Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ОТВЕТА И ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ Т-ЛИМФОЦИТАМИ НОВОРОЖДЕННЫХ

Л-ЗЭЗЭЗ

На правах рукописи

Занченко Ирина Евгеньевна

Особенности регуляции пролиферативного ответа и продукции цитокинов Т-лимфоцитами новорожденных

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2004

Нижегородский ііаучію-іісследовательский институт эпидемиологии н микробиологии имени академика И.Н.Блохиной Минздрава России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук В.Ю. Талаев Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А, А. Михайлова

доктор медицинских наук, профессор И. Г. Козлов

Ведущая организация: Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, г. Москва

/ // Защита состоится «¿4 ». {¡ й/лК 2004 г. в Л_ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.017.01 в ГНЦ РФ - Институте

иммунологии Федерального управления медико-биологических и

экстремальных проблем при Минздрава России по адресу; 115478,

г. Москва, Каширское шс-сс*. лом 24, кор. 1.

С диссертацией мо»:н" с: - л - в библиотеке ГНЦ РФ Института иммунологии го управления медико-

биологических и экстремальна' : при Минздраве России.

Автореферат разослан « 3 . -у, 1004 г.

Ученый секретарь дне . ь -га

доктор медицинских наук Л.С. Сеславнн

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Общепринятой в современной медицинской науке является концепция, согласно которой одна из главных причин широкой распространенности инфекционных и гнойно-септических заболевании среди новорожденных и детей раннего возраста является «незрелость» иммунной системы младенцев. В то же время, конкретные механизмы, лежащие в основе низкой эффективности иммунной защиты плода и новорожденного началн изучаться лишь в последние годы. Знание механизмов, определяющих особенности функционирования иммунной системы матери, плода и новорожденного, необходимо для планирования адекватных медицинских мероприятий, направленных на профилактику и лечение инфекций плода и новорожденного, для оптимизации схем вакцинации детей раннего возраста.

Общеизвестно, что основную роль в реализации функций гуморального иммунитета у новорожденных и детей раннего возраста выполняют антитела матери, полученные плодом н новорожденным трансплацентарно и с материнским молоком. В то же время, важные защитные функции клеточного иммунитета у младенцев обеспечиваются собственной иммунной системой.

В связи с этим в данной работе представлялось важным изучить основные механизмы регуляции функциональной активности Т-лимфоцитов, важнейших компонентов иммунной системы, реализующих функции клеточного эвена иммуиитета.

Изучение функционального состояния Т-клеточного звена иммунной системы новорожденных детей в настоящее время, в условиях широкого распространения пониженной иммунной реактивности населения, приводящей к снижению резистентности к инфекциям и неэффективности вакцинации, является чрезвычайно актуальной и социально значимой проблемой.

! ¡46 МСХА ■ .. ■ ОЙ 3:^037^

¿-3333.1.

Цель работы

Изучить особенности регуляции функциональной активности Т-лимфоцитов новорожденных, выявить причины лежащие в основе снижения уровня пролиферации Т-лимфоцитов, оценить связь снижения пролиферативного ответа с клиническим состоянием новорожденных детей.

Задачи исследования

1. Оценить статистическую связь функциональных параметров Т-лимфоцитов с клиническим состоянием новорожденных детей.

2. Исследовать продукцию гуморальных факторов, подавляющих п рол нфе рати вный ответ Т-лимфоцитов на активацию.

3. Исследовать регуляцию пролиферации Т-лимфоцитов новорожденных цитокинами и гормонами.

4. Изучить продукцию цитокинов Т-лимфоцитами новорожденных и выявить особенности регуляции этого процесса.

Научная иовнзна

Была обнаружена статистическая связь неудовлетворительного клинического состояния новорожденных детей с двумя относительно независимыми дефектами функциональной активности Т-лимфоцитов: повышенным апоптозом и слабостью пролиферативного ответа. Как показали проведенные исследования, одной из причин слабого пролиферативного ответа является продукция в культурах клеток новорожденных гуморальных факторов, ограничивающих пролиферацию. В ходе исследований особенностей регуляции функциональной активности Т-лимфоцитов новорожденных детей было показано, что одной из причин подавления пролиферации является продукция интерлейкина (ИЛ)-10, способного ограничивать пролиферативныи ответ. Однако, наряду с антипролиферативной активностью ИЛ-10 обладает антиапоптотическим

действием в культурах мононуклеаров пуповинной крови новорожденных. Результат действия ИЛ-10 на пролиферацию Т-лпмфоцнтов новорожденных детей зависит от способности Т-клеток младенцев вступать в апоптоз.

Впервые обнаружена потребность.Т-лимфоцитов части новорожденных в специфическом наборе регуляторных факторов, необходимых для эффективного ответа на активацию. Показано, что глюкокортикоиды способны усиливать ростовое действие ИЛ-7 на активированные Т-лимфоциты новорожденных и, совместно с этим цптокпном, стимулировать созревание Т-хелперов первого и второго типа в культуре.

