Автореферат и диссертация по медицине (14.01.11) на тему:Особенности течения острого периода ишемического инсульта у пациентов с различным уровнем трансмембранного ионотранспорта

Мухутдинова Эльвира Маратовна

ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ПЕРИОДА ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА У ПАЦИЕНТОВ С РАЗЛИЧНЫМ УРОВНЕМ ТРАНСМЕМБРАННОГО ИОНОТРАНСПОРТА

14.01.11— нервные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 9 ГЕН 2011

Казань-2011

4854816

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Дина Рустемовна Хасанова Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Мурат Мазгутович Ибатуллин Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Георгий Александрович Иваничев Доктор медицинских наук, профессор Рашид Асхатович Алтунбаев

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Нижний Новгород).

Защита состоится «_» _ 2011 г. в _ ч. на заседании

диссертационного совета Д.208.033.02 в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации: 420012, г. Казань, ул. Муштари, д. 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Автореферат разослан «_»_2011

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

Е.К. Ларюкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Распространенность острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК), огромный процент людей, перенесших инсульт, значительное количество которых приобретает ту или иную степень инвалидизации и необходимость постороннего ухода, неся, таким образом, моральные, физические и материальные затраты как со стороны окружения больного, так и государства, исключает необходимость обоснования, поиска доказательств актуальности изучения патогенеза ишемического инсульта (ИИ). Многофакторность природы ИИ обуславливает необходимость более детального изучения константных наследственных факторов, которые реализуются, в том числе, на клеточном уровне. Многие программы повреждения клеток, генетически обусловлены, что подтверждает значимость изучения вклада генетически детерминированных свойств клеток в патогенез ИИ. К таким свойствам относится структурно-функциональное состояние плазматической мембраны клеток отличающееся по своим характеристикам в популяции людей и животных (Орлов С.Н. и др., 1982; Постнов Ю.В. и др., 1987; ]. й а1., 1999).

Отражением генетически детерминированных струиурно-функциональных свойств мембраны клеток является транспорт ионов через плазматическую мембрану, осуществляемый обменниками (1\та+-Ма+, №+-Н+, Ыа+-Ь1+) (Постнов Ю.В. и др., 1987). Многочисленные исследования, берущие начало с 70-80гг. XX столетия, определили ассоциированность первичной гипертензии, а также ряда других заболеваний, с высоким уровнем функционирования указанных транспортных систем. Нарушение транспорта одновалентных ионов оказалось сопряженным с целым рядом других структурно-функциональных особенностей клеток, объединенных общим названием мембранные нарушения, оказавшиеся характерными для клеток как возбудимого, так и невозбудимого типов: сниженная способность клетки поддерживать в цитоплазме постоянный градиент концентрации ионов, повышение концентрации и снижение К+ в клетке, снижение мембранного потенциала и частичная деполяризация мембраны, повышение клеточной возбудимости, повышенние концентрации в цитозоле клетки свободного кальция, являющего основным медиатором этапов ишемического каскада (Постнов Ю.В. и др., 1987; Ослопов В.Н., 1995; Постнов Ю.В. и др., 2008), уменьшение скорости поглощения нейромедиаторов в синаптосомах и их длительный контакт с постсинаптической мембраной (Бриттов А.Н. и др., 1984; Постнов Ю.В. и др., 1985), избыточная концентрация токсических веществ, недостаток генерирования АТФ и, соответственно, предрасположенность к апоптозу (Постнов Ю.В. и др., 2008; ЬеЬшгщег А.Ь. е! а1., 1967; Еше Р. ег а1„ 1984; Ои1ак Р.У. й а1., 1986; Натег Р. й а1„ 1995; Ог1оу Б-Ы. е! а1., 1995; Норосгку в. й а1., 2006). Определено что, как у крыс БНЯ, так и у больных с эссенциальной гипертензией причиной более высокого количества ионов кальция в цитозоле является изменение микроструктуры мембран клеток (Могиепау-Оагез^ег Т. ег а1., 1981; Ог1оу Э.М. й а1., 1982; Ог1оу Б-Ы. й а1., 1982; 1. е1 а1., 1999), их количественного состава, приводящие

к модификации ионотранспортной функции клеточной мембраны (Postnov Yu.V. et al., 1988).

На современном этапе для характеристики вышеперечисленных свойств клеточных мембран используется один из механизмов транспорта ионов -диффузия Na+, который в свою очередь верифицируется путем определения скорости Na+-Li+ противотранспорта (Na+-Li+-countertransport - NLC) в мембране эритроцита. Генетические исследования, показавшие общность структурно-функциональных свойств мембран клеток различных типов, позволяют использовать результаты анализа эритроцитов, для оценки состояния мембран других клеток (Розеншраух JI.B. и др., 2010).

На основании вышесказанного было предположено, что особенности в структурно-функциональных свойствах мембран клеток, являются неблагоприятными, и с учетом патогенеза ишемии могут создавать основу более агрессивного течения всех патобиохимических этапов ишемии клеток головного мозга, что будет отражаться на тяжести течения ИИ, объеме и «глубине» поражения вещества мозга, и в конечном итоге на исходе заболевания, что наиболее значимо. Вышесказанное не может не обусловить интерес определения наличия или отсутствия ассоциаций приведенных свойств клеток с выраженностью поражения головного мозга и клиническими проявлениями ИИ. К настоящему времени не проводилось каких-либо работ, посвященных изучению данной проблемы, и вопрос поиска ассоциаций структурно-функциональных особенностей мембран клеток на тяжесть течения ИИ остается открытым.

Цель работы. Изучить особенности клиники и нейровизуализационных характеристик острого периода ишемического инсульта в ассоциации со структурно-функциональным состоянием клеточных мембран для оптимизации терапии и прогнозирования исходов инсульта. Задачи исследования:

1. Определить особенности нейровизуализационных характеристик ишемического очага в период терапевтического окна и в динамике острого периода инсульта при различном уровне ионотранспорта в мембранах клеток.

2. Определить клинические особенности ишемического инсульта в период терапевтического окна и в динамике в остром периоде при различном уровне ионотранспорта в мембранах клеток.

3. Оценить возможность применения величины скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита, отражающего структурно-функциональное состояние клеточных мембран, как генетического маркера течения ишемического инсульта.

4. На экспериментальной модели ишемии определить морфологические характеристики ишемического очага большого мозга крыс линии SHR, характеризующихся высокой скоростью трансмембранного ионотранспорта, и в контрольной группе линии Wistar.

Научная новизна. Впервые выявлены клинические и нейровизуализационные особенности течения острого периода ИИ в ассоциации со структурно-функциональным состоянием клеточных мембран. Впервые установлена

стабильность величины скорости Ка+-1л+-противотранспорта в мембране эритроцита при ИИ, что позволило провести анализ ассоциативности полиморфизмов генов, отвечающих за гетерогенность рецепторов мембран, участников ишемического повреждения клеток головного мозга, с диапазонами скорости NLC в мембране эритроцита. Впервые в экспериментальном исследовании на модели ишемии определены морфологические характеристики вещества мозга в очаге ишемии, в том числе уровень экспрессии защитного стресс-белка, у крыс линии SHR, характеризующихся высокой скоростью транспорта ионов в мембранах клеток, в сравнении с контрольной группой Wistar. Впервые обоснована возможность прогнозирования клинических исходов ИИ и необходимость коррекции методов лечения с учетом скорости NLC.

