрессии е-Ж)8.

247,3'

210,3" 209,9

5 150

12 3 4

Экспрессия е-ЫОБ

Артериальное давление

Коэффициент эндотелиальной дисфункции

4 5 12

Диаметр кардиомиоцитов

40

1 2 3 4 5

Адренореактивность

300

1 2 3 4 5

Нагрузка сопротивлением

Концентрация нитрит-ионов

Рис. 1. Влияние препаратов этоксидол, резвератрол, аскорбиновая кислота на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0,

Примечание. 1 - интактные; 2 - ЫЧАМЕ 25 мг/кг/сут; 3 - Ь-КАМЕ + этоксидол 25 мг/кг/сут; 4 - Ь-ЫАМЕ + резвератрол 2 мг/кг/сут; 5 - 1ЖАМЕ + аскорбиновая кислота 60 мг/кг/сут; * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** - р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших Е-ЫАМЕ.

Концентрация нитрит-ионов под влиянием исследуемых препаратов увеличивалась достоверно в группах животных, которым вводились препараты этоксидол и резвератрол, приближаясь к группе интактных животных, и составляла 92,3±8,5 и 107,9±5,4 мкМоль соответственно. Что касается изменений содержания нитрит-ионов под влиянием аскорбиновой кислоты, то достоверных отличий от группы с патологией обнаружено не было.

При морфологическом исследовании сердца отмечалась разная степень выраженности кардиопротективного эффекта у исследуемых препаратов (рис. 1). Так, в группе животных, получавших аскорбиновую кислоту и резвератрол, наблюдалась наименьшая степень предотвращения гипертрофии кардиомиоцитов на фоне моделирования Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота. В то же время кардиопротективные эффекты этоксидола, выражающиеся в более выраженном приближении диаметра кардиомиоцитов к группе животных, достоверно отличались от группы контроля.

Таким образом, все исследуемые препараты проявляли эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, но более выраженными эффектом обладали этоксидол и резвератрол, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в увеличении экспрессии еЮБ и предотвращении снижения содержания нитрит-ионов. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования кардиомиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием резвератрола 2 мг/кг и этоксидола 25 мг/кг увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов у животных с ЫЧАМЕ-индуцированной патологией. Аскорбиновая кислота проявляла кардиопротективное действие в меньшей степени.

2. Изучение остеопротективного действия этоксидола и резвератрола в сравнении с препаратом кальций-ДЗ Никомед на модели генерализованного остеопороза в эксперименте с использованием результатов измерения микроциркуляции в кости и гистоморфометрического исследования

Результаты ЛДФ позволили констатировать достоверно более низкий уровень микроциркуляции в костной ткани у крыс через восемь недель после овариэктомии по сравнению с интактными животными (рис. 2).

□ Интактные й Остеопороз Рис. 2. Показатели микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных.

Генерализованные остеопоротические изменения в костях скелета были гистологически подтверждены у всех крыс через восемь недель после овариэктомии: наблюдалось истончение костных трабекул (рис. 3).

Рис. 3. Морфологическая картина среза проксимального метафиза бедренной кости у интактного животного (1) и крысы с остеопорозом (2) (окр. гематоксилин-эозином (Г-Э), ув. 100).

80 ПЕ 60

Кроме того, в отдельных гистологических препаратах отмечались микропереломы костных трабекул (рис. 4). Прорастание пучков соединительной ткани в месте микроперелома свидетельствовало о прижизненном возникновении повреждений трабекул.

Рис. 4. Микроперелом костной трабекулы у крысы с остеопорозом (1) (окр. Г-Э, ув. 400).

Объективной мерой оценки развития генерализованного остеопороза через восемь недель после билатеральной овариэктомии стало статистически значимое уменьшение средней ширины костных трабекул. Так, средняя ширина костной трабекулы у крыс с экспериментальным остеопорозом в проксимальном метафизе бедра была меньше показателя интактных животных на 36,8% (рис, 5).

□ Интактные я Остеопороз

Рис. 5. Средняя ширина костных трабекул в проксимальном метафизе бедренной кости у интактных крыс и животных с генерализованным остеопорозом.

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных.

Изучая индивидуальные показатели микроциркуляции и средней ширины костной трабекулы в проксимальном метафизе бедренной кости в обеих группах животных, обратили внимание на наличие определенной зависимости между двумя указанными параметрами. Для подтверждения наличия таковой зависимости рассчитали коэффициент корреляции Пирсона (г) между уровнем микроциркуляции и средней шириной костных трабекул в обеих группах. Кроме того, для сравнения парных значений в группах построили точечные диаграммы зависимости ширины костных трабекул от уровня регионарной микроциркуляции и провели на диаграммах линии регрессии.