Практическая значимость

Новые знания о причинах нарушений функциональной активности Т-клеток и развития иммунопатологии у новорожденных позволяет определить группы риска, пути диагностики отклонений в реактивности лимфоцитов детей раннего возраста и методы'адекватной иммунокоррекции.

Особую значимость полученным результатам придает тот факт, что препараты глюкокортикондов к, в частности, использованный в данной работе дексаметазон, широко применяются в педиатрической практике. Полученные результаты существенно расширяют представления о механизмах действия глюкокортикоидов на иммунную систему новорожденных и могут стать основой для разработки комплексных препаратов с новыми фармакологическими свойствами.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 10 статей в научных журналах, 2 статьи - в сборниках.

Основные материалы работы были доложены па 4 конгрессе «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии» 29-31 мая 2001г. в г. Москве и на конференции

«Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии», посвященной памяти акад. РАМН И.Н. Блохиной 24-25 апреля 2001г. в г. Москве.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания актуальности работы и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, который содержит 30 отечественных и 194 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 27 рисунками и 5 таблицами.

Материалы и методы исследований

В работе было обследовано 115 новорожденных. Дети находились в различном клиническом состоянии. Масса тела новорожденных была в пределах от 980 г. до 4500 г. Срок их внутриутробного развития находился в интервале от 27 до 42 недель. Контрольную группу взрослых доноров составили 17 практически здоровых женщин в возрасте от 18 до 30 лет. Объектом исследования являлись мононуклеарные клетки пуповинной крови (МНПК) новорожденных детей и венозной крови взрослых здоровых доноров. МНПК выделяли из стерильной пробы пуповинной крови над слоем Histopaque-1077 (Sigma, USA), дважды отмывали и ресуспендировали в питательной среде DMEM (Sigma, USA) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Санкт-Петербург) L-глутамином и гентамицином. Для оценки пролиферации суспензию МНПК, а также активирующие моноклонзльные антитела (мкА), дексаметазон и/или интерлейкины вносили в 9б-луночные плоскодонные планшеты (Evergreen, USA). Контролем служили мнкрокультуры без добавления антител, интерлейкинов и дексаметазона. Общий объем клеточной суспензии составлял 200 мкл на лунку, конечная концентрация клеток - 5X10S клеток/мл. Каждый вариант микрокультуры

засевался в 3 повторах. Для активации Т-клеток использовали специфичные к молекуле CD3 мкА ИКО-90 (ВОНЦ, Москва) в концентрации 100 н 1000 нг/мл. В работе использовались рекомбинантные человеческие ИЛ-2 я ИЛ-4 (Sigma, USA) в концентрации 5 нг/мл и ИЛ-7 в концентрации 10 нг/мл (Sigma, USA). Натриевую соль фосфата дексаметазона (KRKA, Slovenia) в культуры добавляли до концентрации 0,4 мкг/мл. Все клеточные культуры культивировали при 37°С в атмосфере с 5% С02. Пролиферацию оценивали по включению меченного тритием метилтимидина («Изотоп», Санкт-Петербург), который добавляли в культуры по 0,5 мкКюрц через 48 ч. после начала культивирования на срок 24 ч, После культивирования планшеты замораживали, размораживали, хроматин клеток переносили на стекловолокнистые фильтры (Titertek, USA) и анализировали с помощью сцинтнлляционного ß-счетчика Becknian (USA). Результаты выражали в импульсах в мин, и в индексах стимуляции пролиферации (ИС - отношение среднего значения пролиферации в импульсах в мин, в опытных и контрольных культурах).

Апоптоз оценивали по гиполиплоидной фракции клеток с помощью проточной цитофлюориметрии фиксированных 70% этиловым спиртом и окрашенных иодидом пропидия клеток. Фиксацию и окрашивание клеток проводили через 48 часов после начала культивирования.

Популяционный состав МНПК до и после культивирования оценивали с помощью реакции двухцветной иммунофлюоресценцни с использованием антител серии ИКО (МедБиоСпектр, Москва). Анализ образцов проводили с помощью проточного цитофлюориметра FACSCalibur (Becton Dickinson, USA).

