Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Особенности участия белков S100b, HLDF, и аутоантител к ним в развитии цереброваскулярных осложнений гипертонической болезни

4858620

На правах рукописи

ЕЛИСТРАТОВА ЕЛЕНА ИГОРЕВНА

ОСОБЕННОСТИ УЧАСТИЯ БЕЛКОВ вМОЬ, Н!^ И АУТОАНТИТЕЛ К НИМ В РАЗВИТИИ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 3 НОЯ 2011

Москва-2011

4858626

Работа выполнена в лаборатории функциональной нейрохимии Учреждения РАМН НИИ Нормальной физиологии имени П. К. Анохина РАМН.

Научные руководители: кандидат химических наук

МАРИНА АЛЕКСЕЕВНА ГРУДЕНЬ

доктор медицинских наук ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА ДАВЫДОВА

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

ДИНА МИРОНОВНА МЕРКУЛОВА

доктор медицинских наук, профессор ГАЛИНА АЛЕКСАНДРОВНА ДРОЗДОВ А

Ведущее учреждение:

ГБОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. ■ И.М. Сеченова

Автореферат разослан «_»_2011г.

Защита диссертации состоится «_»_2011г. в_часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 при УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии Российской АМН по адресу: 125315, г.Москва, ул-Балгийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Гипертоническая болезнь (ГБ) является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний среди трудоспособного населения в большинстве стран мира (Синькова Г.М., 2007; Kearney P.M. et al., 2005). По данным ВОЗ, в экономически развитых странах повышение артериального давления (АД) отмечается у 25% взрослого населения, а среди лиц старше 65 лет - более чем в 50% случаев. В Российской Федерации частота встречаемости артериальной гипертонии (АГ) у населения превышает 40% (Чазова И.Е., 2007; Гогин Е.Е., 2010).

Одним из центральных органов-мишеней, страдающих при ГБ, является головной мозг (Скворцова В.И., 2006; Суслина З.А. и др. 2006; Amenta F. et al., 2003). Известно, что AT является причиной развития острых нарушений мозгового кровообращения преходящего характера - церебральных гипертонических кризов (ГК) (Широков Е.А., Симоненко В.Б., 2001; Бокарев И.Н., 2005; Vilela-Martin J.F. et al., 2011), транзиторных ишемических атак (Парфенов В.А. и др., 2009; Zhang W.W. et al., 2009), или стойкого характера - геморрагических и ишемических инсультов (Wu C.Y. et al., 2010; Mancia G. et al., 2011), а также хронической прогрессирующей недостаточности мозгового кровообращения - дисциркуляторной энцефалопатии и сосудистой деменции (Камчатнов П.Р. и др., 2007; Зверева З.Ф. и др., 2010; Richard Е. et al., 2010; Sharp S.I. et al., 2011). В настоящее время доля смертности от сердечно-сосудистых заболеваний составляет 53,1%, при этом 35,4% случаев обусловлено именно цереброваскулярными осложнениями ГБ (Харченко В.И. и др., 2005; Гусев Е.И. и др., 2006; Morentin В., Audicana С., 2011).

В связи с широким распространением ГБ и связанных с ее развитием цереброваскулярных заболеваний (ЦВЗ), таких как церебральный ГК и острый ишемический инсульт (ОНИ), дальнейшее изучение механизмов нарушения регуляции АД, приводящих к ГБ, является актуальным направлением современной медицины, а поиск новых подходов ранней молекулярной диагностики осложнений данного заболевания имеет важное социально-экономическое значение.

Современные представления о нейробиологических и патофизиологических механизмах развития ЦВЗ указывают на ключевую роль нарушения микроциркуляции и трофического обеспечения, а также программированной гибели клеток нервной и сердечно-сосудистой систем (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001; Taoufik Е., Probert L., 2008; Busl K.M., Greer D.M., 2010). В связи с этим особый интерес вызывает изучение вовлеченности в молекулярные механизмы ЦВЗ факторов-регуляторов процессов роста, развития, выживаемости и гибели эндотелиальных, нервных, глиальных клеток. В данном аспекте особое внимание привлекает нейротрофический белок SlOOb (Heizmann C.W. et al., 2002). Имеются многочисленные литературные данные о многообразии функциональной активности, которую проявляет SlOOb как внутриклеточно (Brozzi F. et al., 2009; Zimmer D.B., Weber D.J., 2010), так и в межклеточном пространстве (Donato R., Heizmann C.W.,

2010; Sorci G. et al., 2010). Показано, что данный белок в зависимости от концентрации проявляет нейротрофические или проапоптотические свойства (Sherstnev V.V. et al., 2003; Mori Т. et al., 2010). Продемонстрирована патогенетическая роль повышения концентрации S 100b при ишемическом инсульте (Шерстнев В.В. и др., 2002; Kaca-Orynska М. et al., 2010; Dayon L. et.al., 2011) и других заболеваниях нервной системы (Chaves M.L. et.al., 2010; Moritz S. et al., 2010).

Другим молекулярным регулятором процессов роста и гибели клеток является фактор дифференцировки, гликопротеин HLDF (human leukemia differentiation factor) (Kostanyan I.A. et al., 1994), недавно обнаруженный в крови человека (Sherstnev V.V.,

2004) и в различных структурах головного мозга крыс (Sewell R.D., et al., 2005). Показано, что различные пептидные фрагменты HLDF проявляют как про-, так и антиапоптотическую активность (Костанян И.А. и др., 2000; Шерстнев В.В., и др., 2003; Сторожева З.И. и др., 2004). Установлено, что 24-членный и 8-членный пептидные фрагменты фактора - HLDF-24 и HLDF-8 - обладают выраженной гемодинамической активностью: при внутривенном введении они изменяют АД и частоту сердечных сокращений у нормотензивных и у спонтанно-гипертензивных крыс (Ржевский Д.И. и др., 2006). Имеются данные о структурной гомологии HLDF с эндотелин-превращающим ферментом (Ржевский Д.И. и др., 2005). В совокупности вышеизложенные данные позволяют предположить вовлеченность этого фактора в молекулярное обеспечение функционирования сердечно-сосудистой системы при изучаемых заболеваниях.

В настоящее время особый интерес представляет изучение участия иммунных механизмов в формировании ГБ и ЦВЗ (Harrison D.G. et al., 2011; Zhang Y., Popovich P., 2011). Становится все более очевидной вовлеченность иммунной системы в процессы единой нейроиммуноэндокринной регуляции в норме (Морозов С.Г. и др.,

2005), а также при ГБ (Мингазетдинова Л.Н., 2006; Muller D.N. et al., 2011) и при ОИИ (Скворцова В.И. и др., 2005; Алферова В.В. и др., 2008). В последнее время показано, что аутоантитела (ауто-АТ) к SlOOb и к HLDF могут отражать и/или предопределять состояние когнитивных, психических, двигательных и сосудистых функций пациентов при острых и хронических нарушениях мозгового кровообращения (Грудень М.А. и др., 1999; Грудень М.А., Шерстнев В.В., 2008; Sherstnev V.V., 2004).

Вышеизложенные факты указывают на актуальность изучения вовлеченности белков SlOOb, HLDF, а также идиотипических ауто-АТ (AT) и антиидиотипических ауто-АТ (аи-АТ) к данным белкам в развитие ГБ и ЦВЗ, а также поиска современных подходов молекулярной диагностики разных стадий ГБ, контроля эффективности лечения и прогноза ГБ и ее цереброваскулярных осложнений.

Цель работы заключалась в исследовании участия факторов развития и гибели нервных, глиальных, эндотелиальных клеток - белков SlOOb и HLDF, а также идио/антиидиотипических аутоантител к ним в развитии гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнений.

Задачи исследования:

1. Изучить содержание белков БЮОЬ, НЮТ и уровни идио/антиидиотипических аутоантител ним в сыворотке крови пациентов с гипертонической болезнью, а также в критические периоды развития (на 1, 3, 7 и 21 сутки) церебрального гипертонического криза и острого ишемического инсульта.

2. Сопоставить содержание белка Б.ЮОЬ, уровни идио/антиидиотипических аутоантител к БЮОЬ в сыворотке крови с неврологическими показателями у пациентов с церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

3. Проанализировать соотношение содержания белка Н1ЛЭР, уровней идио/антиидиотипических аутоантител к НЮТ в сыворотке крови и клинических показателей, отражающих функциональное состояние сердечно-сосудистой системы у пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

4. Оценить диагностичес(дто и прогностическую значимость определения белков БЮОЬ, НЮТ и уровней идио/антиидиотипических аутоантител к ним в сыворотке крови пациентов при гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнениях.

Научная новизна. Впервые изучена динамика и выявлены различия в сывороточном содержании белков БЮОЬ и НЮТ, а также в уровнях идио/антиидиотипических ауто-АТ к данным белкам у пациентов в критические периоды развития ГК и ОИИ, а также при не осложненной ГБ. С помощью изучаемых иммунобиохимических показателей - белка БЮОЬ и ауто-АТ к нему -обнаружено нарушение гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) у больных с не осложненным и кризовым течением ГБ. Доказана диагностическая значимость определения антиидиотипических ауто-АТ к БЮОЬ на основе выявленных статистических взаимосвязей их уровня с неврологической симптоматикой пациентов при ГК и ОИИ. У пациентов с ГК обнаружена взаимосвязь концентрации Н1Л5Р и уровня ауто-АТ к НЦ)Р с величиной АД длительностью течения ГБ и выраженностью кардиологической симптоматики (сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца). Впервые документирована благоприятная прогностическая значимость повышения уровня идиотипических ауто-АТ к НЬИР для клинического исхода ОИИ.

Теоретическая и практическая значимость. Подтверждены теоретические предпосылки о том, что факторы развития и гибели нервных, глиальных, эндотелиальных клеток - белки БЮОЬ и Н1ЛЭР - наряду с эффекторами гуморального иммунного ответа - ауто-АТ к рассматриваемым белкам - вовлечены в молекулярные механизмы патогенеза ГБ и ее цереброваскулярных осложнений. Полученные новые экспериментальные данные о молекулярных механизмах патогенеза ЦВЗ, связанных с ГБ, расширяют существующие в настоящее время представления о дизрегуляции нейроиммунных взаимодействий при

5

цереброваскулярной патологии. Полученные данные о различном сывороточном содержании изученных показателей у пациентов, страдающих ГБ, ГК и ОИИ, демонстрируют ранее не описанные особенности молекулярных процессов патогенеза ГБ и одновременную вовлеченность элементов нервной, сердечнососудистой и иммунной систем в патогенетические механизмы ЦВЗ, ассоциированных с ГБ. Полученные результаты позволяют рассматривать системы факторов, состоящие из белков БЮОЬ, Н1ЛМ% АТ и аи-АТ к ним, а также перечисленные факторы по отдельности в качестве молекулярных нейроиммунных биомаркеров для ранней диагностики и прогнозирования цереброваскулярных осложнений ГБ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Гипертоническая болезнь и ее цереброваскулярные осложнения (церебральный гипертонический криз, острый ишемический инсульт) сопровождаются повышением содержания белка ЭЮОЬ и уровня идиотипических антител к нему, а также снижением содержания белка НЮТ и уровня идио/антиидиотипических антител к нему в сыворотке крови пациентов.