Практическая значимость. Установленные клинико-нейровизуализационные особенности острого периода ИИ у больных с различным уровнем транспорта ионов в мембранах клеток в ассоциации с другими генетическими маркерами позволяют на ранних стадиях заболевания прогнозировать тяжесть течения инсульта, выделить группу пациентов с прогностически более выраженным ишемическим повреждением головного мозга и неблагоприятным исходом заболевания, что, соответственно, позволит оптимизировать методы лечения. Полученные данные также могут создать основу для дальнейшего исследования эффективности различных групп препаратов, в первую очередь обладающих нейропротективными свойствами, для выработки стандартов лечения пациентов с учетом генетических факторов. Положения, выносимые на защиту.

1. Структурно-функциональное состояние мембран клеток ассоциировано с тяжестью течения ИИ, в том числе с выраженностью повреждения вещества головного мозга в зоне ишемии, объемом поражения, степенью неврологического и функционального восстановления к концу острого периода инсульта.

2. Полиморфизм генов, определяющих генетическую гетерогенность рецепторов клеточных мембран, участвующих в механизмах ишемии головного мозга, ассоциирован с диапазонами скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита.

3. К особенностям патогенеза ИИ у пациентов с различной принадлежностью к диапазонам скорости №+-1л+-противотранспорта в мембране эритроцита может относиться различная степень экспрессии защитного стресс-белка HSP70, что определено в экспериментальном исследовании на крысах SHR с высокими скоростными значениями транспорта ионов в мембранах клеток в сравнении с крысами Wistar.

4. Морфологические, клинические и визуализационные особенности, характерные для пациентов с высокой скоростью Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита, дают возможность выделить обозначенную группу как фактор риска тяжелого течения ишемического инсульта.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационного исследования внедрены в практическую деятельность неврологического

отделения ГАУЗ Межрегионального клинико-диагностического центра (г. Казани) и используются в учебном процессе кафедры неврологии и нейрохирургии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались в стендовом докладе на «XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2007г.; на Второй Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные методы диагностики и лечения кардиальной и церебральной патологии», г. Светлогорск, 2008г.; в стендовом докладе на «I Национальном конгрессе кардионеврологии», Москва, 2008г.; на Ш Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке», г. Казань, 2011г.; на совместном заседании кафедры неврологии и нейрохирургии ФПК и ППС ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (КГМУ), 2011г.; на совместном заседании сотрудников кафедры неврологии и мануальной терапии, кафедры неврологии и рефлексотерапии, кафедры детской неврологии ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, кафедры неврологии и нейрохирургии ФПК и ППС ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, 2011г.

Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ, из них 3 статьи - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК Минобразования и науки РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 16 рисунками, а также дополнена 10 приложениями. Библиографический указатель содержит 232 источников: 120 отечественных и 112 зарубежных авторов.

Содержание работы Материалы и методы клинического исследования. Проведен анализ архивных данных генетического обследования 225 лиц, относящихся к расе кавказиодам. Клинико-инструментальное исследование проведено 137 пациентам, госпитализированным с диагнозом ишемический инсульт в палату интенсивной терапии неврологическое отделения Государственного учреждения «Межрегиональный клинико-диагностический центр» г.Казань в период с мая 2006 по май 2009 гг. Диагноз ИИ и определение его подтипов устанавливались по критериям TOAST (Adams H.PJr. et al., 1993). Проводился сбор анамнеза, жалоб пациентов, неврологический и соматический статусы

оценивались по общепринятой методике. С целью стандартизации проводимого анализа были использованы критерии включения и исключения пациентов в динамический анализ течения ИИ.

Критериями включения пациентов в научный анализ послужили:

1. инсульт в острейшем периоде (от 0 до 3 часов) на момент поступления в стационар по данным анамнеза и МРТ в режиме DWI;

2. инсульт атеротромботического или кардиоэмболического генеза;

3. инсульт в бассейне средней мозговой артерии (СМА);

4. наличие очага по данным МРТ в полушарии мозга размером не менее 15 мм и не более 1/2 зоны васкуляризации СМА;

5. пациенты с уровнем сознания на момент поступления по шкале комы Глазго не менее 13 баллов;

Критериями исключения явились:

1. наличие в анамнезе сахарного диабета;

2. проведение тромболитической терапии;

3. использовании в терапии, препаратов модифицирующих свойства мембран клеток (гиполипидемические средства, эналаприл, нифедипин и другие);

4. использование пациентом до ОНМК препаратов с нейропротекторными свойствами для исключения эффекта медикаментозного прекондиционирования;

5. отсутствие спонтанной реканализации в актуальном бассейне по данным инструментальных методов обследования;

6. другие подтипы ишемического инсульта.

В соответствии с перечисленными критериями среди всех обследованных пациентов динамическое наблюдение было проведено 54 больным в возрасте 38-79 лет (37 мужчин и 17 женщин) с использованием ряда шкал, выявляющих неврологический и функциональный дефициты со шкалированием при поступлении, в первые 5 суток ежедневно, на 14 и 21 сутки от момента развития ОНМК.

Экспериментальное исследование было проведено на кафедре топографической анатомии и кафедре гистологии КГМУ. Исследование выполнялось на трех особях крыс линии Wistar и трех особях линии SUR с массой тела 260-280 гг.

При клиническом исследовании пациентов степень угнетения сознания оценивалась по шкале комы Glasgow (Teasdale G. et al., 1974). Неврологический дефицит оценивался по двум шкалам: шкале NIHSS (National Institutes of Health Stroke Scale, Brott T. et al., 1989) и Оригинальной шкале (Гусев Е.И., 1991). Функциональный дефицит оценивался по шкале Barthel (Mahoney F.T., Barthel D.W., 1965), модифицированной шкале Рэнкина (Rankin J., 1957).

Всем пациентам проводилось дуплексное ультрасонохрафическое исследование эстракраниальных и транскраниальных сосудов мозга с оценкой уровня и степени стеноза на ультразвуковых аппаратах LOGIC 500, VOLUSON EXPERT 730 JE MS, PHILLIPS HDI 5000 SONO CT XP секторным датчиком 2МГц.

Все пациенты с первого дня получали антикоагулянтные, гипотензивные и кардиологические препараты, инфузионную терапию для поддержания гомеостаза, а также были обеспечены адекватные питание и уход. В качестве базисного лечения использовались 25% раствор сульфат магния в количестве 10,0 мл. и препарат с предполагаемым нейропротекторным эффектом парентерально (церебролизин или актовегин). Пациентам всех групп проведен курс ранней реабилитации, с использованием методик лечебной физкультуры, а также логопедические занятия при необходимости.

Методы визуализационного исследования. Для подтверждения клинического диагноза, а также с целью оценки объема поражения всем пациентам проведено нейровизуализационное исследование на магнитно-резонансном томографе с напряженностью магнитного поля 1,0 Тесла (General Electric Medical Systems, Lx-MR/I, USA, 1998, градиентная система HiSpeed, амплитуда 23mT/m, версия программного обеспечения 9,1) на базе отделения лучевой диагностики МКДЦ. Каждому пациенту исследование проводилась два раза - при поступлении и на третьей неделе заболевания, при одинаковых объемах исследования каждого их протоколов (DWI, FLAIR, TI, Т2-взвешенные режимы, магнитно-резонасная ангиография). Полученные изображения проанализированы на рабочей станции Adwantage Windows ULTRASPARK, в ходе которой проведена оценка площади и объема ишемического очага, значения измеряемого коэффициента диффузии (ADC -apparent diffusion coefficient) (Oppenheim С. et al., 2001; Oppenheim С. et al., 2006).

Методика определения скорости Na+-Li+-np0THB0TpaHcn0pTa в мембране эритроцита. При оценке катионтраспортной функции клеточной мембраны использовался метод определения максимальной скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита (NLC) (Постнов Ю.В., Орлов С.Н., 1987; Canessa M.L. et al., 1987). У всех пациентов в день поступлений, а также у 19 из 54 пациентов двоекратно (повторно на 21 сутках) проводился забор крови с последующей оценкой скорости NLC, осуществленной на кафедре пропедевтики внутренних болезней КГМУ. Повторная оценка проведена для исключения возможного влияния ишемического процесса на изучаемый показатель.