Для определения количества клеток, продуцирующих цитокины,

использовали метод оценки внутриклеточных цитокинов и две схемы

активации клеток. При использовании первой, краткосрочной схемы, МНПК

новорожденных и взрослых культивировали 4 часа в присутствии 1 мкг/мл

7

ингибитора внутриклеточного транспорта GolgiPlag (BD Biosciences Immunocytometry Systems, USA) без добавления активаторов или в присутствии 10 иг/мл форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА) (Serva, BRD) и I мкг/мл иономииииа (Sigma, USA). Для исследования процесса сохранения и/или созревания цито кии о продуценте в в культуре и влияния дексаметазона и ИЛ-7 на этот параметр использовали более длительную схему активации. В этом случае МНПК новорожденных и взрослых культивировали в течение 68 часов с мкА к CD3, а также с мкА к CD3 и ИЛ-7 в присутствии дексаметазона и без него. Затем клетки реактивировали в течение 4 часов с помощью ФМА и иономицина в присутствии ингибитора внутриклеточного транспорта. После культивирования клетки отмывали в среде DMEM и переносили в раствор эмбриональной телячьей сыворотки с 10% диметилсульфоксида, и замораживали в жидком азоте для длительного хранения. После раз мороз ки клетки отмывали в среде DMEM, фиксировали в течение 10 мин. при +4°С 4% параформальдегидом (Sigma, USA) и пермеабилизировали в течение 20 минут при комнатной температуре в 0,1% растворе сапонина (Sigma, USA). Затем клетки окрашивали моноклональными антителами к CD7, меченными флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) («Медбиоспектр», Москва), антителами к ИЛ-10, меченными аллофикоцианином (BD PharMingen, USA), и антителами к интерферону у (ИФНу), меченными фикоэритрином (BD Biosciences Immunocytometry Systems, USA). Анализ проб проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (BD Biosciences Immunocytometry Systems, USA).

Концентрацию фактора некроза опухоли а (ФНОа) в среде, собранной из исследуемых культур определяли с помощью иммуноферментной тест-системы «ИФА-ФНОа» («Цитокин», Санкт-Петербург).

Для статистической обработки данных использовали дисперсионный анализ, критерии Фишера и Стьюдента, а также корреляционный анализ.

Результаты исследований

5 ходе предварительных исследований нам» была обнаружена чрезвычайно высокая вариабельность ряда функциональных параметров Т-лимфоцитов новорожденных, определяемых in vitro. В первую очередь это относилось к различиям пролиферативного ответа Т-клеток на активацию и уровню ano птоза в культурах. Целью данной работы было изучить особенности регуляции активности Т-лимфоцитов у новорожденных, выявить причины лежащие в основе снижения уровня пролиферации Т-лимфоцнтов, оценить связь снижения пролиферативного ответа с клиническим состоянием новорожденных детей.

Обследованные нами дети в зависимости от доли клеток в апоптозе в культурах МНПК при активации мкА к CD3 в концентрации 1мкг/мл были разделены на две группы. Для разделения новорожденных на группы использовался критерий, соответствовавший среднему значен ню гиполиплоидной фракции Т-клеток взрослых здоровых доноров и здоровых доношенных новорожденных при активации их мкА к молекуле CD3, который соответствовал 20%.

В первой группе, состоящей из 36 детей, размер гиподиплондной фракции как в культурах без добавления активнруюшпх антител, так и при активации антителами к CD3 не превышал 20%. Вторую группу составили 48 детей с численностью гиподиплоидных клеток в культурах неактивированных и/или активированных МНПК более 20%.

При таком делении степень тяжести клинического состояния детей группы 1, у которых уровень зпоптоза в культурах был менее 20%, статистически достоверно коррелировала со снижением пролиферации в культурах (табл. 1).

В группе 2 степень тяжести клинического состояния, срок внутриутробного развития и масса тела новорожденного статистически

достоверно связаны с уровнем спонтанного апоптоза лимфоцитов, выявленным в исследуемых культурах (табл. I).

По нашему мнению эти два равнозначимых н независимых друг от друга иммунологических параметра, способны отдельно друг от друга маркировать плохое клиническое состояние новорожденных и, отражать не только общее состояние новорожденного, но и степень зрелости иммунной системы.

В связи с этим нами было принято решение изучить причины, лежащие в основе снижения пролиферативного ответа Т-лимфоцитов в культурах МНПК новорожденных с низким уровнем апоптоза.

Таблица 1, Корреляционная связь клинического состояния, массы тела и срока внутриутробного развития с иммунологическими параметрами у новорожденных детей групп 1 и 2.

Параметры Коэффициент корреляции (1 соответствующий ему уровень значимости а

Группа 1 Группа 2

Клиническое состояние и пролифератнвный ответ Т-клеток -0,41 <х<0,02 0,21

Клиническое состояние и доля клеток в апоптозе 0,01 -0,29 а<0,05

Срок внутриутробного развития и пролифератнвный ответ Т-клеток 0,31 0,15

Срок внутриутробного развития и доля клеток в апоптозе 0,16 -0,41 а<0,005

Масса тела и пролифератнвный ответ Т-клеток 0,15 -0,11

Масса тела и доля клеток в апоптозе 0,20 -0,36 а<0,01

На одном из предварительных этапах работы мы в активированную культуру одного здорового новорожденного с хорошим уровнем пролиферативного ответа мы вносили надосадочные жидкости собранные

10

нами из активированных и неактивированных культур МНПК новорожденных с высокими значениями пролиферативного ответа на активацию (группа А) и низкими значениями пролиферации (надосадки группы Б).