2. Содержание белков БЮОЬ, НЮТ и уровни идио/антиидиотипических аутоантител к ним в сыворотке крови коррелируют с клиническими показателями, отражающими функциональное состояние сердечно-сосудистой и нервной систем у пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

3. Системы белков БЮОЬ, НЫЭР и идио/антиидиотипических аутоантител к ним на молекулярном уровне отражают процессы дизрегуляции в нервной, иммунной, и сердечно-сосудистой системах организма при гипертонической болезни, а также могут иметь значение для прогноза развития церебральных осложнений данного заболевания.

Апробация. Основные положения и результаты исследования были доложены на 17-м съезде Европейского колледжа нейрофармакологии (Москва, 2004), Итоговой научной сессии НИИ Нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН (Москва, 2004), XX съезде физиологического сообщества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), юбилейной конференции «Современные возможности клинической лабораторной диагностики», посвященной 20-летию компании БиоХимМак (Москва, 2009), 6-й Российской конференции «Нейроиммунопатология» (Москва, 2010), 7-м Европейском форуме по нейронаукам (Амстердам, 2010), 1-й Международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» (Сафага, 2010), а также на внутрилабораторных конференциях Лаборатории функциональной нейрохимиии НИИ НФ им. П.К.Анохина РАМН (Москва, 2004-2011).

Структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав результатов исследования,

заключения, выводов и списка литературы, содержащего 110 отечественных и 191 иностранный источник. Диссертация изложена на 160-ти страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 45 рисунков.

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 11 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено комплексное клиннко-иммунобиохимическое обследование 117-ти пациентов обоего пола в возрасте 63,0± 11,1 лет. Под наблюдением находились 43 больных с диагнозом гипертоническая болезнь (группа 2) и 34 больных с диагнозом гипертонический криз (группа 3) отделения кардиологии 2-го Центрального Военного клинического госпиталя им. П.В. Мандрыка (руководитель отделения -д.м.н. И.С. Денищук, консультант - профессор, д.м.н. Е.А. Широков), а также 20 пациентов с впервые диагностированным острым ишемическим инсультом (группа 4) 1-го и Н-го неврологических отделений Городской клинической больницы № 20 г. Москвы (консультант - член-корр. РАМН, профессор, д.м.н В.И. Скворцова). 27 условно здоровых лиц сопоставимого возраста составили контрольную группу (группа 1).

Пациенты всех групп подвергались комплексному клиническому обследованию с уточнением анамнеза заболевания, характера жалоб, особенностей течения патологического процесса. Детально анализировали общеклинический и психоневрологический статус. Проводилось функциональное исследование сердечно-сосудистой системы, включающее электро- и эхо-кардиографию с расчетом показателей центральной гемодинамики, суточное моннторирование ЭКГ и АД. Состояние магистральных артерий головы и интракраниальных артерий (наличие и степень стеноза, окклюзии, ангиоспазма) оценивали по данным ультразвуковой допплерографии и дуплексного сканирования брахиоцефалышх сосудов (Денищук И.С., 2006). Проводилось установление степени артериальной гипертонии (АГ), наличия ишемической болезни сердца (ИБС), сердечной недостаточности (СН), их формы, давности течения, наличия инфарктов в анамнезе. Для оценки струк!урно-морфологического состояния головного мозга при цереброваскулярных осложнениях ГБ и подтверждения локализации и характера очаговых изменений в мозге, определенных клинически, использовали результаты магнитно-резонансной и компьютерной томографии (Ефремова Н.М., 2003; Шалавин А.Н.., 2009).

В контрольную группу (11 мужчин и 16 женщин) были включены пациенты, проходившие плановое медицинское обследование в ЦВГ им. П.В. Мандрыка (13 человек) и в ГКБ №20 (14 человек), в результате которого у них не выявлено сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний. Результаты измерений АД У всех пациентов данной группы находилось в пределах нормы (<139/89мм рт.ст.).

Вторую группу (18 мужчин и 25 женщин) составили пациенты с диагностированной гипертонической болезнью (ГБ), протекающей стабильно без

7

осложнений в течение 0,5-34 лет. Среднее систолическое АД (САД) составляло у больных данной группы 144±16 мм рт.ст., диастолическое АД (ДАД) - 89±9 мм рт.ст.

Пациенты третьей группы (22 мужчины и 12 женщин) страдали ГБ 0,5-40 лет, на фоне которой развился гипертонический криз (ГК) с преходящей неврологической симптоматикой - церебральный ГК. Среднее САД в период криза составляло 2 №±23 мм рт.ст., среднее ДАД - 117±9 мм рт.ст. Для объективизации общемозговых и очаговых (полушарных, стволовых, мозжечковых) расстройств у больных данной группы использовали шкалу клинической оценки неврологического статуса Е.А. Широкова (Симоненко В.Б., Широков Е.А., 1998), согласно которой 10 баллов соответствует незначительным нарушениям (таким как головокружение, нистагм и др.), а 100 баллов - коматозному состоянию.

Четвертая группа (7 мужчин и 13 женщин) состояла из пациентов с ГБ длительностью 4-19 лет, на фоне которой впервые развился острый ишемический инсульт (ОНИ) в каротидном бассейне. Среднее САД у больных ОНИ составляло 148±16 мм рт.ст., ДАД - 87±8 мм рт.ст. Методом компьютерной томографии у пациентов данной группы оценивали размер очага инфаркта мозга в динамике на 1, 3, 7 и 21 сутки госпитализации (Ефремова Н.М., 2003). Для объективизации тяжести состояния больных в остром периоде ишемического инсульта были использованы различные клинические шкалы: шкала NIH (National Institutes of Health Stroke Scale) (Brott T. et al., 1989) для оценки степени выраженности неврологического дефицита (отсутствие изменений в неврологическом статусе оценивается как 0 баллов, грубый неврологический дефицит - 55 баллов) и шкала Orgogozo (Orgogozo J.M. et al., 1992) для оценки общей тяжести состояния больных и выраженности неврологического дефицита (оценка в 0 баллов соответствует смерти пациента, 100 баллов -отсутствию неврологического дефекта).

При формировании всех групп пациентов были использованы следующие критерии исключения: 1) вторичная артериальная гипертензия; 2) заболевания периферической нервной системы; 3) эпилепсия или клинически значимые психические заболевания; 4) инфекционные заболевания; 5) травмы головного мозга; 6) коагулопатии; 7) хроническая печеночная, почечная и легочная недостаточность; 8) аутоиммунные заболевания; 9) сахарный диабет; 10) злокачественные новообразования; 11) нейродегенеративные заболевания.

Таким образом, проведенное клиническое обследование пациентов, привлеченных в данное обследование, показало, что одной из основных этиологических причин, вызвавших недостаточность кровоснабжения головного мозга, являлась ГБ.

Белки SlOOb, HLDF и ауто-АТ к ним определяли в сыворотке периферической крови, взятой из кубитальной вены по стандартной методике в условиях асептики. Образцы крови центрифугировали при 3000 об/мин, сыворотку отбирали, аликвотировали и хранили при -80°С до проведения исследования. Определение иммунобиохимических показателей проводилось методом гетерогенного 8

твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА; Ensyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) (Самуилов В.Д., 1999; Rich R.R. et el., 2001; Wilhelm K.R. et al., 2007), модифицированным в лаборатории функциональной нейрохимии УРАМН НИИ НФ им. П.К. Анохина РАМН (Gruden М.А. et al., 2007). Содержание белка SlOOb определяли путем сорбции исследуемой сыворотки непосредственно на полистироловый планшет с последующим выявлением SlOOb с помощью кроличьих моноспецифических поликлональных антител к SlOOb (ИБХ РАН). Содержание белка HLDF определяли «сэндвич»-методом с использованием поликлональных моноспецифических антител крысы (НИИ НФ РАМН) и кролика (ИБХ РАН) к различным антигенным детерминантам белка HLDF. Для определения идиотипических ауто-АТ к SlOOb и к HLDF в качестве тест-антигенов использовали раствор белка SlOOb (Sigma, USA) и белка HLDF (ИБХ РАН) соответственно. Для определения антиидиотипических ауто-АТ к SlOOb и к HLDF в качестве тест-антигенов использовали аффинноочшценные моноспецифические поликлональные антитела кролика к белкам SlOOb и HLDF соответственно. Исследуемые сыворотки титровали для получения последовательных разведений от 1:100 до 1:12800. Полученные результаты выражали в титрах - последнее разведение сыворотки, при котором регистрировалась оптическая плотность, превышающая таковую в контрольной лунке.

Иммунобиохимическое исследование проводилось однократно в контрольной группе и у пациентов с не осложненной ГБ. При ГК и ОИИ определение иммуно-биохимических показателей проводилось динамике на 1-е, 3-е, 7-е и 21-е сутки от поступления в стационар.

Статистическую обработку данных проводили по алгоритму пакета программ «Statistica» (версия 6.0) с использованием описательной статистики, дисперсионного, корреляционного и факторного анализа. Описательная статистика проводилась с расчетом средних величин, моды и медианы, что позволяло проверить соответствие распределения выборки нормальному закону. К нормальному распределению относили ту выбору, в которой значения моды, среднего и медианы отличалось не более чем на 5%. При выборке с нормальным распределением дальнейшая проверка статистических гипотез о различиях между группами проводилась с расчетом t-критерия Стьюдента. Преобладающая часть статистических расчетов производились с использованием непараметрических критериев. Сравнение групп и подгрупп пациентов проводили методом рангового однофакторного дисперсионного анализа по Краскелу-Уоллесу (Kruskal-Wallis ANOVA by Ranks) и при помощи медианного теста. В случае выявленной статистической значимости в данных тестах попарное сравнение групп проводили по Манну-Уитни (Mann-Whitney U Test) и по Колмогорову-Смирнову. Сравнение зависимых групп (динамика неврологических и нейро-иммунохимических показателей) осуществляли с использованием рангового дисперсионного анализа по Фридману (Friedman ANOVA) с вычислением коэффициента конкордантности Кендалла (Kendall Coeff. of Concordance). Данные представлены в виде М±т, где М - среднее арифметическое значение, m -

9

стандартная ошибка среднего. При использовании клинических показателей выделялись подгруппы по порядковым качественным и количественным признакам, таким как степень ИБС и СН, выраженность субъективных симптомов и объективных клинических показателей по клиническим шкалам. Для дальнейшего выявления взаимосвязей клинических и иммуно-нейрохимических показателей использовался корреляционный анализ. Корреляционный анализ проводился с использованием метода ранговой корреляции по Спирмену (Я) и гамма-корреляции (у). Критическое значение уровня статистической значимости (р) при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

БЕЛКИ БЮОЬ, НЮТ И АУТОЛНТИТЕЛА К ЭЮОЬ, Н1Л)Р ПРИ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ И ЕЕ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ОСЛОЖНЕНИЯХ

Содержание белка $100Ь, уровни идиотипических и антиидиотипических аутоантител к вЮОЬ в сыворотке крови пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим

инсультом

Проведено сравнительное изучение количественного содержания БЮОЬ, титров АТ й аи-АТ к БЮОЬ в сыворотке крови пациентов с ГБ, ГК и ОИИ, а также условно здоровых лиц контрольной группы. В результате проведенных исследований выявлено, что в контрольной группе среднее содержание белка БЮОЬ составило 0,57±0,29нг/мл (рис. 1а). У пациентов с ГБ и цереброваскулярными осложнениями ГБ концентрация БЮОЬ статистически значимо превышала более чем в 15 раз таковую у пациентов контрольной группы и составила 8,6±1,0нг/мл (р<0,0001), 9,0±1,1нг/мл (р<0,0001), 15,9±1,6нг/мл (р<0,0001) при ГБ, ГК и ОИИ соответственно. Наибольшее сывороточное содержание белка БЮОЬ, превышающее в 26 раз аналогичный показатель в контрольной группе, выявлено у пациентов с ОИИ, при этом концентрация БЮОЬ у них вдвое превышала таковую у пациентов с ГБ (р=0,001) и ГК (р=0,001) (рис. 1а).