В исследованиях В.Н. Ослопова (1995г.) было установлено, что гистограммы распределения скорости NLC имеют черты мультимодальности (негауссовское распределение) и использование только средних величин, выявляет лишь общие тенденции и не позволяет учесть крайние значения данного показателя. Поэтому на настоящее время наиболее оптимальным считается проведение статистического анализ методом квангильного распределения величин скорости NLC на квартили (кв.). Квантили - это абсциссы вертикальных линий, которые рассекают площадь под кривой плотности распределения всех возможных событий (индивидуальных величин NLC) на равные части (в данном случае на 4), что предполагает одинаковую вероятность попадания случайных величин в каждую из этих равных частей. Проводимое в работе группирование обследованных пациентов также осуществлено путем деления на квартили.

Для простоты восприятия было принято, что I кв. соответствует низкой скорости NLC (38 - 203 мкмоль1л/л клеток в час), II кв. - средней (204 - 271), III кв. - умеренно высокой (272 - 345), IV кв. - высокой скорости NLC в мембране эритроцита (346 - 730 мкмольЫ/л клеток в час) (Ослопов В.Н., 2006). Соответственно анализу к I и II кв. отнесены по 9 пациентов, к III кв. -12 и к IV кв. - 24 пациента.

Методы исследования генетической гетерогенности полиморфизмов генов. Для определения ассоциативности скорости NLC с другими генетически детерминированными свойствами клеток, в том числе с генами, участвующими в ишемическом процессе, проведен анализ результатов генетического обследования 225 пациентов, относящихся к татарскому этносу. Изучены структурные особенности полиморфизма G603A гена транспортёра глутамата ЕААТ, полиморфизма rs545098 гена ионотропного рецептора глутамата GLUR1, полиморфизма rs9307959 гена ионотропного рецептора глутамата GLUR2, полиморфизма rsl89994 гена апоптозиндуцирующего фактора AIF, полиморфизма rsl052576 гена каспазы CASP9, полиморфизма rs3219023 гена медиатора глутаматовой токсичночти PARP1. Генетический анализ материала проводился на базе отдела молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН (г. Москва). Выделение ДНК из клеток крови человека проводилось стандартным методом фенол-хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1989). Определение полиморфизмов генов осуществлялось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе фирмы "ДНК-технология" (Россия) в пробирках "Eppendorf" по 0,5 мл. Для анализа фрагментов ДНК, получаемых в ходе ПЦР, проводился вертикальный электрофорез в 6% полиакриламидном геле (ПААГ), 0,5хТВЕ. Для обнаружения наличия сайта рестрикции выполнялся рестрикционный анализ соответствующими рестриктазами. Материал и методы экспериментального исследования. ИИ у животных осуществлялся в левом полушарии головного мозга методом окклюзии СМА путём введения в сосуд монофиламентной нити (Bederson J. В. et al., 1986). Животные выводились из эксперимента через 12 часов после операции однократной инъекцией препарата (уретан). Проводилось нейровизуализационное исследование большого мозга крыс — МРТ в режимах FLAIR и DWI, осуществленное в отделении лучевой диагностики МКДЦ. Перед проведением исследования животные наркотизировались, для обеспечения неподвижности крысы фиксировались к планшете. Для проведения гистологического исследования головной мозг крыс постфиксировался в растворе параформальдегида в течение четырех часов на ротационном столике и заливался в парафин по стандартной методике. Для морфологического исследования парафиновые срезы (толщина 6 мкм) окрашивались гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводилось с помощью непрямого иммунопероксидазного метода (Полак и Ван Норден, 1987). При проведении иммуноблотинга (вестерн блот) использовались первичные антитела: поликлональные кроличьи антитела к Hsp25 в разведении 1:5000 (Stressgen, SPA-801; кроличьи поликлональные антитела к Hsp70 в разведении 1:1000 (Stressgen, SPA-812);

моноклональные антитела к актину в разведении 1:5000 (Sigma, А5441). Процессированные мембраны сканировались, денситометрический анализ полученных изображений проводился в программе Scion Image (Scion Corporation). Для стандартизации эксперимента интенсивность иммунной реакции нормализовалась по сигналу - актина.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ BIOSTATISTICS 4.0.

Результаты собственных исследований и обсуждение Оценка вариабельности значения скорости 1>1а+-1л+-противотранспорта в мембране эритроцита в динамике. В результате анализа значений NLC в динамике достоверной разницы между средними значениями скорости NLC, определенных в первый день развития болезни и на 21 сутках, не установлено (р<0,05). Не отмечено какой-либо закономерности в изменениях значений NLC в сторону увеличения или уменьшения. Кроме того, ни у одного пациента, у которого проведена оценка в динамике, величина скорости NLC не изменилась настолько, чтобы перейти по своим новым значениям в другой квартиль. Все это говорит об отсутствии зависимости изучаемого показателя от ишемического процесса, отражая определенную устойчивость признака, являющегося генетически детерминированным.

Особенности ишемического инсульта у больных с различной скоростью Na+-Li+-npoTHBOTpaHcnopTa в мембране эритроцита. Для определения сопоставимости изучаемых групп, оценены исходные демографические и клинические характеристики пациентов. В результате анализа не выявлены различия между группами по возрасту, полу, сторонности поражения, выраженности атеросклеротических изменений в сосудах головного мозга на стороне поражения, а также по наличию факторов риска (гипертоническая болезнь, нарушение ритма, ИБС, инфаркт миокарда, стенокардия напряжения, хроническое ревматическое поражение сердца). Исключение составили пациенты I кв., для которых оказалось характерным достоверное преобладание кардиоэмболческого подтипа ИИ (88,8% пациентов) и наличие в анамнезе нарушения сердечного ритма - постоянной формы фибрилляции предсердий (77,8% пациентов), а у пациентов II кв. по сравнению с I кв. значимо преобладала дислипидемия (33% и 0%, соответственно, р=0,025). Выявлено большее количество пациентов мужского пола во всех квартилях и в популяции в целом (р<0,05), что соответствует тому положению, что мужской пол является фактором риска OHMK (Apperlos P. et al., 2009, Haberman S. et al., 1981). Корреляционный анализ также подтвердил отсутствие связи между полом пациентов, стройностью поражения, сопутствующей патологией, степенью стенозирующих изменений брахиоцефальных сосудов с выраженностью клинических проявлений заболевания, оцененных по шкалам.

Нейровизуализациоиные особенности ИИ в ассоциации со скоростью Na+-ЬГ-противотранспорта в мембране эритроцита. Результаты

однофакторного дисперсионного анализа данных нейровизуализационного обследовшшя, проведенного в первые часы клинической манифестации заболевания, представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

_Изменения объема ишемического очага в квартилях скорости NLC

Вся I кв. II кв. III кв. IV кв. Р

выборка

Объем очага в 1 3330,4 6276,5* 2012,4 3413,5 2678,4 0,115

сутки (мм3) ±1382,6 ±1008,0 ±917,9 ±902,7 ±1036,7

Объем очага на 21 5205,2 10605,9 2138,4 1947,0 7387,1 0,025

сутки МРТ (мм3) ±1845,0 ±2765,9 ±1292,0 ±852,7 ±1914,5Л

Разница средних 1874,8 4329,4 126 -1467 4709,3* 0,009

значений объемов ±2150,0 ±3260,6 ±212,4 ±965,8 ±1053,7

очага (мм3) (0,936)

Р° 0,161 0,938 0,250 0,000

Примечание: /-/ уменьшение размера очага; р°- различия при сравнении размеров очага при поступлении и при повторной МРТ у пациентов одной группы; р — различия при сравнении значений у пациентов разных квартилей; * - р<0,05 - различия при сравнении групп больных; л - р<0,05 - различия между значениями у пациентов одного квартиля.

