Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Индуцированный активацией апоптоз Т-лимфоцитов новорожденных. Связь с заболеваниями матери и ребенка

На правах рукописи

ТАЛАЕВ Владимир Юрьевич

ИНДУЦИРОВАННЫЙ АКТИВАЦИЕЙ АПОПТОЗ Т-ЛИМФОЦИТОВ НОВОРОЖДЕННЫХ. СВЯЗЬ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ МАТЕРИ И РЕБЕНКА

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1999

Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Минздрава России.

Научные консультанты: академик РАМН, доктор медицинских

Ведущая организация : Научный центр акушерства, гинекологии и

перинатологии РАМН

Защита состоится 24. ноября 1999 года в 14 часов на заседании диссертационного Совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава России по адресу : 115478, г. Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп. 2.

С диссертацией мсисно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава России.

Автореферат разослан " " октября 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного

Совета, д.м.н. Л.С. Сеславина

наук, проф. И.Н.Блохнна доктор медицинских наук, профессор А. А.Ярилнн

Официальна оппонента

д.м.н., профессор Б.В. Пинегин д.м.н., профессор А.Н. Чередеев д.м.н., профессор Б.Б. Першин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Апоптоз или программированная гибель клеток играет важную роль в формировании и функционировании иммунной системы (Ярилин A.A., 1998). Именно апоптоз является эффекторным механизмом процесса тимической селекции репертуара Т-клеток, участвует в регуляции длительности и масштаба иммунного ответа , в процессе поддержания аутотолерантности зрелых лимфоцитов (von Boehmer Н., 1994; Robey Е., 1994; Russell J.H., 1995; Wong1 В., et all., 1997). Кроме того, с индукцией апоптоза связана эффекторная функция цитотоксических лимфоцитов и функционирование барьеров "иммунологически-привилегированных" вон организма (Carter L.L., et all., 1995). Нарушения столь важного регуляторного процесса могут приводить к развитию тяжелых патологических состояний. Так, ослабление апоптоза Т-лимфоцитов лежит в основе ряда аутоиммунных заболеваний (Salman М., et all., 1995; Suzuki N.. et all., 1996, Tokano Y., et all., 1996). Усиление апоптоза кроветворных клеток приводит к развитию различных форм анемий, тромбоци-топении, нейтропении или панцитопении (Lepelley Р., et all., 1996). Усиление апоптоза лимфоцитов наблюдается при ряде инфекционных процессов (Fleischer В., 1994; Gougeon M.-L., et all., 1996; Sieg S., et all., 1997). Однако несмотря на определенный прогресс, состояния, связанные с усилением апоптоза лимфоцитов, до сих пор исследованы лишь фрагментарно.

Данная работа посвящена изучению особенностэй ответа на активацию Т-лимфоцитов новорожденных, находящихся в различном клиническом состоянии, и определению чувствительности Т-клеток новорожденных к индуцированному активацией апопто-зу. Предполагается, что ослабление чувствительности Т-лимфо-цитов новорожденных к активационному апоптозу чревато развитием аллергических и аутоиммунных заболеваний, тогда как повышенная чувствительность может привести к снижению резистентности к инфекционным агентам и, в случае инфицирования, к развитию толерантности и длительной персистенции инфекции в организме ребенка. Значимость процессов апоптоза и пролиферации Т-клеток в функционировании иммунной системы, не-

достаточная изученность особенностей этих процессов у новорожденных детей определяет актуальность этих исследований.

Цель исследований.

Изучить характер ответа Т-лимофцитов новорожденных на активацию и чувствительность их к активационному апоптозу. Исследовать связь изменения чувствительности Т-клеток к апоптозу с клиническим состоянием новорожденных.

Задачи исследования:

1. Исследовать пролиферативный ответ активированных Т-лимфоцитов новорожденных, находящихся в различном клиническом состоянии.

2. Исследовать чувствительность Т-клеток новорожденных к индуцированному активацией апоптозу.

3. Изучить связь характера ответа Т-лимфоцитов на активацию с клиническими отклонениями в ходе беременности.

4. Изучить связь характера ответа Т-лимфоцитов на активацию с клиническим состоянием новорожденных.