Обнаружение нейроспецифического белка БЮОЬ в крови пациентов с ГБ указывает на нарушение его метаболизма в клетках мозга и/или их повреждение, а также на нарушение проницаемости ГЭБ не только при ЦВЗ, но и при гипертонии, протекающей без церебральных осложнений (Ганнушкина И.В. и др., 2005; Юешсйещ! А. е1 а1., 2007). Следует отметить, что, согласно литературным данным, циркулирующий в повышенной концентрации БЮОЬ может принимать участие в развитии эндотелиальной дисфункции, усиливать адгезию лейкоцитов к эндотелию, способствовать пролиферации гладкомышечных клеток сосудов (особенно в присутствии глюкозы и ангиотензина II), таким образом выступая одним из патогенетических факторов ГБ (Богм в. е1 а1., 2010).

вЮОЬ, нг/мл

АТ к ЭЮОЬ (идиотипические), титр

аи-АТ кЭЮОЬ (антиидиотипические), титр

4000 ------------—-1

[^Контроль [^Гипертоническая болезнь ¡^Гипертонический криз ЩИшемический инсульт

*р<0,0001 в сравнении *р<0,05 в сравнении с

с контрольной группой контрольной группой

*р<0,01 в сравнении с группами "р<0,01 в сравнении с группой пациентов с гипертонической пациентов с гипертонической болезнью и гипертоническим кризом болезнью

Рис.1. Средние значения содержания белка $4 ООЬ (а), титра идиотипических аутоантител (Ь) и антиидиотипических аутоантител (с) к 57ООЬ в сыворотке крови пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

Выявление повышенного содержания белка 81 ООЬ при ГБ и ее церебральных осложнениях поставило перед нами задачу изучения у обследуемых пациентов активности гуморального звена иммунитета, а именно - продукции ауто-АТ к белку БЮОЬ. Подробное изучение сывороточного уровня данных ауто-АТ у пациентов обследованных групп выявило следующие закономерности. Средний титр АТ к вЮОЬ в сыворотке крови условно здоровых лиц составил 1:237±1:211 (рисЛЬ). У пациентов с ГБ и ее церебральными осложнениями титр идиотипических ауто-АТ к 81 ООЬ статистически значимо (в 4-12 раз) превышал уровень, выявленный в контрольной группе, и составил при ГБ 1:1033±1:451 (р=0,004), при ГК -1:1715±1:413 (р=0,014) и при ОНИ - 1:2840±1:1144 (р=0,005). Кроме того, титр АТ к 81 ООЬ у пациентов с ГК и ОИИ превышал таковой у пациентов с не осложненным течением ГБ в 1,7 (р=0,002) и 2,7 (р=0,001) раз соответственно, при этом наиболее высокий средний титр АТ к БЮОЬ наблюдался у пациентов с ОИИ. Обнаруженный повышенный уровень АТ к 8100Ь у пациентов, длительно страдающих ГБ, вероятно, является результатом хронической недостаточности мозгового кровообращения, что может привести к гибели нейронов и глиальных клеток, изменениям в проницаемости ГЭБ с проникновением нейроантигенов в спинномозговую жидкость и кровь и инициации аутоиммунных процессов против БЮОЬ и/или проникновению фрагментов ауто-АТ в мозг и связыванию свободного 81 ООЬ, что в результате ослабляет нейротрофическое звено регуляции с его участием (Скворцова В.И. и др., 2005).

Исследование антиидиотипических (вторичных) ауто-АТ к белку 8100Ь при ГБ и ЦВЗ представляет особый интерес, что обусловлено возможностью выявления не

только особенностей функционирования иммунологической сети у обследованных пациентов, но и нарушений нейроиммунных взаимодействий, а также дисбаланса иммунного ответа (Корнева Е.А., 2005; Магаева C.B., Морозов С.Г., 2005; Полетаев А.Б., 2004). При определении уровня аи-АТ к S100b установлено, что в сыворотке крови условно здоровых лиц их средний тигр составил 1:185±1:49, в ipynne с не осложненной ГБ - 1:107±1:4, при ГК - 1:209±1:62, при ОИИ - 1:113±1:7 (рис.2с). Статистически значимых отличий в титрах аи-АТ к S100b у пациентов с ГБ, ГК и ОИИ от контрольной группы выявлено не было. Возможно, это обусловлено начальными стадиями индукции синтеза аи-АТ, либо образованием иммунных комплексов с первичными ауто-АТ. Кроме того, аи-АТ могут не выявляться с помощью используемой методики ИФА в результате их низкой аффинности, которая определяет слабое связывание данных аи-АТ с иммобилизованными на полистироловом планшете AT к S100b.

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали, что ГБ, ГК и ОИИ характеризуются 15-26-кратным увеличением сывороточной концентрации белка S100b и 4-12-кратным увеличением титра AT к S100b по сравнению с контрольной группой. При этом, по сравнению с не осложненной ГБ, ГК характеризуется повышением в 1,6 раз уровня AT к S100b, а ОИИ сопровождается увеличением концентрации SlOOb и титра AT к S100b в 2 и 2,7 раз соответственно.

Содержание белка HLDF, уровни идиотипических и антиидиотипических аутоантител к HLDF в сыворотке крови пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим

инсультом

Результаты исследования содержания белка HLDF, уровня AT и аи-АТ к HLDF в сыворотке крови пациентов с диагностированными ГБ, ГК, и ОИИ, а также условно здоровых лиц представлены на рис.2. Установлено, что у пациентов контрольной группы среднее содержание HLDF составило 435,8±21,2нг/мл, в то время как в группах пациентов с ГБ и церебральными осложнениями ГБ оно было статистически значимо снижено более чем в 50 раз: 2,7±0,9нг/мл (р<0,0001) при не осложненной ГБ; 46,4±10,0нг/мл (р<0,0001) при ГК; 51,4±8,4нг/мл (р<0,0001) при ОИИ. Как видно из рис.2а, наименьшая концентрация HLDF, составляющая 0,6% от нормы, выявлена у пациентов с не осложненной ГБ, при этом она была статистически значимо ниже, чем у пациентов с осложненным течением ГБ: в 17 раз по сравнению с ГК (р=0,0003) и в 19 раз по сравнению с ОИИ (р=0,0001).

Выраженное снижение содержания фактора дифференцировки HLDF в сыворотке крови пациентов с ГБ и ее церебральными осложнениями по сравнению с условно здоровыми лицами позволяет предположить вовлеченность HLDF в механизмы регуляции АД на молекулярном уровне. Возможно, данный фактор дифференцировки принимает участие в процессах, контролирующих нормальное функционирование эндотелия и/или других клеток сердечно-сосудистой системы, в частности, в процессах вазоконстрикции, так как при снижении его сывороточной 12

концентрации в организме происходят гипертонические изменения, которые мы наблюдали у пациентов с ГБ, ГК и ОИИ. Объяснением этому эффекту может служить продемонстрированная гемодинамическая активность пептидных фрагментов фактора - HLDF-24 и HLDF-8, а также обнаруженный гомологичный мотив в аминокислотной последовательности HLDF с молекулой эндотелин-превращающего фермента (Ржевский Д.И. и др., 2006). Известно, что развитие ГБ напрямую связано с эндотелиалъной дисфункцией (Versan D. et al., 2009; Hirata Y. et al., 2010), в формирование которой, возможно, вовлечен изучаемый фактор дифференцировки и его фрагменты. Учитывая факт обнаружения белка HLDF в структурах мозга (Sewell R.D. et al., 2005), нельзя исключить вовлеченность HLDF в регуляцию АД на уровне центральной нервной системы.

HLDF, нг/мл

АТ к HLDF (идиотипические), титр

200 100

аи-AT к HLDF (антиидиотилические), титр

5000

*# *# jssmm

| [Контроль ¡Щ]Гипертоническая болезнь ^Гипертонический криз

*р<0,0001 в сравнении с контрольной группой ир<0,0001 в сравнении с группой пациентов с гипертонической болезнью

*р<0,05 в сравнении с контрольной группой пр<0,025 в сравнении с группой пациентов с гипертонической болезнью

|Ишемический инсульт

*р<0,05 в сравнении с контрольной группой р<0,001 в сравнении с группой пациентов с гипертоническим кризом Лр<0,05 в сравнении с группой пациентов с гипертонической болезнью

Рис.2. Средние значения содержания белка НЫ)¥ (а), титра идиотипических аутоантител (б) и а и тиидиотип ических аутоантител (с) к ЯЫЖ в сыворотке крови пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым нигемическим инсультом.

Исследование продукции АТ к белку НЫ)Р у пациентов обследованных групп выявило, что их средний титр в сыворотке крови условно здоровых лиц составил 1:4250+1:982 (рис.2Ь). У пациентов с ГБ и церебральными осложнениями ГБ титр АТ к НЬОР был статистически значимо ниже в 2-2,5 раз, чем в контрольной группе, и составил 1:1965±1:545 при ГБ (р=0,002), 1:1922±1:592 при ГК (р=0,012), и 1:1698±1:681 при ОИИ (р=0,011). Обнаружено, что титр АТ к Н1Л)Р при не осложненном течении ГБ статистически значимо отличался в распределении от титра АТ к Н1ЛЭР при кризовом течении ГБ согласно тесту Колмогорова-Смирнова (р<0,025).