Между пациентами разных квартилей не выявлены достоверные различия в объеме очага, сформировавшего в острейшем периоде. Наименьшее среднее значение объема очага поражения определялось во II кв., наибольшее - в I кв.

Таблица 2

Сравнительный анализ ADC в очаге ишемии и в «зеркальной» области

Квартиль ADC на стороне поражения ADC в противоположном полушарии Р

I 0,000641±0,000013 0,000947±0,000032 0,933

II 0,000633±0,000033* 0,000936±0,000052 0.014

III 0,000680±0,000029* 0,001016±0,000025 0;056

IV 0,000691±0,000017* 0,001013±0,000022 0.002

Р° 0,233 0,085

Примечание: * - р<0,05 - различия при сравнении значений ADC на стороне очага и в противоположном полушарии у пациентов одного квартиля; р - достоверность отличий у пациентов одного квартиля; р°- достоверность отличий у пациентов разных квартилей

Сравнение квартилей по абсолютным значениям ADC в очаге поражения также не показало различий, достигающих степени достоверности (таблица 2). В то же время, у пациентов II, III и IVkb. коэффициент диффузии в очаге ишемии достоверно отличался от указанного показателя в контрлатеральной интактной «зеркальной» области (р<0,05). Но в I кв. данная разница не

выявлялась, что может свидетельствовать о менее «глубоком» поражении вещества мозга в отличие от пациентов других групп, несмотря на то, что у данной группы больных была выявлена большие размеры очага. Учитывая отсутствие разницы в тяжести заболевания между группами, можно говорить о том, что диффузионные изменения в клетках не достигают такой степени, чтобы в первые минуты нарушения мозгового кровотока реализоваться клинически. Корреляционный анализ также показал, что значения ADC в очаге ишемии и выраженность заболевания в острейшем периоде не имеют какой-либо связи.

Сравнительный анализ объема инфаркта головного мозга при поступлении и при повторной нейровизуализации (3 неделя) показал значимое нарастание у пациентов IV кв. (р=0,04) (таблица 1). В I кв. очаг ишемии также увеличился, но выраженность изменения не соответствовала степени достоверности. Во II и III кв. объемы изменились незначительно. Сравнение разницы средних значений объемов при первом и повторном исследованиях выявило различия, достигающие степени достоверности, Г/кв. со II и III кв. (р<0,05), свидетельствующие о более выраженном нарастании зоны ишемии у пациентов с высокой скоростью NLC.

Клинические особенности ИИ в острейшем периоде и в динамике в ассоциации со скоростью Ка+-Ы+-противотранспорта в мембране эритроцита. По результатам анализа шкал, оценивающих функциональный и неврологический статусы в первые часы клинической манифестации заболевания, не выявлено достоверных различий между группами. Отсутствие различий в клинических проявлениях и визуализационных характеристиках в первые сутки от клинической манифестации заболевания у пациентов различных квартилей позволяет сделать предположение, что исследуемые генетические механизмы, как предикторы тяжести течения заболевания, реализуются не в острейшем периоде ИИ, а позже, «способствуя» или наоборот «препятствуя» выживанию в той или иной степени ишемизированных клеток мозга, определяя таким образом их судьбу. Возможно, в первые минуты объемы формирующихся зон инфаркта и пенумбры минимально или вовсе не «зависят» от изучаемых свойств мембран, и лавинообразные этапы ишемического каскада являются равнозначными для клеток любых типов. Лишь в последующем, на более поздних стадиях ишемического повреждения, особенности функционирования мембран клеток оказывают влияние на течение ишемии - «положительно» или «отрицательно», когда наиболее важным становится выживание клеток в зоне с пониженным кровотоком, в зоне пенумбры, олигемии, в то время, когда запускаются более поздние механизмы гибели или наоборот выживания клеток, что будет реализовываться в изменениях размеров очага и в динамике неврологического и функционального дефицитов.

Определялась достоверно лучшая динамика восстановления у пациентов с меньшими значениями скорости NLC, которая становиться менее выраженной от I кв. к IV (таблица 3).

Таблица 3

Динамика неврологического и функционального статусов за весь период наблюдения по шкалам в квартилях скорости NLC

Квартиль I II III IV Р

NIHSS (баллы) 6,3±0,3* 5,1±0,6 4,2±0,8 4,5±0,5 0,160

Оригинальная шкала баллы) 4,4±0,2* 4,4±0,6* 3,3±0,5 2,4±0,5 0,024

Barthel (баллы) 48,1±3,8* 33,9±4,2 29,2±7,1 27,3±4,1 0,054

Примечание: * - р<0,05 - различия при сравнении поквартильно групп больных

По всем шкалам динамика по баллам у пациентов I кв. достоверно отличалась от других квартилей. По шкале NIHSS в I кв. разница между днем поступления и 21 сутками составила 6,3±0,3б., что статистически значимо преобладало над значениями у пациентов III кв. (4,2±0,8б., р=0,042), и IV кв. (4,5±0,5б., р=0,041). По Оригинальной шкале достоверная разница определялась между I и IV квартилями (4,4±0,2б. и 2,4±0,5б., соответственно, р=0,023), а также между II и IVkb. (4,4±0,6б. и 2,4±0,5б., соответственно, р=0,031). Оценка динамики функционального дефицита по шкале Barthel выявила отличия I кв. от всех остальных, при этом степень достоверности между I и II квартилями достигала 0,023, между I и 1П кв. - 0,046, и между I и IV кв. — 0,007. Полученные данные указывают на тот факт, что у пациентов I кв. определяется клинико-визуализационное несоответствие, когда при изначально более низких значениях в баллах по шкалам неврологического и функционального статусов и большем объеме очага динамика восстановления оказалась интенсивнее.

Анализ состояния пациентов в конце наблюдения (21 сутки) показал отсутствие достоверной разницы между квартилями в неврологическом статусе по шкале NIHSS и по оригинальной шкале (таблица 4). По шкале Barthel, оценивающей функциональный дефицит, определилась значимая разница в степени восстановления между двумя крайними квартилями с лучим исходом в I кв., где среднее значение по данной шкале составило 109,3±0,71б., в IV кв. - 95,8±3,93б. (р=0,046). По первым двум шкалам для средних квартилей оказалось характерным лучшие значения, но без значимых отличий от I и IV квартилей.

Таблица 4

Результаты анализа неврологического статуса в баллах _на 21 сутки в квартилях скорости NLC__

Квартиль I II III IV Р

NIHSS (б.) 3,55±0,81 2,1±0,47 3,08±0,99 3,79±0,70 0,504

Оригинальная шкала (б.) 43,44±0,94 45,44±0,86 45,42±0,91 42,50±0,68 0,384

Barthel (б.) 109,3±0,71* 105,6±2,81 100,0±6,15 95,8±3,93 0,173

Примечание: * - р<0,05 - различия при сравнении поквартильно групп больных

Помимо шкалы Ваг&е1 исход заболевания к 21 суткам, степень инвалидизации и возможность самообслуживания оценивались по двум

другим шкалам: модифицированной шкале Рэнкина. Достоверная разница выявлялась между пациентами II, III и IV кв., таким образом, что значения во II кв. преобладали по баллам над Шкв. (1,1±0,1б. и 1,6±0,1б., соответственно, р=0,003) и IVkb. (1,1±0,1б. и 2,1±0,15б., соответственно, р=0,000), а Шкв. над IVkb. (1,6±0,1б. и 2,1±0,15б., соответственно, р=0,033). Таким образом, наихудшая степень восстановления по шкале определяется у пациентов IV кв. У пациентов I кв. регресс функционального дефицита также оказался лучшим в сравнении с пациентами IV кв., но без значимой разницы.