В ходе этого эксперимента мы выявили, что надосадки, собранные памп из активированных культур мононуклеаров новорожденных с низким уровнем ответа подавляют пролиферацию активированных лимфоцитов здорового ребенка достоверно сильнее надосадков, собранных из культур с нормальным уровнем пролиферативного ответа (рис. 1).

14000 л 12000 10000 I еооо

I

| еооо

4000 2000 о

★

-ь-

Бм активации

мкА к

соз

группа А

без активации

группа Л группа Б + мкЛ к без СБЗ активации

группа Б + мкА к СОЗ

Рис. 1. Подавление пролиферативного ответа-активированных МНПК здорового новорожденного при введении надосадков собранных из неактивированных и активированных культур группы А (с высоким пролнферативным ответом) и группы Б (с низким пролнферативным ответом). По оси ординат отражена пролиферация в нмп/мнн. Данные представлены как М±м. различия между группами А и Б достоверны при р<0,05

Такая супрессорная активность надосадков, собранных из культур с низким пролнферативным ответом, по нашему мнению, является следствием

наличия в этих надое ад ках гуморальных факторов, способных подавлять пролиферативный ответ. Одним из факторов, способных подавлять пролиферативный ответ Т-клеток является ИЛ-10. Учитывая данные о высокой сывороточной концентрации ИЛ-10 у недоношенных детей и детей с патологией развития нами было принято решение, изучить роль эндогенного ИЛ-10 в снижении пролиферации. Для этого мы использовали мкА, способные ингибировать активность эндогенного ИЛ-10.

Введение таких ингибирующих антител показало, что у части новорожденных блокирование эндогенного ИЛ-10 приводит к усилению пролиферативного ответа Т-лнмфоцитов на активацию в культуре (рис. 2).

9000-

8000-

7000-

6000-

I

5 5000

^ 2 4000-

X

3000-

2000-

1000-

Контроль мкА к СВЗ мкА к ИЛ-10 мкА к СШ +

мкА к ИЛ-10

Рис. 2. Усиление пролиферативного ответа активированных Т-лимфоцитов в культурах МНПК новорожденного ребенка при введении ингибирующих активность ИЛ-10 антител. Данные представлены как М±м.

Однако наряду с такой, антипролиферативной активностью ИЛ-10 мы выявили, что в части культур введение ингибирующих антител к ИЛ-10 приводит к ослаблению пролиферативного ответа за счет увеличения доли клеток в апоптозе в этих культурах (рис. 3).

3000

2500-

20СЮ-

i s

|1500 s

1000 500 0

Без акти вашій

мкА к CD3

мкА к CD3 + мкА к ИЛ-10

Рис, 3. Подавление пролиферативиого ответа под действием ингибнрующих активность ИЛ-10 антител в активированных культурах МНПК новорожденного ребенка. По оси ординат пролиферация в имп/мин. Данные представлены как М±м.

Показано, что результат действия эндогенного ИЛ-10 на пролиферацию Т-клеток зависит от способности Т-клеток новорожденных детей вступать в апоптоз. В культурах со слабым апоптозом продукция ИЛ-10 может являться фактором, ограничивающим пролифератнвный ответ Т-клеток новорожденных на активацию. Исследования влияния ИЛ-10 на апоптоз показали, что введение ингибирующих эндогенную активность ИЛ-10 антител приводило к достоверному увеличению количества вступивших в апоптоз клеток (рис. 4).

Полученные данные свидетельствуют о сложной роли ИЛ-10 в регуляции активности Т-лимфоцнтов. По нашему мнению в раннем неонатальнам периоде ИЛ-10 присуща специфическая и не исследованная до сих пор функция: по-видимому, этот цитокин у части недоношенных и

60' 50-АО-3020 10-

Без активации

ИЛ-7

мкА к СЭЗ

мкА к СОЗ + ИЛ-7

мкА к СОЗ + мкАкИЛ-10

мкА к СОЗ + мкА к ИЛ-10 + ИЛ-7

Рис, 4. Доля клеток в апоптозе в культурах новорожденных, с различной комбинацией реагентов. Комбинация реагентов указана под

рисунком. Данные представлены как М±м.

* .

различия уровня апоптоза в

культурах без антител к ИЛ-10 и с этими антителами достоверны при р<0,05.

ослабленных новорожденных блокирует не только вовлечение Т-клеток в иммунные реакции, но и апонтоз в тот период, когда существенная часть лимфоцитов обладает чрезвычайно высокой чувствительностью к апоптоэу. По нашему предположению, этот противовоспалительный цитокин с одной стороны сдерживает развитие иммунных реакций, а с другой, вероятнее всего, предотвращает потерн иммунной системой ребенка незрелых лимфоцитов, еще не готовых к полноценному иммунному ответу. Обобщая полученные данные можно утверждать что, ИЛ-10 в культурах МНПК новорожденных может проявлять себя и как антипролиферативный и как антиапоптогенный фактор.