Получили следующие значения: в группе интактных животных г=0,7, в группе крыс с остеопорозом г=0,6. Данные значения коэффициента свидетельствуют о наличии достаточно тесной прямой зависимости между уровнем микроциркуляции и средней шириной костной трабекулы в проксимальном метафизе бедра у крыс в обеих группах.

Точечные диаграммы подтвердили наличие прямой зависимости между изучаемыми параметрами в каждой группе и позволили более наглядно визуализировать имеющиеся закономерности (рис. 6).

Рис. 6. Диаграммы зависимости средней ширины костных трабекул от значений регионарной микроциркуляции.

Примечание, 1 - в группе интактных крыс; 2 - в группе животных с остеопорозом.

Таким образом, через восемь недель после проведения билатеральной овариэктомии у самок белых крыс линии Вистар отмечается значительное ухудшение регионарного кровотока в костной ткани, приводящее к дисбалансу процессов костного ремоделирования и в конечном счете к возникновению и развитию генерализованного остеопороза, сопровождающегося истончением костных трабекул и возникновением в них микропереломов. Подтверждением данного положения служит наличие прямой тесной зависимости между

уровнем микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости и шириной костных трабекул в данной локализации у крыс. Этот факт позволяет нам в дальнейшем использовать значения регионарной микроциркуляции в качестве прогностического фактора при оценке влияния изучаемых препаратов на «качество» кости.

Было обнаружено, что этоксидол в дозе 12,5 мг/кг не предотвращал снижения уровня регионарного кровотока в костной ткани бедра крыс. Результаты проведения ЛДФ в группе крыс, получавших этоксидол, достоверно отличались от таковых в группе интактных (ЛО) животных (р<0,05) и статистически значимо не различались между собой (р=0,444), а также достоверно не отличались от показателей в группе крыс с остеопорозом (р=0,433 и р=0,999 соответственно). В группе животных, ежедневно получавших в течение восьми недель после овариэктомии внутрибрюшинно резвератрол в дозе 2 мг/кг, наблюдалось статистически значимое повышение среднего уровня микроциркуляции в проксимальном метафизе бедра по сравнению с контрольной группой до 91,0+12,8 ПЕ (р<0,05 ) (рис. 7).

о.о

61,5

Рис. 7. Влияние этоксидола, резвератрола и кальция-ДЗ Никомед на показатели микроциркуляции в костной ткани проксимального метафиза бедренной кости. Примечание: 1 - интактные; 2 - остеопороз; 3 - остеопороз + этоксидол 12,5 мг/кг/сут; 4 - остеопороз + резвератрол 2 мг/кг/сут; 5 - остеопороз + кальций-ДЗ Никомед 85,7 мг/кг/сут.

* - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных;

**- р<0,05 по сравнению с группой хрыс с экспериментальным остеопорозом.

При световой микроскопии срезов бедренных костей у крыс, получавших лечение, обнаружили отсутствие микропереломов трабекул, сохранение структуры костной ткани. В группах крыс, получавших этоксидол, наблюдалась несколько большая ширина костных трабекул, чем у крыс с остеопорозом, впрочем, различия не переходили порога статистической

значимости. В группе крыс, получавших в течение восьми недель после овариэктомии резвератрол и кальций-ДЗ Никомед, наблюдалось достоверное увеличение средней ширины костных трабекул по сравнению с животными контрольной группы до 90,0+2,0 мкм и 70,5±1,5 мкм соответственно (рис. 8).

Таким образом, в результате исследования выявили, что этоксидол 12,5 мг/кг через восемь недель после билатеральной овариэктомии у крыс не обладал остеопротективным действием. Статистически значимым остеопротективным действием обладал резвератрол 2 мг/кг и кальций-ДЗ Никомед 85,7 мг/кг. Более выраженным остеопротективным действием обладал резвератрол, что выражалось в предотвращении истончения костных трабекул, отсутствии микропереломов и, таким образом, в замедлении развития генерализованного остеопороза.

1 2 3 4 5

Рис. 8. Влияние этоксидола, резвератрола и кальция-ДЗ Никомед на значение средней ширины костной трабекулы в проксимальном метафизе бедренной кости у самок крыс через восемь недель после овариэктомии. Примечание: ! - интактные; 2 - остеопороз; 3 - остеопороз + этоксидол 12,5 мг/кг/сут; 4 - остеопороз + резвератрол 2 мг/кг/сут; 5 - остеопороз + кальций-ДЗ Никомед 85,7 мг/кг/сут.