Известным и доказанным является более значимый дефицит в острейшем периоде ОНМК, более тяжелое течение заболевания, высокая частота обширного инфаркта мозга и геморрагической трансформации в очаге у пациентов с кардиоэмболическим ИИ в сравнении с другими вариантами (Тихомирова О.В. и др., 2001; Henrik S.J. et al., 1996; Hen Hallevi et al., 2008; Paciaroni M. et al., 2008). В соответствии со сказанным можно предположить, что тенденция к большему неврологическому дефициту, больший объем ишемического очага и его нарастание, но незначимое, к 21 суткам, у пациентов I кв. в сравнении с пациентами других групп, в том числе IVkb., может быть обусловлен преобладанием кардиоэмболического подтипа инсульта. Но, несмотря на указанные особенности, у пациентов данной группы динамика восстановления оказалась более интенсивной настолько, что к концу наблюдения значения стали лучшими в сравнении с бальными характеристиками пациентов других групп. Пациенты средних квартилей заняли промежуточные значения по баллам, показав также лучшее восстановление по ряду шкал и данным нейровизуализации, чем пациенты IV кв. Динамическое наблюдение пациентов, принадлежащих ко II, III и IVkb., нарушение мозгового кровообращения которых произошло в изначально равнозначных условиях, дает возможность предположить, что именно структурно-функциональная особенность клеточных мембран у пациентов IVkb. является ведущим предиктором тяжести течения заболевания и нарастания объема ишемического очага в веществе головного мозга к третьей неделе заболевания.

Проведен поквартальный анализ развития осложнений у пациентов. К осложнениям ишемического инсульта отнесены: геморрагическая трансформация в очаге ишемии и отек с дислокацией головного мозга. Все виды осложнений были объединены в одну группу, таким образом, что у каждого участника за весь период наблюдения и к его концу либо выявлялось осложнения, либо вовсе отсутствовали. У 8 пациентов из 54 наблюдавшихся развились те или иные осложнения (14,8%). Разницы в частоте развития осложнения у пациентов, с разными скоростями NLC, не выявлено.

Таким образом, выявленные специфики позволяют предположить, что, как и у пациентов с высокими значениями скорости NLC в мембране эритроцита, так и у крыс линии SHR, используемых как экспериментальная модель ишемии, существуют условия, которые приводят к более агрессивному течению ИИ, большей гибели клеток, и возможно меньшей их способности к

включению защитных механизмов, в том числе синтезу защитного белка Н8Р70, что было показана в экспериментальной части работы. Популяционные различия генотипов в квартилях скорости 1Ча+-1Л+-противотранспорта в мембране эритроцита. Основываясь на предыдущем утверждении и на основании того, что гибель клеток при ишемии в большей степени протекает под контролем генетически установленных программ, сделана попытка выявить особенности полиморфизмов генов, белковые продукты которых принимают участие в реализации программ реакции клеток на ишемию, в квартилях распределения скорости ]ЧЬС в мембране эритроцита. Изучение поквартальной частоты встречаемости генотипов изучаемых генов выявило достоверные различия (р<0,05) между квартилями, представленные в таблице 5.

Установлены статистически значимые корреляции частоты встречаемости полиморфизмов гена А№ для следующих квартилей: для I кв. характерным явилось преобладание генотипа ТТ, статистически значимо отличающегося от III кв. (0,46 и 0,19, р<0,05), для которого в свою очередь получены достоверно более высокие значения частоты генотипа СС по сравнению с I и II кв. (0,65 к 0,32 и 0,34, соответственно, р<0,05); во II кв. частота встречаемости генотип ТС превышала частоту встречаемости в II кв. (0,41 и 0,15, р<0,05).

Таблица 5

Популяционные различия генотипов в квартилях скорости NLC _в мембране эритроцита (р<0,05)_

Большая частота встречаемости Меньшая частота встречаемости

Ген апоптоз индуцирующего фактора (AIF rsl89994 CYT )

генотип TT I кв. - 0,46 III кв.-0,19

генотип С С III кв. - 0,65 I кв.-0,32, II кв.-0,34

генотип ТС II кв.-0,41 III кв.-0,15

Ген транспортера глутамата (ЕААТ ехоп 5 G603A )

генотип АА II кв -0,55 I кв. - 0,29, IV кв. - 0,26

генотип AG IV кв. - 0,68 II кв. - 0,36

Ген ионотропных рецепторов глутамата (GLUR2 rs93 07959 С\Т )

генотип СС I кв. - 0,71 III кв. - 0,73 II кв - 0,48

Ген медиатора глутаматовой токсичности (PARP1 rs3219023 A\G)

генотип GG I кв.-0,18, II кв. - 0,23, IV кв. - 0,26 III кв.- 0,00

генотип AG III кв. - 0,58 II кв. - 0,32

Для гена ЕААТ характерным явилось преобладание генотипа АА во II кв. по сравнению с I и IV кв. (0,55 к 0,29 и 0,26, соответственно, р=0,05), и

генотипа AG в IV кв. по сравнению со II кв. (0,68 и 0,36, р<0,05). Распределение генотипа гена GLUR2 показало статистически значимо меньшие цифры для генотипа СС во II кв. по сравнению с I и III кв. (частота 0,48 к 0,71 и 0,73, соответственно, р<0,05). Генотип GG гена PARP1 не был выявлен ни у одного пациента в III кв., что статистически значимо отличалось от I, II и IV кв. (0,00 по сравнению с 0,18, 0,23 и 0,26, соответственно, р<0,05). В то же время в III кв. значимо преобладал генотип AG по сравнению со II кв. (0,58 и 0,32, р<0,05). Кроме того, анализ 84 из 225 лиц показал наличие значимой корреляционной связи генотипов гена AIF со значениями скорости NLC. У 34 исследованных лиц с низким уровнем скорости NLC в мембране эритроцита (среднее значение было равным 241 мкмольЫ/л клеток в час) определялась значимая корреляция с генотипом TT данного гена, в то время как у 50 с более высоким уровнем скорости (среднее значение было равным 279 мкмольЫ/л клеток в час) - с генотипом СС (р=0,04).

На основании предположенного худшего прогноза течения ИИ у пациентов IV кв. и более «благоприятного» у пациентов с низкими значениями скорости NLC можно с определенной осторожностью утверждать, что выявленные сочетания полиморфизмов могут формировать группу высоко риска «неблагоприятного» течения ИИ, и, наоборот, определенные комбинации могут способствовать более мягкому, менее агрессивному повреждению клеток мозга в случае ОНМК.

В результате проведенного анализа получены доказательства неравномерности сцепления, ассоциации полиморфизмов некоторых генов в с интервалами скорости (квартилями) NLC в мембране эритроцита, На основании этого возникает предположение, что свой вклад в патогенез ИИ как генетически детеминированные факторы привносят не только изучаемые мембранные характеристики, но, возможно, и генетическая гетерогенность рецепторов, участников ишемического процесса, что требует дальнейшего изучения. Таким образом, сочетание комбинаций генотипов разных генов в пределах одного квартиля может быть «благоприятным» или «неблагоприятным», что требует дальнейшего изучения данной гипотезы на большей популяции исследуемых пациентов с ИИ с использованием молекулярно-генетических методов исследования структуры генотипов. Это также позволит разработать основу для дальнейшего комплексного исследования значений генетических факторов в реализации тяжести течения ОНМК. .