В результате выявления аи-АТ к НЮТ установлено, что в сыворотке крови условно здоровых лиц их средний титр составил 1:2350±1:800 (рис.2с). Наивысшее значение титра аи-АТ к НИЖ среди пациентов обследованных групп выявлено при не осложненной ГБ (1:3509± 1:845), однако статистически значимого отличия от контрольной группы не обнаружено. Уровень аи-АТ к НЮТ у пациентов с кризовым течением ГБ был в 2,6 раза снижен по сравнению не осложненной ГБ (1:1316±1:293, р=0,032). При этом обнаружено, что титр аи-АТ к ШЛЭР у пациентов с ОНИ выявлялся на уровне 1:210±1:74 и был статистически значимо снижен по сравнению с условно здоровыми лицами в 12 раз (р<0,05) и по сравнению с ПС в 2 раза (р=0,0002).

Однонаправленное снижение уровня АТ и аи-АТ к НЮТ по сравнению с контролем, согласующееся со снижением концентрации белка ШЛЯ7 в сыворотке крови пациентов с ГБ и с церебральными осложнениями ГБ, позволяет предположить вовлеченность в механизмы регуляции АД также и специфичных к НЮТ ауто-АТ. Можно полагать, что ауто-АТ к НЮТ в достаточно высоких тиграх (что свидетельствует о высокой их активности) в норме выполняют регуляторную гомеостатическую функцию. При этом снижение синтеза и/или усиление катаболизма фактора Н1Л)Р приводит к ответному снижению титра идиотипических ауто-АТ к Н1ЛЖ В то же время, аи-АТ к могут служить функциональным аналогом антигена и существенно влиять на течение аутоиммунных процессов (Крьгжановский Г.Н., 2010; Морозов С.Г. и др., 2005). Действительно, при не осложненной ГБ выявлено минимальное из всех обследованных групп пациентов содержание Н1Л5Р (рис.2а) и максимальный уровень аи-АТ к НЦ)Р (рис.2с). Не исключено, что при нарушении метаболизма белка НЫМ7, наблюдаемого нами при ГБ, повышение уровня аи-АТ к НЮТ можно объяснить попыткой организма скомпенсировать недостаточность фактора дифференцировки НЮТ как адапгогенного агента. С другой стороны, понижение уровня ауто-АТ к Н1Л5Р по сравнению с наблюдаемым у здоровых лиц может свидетельствовать о дисбалансе в системе ЯLDF-АТ к НЮР -аи-АТ к Я££>/% взаимосвязанной, по нашему предположению, с эндотелиновой системой, что, вероятно, может быть одним из звеньев дизрегуляции функционирования сердечно-сосудистой системы на молекулярном уровне. Так, при ОНИ мы наблюдаем не только истощение самого фактора НЫЭР в крови пациентов (рис.2а), но и снижение титра аи-АТ к НЮТ7 до минимального из всех обследованных групп пациентов уровня (рис.2с).

Таким образом, проведенные исследования показали, что ГБ, ГК и ОНИ сопровождаются снижением сывороточного содержания белка Н1ЮР (в 160, 9 и 8,5 раз соответственно), а также снижением уровня АТ к НЮТ7 в 2-2,5 раз и уровня аи-АТ к НЬБР в 2-11 раз по сравнению с условно здоровыми лицами. При этом развитие ГК характеризуется снижением тигра аи-АТ к Н1Л)Р по сравнению с не осложненной ГБ в 2,6 раз.

СОПОСТАВЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БЕЛКОВ БЮОЬ, НЬБР И УРОВНЕЙ ИДИОТИПИЧЕСКИХ И АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АУТОАНТНТЕЛ К НИМ С ПОКАЗАТЕЛЯМИ

ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ И НЕРВНОЙ СИСТЕМ У ПАЦИЕНТОВ С ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ И ЕЕ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ

Сравнительный анализ содержания белка вЮОЬ, уровня идиотипических и

антиидиотипических аутоантител к вЮОЬ и динамики неврологических показателей у пациентов с церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом

При помощи статистического анализа были изучены взаимосвязи количественного содержания БЮОЬ, продукции АТ к БЮОЬ, аи-АТ к БЮОЬ в сыворотке крови пациентов, перенесших ГК и ОНИ, с неврологической симптоматикой. Обнаружена прямая корреляция титра АТ к 8100Ь с очаговой симптоматикой при полушарном повреждении мозга, оцениваемой по шкале клинической оценки неврологического статуса Е.А. Широкова на 3-е сутки (11=0,37 р=0,042), 7-е сутки (11=0,41 р=0,021) и 21-е сутки (у=0,57 р=0,031) развития ГК.

Сравнение по уровню аи-АТ к БЮОЬ подгрупп пациентов с различной выраженностью очаговой симптоматики при полушарном повреждении мозга (0 баллов, 10 баллов, 20 баллов) продемонстрировало, что на всех этапах обследования - с 1-го по 21-й день от начала ГК - наибольший титр аи-АТ к БЮОЬ соответствует наиболее выраженной очаговой симптоматике (рис.3).

1600 - ггеп

1400 :::

£ 1200 ь

1 „ 3 = 7 21

период наблюдения, сутки Ш0 баллов 010 баллов 020 баллов

*р<0,05 в сравнении с симптоматикой 0 баллов в соответствующий период наблюдения **р<0.01 в сравнении с симптоматикой 0 баллов в соответствующий период наблюдения

Рис.3. Взаимосвязь титра антиидиотипических антител к ЯМОЬ и очаговой симптоматики при полушарном повреждении мозга у пациентов с гипертоническим кризом в течение периода наблюдения.

У пациентов, перенесших ОИИ, обнаружена отрицательная корреляция содержания 5100Ь с неврологической симптоматикой, оцениваемой по клинической шкале Oтgogozo (рис.4), при которой более низкие баллы соответствуют более

15

выраженному неврологическому дефициту. Как видно из представленных на рис.4 кривых корреляции, наиболее высокая концентрация БЮОЬ соответствует наиболее низким баллам по шкале Ог§о§ого, т.е. чем выше сывороточное содержание белка БЮОЬ в крови пациентов с ОИИ, тем выраженнее у них неврологическая симптоматика согласно данной шкале.

Неврологическая симптоматика по шкале Огдодого, баллы: 1 сутки Зсутки 7сутки 21 сутки

S100b, нг/мл

/=-0.35 р=0,038 /=-0,35 р=0,034 у=-0,36 р=0,032 R=-0,52 р=0,041 Рис.4. Корреляционные зависимости сывороточного содержания белка SlOOb от неврологической симптоматики по шкале Orgogozo в течение периода обследования пациентов с острым ишемическим инсультом.

25 20

с

| 15 х •сГ

о

О 10 ОТ

5 0

3,8-15 15-100 100-209

Объем инфаркта мозга, см3

*р<0,05 по сравнению с объемом 3,8-15 и 15-100 см3 Рис.5. Содержание белка SlOOb в сыворотке крови пациентов с различным объемом инфаркта мозга при остром ишемическом инсульте.

В результате проведения дисперсионного анализа полученных экспериментальных и клинических данных в работе обнаружена прямая взаимосвязь содержания белка SlOOb у пациентов, перенесших ОИИ, с объемом инфаркта мозга (ОИМ). При сравнении подгрупп пациентов с различным размером инфаркта мозга при ОИИ было обнаружено, что наивысшей концентрации белка SlOOb соответствует наибольший объем очага (рис.5). Принимая во внимание литературные данные, указывающие на то, что течение и исход инсульта напрямую зависят от ОИМ (Гусев Е.И., 2003; Широков Е.А., 2007; Gaudinski M.R. et al., 2008; Pialat J.В. et al., 2005; Schiemanck S.K. et al., 2005), а также полученные в данной

работе результаты, указывающие на статистически значимо больший размер очага инфаркта мозга у пациентов с неблагоприятным исходом ОИИ (рис.14), можно утверждать, что сывороточное содержание белка БЮОЬ может быть прогностическим показателем относительно исхода ишемического инсульта, поскольку оно коррелирует с ОИМ. В связи с этим данный временной период можно рассматривать как критический для дальнейшего развития и прогноза исхода ОИИ.

Анализ взаимосвязей иммунохнмических и клинических показателей также документировал прямую корреляцию титра аи-АТ к БЮОЬ с выраженностью неврологической симптоматики по шкале №Н в группе пациентов, перенесших ОИИ (рис.6): Представленные на данном рисунке кривые корреляции указывают на то, что чем выше сывороточное содержание белка БЮОЬ в крови пациентов с ОИИ, тем выраженнее у них неврологическая симптоматика согласно шкале Ы1Н.

Неврологическая симптоматика по шкале Ы1Н, баллы:

аи-АТ к S100b, нг/мл

/=0,7/ р=0,024 R=0,47 р-0,035 у=0,67 р~0,033 у=0,92 р=0,023 Рис. 6. Корреляционная зависимость титра аи-А Т к SlOOb от неврологической симптоматики по шкале NIH в течение периода обследования пациентов с острым ишемическим инсультом.

Таким образом, в данной работе установлена прямая статистическая взаимосвязь сывороточного содержания белка SlOOb и уровней AT и аи-АТ к SlOOb с выраженностью неврологической симптоматики при ГК и при ОИИ, а также с объемом инфаркта мозга при ОИИ.

Полученные в данной работе результаты подтвердили литературные данные о взаимосвязи содержания белка SlOOb (Foerch С. et al., 2005; Nash D.L. et al., 2008; Sienkiewicz-Jarosz H. et al., 2009; Dayon L. et al., 2011) и уровня первичных ауто-АТ к нему (Жданов Г.Н. и др., 2004; Камчатнов П.Р. и др., 2009; Poletaev А.В. et al., 2000) с неврологической симптоматикой, тяжестью и исходом цереброваскулярных заболеваний, а также выявили статистическую взаимосвязь титра вторичных ауто-АТ к SlOOb с выраженностью неврологических проявлений при церебральном ГК и при ОИИ. Описанные данные указывают на вовлеченность белка SlOOb и ауто-АТ к SlOOb в патогенетические механизмы цереброваскулярных осложнений ГБ, что позволяет использовать SlOOb, AT к SlOOb и аи-АТ к SlOOb в качестве маркеров нейронального повреждения и нарушений нейроиммунных взаимодействий при рассматриваемых патологиях.

1 сутки Зсутки 7сутки 21 сутки

Сравнительный анализ содержания белка НЬБР, уровня идиотипических и антиидиотипических аутоантител к НЬОГ и клинических показателей, отражающих функциональное состояние сердечно-сосудистой системы у пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом

Для выяснения возможных статистических взаимосвязей между сывороточным содержанием белка НЫ)Р, а также уровнем АТ к НЮТ и аи-АТ к НЬОР и клиническими показателями, отражающими функциональное состояние сердечнососудистой системы у обследованных пациентов с ГБ, ГК и ОИИ, был проведен корреляционный и дисперсионный анализ. Выявлено, что содержание белка НЬБР в сыворотке крови всех обследованных пациентов с ГБ и осложнениями ГБ, а также пациентов контрольной группы, обратно взаимосвязано с длительностью протекания ГБ (рис.7). При этом длительность ГБ у условно здоровых лиц принималась равной нулю.