Слабость пролиферативного ответа Т-клеток новорожденных в культуре может быть следствием специфических отличий потребностей этих клеток в регуляторных факторах. Создаваемые нами условия активации, оптимальные для запуска пролиферации Т-лнмфоцитов взрослых и здоровых

новорожденных могут быть неадекватнымн для Т-клеток детей с патологией и отставанием в развитии, В связи с этим нами исследовались особенности регуляции функциональной активности Т-клеток новорожденных в условиях культуры клеток. Известно, что одним, из мощных регуляторов иммунных реакций являются гормоны коры надпочечников. Мы исследовали влияние синтетического аналога глюкокортикондов - дексаметазона на уровень пролиферативного ответа. Параллельно с исследованием роли дексаметазона в ограничении пролиферативного ответа Т-лимфоцитоэ, мы изучали совместное действие дексаметазона я основных ростовых цитокинов: ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-7 на пролиферацию в культуре, В ходе проведенных экспериментов нами было установлено, что ИЛ-7 эффективнее ИЛ-2 и ИЛ-4 восстанавливает подавленную дексаметазоном пролиферацию (рис. 5). Более того, у части детей совместное введение дексаметазона и ИЛ-7 в активированные культуры МНПК приводило к изменению результата действия дексаметазона: дексаметазон в активированных культурах с ИЛ-7 у этих детей не подавлял, а усиливал пролиферацию (рис. 5).

Для более детального изучения выявленного «ростового» эффекта совместного действия дексаметазона и ИЛ-7, мы набрали группы доноров, состоящие из 43 детей к 17 взрослых.

Совместное введение дексаметазона и ИЛ-7 в активированные культуры мононуклеаров пуповин ной крови новорожденных вызывало значительное усиление пролиферативного ответа у 23 новорожденных, они были выделены нами в группу 1 - группа с ростовым эффектом дексаметазона (рис. 6). У 20 новорожденных усиление пролиферации под действием дексаметазона в присутствие ИЛ-7 не происходило, - они составили группу 2 (рис. 6).

Анализ клинических и антропометрических показателей у этих детей показал, что в группе с «ростовым эффектом» дексаметазона в присутствии

tie«l ДІІЇІ и ІТ|1«И> 03с н к г щ intlltHIMM

Рис. 5. Влияние дексаметазона на пролиферацию неактивнрованных МНПК, клеток, активированных 1 мкг/мл мкА к CD3, в присутствии 5 иг/мл ИЛ-, -4 или 10 нг/мл ИЛ-7. * - различия пролиферативного ответа в культурах с ИЛ-2 и без него достоверны при р<0,05. различия пролиферативного ответа в активированных и неактивнрованных культурах с ИЛ-7 и без него достоверны при р<0,0!.

Группа 1 Груп™ I

Рис. 6. Пролиферация МНПК новорожденных в культуре без стимуляторов (контроль) с мкА к СРЗ, с дексаметазоном и/или ИЛ-7. По оси ординат - ИС. Данные представлены как М±м. Знаком ~к - отмечено достоверное различие пролиферации в присутствии дексаметазона и без него.

ИЛ-7 клиническое состояние и срок внутриутробного развития статистически достоверно связаны со степенью проявления ростового эффекта дексаметазона. Причем, чем тяжелее клиническое состояние у ребенка, тем более выражено у него ростовое действие дексаметазона.

В культурах мононуклеаров периферической крови взрослых доноров ростовой эффект дексаметазона в присутствие ИЛ-7 не был выявлен ни в одной из исследуемых культур.

Рост пролиферации, выявленный нами при совместном действии дексаметазона и ИЛ-7 на активированные Т-лимфоциты, у части новорожденных детей может быть следствием нескольких принципиально различных процессов. Одним из таких процессов могла быть индуцированная дексаметазоном «ингибиция ингибиторов» пролиферации. В соответствии с этой гипотезой дексаметазон угнетает продукцию как ростовых цитокинов, так и факторов-ингибиторов, тогда как введение в культуру ИЛ-7 полностью компенсирует последствия ингибиции только ростовых цитокинов. При этом результат совместного действия дексаметазона и ИЛ-7 зависит от исходного уровня продукции факторов, ингибирующих пролиферацию. В культурах с гяперпродукцией этих факторов дексаметазон и ИЛ-7 вызывают усиление пролиферативного ответа Т-клеток, в культурах с низким уровнем продукции ингибиторов - дексаметазон существенно не изменяет уровень пролиферации в присутствии ИЛ-7.

В соответствии с другой, выдвинутой нами гипотезой дексаметазон в присутствии ИЛ-7 обладает прямым стимулирующим действием на функциональную активность Т-лимфоцитов. Механизм такого действия неизвестен.