Гистологические особенности ишемического очага в большом мозге крыс после окклюзии средней мозговой артерии. Трудность прижизненной диагностики гистологических особенностей ишемического повреждения ткани мозга у пациентов, относящихся к различным квартилям скорости NLC, определила необходимость использования крыс в качестве модели ишемии. Экспериментальная работа была проведена путем сравнения гистологических данных крыс со спонтанной гипертензией линии SHR, для представителей которых присущи высокие скоростные характеристики функционирования клеточных мембран (David-Duffilho М. et al., 1986) с крысами, принадлежащими к нормотензивной линии Wistar, клетки которых не имеют

таких особенностей и сравнимы с изучаемыми группами пациентов, принадлежащих к различным квартилям скорости NLC. Это позволило провести морфологическое исследование тканей, а также определить концентрацию одного из маркеров ишемии — белка теплого шока HSP70, уровень которого значительно возрастает при патологическом воздействии на клетку, в том числе при ишемии (Holbrook N.J. et al., 1994; Feder M.E. et al., 1995; Lindquist S. et al., 1993), и синтез которого зависим от полноты энергетического обеспечения клетки (Sharp F.R. et al., 2000). В соответствии со сказанным выше, была поставлена задача установления разницы концентрации указанного белка при различных генетически обусловленных особенностях функционирования клеток.

При проведении визуализационного исследования у крыс SHR выявлена яркая зона ишемии в режиме DWI, плохо определяемая у крыс линии Wistar. По данным морфологического и иммуногистохимического исследований, проведенных через 12 часов после окклюзии левой СМА, более выраженное и обширное поражение вещества мозга выявлено у крыс SHR в сравнении с крысами линии Wistar. Для первых характерным явилось отсутствие видимых границ поражения и дифференциации слоистой структуры коры большого мозга, определение в структуре очага одиночных выживших нервных клеток, рассеянных в ишемизированной зоне. В области ишемии головного мозга крыс Wistar по данным иммуногистохимического исследования выявлялись интенсивно окрашенные клетки пенумбры, достаточно четко ограничивающие зону инфаркта от жизнеспособной ткани.

Денситометрический анализ интенсивности экспрессии белка у крыс SHR после 12-часовой ишемии показал, что уровень HSP70 в актуальном полушарии у указанных животных повышается лишь на 20% по сравнению с интактным правым полушарием мозга (р>0,05), в то время как у крыс Wistar увеличение HSP70 в ишемизированном полушарии более значительно, составляя разницу со здоровым близкой к 100% (р<0,05).

Таким образом, у SHR крыс через 12ч. после операции поражение головного мозга носит более выраженный характер, и концентрация защитного белка повышается незначительно. Соотношение факта энергозатратности синтеза исследуемого белка и низкого его уровня у крысы SHR свидетельствует о более грубом поражении вещества мозга, об отсутствии клеток, способных к жизнедеятельности в той степени, чтобы синтезировать белки de novo в отличие от контрольной крысы. Подобные свойства возможно характерны и для изучаемых групп пациентов.

Выводы

1. Определен наибольший объем очага ишемии, формирующийся в острейшем периоде инсульта, у пациентов I квартиля с низким уровнем трансмембранного ионотранспорта, ассоциирующийся с

кардиоэмболическим подтипом ишемического инсульта, без дальнейшей динамики размеров к 21 суткам. Большая степень изменений в очаге по оценке ADC МРТ установлена у больных IV квартиля с высокими значениями трансмембранного ионотранспорта, для которых также

характерно достоверное увеличение размеров очага ишемии в динамике (р<0,05). У пациентов II и III квартилей не выявило достоверных МРТ особенностей динамики размеров очага (р>0,05).

2. В дебюте инсульта по клиническим характеристикам пациенты, относящиеся ко всем диапазонам скорости Ыа+-1л+-противотранспорта в мембране эритроцита, были сопоставимы. При оценке течения острого периода инсульта установлено, что пациенты I квартиля характеризовались более выраженной положительной динамикой восстановления функциональной недостаточности (р<0,05), а пациенты IV квартиля имели достоверно худшую динамику восстановления с меньшей степенью нивелирования неврологического дефицита и функционального восстановления. Пациенты, относящиеся ко II и III квартилям, имели положительную динамику течения заболевания, достоверно отличаясь по интенсивности изменений от пациентов двух крайних квартилей, занимая промежуточное положение.

3. Установлена стабильность значения скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита в остром периоде ишемического инсульта (р>0,05), а также выявлена генетическая гетерогенность рецепторов, участвующих в патобиохимических процессах ишемии в диапазонах скорости Ка+-Ь1+-противотранспорта, что позволяет использовать результаты изучения особенностей течения ишемического инсульта в ассоциации со скоростью трансмембранного ионотранспорта для создания основ прогнозирования течения патологического процесса и отнести лиц с высокой скоростью Na+-Ы+-противотранспорта к группе риска неблагоприятного течения ишемического инсульта.

4. На экспериментальной модели ишемии установлена большая выраженность ишемического повреждения у крыс линии SHR с отсутствием дифференциации структуры вещества головного мозга и одновременно меньшей экспрессией защитного белка HSP70 в пораженном полушарии в сравнении с крысами линии Wistar (р<0,05).

Практические рекомендации

1. Определение величины скорости Ыа+-1л+-противотранспорта в мембране эритроцита у больных с ишемическим инсультом дает возможность прогнозировать выраженность повреждения головного мозга в зоне ишемии, тяжесть течения и исход заболевания, как в отношении степени неврологической недостаточности, так и функционального дефицита к концу острого периода инсульта.

2. Выявление группы пациентов с генетически заложенным неблагоприятным течением ишемического инсульта может быть использовано для дифференцированного подхода в лечении данного заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хасанова Д.Р. Динамика неврологического дефицита у больных в остром периоде ишемического атеротромботического инсульта на фоне лечения актовегином и димефосфоном / Хасанова Д.Р., Мухутдинова Э.М., Китаева Э.А., Демин Т.В. // Тез. докл. XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москваю - 2007. - С. 785-786.

2. Хасанова Д.Р. Особенности ишемического инсульта у больных с различной скоростью Na+/Li+ противотранспорта в мембране эритроцита / Хасанова Д.Р., Ослопов В.Н., МухутдиЕюва Э.М., Ибатуллин М.М, Китаева Э.А, // Практическая медицина. Неврология и психиатрия. - Казань. - 2007. -№03(22). - С. 7-9.

3. Мухутдинова Э.М. Методы нейровизуализации в диагностике ишемического инсульта (обзор литературы) / Мухутдинова Э.М., Ибатуллин М.М. // Практическая медицина. Неврология и психиатрия. — Казань.-2007.-№03(22).-С. 11-13.

4. Хасанова Д.Р. Особенности ишемического инсульта у больных с различной скоростью Na+/Li+ противотранспорта в мембране эритроцита / Хасанова Д.Р., Мухутдинова Э.М., Демин Т.В., Ибатуллин М.М, Ослопов В.Н. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Инсульт: приложение к журналу. Спецвыпуск. - 2007. - С. 238.

5. Мухутдинова Э.М. Динамика клинических и нейровизуализационных характеристик в остром периоде ишемического инсульта у больных с различной скоростью пассивного трансмембранного ионотранспорта в мембране эритроцита / Мухутдинова Э.М., Ослопов В.Н., Хасанова Д.Р., Хасанов Н.Р. // Вестник национального медико-хирургического центра im. Н.И. Пирогова. - 2008. — Т. 3. - №1. - С. 62-63.