260 7-------------------------------------------------------------------------—-.........—..........—-------------------------------------

0-5 лет $-16 лег > 16лет

Длительность ГБ, гада

*р<0,05 по сравнению с длительностью ГБ 0-5 лет Рис.7. Взаимосвязь сывороточного содержания белка НЬИГс длительностью гипертонической болезни у всех обследованных пациентов.

90 -| 60 ТО -

<70% >70%

Степень стеноза МАГ, %

*р<0.05 по сравнению со стенозом МАГ менее 70% Рис.8. Взаимосвязь сывороточного содержания НГПГс выраженностью стеноза магистральных артерий головы у пациентов с острым ишемическим инсультом.

Как продемонстрировано на рис.7, содержание белка НЮТ у пациентов, страдающих ГБ от 6-ти до 15-ти и более лет, статистически значимо снижено по сравнению с содержанием Н1ЛЭР у пациентов, страдающих ГБ менее 5-ти лет.

При дисперсионном анализе обнаружен также факт зависимости концентрации белка НЮР от выраженности стеноза магистральных артерий головы (МАГ) у пациентов, перенесших ОИИ (рис.8). Как видно из данного рисунка, пациенты с гемодинамически не значимым (менее 70%) стенозом МАГ демонстрируют более высокую сывороточную концентрацию белка НЫ)Р (в 2 и более раз), чем пациенты с гемодинамически значимым (более 70%) стенозом МАГ.

4000 3500 -3000 I 2500 § 2000 -

! 1500 -<

1000 500 О -

*р<0,05 по сравнению с длительностью ГБ 0,5-5 лет Рис.9. Взаимосвязь титра АТ к НЫ)Рс длительностью гипертонической болезни у пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

4500

4000

3500

3000

ЦГ 2500

^ 2000 5

5 1500 1000 500 О

И ИБС функционального класса 1 б ИБС функционального класса 2

*р<0.05 по сравнению с ИБС функционального класса «1» в соответствующий период наблюдения **р<0.001 по сравнению с ИБС функционального класса «1»в соответствующий период наблюдения Рис.10. Взаимосвязь титра АТ к с выраженностью ишемической

болезни сердца у пациентов с гипертоническим кризом в течение периода наблюдения.

1 7 21

Период наблюдения, сутки

Дисперсионный анализ позволил обнаружить прямую взаимосвязь уровня идиотипических ауто-АТ к HLDF с длительностью протекания ГБ у пациентов с ГБ, ГК и ОИИ (рис.9). Данный рисунок демонстрирует, что значения титра AT к HLDF у пациентов, страдающих ГБ 15-ть и более лет, статистически значимо превышают его значения у пациентов, страдающих ГБ от 0,5-ти до 15-ти лет.

При изучении кардиологической симптоматики в анамнезе обследованных пациентов с 1-го по 21-й день после поступления в стационар обнаружено, что в группе пациентов с ГК уровень AT к HLDF взаимосвязан выраженностью ИБС. При разделении пациентов с ГК по степени выраженности ИБС на подгруппы с ИБС функционального класса «1» и ИБС функционального класса «2» было установлено, что титр AT к HLDF в течение всего периода наблюдения выше у больных с более выраженной ИБС (рис. 10). На данном рисунке видно, что титр AT к HLDF на 1-е, 7-е и 21-е сутки обследования пациентов, страдающих ИБС функционального класса «2», статистически значимо превышает титр AT к HLDF у пациентов, страдающих ИБС функционального класса «1» в те же временные периоды. В 3-й сутки обследования статистически значимых отличий титра AT к HLDF у пациентов с различной выраженностью ИБС выявлено не было.

Дизрегуляция в сердечно-сосудистой системе у пациентов как с не осложненной, так и с осложненной ГБ напрямую взаимосвязана с иммунологической регуляцией гомеостаза сосудов (Harrison D.G. et al., 2011; Matrougui К. et al., 2011; Muller D.N. et al., 2011). Примером может служить выявленная в результате проведенного анализа прямая корреляция титра аи-АТ к HLDF и величины САД и ДАД у всех обследованных пациентов независимо от патологического состояния (рис.11). Как видно, тигр аи-АТ к HLDF прямо коррелирует с САД (R=0,24 р=0,017) и ДАД (R=0,27 р=0,007^, что еще раз подтверждает предположение о том, что ауто-АТ к HLDF вовлечены в регуляцию АД.

Систолическое Диастол ическое артериальное артериальное

давление давление

аи-АТ к HLDF, титр

Рис.П. Прямая корреляционная зависимость титра антиидиотипических антител к НЬОР от величины систолического и диастолического артериального давления во всех группах обследованных пациентов.

Дальнейшие исследования кардиологических показателей продемонстрировали, что уровень аи-АТ к НГОР также взаимосвязан с выраженностью СН у пациентов с ГК (рис.12). На данном рисунке показано, что уровень аи-АТ к ^ОР у пациентов,

страдающих выраженной СН, статистически значимо превышает таковой у пациентов, не имеющих СН или страдающих СН умеренной степени.

Отсутствует Умеренная Выраженная

Сердечная недостаточность, степень

*р<0,05 по сравнению с группой пациентов с отсутствующей и умеренно выраженной сердечной недостаточностью

Рис.12. Взаимосвязь титра аи-АТ к НЮР с выраженностью сердечной недостаточности у пациентов с гипертоническим кризом.

Полученные результаты демонстрируют, что длительное протекание ГБ приводит к снижению концентрации белка НПЭР и повышению титра АТ к НЫ5Р в крови пациентов, страдающих как ГБ, так и ее осложнениями относительно контрольной группы. Обнаруженное в работе снижение содержания НЬОТ при длительно протекающей ГБ и при выраженном стенозе МАГ позволяет предположить протективную роль белка НЮТ для сердечно-сосудистой системы и взаимосвязи данного фактора с другими системами регуляции АД (эндотелиновая, ренин-ангиотензиновая) при развитии ГБ. Повышение титра АТ к НЬОР и аи-АТ к Ш-ОТ при увеличении длительности ГБ и прогрессировании ИБС и СН может расцениваться как модуляция защитной функции Н1ЛЭР по мере прогрессирования заболевания; компенсаторное повышение уровня ауто-АТ к Н1Л)Р указывает на дисбаланс иммунологической сети, регулирующей биологическую активность фактора Н1ЛЖ Выявленная обратная корреляция уровня аи-АТ к НЫ)Р с САД и ДАД свидетельствует о вовлеченности данных ауто-АТ в регуляцию АД, причем роль аи-АТ к Н1Л5Р может сводиться не только к участию в деятельности иммунологической сети, но и состоять в функциональной замене самого фактора дифференцировки в условиях его сниженной концентрации для поддержания гомеостаза сердечно-сосудистой системы. В целом, выявленные взаимосвязи содержания НЬОР и уровня ауто-АТ к НЬБР с АД, длительностью протекания ГБ, выраженностью ИБС и СН, степенью стеноза МАГ подтверждают предположение о вовлеченности данных иммунобиохимических факторов в механизмы функционирования сердечно-сосудистой системы и формирование гипертонии.

Для выяснения возможной прогностической значимости изучаемых иммунобиохимических показателей в работе проведено разделение пациентов, перенесших ОИИ, на подгруппы с благоприятным и неблагоприятным исходом

21

заболевания. Согласно клиническим наблюдениям, все пациенты с летальным исходом ОИИ демонстрировали статистически значимо более выраженную неврологическую симптоматику (рис.13) и больший объем инфаркта мозга (рис.14), а при благоприятном исходе наблюдалось угашение данных показателей. При этом у пациентов с благоприятным исходом было установлено статистически значимое повышение титра АТ к НЮТ в течение периода обследования, причем их титр приближался к уровню контрольной группы, в то время как при неблагоприятном исходе титр АТ к НЬЭР изначально был ниже и имел тенденцию к дальнейшему снижению (рис.15).

Шкала И1Н-

Шкала огдодого

* * * 1 X \4\\\

•лчччч'! [ч\ч\чч ччччч1 КУ*444 1444444 44444 44444 Ч44\\ к44444*| 44444 44444

ч\ч\ч\} 1ччч\Ч\ «.444441 ¡444444 .44444^ 44444 [44444^ 44444

21

период обследования. сутки

Период обсл едов а

из Неблагогриятный исход

благоприятный исход

*р^0.05 по сравнению с теми же сутками

при благоприятном исходе Рис.13. Динамика неврологической

симптоматики ^ больных с благоприятным и неблагоприятным исходом ишемического инсульта.

| стНабпагоориятный исход

-♦-Благоприятный исход

□

*р<0,05 по сравнению с теми же сутками при благоприятном исходе Рис. 14. Динамика объема инфаркта мозга у больных с благоприятным и неблагоприятным исходом ишемического инсульта.

Благоприятный исход инсульта

Неблагоприятный иоход инсульта

И1сутеи ИЗоутки И7сутки В21су1ки

*р<9,05 по сравнению с 1-ми сутками Рис. 15. Динамика идиотипических антител к НЮРу пациентов с различным исходом ишемического инсульта относительно контрольной группы.

Учитывая разнонаправленную динамику титра АТ к НЬОР при благоприятном и неблагоприятном исходе ишемического инсульта и взаимосвязь динамики АТ к НЬБЕ с изменениями неврологического статуса, можно полагать, что увеличение

титра АТ к Н1ЛЗР является одним из показателей положительного прогноза исхода ОИИ.

Таким образом, полученные в работе результаты расширяют существующие в •• настоящее время представления о дизрегуляции взаимодействия нервной, сердечнососудистой и иммунной систем при цереброваскулярной патологии, осложняющей ГБ. Иммунобиохимические показатели, определяемые в критические периоды развития церебральных осложнений ГБ, отражают функциональное состояние сердечно-сосудистой и нервной систем, а также гуморального звена иммунитета пациентов, и участвуют в развитии ЦВЗ при ГБ. Выявленные особенности систем факторов БЮОЬ, Н1Л)Р и вдио/антиидиотипических ауто-АТ к ним мохут быть использованы в практических целях для разработки новых прогностических подходов к изучению развития цереброваскулярных осложнений ГБ.

ВЫВОДЫ

1. Развитие гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнений (церебральный гипертонический криз, острый ишемический инсульт) сопровождается повышением содержания белка БЮОЬ и уровня идиотипических аутоантител к БЮОЬ в сыворотке крови пациентов. Наиболее выраженная продукция идиотипических аутоантител к 8100Ь наблюдается при гипертоническом кризе и ишемическом инсульте, который также характеризуется резким повышением содержания белка Б ЮОЬ.