5. Изучить механизмы, лежащие в основе изменения чувствительности Т-клеток новорожденных,к индуцированному активацией апоптозу.

6. Сравнить функциональные особенности Т-лимфоцитов у-новорожденных и у взрослых с повышенным риском развития иммунопатологии (больные хроническими респираторными заболеваниями, ликвидаторы последствий катастрофы на ЧАЭС).

Научная новизна.

В работе впервые показана повышенная чувствительность Т-клеток новорожденных к индуцированному активацией апоптозу и связь повышенной чувствительности с неудовлетворительным клиническим состоянием новорожденных. Показано, что мононук-леарные клетки пуповинной крови части новорожденных отвечают на активацию входящих в их состав Т-лимфоцитов через молекулу СБЗ не усилением пролиферации, как это наблюдается у всех взрослых здоровых доноров и большей части новорожденных, а падением пролиферации ниже контрольных значений неактивированных культур. Подавление пролиферации связано с массовой

гибелью активированных клеток по механизму апоптоза.

Показана связь характера ответа Т-клеток на активацию через молекулу CD3 со следующими клиническими отклонениями в ходе беременности: анемии II и III степени, гестозы, пиелонефриты и ОРВИ в последнем триместре беременности.

Показана связь повышенной чувствительности Т-лимфоцитов к активационному апоптозу с неудовлетворительным клиническим состоянием новорожденных, обусловленным недоношенностью и отклонениями внутриутробного развития, способными привести к задержке развития плода. Дети с повышенной чувствительностью Т-клеток к индуцированному активацией апоптозу имеют меньшую массу тела, меньший гестационный возраст и большую потерю массы тела в раннем неонатальном периоде.

Показано, что повышенная чувствительность к активационному апоптозу - связана не с избытком стимулирующих алоптоз сигналов в культуре, а с недостатком факторов, защищающих активированные клетки от апоптоза. При исследовании действия известных факторов, предотвращающих апоптоз активированных Т-клеток, оказалось, что костимуляция через молекулу CD28 не защищает от гибели активированные через молекулу CD3 Т-лимфоциты новорожденных с повышенной чувствительностью к апоптозу, тогда как ЙЛ-2 и, особенно, ИЛ-4 защищают от гибели активированные клетки новорожденных при активации через молекулу CD3 и усиливают пролиферацию активированных МНПК новорожденных с низким уровнем ответа на активацию.

Выявленные нами отклонения в реактивности Т-лимфоцитов новорожденных по своему спектру отличаются от нарушений функции Т-клеток у взрослых больных хроническими бронхитами и ликвидаторов последствий катастрофы на ЧАЭС. При хронических заболеваниях дыхательной системы, особенно у лиц, подвергавшихся действию ионизирующего излучения, обнаруживается избирательное поражение ответа Т-клеток на активацию по альтернативному пути, тогда как дефект реактивности Т-клеток новорожденных заключается в повышенной чувствительности их к апоптозу при активации по классическому пути.

Практическая значимость.

В связи с тем, что в ходе работы была установлена связь характера ответа Т-клеток пуповинной крови на активацию с

клиническим состоянием ребенка, разработан метод, позволяющий по характеру ответа Т-клеток пуповинной крови на активацию прогнозировать клиническое состояние новорожденных в первые недели жизни.

Повышенная чувствительность Т-клеток к активационному апоптозу может привести к снижению реактивности организма и к развитию' толерантности к чужеродным антигенам при инфицировании или Еакцинации детей. Всвязи с этим представляется' целесообразным учитывать чувствительность лимфоцитов новорожденных к активационному апоптозу при вакцинации новорожденных и выборе тактики лечения возникающих у детей инфекционных и гнойно-септических заболеваний. Для профилактики описанного отклонения реактивности Т-клеток новорожденных требуется проведение своевременного лечения таких патологий беременности, как анемии беременных, сочетанные ОПТ- и ОГ-гестозы, хронические и ге'стационные пиелонефриты, а также проведение профилактики вирусных заболеваний у беременных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Т-лимфоциты части новорожденных обладают повышенной чувствительностью к апоптозу, индуцированному активацией через молекулу СБЗ.