6. Китаева Э.А. Нейропротективное действие ПК-Мерц, связанное с усилением экспрессии белка теплового шока HSP70 в нейронах коры большого мозга крыс после окклюзии средней мозговой артерии / Китаева Э.А., Баширов Ф.В., Ризванов A.A., Хомяков Е.А., Халиков М.М., Гильмуллин Ф.И., Мугинов Р.Н., Мухутдинова Э.М., Хасанова Д.В., Исламов P.P. // Морфологические ведомости. - 2008. - 1-2. — С. 66-72.

7. Хасанова Д.Р. Особенности нейровизуализационных характеристик в остром периоде ишемического инсульта у больных с различной скоростью пассивного трансмембранного ионотранспорта в мембране эритроцита / Хасанова Д.Р., Ибатуллин М.М., Мухутдинова Э.М., Данилова Т.В., Ослопов В.Н. // I Национальный конгресс кардионеврологии. — Москва. -2008.-С. 373.

8. Хасанова Д.Р. Скорость пассивного трансмембранного ионотранспорта как предиктор тяжести течения острого периода ишемического инсульта / Хасанова Д.Р., Мухутдинова Э.М, Ибатуллин М.М., Данилова Т.В. // Неотложные состояния в неврологии. - Москва. - 2009. - С. 336.

9. Хасанов Н.Р. Генотипы, ассоциированные с различной скоростью Na+/Li+ противотранспорта в мембране эритроцита / Хасанов Н.Р., Хасанова Д.Р., Мухутдинова Э.М., Сломинскнй П.А. // Казанский медицинский журнал. - Казань. - 2010. - С. 7- 11.

Ю.Хасанова Д.Р. Ишемия головного мозга крыс линии SHR и Wistar-Kyoto как экспериментальной модели ишемического инсульта у пациентов с различивши структурно-функциональными свойствами плазматической мембраны клеток / Д.Р.Хасанова, Э.М.Мухутдинова, Р.Р.Исламов // Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение. - Пятигорск.-2010.-С. 33-34. П.Хасанова Д.Р. Особенность течения острого периода ишемического инсульта у пациентов с различным уровнем трасмембранного ионотранспорта / Д.Р.Хасанова, Э.М.Мухутдинова, В.Н.Ослопов, М.М.Ибатуллин, Н.Р.Хасанов // Материалы Ш-й Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке». - Казань,-2011.-С. 126-130.

12.Хасанова Д.Р. Особенности течения острого периода ишемического инсульта у пациентов с различным уровнем трансмембранного ионотранспорта / Хасанова Д.Р., Мухутдинова Э.М., Ибатуллин М.М., Ослопов В.Н., Хасанов Н.Р. // Клиническая геронтология. - 2011. - №78. - С.31-37.

Список условных сокращений

ГТ - геморрагическая трансформация ИБС — ишемическая болезнь сердца ИИ — ишемический инсульт кв. - квартиль

МРТ — магнитно-резонансная томография

МРТ — магнитно-резонансная томография

ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения

ПИКС - постинфарктный кардиосклероз

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СМА — средняя мозговая артерия

ХРБС — хроническое ревматическое поражение сердца

ADC (apparent diffusion coefficient) - измеряемый коэффициент диффузии

DWI - диффузионно-взвешенная МРТ

HSP70 (heat shock protein) - белок теплового шок с молекулярной массой около 70 кДа

NIHSS - Шкала инсульта Национального Института Здоровья США

NLC - Na+-Li+-npoTHBorpaHcnopT в мембране эритроцита

rADC - соотношение ADC зоны ишемии с ADC «зеркальной» области другого

полушария

SHR- крысы со спонтанной гипертензией линия Окамото-Аоки

Подписано в печать 07.09.2011 г. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 272.

Изготовлено в полиграфическом центре «Отечество» 420126, г.Казань, ул.Чистопольская, д.27а

Сосудистые заболевания головного мозга остаются одной из острейших медико-социальных проблем, затрагивающих большое количество людей - в. России более 450 тысяч случаев заболевания в год [Гусев Е.И., Скворцова В.И., Стаховская Л.В., 2003] Значимый процент больных с острым нарушением мозгового кровообращения (ОНМЕС) приобретает ту или иную степень неврологических и функциональных нарушений, ограничивающих их жизнедеятельность и трудоспособность, таким образом, инвалидизируя общество. Кроме того,* ОНМК характеризуются! высокой летальностью на протяжении всего) периода восстановления: ^Значимый; урон, наносимый заболеванием, говорит о том, что проблема профилактики и лечения инсульта для современной медицины остается- не решенной, и позволяет утверждать о большой актуальности изучения? данного вопроса, необходимости^ научных изысканий, которые возможно помогут более существенно повлиять на исход.заболевания. .

Большое количество проведенных и проводимых работ посвящено ишемическому инсульту (ИИ), где значительное внимание уделяется предикторам тяжести течения и исходов заболевания1, а также изучению участия- мембран в механизмах гибели клеток при ишемии; В настоящее время В: клиническую практику внедрены достижения многочисленных теоретических и экспериментальных разработок. Генетическая обусловленность большинства, программ повреждения клеток при ишемии говорит о важности изучения вклада генетически детерминированных свойств клеток в патогенез ИИ; Исследования, берущие начало в 70-80гг. XX столетия выявили у пациентов с эссенциальной гипертензией ряд особенностей в структурно-функциональных свойствах мембран клеток, объеденных общим названием - «мембранные нарушения», оказавшиеся характерными для клеток как возбудимого, так и невозбудимого типов, т.е. являющиеся генерализованными, а также генетически детерминированными

Розенштраух Л.В., Резник A.B., Белошапко Г.Г. и др., 2010]. К одним из таких установленных признаков относится увеличение скорости равновесного Na-Na-обмена [Постнв Ю.В., 1998], в основе чего лежат нарушения как в системе противотранспорта, так и в однонаправленном переносе одновалентных катионов [Canessa М., 1980]. Нарушение транспорта одновалентных ионов оказалось сопряженным с целым рядом других структурно-функциональных особенностей клеток с «мембранными нарушениями»: сниженной способностью клетки поддерживать в цитоплазме постоянный градиент концентрации ионов, повышением концентрации Na+ и снижением К+ в клетке, снижением мембранного потенциала и частичной деполяризацией мембраны, повышением клеточной возбудимости, повышенной концентрацией в цитозоле клетки свободного кальция, являющего основным медиатором этапов ишемического каскада [Постнов Ю.В:, Орлов С.Н., 1987, Ослопов- В.Н., 1995, Постнов? K)tB., Орлов. G.H., Будников Е.Ю. и др., 2008], уменьшением скорости поглощения нейромедиаторов в синаптосомах и их длительным контактом с постсинаптической мембраной [Бриттов А.Н., 1984, Постнов Ю.В., Кравцов Г.М.,' Орлов С.Н.' и др., 1985], избыточной' концентрацией токсических веществ, недостатком генерирования энергетических субстанций, и соответственно, предрасположенностью к апоптозу [Постнов Ю.В., Орлов С.Н., Будников Е.Ю. и др'412008]."

Вышеперечисленное позволяет предположить, что обозначенные свойства мембран клеток, индикатором которых послужил один из механизмов транспорта ионов - равновесный Na+-Na+o6MeH, который в свою очередь определяется по скорости лабораторного маркера - максимальной скорости Na+-Li+ противотранспорта (Na+-Li+countertransport - NLC) в мембране эритроцита, "могут создавать основу для более агрессивного течения всех патобиохимических этапов ишемии клеток головного мозга, что будет отражаться на тяжести течения ИИ, объеме и «глубине» поражения вещества мозга, и в конечном итоге на исходе заболевания, что наиболее значимо. Генетические исследования, показавшие общность структурно-функциональных свойств мембран клеток различных типов, позволили использовать результаты анализа эритроцитов для оценки состояния мембран любых других клеток [Розенштраух Л.В., Резник A.B., Белошапко Г.Г. и др., 2010]. Это не может не обуславливать интерес к поиску наличия или отсутствия ассоциаций обозначенных свойств мембран клеток с выраженностью поражения вещества головного мозга при инсульте. К настоящему времени не проводилось каких-либо работ, изучающих данную проблему, и вопрос поиска ассоциаций структурно-функциональных свойств клеточных мембран с тяжестью течения ИИ остается открытым.