2. Развитие гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнений (церебральный гипертонический криз, острый ишемический инсульт) сопровождается снижением содержания белка Н1ЛЭР и уровня идио/антиидиотипических антител к Н1Л5Р в сыворотке крови пациентов. Наиболее снижена продукция антиидиотшшческих аутоантител к НЫЛ-1 при гипертоническом кризе и ишемическом инсульте.

3. Содержание белка БЮОЬ и уровни идио/антиидиотипических антител к БЮОЬ положительно коррелируют с выраженностью неврологической симптоматики у пациентов с церебральными осложнениями гипертонической болезни, а также с объемом инфаркта мозга при остром ишемическом инсульте.

4. Содержание белка НЫ)Р отрицательно коррелирует с продолжительностью гипертонической болезни у пациентов всех групп и со степенью стеноза магистральных артерий головы у пациентов с шпемическим инсультом. Уровни идио/антиидиотипических антител к Н1Л)Р положительно коррелируют с величиной артериального давления, продолжительностью гипертонической болезни у пациентов всех групп, с выраженностью ишемической болезни сердца и сердечной недостаточности у пациентов с гипертоническим кризом.

5. Выявленные особенности систем факторов $100Ь, НЬБР и идио/антиидиотипических аутоантител к ним при гипертонической болезни, церебральном гипертоническом кризе и остром ишемическом инсульте могут

быть использованы в разработке новых подходов для прогноза развития цереброваскулярных осложнений гипертонической болезни.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Грудень М.А., Шерстнев В.В., Ефремова Н.М., Елистратова Е.И., Стаховская Л.В., Скворцова В,И. Нейротрофические факторы и антитела к ним: участие в развитии нейроиммунных реакций при различных нарушениях нервной системы. // Материалы X конференции «Нейроиммунология». - 2001. - Т.2 - С.49.

2. Елистратова Е.И., Грудень М.А., Давыдова Т.В., Шерстнев В.В. Особенности иммунобиохимических показателей у пациентов с различными цереброваскулярными заболеваниями гипертонического генеза. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2011. -№3. - С.25-28.

3. Елистратова Е.И, Грудень М.А., Шерстнев В.В. Нейроиммунные механизмы нарушений мозгового кровообращения // Материалы 1-й Международной мевдисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций». - 2010. - С. 183-184.

4. Елистратова Е.И., Грудень М.А., Шерстнев В.В. Новые нейроиммунные маркеры цереброваскулярных осложнений гипертонической болезни. // Патогенез. - 2010. - №1. - С.38.

5. Шерстнев В.В., Грудень М.А., Елистратова Е.И., Денищук И.С., Юрасов В.В., Яковлева Н.Е. Костанян И.А., Шетова И.М., Широков Е.А., Драницына С.М., Скворцова В.И. Регуляторы апоптоза и антитела к ним в механизмах устойчивости к повреждающему действию церебральной ишемии. // Труды XI Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - 2003, - С.369-370.

6. Шерстнев В.В., Грудень М.А., Скворцова В.И., Елистратова Е.И., Яковлева Н.Е., Широков Е.А., Юрасов В.В., Денищук И.С. Аутоантитела к белкам-регуляторам развития и гибели клеток как молекулярные маркеры цереброваскулярных заболеваний. // Материалы 1-й Московской международной конференции "Естественный иммунитет в норме и патологии". - 2005. - С.78-79.

7. Шерстнев В.В., Скворцова В.И., Грудень М.А., Широков Е.А., Денищук И.С., Юрасов В.В., Елистратова Е.И., Яковлева Н.Е., Шетова И.М., Костанян И.А., Губская О.Б. Белок HLDF и антитела к нему как молекулярные патогенетические факторы и новые маркеры острых нарушений мозгового кровообращения. // Журнал неврологии и психиатрии. Приложение «Инсульт». - 2004. - №12. - С.53-59.

8. Широков Е.А., Грудень М.А., Денищук И.С., Елистратова Е.И., Юрасов В.В., Яковлева Н.Е., Шалавин А.Н., Шерстнев В.В. Особенности содержания белка S100b и антител к нему в сыворотке пациентов с прекргоовым и стабильным течением гипертонической болезни. // Клин. Медицина. - 2006. - Т.84. - №11. -С.45-48.

9. Яковлева Н.Е., Юрасов В.В., Шетова И.И., Елистратова Е.И., Грудень М.А., Костанян И.А., Скворцова В.И., Шерстнев В.В. Фактор апоптоза HLDF и антитела к нему при развитии атеротромботического инсульта. // Труды межведомственного научного совета по экспериментальной и прикладной физиолопш «Системные аспекты физиологических функций». - 2002. - Т.П. -С.249-250.

10. Elistratova E.L, Gruden М.А., Sherstnev V.V. Novel serum biochemical and immune markers for hypertension-induced cerebrovascular disorders: protein with difFerentiative activity: human leukemia differentiation factor (HLDF) and HLDF antibodies. // Abstracts of the 7-th FENS Forum. - 2010. - V.5. -132.13. - P.184.

11. Elistratova E.I., Yakovleva N.E., Sherstnev V.V., Denischuk I.S., Yurasov V.V., Kostanyan I.A., ShirokovE.A., Skvortzova V.I., Gruden M.A. Autoimmune responces to proteins HLDF, SlOOb as pathogenic factors and molecular markers of cerebrovascular diseases. // J.of European College of Neuropsychopharmacology. -2005,- V.15.-Suppl.2. - P.S191.

Elistratova Elena Igorevna PROTEINS S100B, HLDF, AND AUTOANTIBODIES AGAINST S100B, HLDF IN CEREBROVASCULAR COMPLICATIONS OF HYPERTENSION

In patients suffering with hypertension and its cerebrovascular complications (cerebral hypertensive crisis and acute ischemic stroke) serum SlOOb & HLDF, anti-SlOOb & anti-HLDF idio-and antiidiotypic antibodies (ABs) were measured by ELISA. In comparison with normotensive controls all patients showed significantly higher median levels of SlOOb & anti-SlOOb idiotypic ABs and significantly lower levels of HLDF & anti-HLDF idio-and antiidiotypic ABs at the 1st day of hospitalization. SlOOb and anti-SlOOb idio-and antiidiotypic ABs positively correlated with neurological symptoms in hypertensive crisis and ischemic stroke patients and with cerebral infarct volume size. Negative correlation was found between HLDF and essential hypertension duration in all patients and with carotid stenosis degree in stroke patients. Anti-HLDF idiotypic ABs positively correlated with degree of ischemic heart disease in hypertensive crisis patients and with essential hypertension duration. Anti-HLDF antiidiotypic ABs positively correlated with blood pressure in all patients and cardiac failure in hypertensive crisis patients. Gradual increasing of anti-HLDF idiotypic ABs in stroke patients with favourable outcome was found within 21 days of observation, whereas in deceased persons HLDF ABs were lower and did not change. These findings indicate an involvement of SlOOb, HLDF and anti-S 100b & anti-HLDF ABs in hypertension-induced cerebrovascular disorders. Investigated proteins can be evaluated as biomarkers of hypertension and its cerebrovascular complications.

Подписано в печать 28.09.2011 г.

Заказ № 336 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.

Актуальность исследования. Гипертоническая болезнь (ГБ) является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний среди трудоспособного населения в большинстве стран мира (Синькова Г.М., 2007; Kearney P.M. et al., 2005). По данным ВОЗ, в экономически развитых странах повышение артериального давления (АД) отмечается у 25% взрослого населения, а среди лиц старше 65 лет — более чем в 50% случаев. В Российской Федерации частота встречаемости артериальной гипертонии (АГ) у населения превышает 40% (Чазова И.Е., 2007; Гогин Е.Е., 2010).

Одним из центральных органов-мишеней, страдающих при ГБ, является головной мозг (Скворцова В'.И.,. 2006; Суслина 3;А.и др. 2006; Amenta F. et al., 2003). Известно, что AT является* причиной развития острых нарушений мозгового кровообращения преходящего характера — церебральных гипертонических кризов.(ГК) (Широков Е.А., Симоненко В.Б.,

2001; Бокарев И.Н., 2005; Vilela-Martin J.F. et al., 2011), транзиторных ишемических атак (Парфенов В.А. и др., 2009; Zhang W.W. et al., 2009), или стойкого характера,- геморрагических и ишемических инсультов (Wu С.Y. et al., 20Ю; Mancia G: et al., 2011), a также хронической прогрессирующей недостаточности мозгового кровообращения — дисциркуляторной энцефалопатии и, сосудистой деменции (Камчатнов П.Р. и др., 2007; Зверева З.Ф. и др., 2010; Richard Е. et al., 2010; Sharp Si. et al., 2011). В настоящее время доля смертности от сердечно-сосудистых заболеваний составляет 53,1%, при этом 35,4% случаев обусловлено именно цереброваскулярными осложнениями ГБ (Харченко В.И. и др., 2005; Гусев Е.И. и др., 2006; Morentin В., Audicana С., 2011).

В связи с широким распространением ГБ и связанных с ее развитием цереброваскулярных заболеваний (ЦВЗ), таких как церебральный^ ГК и острый ишемический инсульт (ОИИ), дальнейшее изучение механизмов нарушения регуляции АД, приводящих к ГБ, является актуальным направлением современной медицины, а поиск новых подходов ранней молекулярной диагностики осложнений данного заболевания имеет важное социально-экономическое значение.

Современные представления о нейробиологических и патофизиологических механизмах развития ЦВЗ указывают на ключевую роль нарушения микроциркуляции и трофического обеспечения,, а также программированной гибели клеток нервной и сердечно-сосудистой- систем (Гусев. Е.И., Скворцова В.И., 2001; Taoufik Е., Probert L., 2008; Busl К.М., Greer D.M., 2010). В связи с этим особый интерес вызывает изучение вовлеченности в молекулярные механизмы- ЦВЗ; факторов-регуляторов> процессов роста,, развития, выживаемости и гибели эндотелиальных, нервных, глиальных клеток. В' данном* аспекте особое внимание привлекает нейротрофический белок S100b (Heizmann C.W. et al., 2002). Имеются многочисленные литературные данные о многообразии функциональной активности, которую1 проявляет S100b как внутриклеточно (Brozzi F. et al., 2009; Zimmer D.B., Weber D.J., 2010), так и в межклеточном пространстве (Donato R., Heizmann C.W., 2010; Sorci G. et al., 2010). Показано, что данный белок в зависимости от концентрации проявляет нейротрофические или проапоптотические свойства (Sherstnev V.V. et al., 2003; Mori Т. et al., 2010). Продемонстрирована патогенетическая роль повышения концентрации S100b при ишемическом инсульте (ШерстнеВ' В.В.- и др., 2002; Kaca-Orynska М. et al., 2010; Dayon L. et.al., 2011) и других заболеваниях нервной системы (Chaves M.L. et.al., 2010; Moritz S. et al., 2010).