2. Повышенная чувствительность Т-клеток к активационному апоптозу связана с клиническими отклонениями в ходе беременности, неудовлетворительным клиническим состоянием новорожденных, обусловленным недоношенностью, гипотрофией и отклонениями внутриутробного развития, способными привести к задержке развития плода и к преждевременным родам.

3. Повышенная чувствительность к активационному апоптозу связана не с избытком стимулирующих апоптоз сигналов в культуре, а с недостатком факторов, защищающих активированные клетки от апоптоза. Такими факторами могут являться ин-терлейкин-2 и интерлейкин-4, защищающие от гибели клетки детей с повышенной чувствительностью Т-лимфоцитов к активационному апоптозу.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 20 печатных научных работ, в том числе 1 методические рекомендации, принято к печати 5 печатных работ.

Основные материалы работы были доложены на: седьмой (ЬХХ) сессии общего собрания Российской академии медицинских наук, 14 - 16 апреля 1998 г., Москва; II Съезде иммунологов России, 5-9 сентября 1999 г., г. Сочи, I Российском форуме "Мать и дитя", 21 - 23 сентября 1999 г., г. Москва и на 6 научных конференциях.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 254 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела "Материалы и методы", раздела "Результаты исследования", главы "Обсуждения результатов", выводов и списка цитируемой литературы, который содержит 27 отечественных л 323 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 45 рисунками и 10 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследований.

Изучались функциональные свойства лимфоцитов периферической крови 160 новорожденных, находящихся в различном клиническом состоянии, а также 50 недоношенных детей в возрасте от 20 до 45 дней и 40 взрослых здоровых доноров. Кроме того, для сравнения нарушений процесса активации Т-лимфоцитов, обнаруженных нами у части новорожденных, было исследовано состояние путей активации Т-лимфоцитов в группах■с заведомо сниженной резистентностью - у 30 больных хроническим бронхитом ликвидаторов аварии на Чернобыльской атомной электростанции и 30 больных хроническим бронхитом, не подвергавшихся действию ионизирующего облучения.

В работе были использованы очищенные до гомогенности мо-ноклональные антитела (МКА) ИКО-90, связывающие молекулу СБЗ Т-лимфоцитов человека (Барышников А.Ю., 1990), а также неочищенный асцит гибридомы ИК0-90. Антитела для работы были любезно предоставлены д.б.н., зав. лабораторией моноклональ-

ных антител Нижегородского НИИЭМ В. В. Новиковым. В работе также были использованы МКА к молекуле CD28 человека (Sigma, USA.) и рекомбинантные человеческие интерлейкины (ИЛ): ИЛ-2 (Sigma, USA) и ИЛ-4 (Sigma, USA).

Объектом исследования служили мононуклеарные клетки (МНПК) пуповинной крови новорожденных и венозной крови обследуемых детей и взрослых. С помощью МКА ИК0-90 активировали входящие в состав МНПК Г-лимфоциты и оценивали индуцированную активацией пролиферацию и апоптоз этих клеток.

Для оценки пролиферации, МНПК засевали в лунки 96-лу-ночных планшетов для культур клеток (Evergreen scientific, USA) в питательной среде ДМЕМ (Sigma, USA) с 10 % инактиви-рованной фетальной телячьей сыворотки, L-глютамином и гента-мицином. К микрокультурам добавляли МКА ИК0-90 в концентрациях от 1 нг/мл до 2 мкг/мл и культивировали 72 часа при + 37° С в атмосфере с 5 % СОг- В качестве костимуляторов использовались МКА к CD28, ИЛ-2 и ИЛ-4. Пролиферацию оценивали по включению /метил-3Н/Тимвдина, добавляемого в лунки на последние 24 часа культивирования. Радиоактивность проб хроматина МНПК определяли с помощью ß -счетчика (Bekman, USA). Результаты выразкали в импульсах в минуту и в индексах стимуляции (ИС - отношение числа имп./мин. в опытных и контрольных, неактивированных микрокультурах), или в индексах подавления пролиферации (ИП=1/ИС). Определялась динамика жизнеспособности и клеточности активированных микрокультур.

Для исследования индуцированного активацией апоптоза использовали определение межнуклеосомной фрагментации ДНК клеток с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле, определение доли гиподиплоидных клеток с помощью проточной цитоф-люориметрии окрашенных проаидиумиодидом клеток, проводились морфологические исследования микрокультур.