* - р<0,05 по сравнению с группой интактных животных;

**- р<0,05 по сравнению с группой крыс с экспериментальным остеопорозом.

выводы

1. Новое производное 3-оксипиридина этоксидол в дозе 25 мг/кг/сут проявлял эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Е-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до значения 2,3 по сравнению с 5,4 у животных, получавших Ь-КАМЕ, а также в увеличении экспрессии еЬ'ОЯ (до 37,7% по сравнению с 21,4% от контроля в контрольной группе) и предотвращении снижения концентрации нитрит-ионов (92,3 мкмоль/л по сравнению с 114,1 мкмоль/л у интактных и 61,2 мкмоль/л у контрольных животных). Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и улучшение результатов проб на нагрузку сопротивлением. Морфометрические исследования кардиомиоцитов обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов под влиянием этоксидола у животных с Ь^АМЕ-индуцированной патологией (12,8 мкм по сравнению с 18 мкм в контрольной группе).

2. Резвератрол в дозе 2 мг/кг/сут на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота проявлял эндотелио- и кардиопротективное действие, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции практически до уровня интактных животных (1,2 по сравнению с 1,1 у интактных крыс), а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов (107,9 мкмоль/л по сравнению с 61,2 мкмоль/л у животных с Ь-ЫАМЕ-патологией). Результаты нагрузочных проб свидетельствовали о выраженной кардиопротективной активности препарата. Морфологические исследования выявили способность препарата предотвращать возникновение гипертрофии кардиомиоцитов у животных на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота: поперечный диаметр кардиомиоцитов был в среднем равен 13,9 мкм по сравнению с 18 мкм у крыс, получавших Ь-ЫАМЕ.

3. Аскорбиновая кислота в дозе 60 мг/кг/сут обладала эндотелио- и кардиопротективным действием на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота. Это выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (до значения 2,1 по сравнению с 5,4 у животных, получавших Ь-ЫАМЕ), а также в увеличении экспрессии еМ08 (до 36,1% по

сравнению с 21,4% от контроля в группе Ь-ЫАМЕ-патологии). Результаты нагрузочных проб выявили улучшение результатов проб на нагрузку сопротивлением относительно группы контроля. Препарат предотвращал увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов на выбранной модели патологии.

4. Резвератрол в дозе 2 мг/кг/сут обладал остеопротективным действием на модели остеопороза, вызванного билатеральной овариэктомией, что выражалось в предотвращении снижения уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани бедра (91,0 ПЕ по сравнению с 61,6 ПЕ у крыс с остеопорозом) и истончения костных трабекул (средняя ширина трабекул в бедренной кости составляла 90,0 мкм по сравнению с 61,7 мкм у животных с остеопорозом), а также отсутствии микропереломов.

5. Этоксидол в дозе 12,5 мг/кг через восемь недель после билатеральной овариэктомии у самок крыс линии Вистар не оказывал статистически значимого влияния на уровень регионарной микроциркуляции и ширину костных трабекул.

6. Кальций-ДЗ Никомед в дозе 85,7 мг/кг на модели остеопороза, вызванного билатеральной овариэктомией, не оказывал влияния на кровоснабжение костной ткани, но вместе с тем обладал положительным воздействием на ширину костных трабекул в проксимальном метафизе бедренной кости у крыс (средняя ширина костных трабекул составила 70,5 мкм по сравнению с 61,7 мкм у крыс с остеопорозом).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Использование металлокомплексных соединений с антиоксидантными свойствами для фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / Л.М. Даниленко, Э.А. Парфенов, М.В. Покровский, Н.Г. Туманова, В.А. Метельская, К.Е. Бобраков, В.А. Рагулина, Н.В. Стабровская, В.А. Савин // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 5. - С. 20-24.

2. Эндотелий костных сосудов как мишень фармакологического воздействия при экспериментальном остеопорозе / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, М.В. Покровский, Г.М. Дубровин, В.А. Рагулина, Н.В. Стабровская, Н.Ю. Коклина // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - JVs 5. - С. 116-121.

3. Модель экспериментального гипоэстрогенного остеопороза / О.С. Гудырев, Н.Ю. Коклина, М.В. Корокин, A.C. Белоус, Н.В. Стабровская // IV Международная научная конференция молодых ученых-медиков (25-26 февраля 2010 г., г. Курск). - Курск: КГМУ, 2010. - Т. 1. - С. 304-305.