Другим молекулярным регулятором процессов роста и гибели клеток является фактор дифференцировки, гликопротеин HLDF (human leukemia differentiation factor) (Kostanyan I.A. et a!., 1994), недавно обнаруженный в крови человека (Sherstnev V.V., 2004) и в различных структурах головного мозга крыс (Sewell R.D., et al., 2005). Показано, что различные пептидные фрагменты HLDF проявляют как про- , так и антиапоптотическую активность (Костанян И.А. и др., 2000; Шерстнев В.В., и др., 2003; Сторожева З.И. и др., 2004). Установлено, что 24-членный и 8-членный пептидные фрагменты фактора - HLDF-24 и HLDF-8 - обладают выраженной гемодинамической активностью: при внутривенном введении они изменяют АД и частоту сердечных сокращений у нормотензивных и у спонтанно-гипертензивных крыс (Ржевский Д.И. и др., 2006). Имеются данные о структурной гомологии HLDF с эндотелин-превращающим ферментом (Ржевский Д.И. и др., 2005). В. совокупности вышеизложенные данные позволяют предположить вовлеченность этого фактора в молекулярное обеспечение функционирования сердечно-сосудистой системы при изучаемых заболеваниях.

В настоящее время особый интерес представляет изучение участия иммунных механизмов 4в формировании ГБ и ЦВЗ (Harrison D.G. et al., 2011; Zhang Y., Popovich P., 2011). Становится все более очевидной вовлеченность иммунной системы в процессы единой нейроиммуноэндокринной. регуляции в норме (Морозов ;С.Г. и др., 2005), а также при ГБ (Мингазетдинова JI.H., 2006; Muller D.N. et al., 2011) и при ОИИ (Скворцова В.И. и др., 2005; Алферова В.В. и-др., 2008). В-последнее время показано, что аутоантитела (ауто-АТ) к S100b и к HLDF могут отражать и/или предопределять состояние когнитивных, психических, двигательных и сосудистых функций пациентов при острых и хронических нарушениях мозгового кровообращения (Грудень М.А. и др., 1999; Грудень М.А., Шерстнев В.В., 2008; Sherstnev V.V., 2004).

Вышеизложенные факты указывают на- актуальность, изучения вовлеченности белков S100b, HLDF, а также идиотипических ауто-АТ (AT) и антиидиотипических ауто-АТ (аи-АТ) к данным белкам в развитие ГБ и ЦВЗ, а также поиска современных подходов молекулярной диагностики разных стадий ГБ, контроля эффективности лечения и прогноза ГБ, и ее цереброваскулярных осложнений.

Цель работы заключалась в исследовании участия факторов развития и гибели нервных, глиальных, эндотелиальных клеток - белков S100b и

ШЛЗР, а также идио/антиидиотипических аутоантител к ним в развитии гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнений.

Задачи исследования:

1. Изучить содержание белков БЮОЬ, НЫЭР и уровни идио/антиидиотипических аутоантител ним в сыворотке крови-пациентов с гипертонической болезнью, а также в критические периоды развития (на 1, 3, 7 и 21 сутки) церебрального гипертонического криза и острого ишемического инсульта.

2. Сопоставить содержание белка БЮОЬ, уровни идио/антиидиотипических аутоантител к БЮОЬ в сыворотке крови с неврологическими показателями у пациентов с церебральным^ гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

3. Проанализировать соотношение содержания белка НЫЭР, уровней идио/антиидиотипических аутоантител к НЬБР в сыворотке крови и клинических показателей, отражающих функциональное состояние сердечно-сосудистой системы у пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

4. Оценить диагностическую и прогностическую значимость определения белков 8100Ь, НЫЭР и. уровней идио/антиидиотипических аутоантител к ним в сыворотке крови пациентов при гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнениях.

Научная новизна. Впервые изучена динамика и выявлены различия в сывороточном содержании белков БЮОЬ и НЬВБ, а также в уровнях идио/антиидиотипических ауто-АТ к данным белкам у пациентов в критические периоды развития ГК и ОИИ, а также при не осложненной ГБ. С помощью изучаемых иммунобиохимических показателей — белка, ЭЮОЬ и ауто-АТ к нему - обнаружено нарушение гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) у больных с не осложненным и кризовым течением ГБ. Доказана диагностическая значимость определения антиидиотипических ауто-АТ к 8100Ь на основе выявленных статистических взаимосвязей их уровня с неврологической симптоматикой пациентов при ГК и ОИИ. У пациентов с ГК обнаружена взаимосвязь концентрации НЫЗР и уровня ауто-АТ к Н1Л)Р с величиной АД, длительностью течения ГБ и выраженностью кардиологической, симптоматики (сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца). Впервые документирована благоприятная прогностическая значимость повышения уровня идиотипических ауто-АТ к НЬЛЭР для клинического исхода ОИИ.

Теоретическая и практическая значимость. Подтверждены теоретические предпосылки о том, что факторы развития и гибели нервных, глиальных, эндотелиальных клеток - белки 8100Ь и Н1Х)Р - наряду с эффекторами гуморального иммунного ответа — ауто-АТ к рассматриваемым белкам - вовлечены в молекулярные механизмы патогенеза ГБ и ее цереброваскулярных осложнений. Полученные новые экспериментальные данные о молекулярных механизмах патогенеза. ЦВЗ, связанных с ГБ, расширяют существующие в настоящее время представления о дизрегуляции нейроиммунных взаимодействий: при< цереброваскулярной патологии. Полученные данные о различном сывороточном содержании изученных показателей у пациентов, страдающих ГБ, ГК и ОИИ; демонстрируют ранее не описанные особенности молекулярных процессов патогенеза ГБ и одновременную вовлеченность элементов нервной, сердечно-сосудистой и иммунной систем в патогенетические механизмы ЦВЗ, ассоциированных с ГБ. Полученные результаты позволяют рассматривать системы факторов, состоящие из белков 8100Ь, НГЛЭР, АТ и аи-АТ к ним, а также перечисленные факторы по отдельности в качестве молекулярных нейроиммунных биомаркеров для ранней диагностики и прогнозирования цереброваскулярных осложнений ГБ. и

Положения, выносимые на защиту:

1. Гипертоническая болезнь и ее цереброваскулярные осложнения (церебральный гипертонический криз, острый ишемический инсульт) сопровождаются повышением содержания белка 8100Ь и уровня идиотипических антител к нему, а также снижением содержания белка НГЛЭР и уровня идио/антиидиотипических антител к нему в сыворотке крови пациентов.

2. Содержание белков 8100Ь, НЬОГ и уровни идио/антиидиотипических аутоантител к ним в сыворотке крови коррелируют с клиническими показателями, отражающими функциональное состояние сердечнососудистой и нервной систем у пациентов с гипертонической болезнью, церебральным гипертоническим кризом и острым ишемическим инсультом.

3. Системы белков 8100Ь, НЬБР и идио/антиидиотипических аутоантител к ним на молекулярном уровне отражают процессы дизрегуляции в нервной, иммунной, и сердечно-сосудистой системах организма при гипертонической болезни, а также могут иметь значение для прогноза развития церебральных осложнений данного заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Развитие гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнений (церебральный гипертонический криз, острый ишемический инсульт) ' сопровождается повышением содержания белка 8100Ь и уровня идиотипических аутоантител к ЭЮОЬ в сыворотке крови пациентов. Наиболее выраженная продукция идиотипических аутоантител к БЮОЬ наблюдается при гипертоническом кризе и ишемическом инсульте, который также характеризуется резким повышением содержания белка БЮОЬ.

2. Развитие гипертонической болезни и ее цереброваскулярных осложнений (церебральный гипертонический криз, острый ишемический инсульт) сопровождается снижением содержания белка НЫЭР и уровня идио/антиидиотипических антител к НЬБР в сыворотке крови пациентов. Наиболее снижена продукция антиидиотипических аутоантител к НЕЛЭР при гипертоническом кризе и ишемическом инсульте.

3. Содержание белка Б1ООЬ и уровни идио/антиидиотипических антител к 8100Ь положительно коррелируют с выраженностью неврологической симптоматики у пациентов с церебральными осложнениями гипертонической болезни, а также с объемом инфаркта мозга при остром ишемическом инсульте.

4. Содержание белка НЫЛ7 отрицательно коррелирует с продолжительностью гипертонической болезни у пациентов всех групп и со степенью стеноза магистральных артерий головы у пациентов с ишемическим инсультом. Уровни идио/антиидиотипических антител к НЫЛ7 положительно коррелируют с величиной артериального давления, продолжительностью гипертонической болезни у пациентов всех групп, с выраженностью ишемической болезни сердца и сердечной недостаточности у пациентов с гипертоническим кризом.

5. Выявленные особенности систем факторов БЮОЬ, НЫЛ7 и идио/антиидиотипических аутоантител к ним при гипертонической болезни, церебральном гипертоническом кризе и остром ишемическом инсульте могут быть использованы в разработке новых подходов для прогноза развития цереброваскулярных осложнений гипертонической болезни.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с неуклонным ростом числа случаев заболеваемости гипертонической болезнью (ГБ) и ее церебральными осложнениями (Суслина З.А. и др. 2006; Синькова Г.М., 2007; Amenta F. et al., 2003; Kearney P.M. et al., 2005) повышенный интерес проявляется к более углубленному изучению центральных и периферических механизмов ■ развития- данных заболеваний. Понимание лежащих в их основе процессов возможно только с позиций интегративного знания, в данном случае - путем исследования сопряженных процессов дизрегуляции в нервной; иммунной и сердечно-сосудистой системах, протекающих в организме В'условиях повышения' артериального давления (АД).