Активацию МНПК по альтернативному пути индуцировали комбинацией аутологичных эритроцитов и форбол-12-мирис-гат-13-ацетата (ША) по методу Никоновой М.Ф., Литвиной М.М. и Ярилина A.A. Для постановки реакции бласттрансформации Т-лимфоцитов (РБТЛ) использовали митоген конканавалин А (КонА).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. ХАРАКТЕР ОТВЕТА ЛИМФОЦИТОВ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ НА АКТИВАЦИЮ АНТИТЕЛАМИ К МОЛЕКУЛЕ CD3.

Для исследования .характера ответа МНПК взрослых доноров на МКА к CD3 была определена дозовая зависимость пролифера-тивного ответа у 28 здоровых доноров. Т-клетки крови взрослых здоровых доноров в 72-часовом тесте отвечали пролиферацией на МКА ИК0-90 в широком диапазоне использованных концентраций. Асцитическая жидкость гибридомы ИК0-90 при разведениях в 813 200 - в 200 раз, вызывала мощную пролиферацию клеток, причем уровень включения метки в пределах этого "плато" изменялся незначительно. МКА при разведении в 3 276 800 раз вызывали включение радиоактивной метки, близкое к полумаксимальному. Такая картина дозовой зависимости была характерна для 71,4 % обследованных доноров. У 28,6 % высокая концентрация МКА ИКО-90 (разведение в 200 раз) слабее стимулировала включение метки, и плато максимальных значений пролиферации было ограничено не только малыми, но и большими концентрациями антител.

Пролиферативный ответ МНПК новорожденных на МКА ИК0-90 ' отличался значительной вариабельностью, причем у части детей было обнаружено подавление пролиферации клеток в присутствии высоких концентраций антител к молекуле CD3. По характеру ответа МНПК новорожденных на высокие концентрации антител мы выделили три типа ответа:

1. У детей с первым типом ответа Т-клетки усиливали пролиферацию в присутствии высоких концентраций МКА к CD3 по сравнению с неактивированными клетками.

2. Второй тип ответа характеризовался подавлением пролиферации антителами ИКО-90 при разведении в 200 раз и усилением пролиферации МНПК антителами в меньших концентрациях. Индекс подавления пролиферации был не более 2,15.

3. При третьем типе ответа разведения асцитической жидкости гибридомы ИК0-90 в 200, 400, 800 и, в отдельных случаях, в 1 600 раз снижали пролиферацию МНПК в 2 и более раз по сравнению с неактивированным контролем.

В соответствии с перечисленными типами ответа на активацию обследованные нами новорожденные были разделены на 3 группы. Было проанализировано 35 дозовых зависимостей ответа Т-клеток детей первой группы, 22 - второй и 12 - третьей группы.

У 51,4 %> детей с первым типом ответа дозовая зависимость пролиферации активированных МНПК принципиально не отличалась от типичной дозовой зависимости ответа МНПК взрослого донора. У остальных 48,6 % детей с ответом первого типа дозовая зависимость пролиферации МНПК имела очень узкий участок дозовой зависимости с высокими значениями пролиферации, ограниченный как высокими, так и низкими концентрациями МКА. Максимальный ИС у детей этой группы составлял от 8,4 до 42,9. Оптимальные митсгенные концентрации МКА ИК0-90 для большинства детей соответствовали разведениям асцита в 3 200 и б 400 раз.

Ответ МНПК детей второй группы на антитела обладая следующими признаками :

* Подавление пролиферации антителами ИК0-90 при разведении в 200 раз по сравнению со значениями пролиферации неактивированных МНПК. Индекс подавления пролиферации был не более 2,15.

* Узкое "плато" высоких значений пролиферации.

л Максимальный уровень пролиферации, индуцированной МКА ИК0-90 существенно ниже, чем у детей первой группы. У 68,2 % детей второй группы максимальный ИС был меньше 2. У 9,1 % -максимальный ИС был меньше 3. Лишь у 22,7 £ детей был обнаружен высокий уровень пролиферации (ИС от 6,17 до 97,12).