4. Фармакологическая коррекция микроииркуляторных нарушений при экспериментальном остеопорозе / О.С. Гудырев, Н.Ю. Коклина, Н.В. Стабровская, М.В. Корокин, A.C. Белоус // IV Международная научная конференция молодых ученых-медиков (25-26 февраля 2010 г., г. Курск). -Курск: КГМУ, 2010. - Т. 1. - С. 310-311.

5. Кардиопротективные эффекты нового производного 3-оксипиридина при моделировании L-NAME-индуцированного оксида азота / М.В. Корокин, Н.В. Стабровская, J1.B. Корокина, О.С. Гудырев, A.C. Белоус // IV Международная научная конференция молодых ученых-медиков (25-26 февраля 2010 г., г. Курск). - Курск: КГМУ, 2010. - Т. 2. - С. 116-117.

6. Кардиопротективные эффекты нового производного 3-оксипиридина /

B.А. Рагулина, М.В. Корокин, М.В. Покровский, Н.В. Стабровская, О.С. Гудырев, Л.В. Корокина, Н.В. Королева, Е.Б. Артгошкова, Т.Г. Покровская // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г., г. Москва). - Москва, 2010. - С. 708.

7. Фармакологическая коррекция нарушений микроциркуляции на модели экспериментального остеопороза / A.B. Файтельсон, О.С. Гудырев, М.В. Покровский, Г.М. Дубровин, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова, М.В. Корокин, Н.Ю. Коклина, A.C. Белоус, В.А. Рагулина, Н.В. Стабровская // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г., г. Москва). - Москва, 2010. - С. 731-732.

8. Резвератрол в фармакологической коррекции микроциркуляторных нарушений при экспериментальном остеопорозе / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский, Н.Ю. Коклина, М.В. Корокин, A.C. Белоус, Н.В. Стабровская, Е.В. Артюшкова // III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (7-8 июня 2010 г., г. Курск). - Курск, 2010. -

C. 190-192.

9. Изучение модели гипоэстрогенного остеопороза на экспериментальных животных / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, М.В. Покровский, Н.Ю. Коклина, М.В. Корокин, A.C. Белоус, Н.В. Стабровская, Е.В. Артюшкова // III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (7-8 июня 2010 г., г. Курск). - Курск, 2010. - С. 193-195.

10. Роль эндотелиальной дисфункции в развитии остеопоротических изменений костей скелета / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, Н.Ю. Коклина, Н.В. Стабровская, А.Ш. Ванян, P.A. Нарыков // Третья международная дистанционная научная конференция «Инновации в медицине» (декабрь 2010 г., г. Курск). - Курск, 2010. - С. 47-48.

11. Остеопротективные свойства резвератрола при экспериментальном остеопорозе / О.С. Гудырев, A.B. Файтельсон, Н.Ю. Коклина, Н.В. Стабровская // Третья международная дистанционная научная конференция «Инновации в медицине» (декабрь 2010 г., г. Курск). - Курск,

2010.-С. 55-56.

12. Влияние антиоксидантов на эндотелиальную дисфункцию при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / В.И. Якушев, Н.В. Стабровская, В.А. Рагулина, Т.Г. Покровская, М.В. Корокин, E.H. Пашин, Т.В. Долженкова, A.B. Бабко, Е.Г. Терехова,

A.B. Файтельсон, A.A. Барсук, Т.Н. Чулнжова // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 9. - С. 187-190.

13. Изучение кардиопротективной активности производного 3-оксипиридина / В.А. Рагулина, М.В. Корокин, М.В. Покровский, Н.В. Стабровская, О.С. Гудырев, Т.Г. Покровская, И.М. Колесник // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. -

2011.-№3.-С. 118.

14. Исследование эндотелиопротективных свойств этоксидола при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте / Н.В. Стабровская, В.А. Рагулина, М.В. Корокин, О.С. Гудырев, М.В. Покровский // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2011. -№ 3. - С. 123-124.

15. Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов препаратов эгоксидол и резвератрол при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / Н.В. Стабровская,

B.А. Рагулина, М.В. Корокин, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, О.С. Гудырев // Врач-аспирант. - 2011. - № 1.2(44). - С. 304-310.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 11.03.2011 г. Подписано в печать 12.03.2011 г. Формат 30x42 /8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 152"А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.