Для выяснения причин, лежащих в основе парадоксального -стимулирующего действия дексаметазона совместно с ИЛ-7 на пролиферацию, мы исследовали продукцию цитокинов в культурах клеток

новорожденных и взрослых и влияние дексаметазона на ц и то кинопродукцию.

17

Исследование продукции ФНОа в культурах клеток новорожденных показало, что у детей в культурах МНПК которых, дексаметазон совместно с ИЛ-7 проявляет «ростовой» эффект, уровень продукции ФНОа не отличался от такового'у детей без эффекта дексаметазона.

Таким образом «ростовой» эффект дексаметазона совместно с ИЛ-7, выявленный нами у части новорожденных детей не является следствием гиперпродукции ФНОа в исследуемых нами культурах.

Далее нами исследовался уровень продукции ИЛ-10 и ИФНу в культурах мононуклеаров новорожденных и взрослых. Эти цитокины были выбраны нами прежде всего исходя из тех позиций, что данные цитокины являются на наш взгляд наиболее информативными маркерами основных субпопуляций Т-лимфоцитов-хелперов, исследование уровня продукции этих цитокинов демонстрирует не только продукцию данных цнтокинов Т-лимфоцитами вообще, но и возможный баланс между субпопуляциями Т-хелперов в культуре и воздействие на данные параметры дексаметазона. Кроме того, ИЛ-10 интересовал нас в связи с тем, что его избыточная продукция способна подавлять пролиферативный ответ активированных Т-лимфоцитов и функциональную активность Т-хелперов I типа. ИФНу можно рассматривать как некую контр-пару ИЛ-10, т.к. он может ограничивать активность Т-хелперов 2 типа.

Для исследования продукции ИЛ-10 и ИФНу мы использовали метод определения внутриклеточных цнтокинов с помощью проточной лазерной цнтометрии. С помощью этого метода мы исследовали процесс сохранения и/или созревания цитокннопродуцентов в культуре при различных условиях активации, а также влияние дексаметазона и ИЛ-7 на этот параметр. Для этого МНПК культивировали в течение 68 часов с мкА к СОЗ, также мкА к СЭЗ вместе с ИЛ-7. Клетки культивировали в присутствии дексаметазона и без него. Затем Т-клетки реактивировали в течение 4 часов с помощью ФМА и иономицнна в присутствии ингибитора внутриклеточного транспорта. В

18

отдельных случаях реактивация не проводилась, и последние 4 часа клетки культивировались только в присутствии ингибитора внутриклеточного транспорта. Эти эксперименты, показали, что реактивация необходима для проявления функциональных свойства всех созревших и выживших в культуре цитокинопродуцентов.

Данные, полученные нами показывают, что совместное введение дексаметазона с ИЛ-7 вызывает значительное увеличение числа Т-клеток продуцентов ИЛ-10 через 72 часа культивирования как в культурах новорожденных так и в культурах взрослых (рис. 7).

4540 -3530252015 -105 -0

Т-клетки новорожденных Т-клетки взрослых

□ мкА к СРЗ НмкА к СОЗ+Декс, ШмкА к СОЗ+ИЛ-7 ■ мкА к СОЗ+ИЛ-7+Декс.

Рис. 7. Количество клеток продуцентов ИЛ-10 {%) среди Т-лимфоцитов у новорожденных и взрослых в «долгой системе», в культурах с различной композицией реагентов. Данные представлены как М±м. * -достоверное увеличение числа доли Т-клеток ИЛ- 10-продуцентов в культурах с дексаметазоном и без него при р<0,05.

M К-А к CD3 мкА (С CD3+ ИЛ-7

£ в s s

V i

І.

о tt о s

Ь£ С

з: S

m4«1

4,1} H

Ів* I»' tV

»ЧЧН O*»

___IH*

îv 10* 11 "bl

мкА к CD3+ дексамстшоп

• Imk D» №)

IV* Ht

мкА к CD3+ ИЛ-7+ дексаметазои

<e" ÎT ïtr5 ic1 Te*

Ю*«*

«¿H ш

.A..

ia* M* S*ïo1ïo*

мкА к CD3 мкА к CD3+ ИЛ-7

Рис. 8. Результаты репрезентативного теста оценки числа Т-лимфоцитов продуцентов ИЛ-10 в культурах МНПК новорожденного и взрослого в стандартной «долгой системе» (объяснения в тексте). На рисунках представлены гистограммы, отражающие люминесценцию АРС среди CD7+ Т-лимфоцитов. Изотипический контроль - гистограмма с неокрашенным полем. Проба окрашенная анти-ИЛ-Ю-АРС антителами - гистограмма с серым полем.