Характерными признаками третьего типа ответа являются:

* Глубокое подавление пролиферации высокими концентрациями МКА ИК0-90 по сравнению с контрольными значениями пролиферации неактивированных МНПК. ИП пролиферации при разведении МКА ИКО-90 в 200 раз от 1,96 до 23,47.

* Подавление пролиферации при разведении МКА ИК0-90 в 200, 400 и 800 раз.

* Слабая пролиферация, индуцированная оптимальными ми-тогенными концентрациями МКА ИК0-90. У 75 X новорожденных максимальный ИС был меньше 2, у остальных - меньше 3,17.

Средние значения пролиферации неактивированных МНПК новорожденных и взрослых доноров и МНПК, активированных МКА ИК0-90 в высоких ( разведение в 200 раз ) и оптимальных ми-тогенных концентрациях ( разведение в 3 200 раз ) представлены на рис. 1. Средние значения спонтанной пролиферации МНПК у трех групп новорожденных статистически не различались. Спонтанная пролиферация неактивированных МНПК взрослых здоровых доноров была в 2,5 - 3,4 раза ниже, чем у новорожденных. Соотношение уровня ответа на высокие и оптимальные концентрации МКА ИК0-90 у взрослых и новорожденных первой группы принципиально не отличалось. Абсолютные значения включения /метил-3Н/Тимидина в присутствии высоких и оптимальных митогенных концентраций антител у новорожденных первой группы были в 1,7 и в 1,5 раз выше соответствующих значений у взрослых доноров. Во второй группе новорожденных высокие концентрации МКА ИК0-90 вызывали подавление пролиферации МНПК в 1,6 раз по сравнению с контролем. Оптимальные ми-тогенные концентрации антител увеличивали включение радиоактивной метки в 3,1 раза по сравнению с неактивированным контролем. МНПК детей третьей группы снижали свою пролиферацию в присутствии как высоких, так и оптимальных митогенных концентраций антител ИК0-90.

Моноклональные антитела ИК0-90 являются антителами класса и обладают способностью индуцировать комплемент-зависимый цитолиз клеток-мишеней. Перед нами встал вопрос : не является ли эффект подавления пролиферации МНПК части новорожденных высокими концентрациями асцита ИК0-90 следствием комплемент-зависимого циготоксического действия этих антител. Инактивированная нагреванием сыворотка эмбрионов коров, которую мы использовали для приготовления полной питательной среды, не может являться источником функционально активных белков комплемента. Сохранение активности комплемента в ас-цитической жидкости гибридомы и способность комплемента работать при разведении асцита в 200 и более раз вызывает сомнения. Однако полностью исключить возможность поставки в культуру белков комплемента вместе с асцитом гибридомы нельзя. Поэтому было решено воспроизвести эффекты активации МНПК новорожденных с помощью очищенных до гомогенности МКА

■w

I

* ñ

-i-

/ г А

1 г ) Б

< г * а

i г ) г

Рис. 1. Средние значения пролиферации в группе взрослых доноров (А, N=32), в первой (Б, N=68), второй (В, N=42) и третьей (Г, N=18) группах новорожденных (объяснение в тексте). 1 - включение метки в контроле, 2 - при культивировании клеток с МКА ИКО-90 (5 7№), 3 - при культивировании с мкА ИКО-90 (0,5 7оо). * - различия между группами достоверны при р<0,01. По оси ординат - включение радиоактивной метки (тыс. имп./мин.).

)

ИК0-90.

Дозовые зависимости ответа на очищенные МКА принципиально не отличались от описанных выше зависимостей ответа МНПК на асцит гибридомы ИК0-90. Для пролиферативного ответа первого типа характерно "плато" высоких значений включения /метил-3Н/Тимидина при концентрациях МКА выше 5 нг/мл. Максимальное значение пролиферации соответствовало концентрациям МКА 100, 50 и 10 нг/мл. Действие больших концентраций МКА (500 и 1000 нг/мл) не вызывало существенного снижения пролиферации по сравнению с уровнем "плато". Для второго типа ответа было характерно подавление пролиферации МНПК МКА ИК0-90 в концентрации 1000 нг/мл и слабая стимуляция пролиферации антителами в оптимальной митогенной концентрации 100 нг/мл.