Цель работы

Изучить особенности клиники и нейровизуализационных характеристик острого периода ишемического инсульта в ассоциации со структурно-функциональным состоянием клеточных мембран для оптимизации! терапии и прогнозирования исходов инсульта.

Задачи исследования

1. Определить особенности нейровизуализационных характеристик ишемического очага в период терапевтического окна и в динамике острого периода инсульта при различном уровне ионотранспорта в мембранах клеток. t < i чм» м • p« I 1 *

2. Определить клинические особенности ишемического инсульта в период терапевтического окна и в динамике в остром периоде при различном уровне ионотранспорта в мембранах клеток. t . , ) ,

3. Оценить возможность применения величины скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита, отражающего структурно-функциональное состояние клеточных мембран, как генетического маркера течения ишемического инсульта.

4. На экспериментальной- модели ишемии определить морфологические характеристики ишемического очага большого мозга крыс линии SHR, характеризующихся высокой скоростью трансмембранного ионотранспорта, и в контрольной, группе линии Wistar.

Научная новизна

Впервые выявлены клинические и нейровизуализационные особенности течения острого периода ИИ в ассоциации со структурно-функциональным состоянием клеточных мембран. Впервые установлена стабильность величины скорости 1Ма+-1л+-противотранспорта в мембране эритроцита при ИИ, что позволило провести анализ ассоциативности полиморфизмов генов, отвечающих за гетерогенность рецепторов мембран, участников ишемического повреждения' клеток головного мозга, с диапазонами скорости NI>C; в' мембранеэритроцита. Впервые в экспериментальном исследовании- на модели ишемии определены: морфологические характеристики вещества мозга в очаге ишемии, в том числе уровень экспрессии^ защитного стресс-белка, у крыс линии; SHR, характеризующихся, высокой^ скоростью транспорта ионов: в ; мембранах клеток, в сравнении с контрольной группой Wistar. Впервые обоснована . возможность прогнозирования клинических исходов ИИ и необходимость коррекции методов лечения с учетом скорости NLG.

Практическая значимость

Установленные клинико-нейровизуализационные особенности острого периода ИИ у больных с различным уровнем транспорта ионов в мембранах клеток в ассоциации с другими-: генетическими маркерами позволяют на ранних стадиях- заболевания1 прогнозировать тяжесть течения инсульта, выделить группу пацйёнтов с прогностически более выраженным ишемическим повреждением головного мозга и неблагоприятным исходом заболевания, что, соответственно, позволит оптимизировать методы лечения. Полученные данные также могут создать основу для дальнейшего исследования эффективности 'различных групп препаратов, в первую очередь обладающих ' нейропротективными свойствами, для выработки стандартов лечения пациентов с учетом генетических факторов.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертационного исследования внедрены в практическую деятельность, неврологического отделения- Государственного автономного учреждения здравоохранения «Межрегиональный клинико-диагностический центр» (г. Казани) и используются в учебном процессе кафедры неврологии и нейрохирургии: ФПК и ГП1С ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет»- Министерства1 здравоохранения и социального развития Российской Федерации. .

Публикации результатов исследования По теме - диссертационной; работы опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 опубликованы: в ведущих; рецензируемых научных журналах,. определенных ВАК Министерства образования и науки Российской* Федераций: ' ! Положения!; выносймые:на защиту

1. Структурно-функциональное состояние мембран клеток ас тяжестью течения ИИ, в том числе с выраженностью повреждения , вещества головного мозга в зоне ишемии, объемом поражения, степенью неврологического? и 'функционального восстановления к концу острого периода инсульта. :

2. Полиморфизм генов, определяющих генетическую гетерогенность рецепторов клеточных мембран,, участвующих в механизмах ишемии головного мозга, ассоциирован: с диапазонами скорости Ка+-1Л+-противотранспорта'в мембране'эритроцита.

3. К особенностям патогенеза ИИ у пациентов с различной принадлежностью к диапазонам скорости Ыа+-ЬГ-противотранспорта в мембране эритроцита.4 может относиться различная степень экспрессии защитного стресс-белка Ш>Р70^ что определено в экспериментальном исследовании на крысах БНЫ с установленными высокими скоростными значениями транспорта ионов в мембранах клеток в сравнении с крысами

4. Морфологические, клинические и визуализационные особенности, характерные для пациентов с высокой скоростью №+-1л+-противотранспорта в мембране эритроцита, дают возможность выделить обозначенную группу как фактор риска тяжелого течения ишемического инсульта.

ВЫВОДЫ

1. Определен наибольший объем очага ишемии, формирующийся в острейшем периоде инсульта, у пациентов I квартиля с низким уровнем трансмембранного ионотранспорта, ассоциирующийся с кардиоэмболическим подтипом ишемического инсульта, без дальнейшей динамики размеров к 21 суткам. Большая степень изменений в очаге по оценке ADC МРТ установлена у больных IV квартиля» с высокими значениями трансмембранного ионотранспорта, для которых также характерно достоверное увеличение размеров очага ишемии в динамике (р<0,05). У пациентов II и Ш квартилей не выявило достоверных МРТ особенностей динамики размеров очага (р>0,05).

2. В дебюте инсульта по клиническим характеристикам пациенты, относящиеся» ко всем диапазонам скорости? Na^Lif-противотранспорта в мембране эритроцита, были сопоставимы. При оценке течения острого периода инсульта^ установлено, что пациенты Г квартиля характеризовались более выраженной положительной динамикой восстановления, функциональной недостаточности (р<0,05), а пациенты IV квартиля имели.¡достоверно худшую динамику восстановления с меньшей степенью нивелирования неврологического дефицита и функционального восстановления. Пациенты, относящиеся ко II и III квартилям, имели положительную динамику течения заболевания, достоверно отличаясь по интенсивности изменений от пациентов двух крайних квартилей, занимая промежуточное положение.

3. У становлена, стабильность значения* скорости Na-Li"1 -противотранспорта в мембране эритроцита в остром периоде ишемического инсульта (р>0,05), а также выявлена генетическая гетерогенность рецепторов, участвующих в патобиохимических процессах ишемии в диапазонах скорости Na+-Li+-npoTHBoipaHcnopTa, что позволяет использовать результаты изучения особенностей течения ишемического инсульта в ассоциации со скоростью трансмембранного ионотранспорта для создания основ прогнозирования течения патологического процесса и отнести лиц с высокой скоростью Ка+-Ьі+-противотранспорта к группе риска неблагоприятного течения ишемического инсульта. На экспериментальной модели ишемии установлена большая выраженность ишемического повреждения у крыс линии БНЯ с отсутствием дифференциации структуры вещества головного мозга и одновременно меньшей экспрессией защитного белка Н8Р70 в пораженном полушарии в сравнении с крысами линии \\^аг (р<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение величины скорости Ка+-1л+-противотранспорта в мембране эритроцита у больных с ишемическим инсультом дает возможность прогнозировать выраженность повреждения головного мозга в зоне ишемии, тяжесть течения и исход заболевания, как в отношении степени неврологической недостаточности, так и функционального дефицита к концу острого периода инсульта.

2. Выявление группы пациентов с генетически заложенным неблагоприятным течением ишемического инсульта может быть использовано для дифференцированного подхода в лечении данного заболевания.