Данный эффект наблюдался нами в культурах клеток детей, как с «ростовым» эффектом дексаметазона, так и без него. Это свидетельствует о том, что «ростовой» эффект дексаметазона не связан с подавлением продукции эндогенного ИЛ-10,

Исследование влияния дексаметазона и ИЛ-7 на число клеток-продуцентов ИФНу при длительном культивировании показало, что введение дексаметазона в культуру активированных МНПК новорожденных и взрослых без ИЛ-7 приводит к уменьшению доли Т-лимфоцитов продуцентов ИФНу, тогда как в присутствии ИЛ-7 дексаметаэон существенно увеличивает число Т-лимфоцитов продуцентов ИФНу в активированных культурах МНПК новорожденных детей. В культурах клеток взрослых такого стимулирующего эффекта дексаметазона не наблюдается (рис, 9).

45-1

□ мкАкСОЗ ЕЭмкА кСОЗ+Декс. ИмкА К СОЗ+ИЛ-7 ■ мкА К СОЗ+ИЛ-7+Декс.

Рис. 9. Количество клеток продуцентов ИФНу (%) среди Т-лимфоцитов у новорожденных и взрослых в «долгой системе», в культурах с различной композицией реагентов. Комбинация использованных реагентов указана под рисунком. Данные представлены как М±м. + -различия количества Т-клеток ИФНу-продуцентов в культурах с дексаметазоном и без него при р<0,05. - достоверное увеличение числа доли Т-клеток

ИФНу-продуцентов в культурах с дексаметазоном и без него при р<0,01.

мкА к СБЗ

мкА к С03+ ИЛ-7

в &

о

¡й С X 2

с

X

г

га

мкА к СЙЗ+ дексамстязоп

•а*

1 -I

ч< и

А «Ж-

мкА к СВЗ

Ч»

■ф 'пі

10 10'

мкА к С03+ дсксяметяиш

и* РЧ»

- И* »■"

В1

Ж-"'

А1 К I1«1 Л1 1 о* щ-т

мкА к С03+ ИЛ-7+ дексаметязон

кг і>* їм

\4-г те м-

і»* «г I « П.І-ИЦ

мкА к С03+ ИЛ-7

мкА к С03+ ИЛ-7+ дексаметнов

М» Р* 17?

Рис. 10. Результаты репрезентативного теста оценки числа Т-лимфоцитов продуцентов ИФНу в культурах МНГТК одного новорожденного и взрослого в «долгой системе». Пробы окрашены антителами к С07, меченными ФИТЦ, (но шкале БЫ-Н) и антителами к ИФНу, меченными фикоэритрином (по шкале БЬЯ-Н). В гейт К2 выделены С07+ Т-лимфоциты.

Суммируя изложенное выше можно утверждать, что «ростовой эффект» дексаметазона не является следствием ннгибицин продукции таких цитокинов, как ИЛ-10, ФНОа и ИФНу. Действие дексаметазона и ИЛ-7 стимулирует процесс созревания Т-хелперов как первого, так и второго типов в культуре МНПК новорожденных.

По нашему мнению, стимулирующий эффект дексаметазона, выявленный нами в культурах клеток новорожденных, может являться следствием прямого действия дексаметазона и ИЛ-7 на Т-клетки. Тем не менее, полученные нами данные не позволяют отказаться от выдвинутой нами гипотезы «ингибиции ингибиторов». Возможно, стимулирующее действие является следствием индуцированного дексаметазоном подавления продукции в культуре факторов с супрессорной активностью, которые в данной работе не определялись. Такими факторами могут являться трансформирующий фактор роста р, простагландин Ег или иные неизвестные агенты.

Выводы

1. Неудовлетворительное клиническое состояние новорожденных детей статистически связано с двумя относительно независимыми дефектами функциональной активности лимфоцитов: повышенным апоптозом клеток и слабостью пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на активацию.

2. Одной из причин слабого пролиферативного ответа является продукция в культурах МНПК новорожденных гуморальных факторов ограничивающих пролиферацию, в частности ИЛ-10.

3. ИЛ-10 в культурах МНПК новорожденных обладает не только антипролиферативной активностью, но и антиапоптогенным действием. Результат воздействия ИЛ-10 в культуре зависит от способности Т-клеток вступать в апоптоз: иигибиция эндогенного ИЛ-10 стимулирует

пролиферацию в культурах с низким уровнем ano птоза, но подавляет пролиферативный ответ в культурах с высоким уровнем апоптоза.

4. ИЛ-7 является оптимальным фактором роста для Т-лимфоцитов новорожденных. Дексаметазон усиливает ростовое действие ИЛ-7 на активированные Т-лимфоциты части новорожденных.

5, Дексаметазон совместно с ИЛ-7 стимулирует созревание Т-хелперов первого и второго типа в культуре МНПК новорожденных. Ростовое действие дексаметазона и ИЛ-7 не связано с подавлением продукции цитокинов, ингибирующих пролиферацию Т-клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Талаев В.Ю., Романова Т.Е., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е. (Заиченко И.Е.) Функциональное состояние Т-лимфоцитов периферической крови у больных хроническим бронхитом ликвидаторов аварии на ЧАЭС. Иммунология, 1999, №2, с. 39-40.