Современные представления о патофизиологических молекулярных механизмах цереброваскулярных осложнений ГБ подчеркивают ключевую-роль целого ряда процессов, связанных, с одной стороны, с нарушением микроциркуляции, а с другой — с недостаточностью- трофического обеспечения« клеток и их программированной гибелью по1 типу апоптоза (Гусев-Е.И:, Скворцова В!И., 2001; Taoufik Е., Probert L., 2008; Busl К.М:, Greer D.M., 2010), а также развитием, аутоиммунных реакций, против* белковых факторов, активно обеспечивающих данные процессы (Шерстнев В.В. др., 2002; Скворцова В.И. и др., 2005; Zhang Y., Popovich PJ, 2011). Исследовательский- интерес в данной работе представлял поиск ранее неизвестных взаимосвязей между содержанием белка S100b как мультифункционального-маркера повреждения мозговой ткани (Nash D.L. et al., 2008; Sanchez-Pena P. et al., 2008; Sienkiewicz-Jarosz H. et al., 2009; Unden J. et al., 2009; Mori T. et al., 2010)- и белка HLDF как фактора с дифференцирующей активностью- и гемодинамическими* свойствами (Костанян И.А. и др., 2000; Шерстнев В.В., и др., 2003; Сторожева З.И. и др., 2004; Ржевский Д.И. и др., 2006), вовлеченных в процессы выживаемости и гибели эндотелиальных, нервных и глиальных клеток, а также уровнем идио/антиидиотипических аутоантител (ауто-АТ) к ним в сыворотке крови и значимыми клиническими параметрами, отражающими функциональное состояние сердечно-сосудистой и нервной систем организма при ГБ и ее цереброваскулярных осложнениях.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что в сыворотке крови пациентов с не осложненной ГБ, а также с развившимися церебральными осложнениями на ее фоне, такими как церебральный гипертонический криз (ГК) и острый ишемический инсульт (ОИИ), более чем в 80% случаев выявляется специфическое повышение концентрации белка S100b и идиотипических (AT), но не антиидиотипических антител (аи-АТ) к S 100b по сравнению с обследуемыми контрольной группы, имеющими нормальное АД, что подтверждается литературными данными (Жданов F.H. и др., 2004; Рулева Н.Ю. и др., 2004; Скворцова В.И. и др., 2005; Камчатнов П.Р. и др., 2009; Weglewski А. et al., 2005; Jauch E.G. et al. 2006; Nash D.L. et al., 2008; Unden J. et al., 2009). Это свидетельствует о нарушениях метаболизма SI 00b в клетках мозга и изменении проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) на стадии хронической сосудистой патологии' при ГБ. Однако до настоящего времени не исследовалась динамика содержания данных факторов и продукция ауто-АТ к ним в течение критических периодов развития осложнений ГБ. Мониторирование концентрации S100b на 1-е, 3-й, 7-е и 21-е сутки церебральных нарушений показало, что при ГК не наблюдается изменений в содержании белка; оно сопоставимо с таковым у пациентов с не осложненной ГБ. В то время как в крови пациентов с ОИИ выявлено снижение повышенной (по сравнению с выявленной при ГБ и ГК) концентрации белка S100b к 21-му дню от начала заболевания. Продемонстрированное снижение сывороточной концентрации S100b у пациентов в постинсультный период согласуется с представлениями, согласно которым максимальное нарушение проницаемости ГЭБ коррелирует с наиболее высокой концентрацией нейроспецифических белков в крови, а по мере восстановления функции ГЭБ поступление этих белков в сосудистое русло прекращается (Ганнушкина И.В. и др., 2005; ЮетсНег^ А. & а1., 2007).

Полученные в работе данные также документируют, что иммунная система активно вовлечена в патогенетические механизмы ГБ и ее церебральных осложнений. Повышенные титры АТ к БЮОЬ обнаружены в тех же группах пациентов, в которых было зафиксировано выраженное повышение сывороточной концентрации нейротрофического фактора 8100Ь, что позволяет предположить, индукцию развития аутоиммунных реакций к 8100Ь уже на стадии не осложненной ГБ и их дальнейшее • прогрессирование при ГК и ОИИ. В работе обнаружена также динамика продукции АТ к 8100Ь при развитии церебрального ГК с вторичной« индукцией их синтеза на 7-й день от развития осложнения. В; отличие от ГК, при1 ОИИ максимальный уровень АТ к 8100Ь в. крови пациентов'выявлялся наЛ-е-сутки наблюдения, что свидетельствует о предшествующей развитию инсульта ишемизации мозга, конечным результатом которой« становится появление мозгоспецифических белков в крови и защитная активация гуморального иммунитета. Полученные результаты свидетельствуют о запущенных ранее, на стадии- формирующейся гипертонии, молекулярных механизмах дизрегуляции нервной системы — снижении трофического обеспечения нервных и глиальных клеток и их гибели при ишемизации мозга в совокупности с нарушенной проницаемостью ГЭБ.

В работе установлена прямая статистическая взаимосвязь сывороточной концентрации белка БЮОЬ и титра идио/антиидиотипических ауто-АТ к 8100Ь с неврологической- симптоматикой пациентов с диагностированными церебральными осложнениями ГБ,. а также с объемом инфаркта мозга при ОИИ. Проведенное исследование подтвердило описанные в литературе взаимосвязи концентрации белка 8100Ь и уровня первичных ауто-АТ к нему, а также выявило специфическую взаимосвязь титра вторичных ауто-АТ к БЮОЬ с тяжестью неврологических проявлений при церебральном ГК и при ОИИ. Описанные данные указывают на вовлеченность белка БЮОЬ и ауто-АТ к 8100Ь в патогенетические механизмы цереброваскулярных заболеваний гипертонического генеза, что позволяет использовать ЭЮОЬ, АТ к 8100Ь и аи-АТ к БЮОЬ в качестве нейроиммунных маркеров нейронального повреждения и нарушений нейроиммунных взаимодействий при рассматриваемых патологиях.

Изучение содержания фактора дифференцировки НЫЭБ, обнаруженного ранее в крови человека и экспериментальных животных (ЗИегеШеу У.У.,

2004), а также в клетках ряда церебральных структур, обладающих свойствами выраженной интегративности и пластичности (Беу/еИ Ы.О., е! а1.

2005), выявило следующие особенности участия данного белка и системы ауто-АТ к нему при- гипертонии и ее церебральных осложнениях. Обнаружено, что сывороточная концентрация белка НЬБР в условиях ГБ и ее церебральных осложнений в десятки раз снижена, при этом вдвое понижен уровень АТ и аи-АТ к НЬБР по сравнению с условно здоровыми лицами. Выявленное нами сниженное содержание фактора дифференцировки НЫЭР в сыворотке крови пациентов с ГБ и с церебральными осложнениями ГБ по сравнению* с условно здоровыми лицами позволяет предположить вовлеченность. НЕЮР в механизмы регуляции А"Д на молекулярном уровне. Возможно, данный- фактор дифференцировки принимает участие в процессах, контролирующих нормальное функционирование эндотелия и/или других клеток сердечно-сосудистой системы, в частности, в процессах вазоконстрикции, так как при снижении его сывороточной концентрации в организме происходят гипертонические изменения, которые мы наблюдали у пациентов с ГБ, ГК и ОИИ. Объяснением этому эффекту может служить продемонстрированная гемодинамическая активность пептидных фрагментов фактора - ШЛЖ24 и ШЛ}р-8 (Мурашев А.Н., 2001; Ржевский Д.И. и др.,

2006). Кроме того, обнаруженный гомологичный мотив в аминокислотной последовательности НЫ)Р с рецептором эндотелина (неопубликованные данные) и с ЭПФ (Ржевский Д.И., 2005) подкрепляет высказанное предположение. Учитывая факт, что эндотелий составляет часть ГЭБ, регулирующего обмен веществ между кровью и тканями мозга (Farrall A.J. et al., 2009; Greenwood J. et al., 2011), а также факт обнаружения белка HLDF в ткани мозга (Sewell R.D: et al., 2005), нельзя исключить вовлеченность HLDF в регуляцию сосудистых процессов, обеспечивающих кровоснабжение мозга в нормальных условиях. Однонаправленное снижение - уровня-АТ и аи-АТ к HLDF по сравнению с контролем, согласующееся со снижением концентрации белка HLDF в сыворотке крови пациентов, с ГБ и с церебральными осложнениями ГБ, позволяет предположить вовлеченность в механизмы-, регуляции АД также и специфичных к HLDF ауто-АТ. Можно полагать, что ауто-АТ к HLDF в достаточно высоких титрах (что свидетельствует о высокой их активности) в норме выполняют регуляторную гомеостатическую функцию. При этом снижение синтеза и/или усиление катаболизма.1 фактора HLDF приводит к ответному снижению- титра идиотипических ауто-АТ к HLDF.

В работе обнаружена обратная зависимость концентрации HLDF от длительности- течения ГБ у пациентов всех групп и от степени стеноза магистральных артерий головы у пациентов с ОИИ, а также прямая статистическая- взаимосвязь между уровнем ауто-АТ к HLDF и АД, длительностью ГБ у пациентов всех групп, и выраженностью > ишемической болезни сердца и сердечной недостаточности у пациентов с ГК. Выявленные взаимосвязи подтверждают предположение о вовлеченности не только данного фактора дифференцировки, но и ауто-АТ к нему в механизмы функционирования сосудистой системы и формирование гипертонии и ее церебральных осложнений. Полученные результаты демонстрируют, что длительное протекание ГБ приводит к снижению концентрации белка HLDF и повышению титра идиотипических ауто-АТ к HLDF в крови пациентов, страдающих как ГБ, так и ее осложнениями по сравнению с контрольной группой. Обнаруженное в работе снижение концентрации HLDF при длительно протекающей ГБ и при выраженном стенозе МАГ позволяют предположить протективную роль белка HLDF для сердечно-сосудистой системы и взаимосвязи данного фактора с другими системами регуляции АД (эндотелиновая, ренин-ангиотензиновая) при развитии ГБ. Повышение титра АТ-НЬОР и аи-АТ-РЦЛЗР при увеличении; длительности ГБ и прогрессировании ИБС и СН может расценивается как модуляция« защитной функции- НЕВЕ по мере: прогрессирования заболевания: Компенсаторное повышение уровня ауто-АТ к ШШР указывает на дисбаланс иммунологической. сети,, регулирующей биологическую^ активность фактора НЬОР. Выявленная обратная корреляция уровня аи-АТ к Н1Л)Р с САД и ДАД свидетельствует о вовлеченности; данных ауто-АТ в регуляцию АД,, причем роль аи-АТ к НГЛЗР может сводиться не только» к участию в деятельности иммунологической? сети;, но и состоять* в функциональной» замене: самого фактора дифференцировки в условиях его сниженной» концентрации для поддержания; гомеостаза сердечно-сосудистой системы. В целом, выявленные взаимосвязи содержания Р1ЬОР и; уровням ауто-АТ юНКОР с АД, длительностью протекания ГБ, выраженностью ИБС и СН, степенью стеноза МАГ подтверждают предположение о вовлеченности; данных иммунобиохимичсских факторов в механизмы функционирования сердечнососудистой системьь и формирование гипертонии.

Полученные в работе: результаты расширяют.- существующие в настоящее время представления« о дизрегуляции взаимодействий; нервной; сердечно-сосудистой и. иммунных систем при- цереброваскулярной патологии, осложняющей; ГБ; Иммунобиохимические показатели, определяемые: в. критические периоды; развития- церебральных. осложнений ГБ, отражают; степень, проницаемости- ГЭБ, функциональное состояние нервных и глиальных клеток, а также состояние гуморального; звена иммунитета пациентов; Выявленные особенности функционирования выбранных систем белковых факторов 8100Ь, НЫЕ)Р и идио /антиидиотипических ауто-АТ к ним могут быть использованы в практических целях для разработки новых прогностических подходов к изучению развитиящереброваскулярных осложнений ГБ.