2.Талаев В.Ю., Заботина Т.Е., Талаева Е.Б., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е. (Заиченко И.Е.) Влияние костимуляции антителами к CD2S и интерлейкинами -2 и -4 на мононуклеарные клетки крови новорожденных детей, активированные антителами к CD3. Иммунология, 1999, №3, с. 29-31,

3.Талаев В. 10., Талаева Е.Б., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е. (Заиченко И.Е.), Заботина Т.Е., Тагиров О.Т. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов части новорожденных к активационному апоптозу. Связь с заболеваниями матери и ребенка. Нижегородский медицинский журнал, 1999, №2, с. 13-18.

4.Талаев В.Ю. Романова Т.Е., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е. (Заиченко И.Е.) Дефекты реактивности Т-лимфоцитов больных хроническим бронхитом, подвергавшихся и не подвергавшихся действию ионизирующего излучения. Нижегородский медицинский журнал, 1999, №3, с. 18-21

24

5.Талаев В.Ю., Талаева Е.Б., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е. (Запченко И.Е,), Заботила Т.Е., Таги ров О.Т. Отклонения в ходе беременности и клиническое состояние новорожденных с повышенной чувствительностью Т-лимфоцитов к индуцированному активацией апоптозу. Иммунология, 1999, №6, с. 46-49.

6. Лебедева И.Е., Рубцова И.Е. (Заиченко И.Е.), Ни ко нова М.Ф., Грачева Е.А., Бабайкина О.Н., Талаев B.IO. Роль интерлейкинов-2, -4, -7 в формировании повышенной чувствительности к апоптозу Т-лимфоцитов пу повинной крови новорожденных. Сборник трудов биологического факультета Нижегородского государственного университета им. Лобачевского «Молекулярная биология, иммунология и эпидемиология», г. Н. Новгород, 2001, с. 132-137.

7. Рубцова И.Е., Лебедева И.Е., Грачева Е.А., Бабайкина О.Н., Ни ко нова М.Ф., Талаев В.Ю. Подавление пролиферации и повышенный апоптоз Т-лимфоцитов крови новорожденных — два независимых параметра, маркирующих тяжелое клиническое состояние в раннем неонатальном периоде. Сборник трудов «Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии», посвященный памяти акад. РАМН И.Н. Блох иной, г.Москва, 2001,том 1, с. 103.

8. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е. (Заиченко И.Е.), Никонова М.Ф., Грачева Е.А., Бабайкина О.Н., Талаева Е.Б., Лукьянова Н.В. Пролиферация и апоптоз Т-лимфоцитов пуповинной крови: связь с клиническим состоянием новорожденных, влияние интерлейкинов-2, -4, -7 и дексаметаэона на эти параметры. Иммунология, 2001, №3, с, 29-35.

9.Talayev V.Yu., Lebedeva I.E., Rubtzova I.E., Nikonova M.F., Talayeva Ye.B., Gracheva E.A., Babaykina O.N., Proymina O.K. The Cord Blood T-cell Proliferation and Apoptosis: Their Connection to Newborn Children Health; Influence of InterIeukin-2, -4, -7 and Dexamethazone Exerted upon the Dala.

Russian Journal of Immunology, 2001 ,-v.6, №1, p. 29-38.

25

10. Рубцова И.Е. (Заиченко И.Е.), Бабайкина О.Н., Лебедева И.Е., Грачева Е.А., Талаев В.Ю. Эндогенный интерлейкин-10 - фактор, подавляющий пролиферативный ответ Т-лимфоцитов части недоношенных новорожденных. Иммунология, 2002, №4, с. 224-227.

П. Talayev V.Yu., Babaykina O.N., Lebedeva I.E., Rubtzova I.E. (Zaichenko I. E.), Talayeva Ye.B., Nikonova M.F., Gracheva E.A, Effect of cytotrophoblast cells on T lymphocyte surface antigen expression in cultures of peripheral blood mononuclear cells from pregnant woman and umbilical cord blood mononuclear cells from newborns. Russian Journal of Immunology, 2003, v. 8, №1; p. 24-30.

12. Рубцова И.Е. (Заиченко И.Е), Лебедева И.Е., Грачева Е.А., Бабайкина О.Н., Талаев В.Ю. Действие монохлональных антител к интерлейкину-10 на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов зависит от уровня апоптоза в культурах мононуклеарных клеток пуп о винной крови новорожденных. Иммунология, 2004, №1, с.400-404.

Служба мно*ttteiii,m>ft техники ГУ РОНЦнм. И.Н. Блохпнэ РАМН

Подписано к печати 03 .02.04Г ТпРаж 100 эт.