Уровень жизнеспособности клеток, активированных высокими концентрациями МКА ИКО-ЭО, через 72 часа после начала культивирования в группах 1 и 2 менялся у различных пациентов в широких пределах от 37 до 74 Установить четкую связь жизнеспособности клеток к концу стандартного срока культивирования с характером пролиферативного ответа не удалось.

В то же время динамика изменения жизнеспособности лимфоцитов детей группы 3 имела характерные отличительные черты (рис. 2.). У всех новорожденных этой группы, начиная с 44 часов культивирования, наблюдалось драматическое снижение жизнеспособности клеток, активированных высокими дозами МКА ИК0-90. Кроме того, у новорожденных третьей группы, в отличие от детей первой и второй группы, обнаружено резкое снижение количества лимфоцитов в 72-часовой культуре в присутствии высоких концентраций МКА ИК0-90.

В микрокультурах активированных МНПК детей третьей группы клоны малочисленны. Большинство входящих в их состав клеток несут характерные для апоптоза признаки деградации : уменьшение размера, фрагментация ядра. Отдельно лежащие клетки также несут признаки апоптоза - малые размеры, потеря складчатости и уплотнение мембраны, фрагментация ядра. При исследовании состояния ДНК клеток детей третьей группы было показано, что гибель лимфоцитов и подавление пролиферации МНПК высокими концентрациями МКА к молекуле СВЗ сопровождается ' характерной для апоптоза межнуклеосомной деградацией

Рис.2. Динамика табели МНПК новорожденного ребенка из третьей группы (ИП пролиферации= 13,2) в ответ на МКА ЙКО-90. Результат репрезентативного эксперимента (количество экспериментов - 5). По оси ординат - доля живых клеток (%), по оси абсцисс - время культивирования (ч.). 1. жизнеспособность неаетивированных МНПК. 2. жизнеспособность МНПК активированных МКА ИКО-90 (асцит гибрид омы, разведение в 320 раз).

ДНК.

По данным цитофлюориметрического исследования доли ги-подиплоидных клеток, у взрослых здоровых доноров доля вступивших в апоптоз клеток при активации МКА ИК0-90 практически не изменялась (рис.3). Средние значения доли гиподиплоидных клеток в группе взрослых доноров составляли для неактивированных клеток - 20,84 + 3,35 %., для клеток, активированных МКА ИК0-90 в концентрации 10 нг/мл, - 19,44 + 3,22 % и для клеток, активированных высокой дозой МКА ИК0-90 ( 1 мкг/мл ) - 21,78 + 3,76 %.

Новорожденные первой группы имели существенно большую, чем взрослые, долю гиподиплоидных клеток во всех вариантах культур (рис.3). Спонтанно в апоптоз в культуре вступали 25,66 + 2,86 % неприлипающих МНПК. Активация МКА ИК0-90 в использованных нами концентрациях вызывала рост доли гипоп-лоидных клеток в 1,4 раза: при концентрации МКА ИК0-90 10 нг/мл доля клеток в апоптозе составляла 36,03 + 3,52 при концентрации МКА 1 мкг/мл - 35,04 + 2,15

Более трети неприлипающих МНПК новорожденных с подавлением пролиферации МКА ИК0-90 к 48 часам в культуре спонтанно вступали в апоптоз. Доля гиподиплоидных клеток в контрольных культурах этой группы составляла 38,68 + 4,95 %. При концентрации МКА ИК0-90 10 нг/мл доля клеток в апоптозе увеличивалась до 50,78 ± 6,03 При культивировании клеток с высокими концентрациями МКА к молекуле CD3 (1 мкг/мл ИК0-90) эта доля возрастала до 59,48 + 5,87 % (рис.3.). Т.е. доля клеток в апоптозе при активации МНПК новорожденных высокими дозами МКА к CD3 по размерам близка к доле всех Т-клеток в составе свежевыделенных МНПК.

Таким образом показано, что:

* МНПК части новорожденных отвечают на активацию входящих в их состав Т-лимфоцитов моноклональными антителами к молекуле CD3 не усилением пролиферации, как это наблюдается у всех взрослых здоровых доноров и большей части новорожденных, а падением пролиферации ниже контрольных значений неактивированных культур. Подавление пролиферации вызывают высокие концентрации МКА ИК0-90 (1 мкг/мл и более).

'* Подавление пролиферации связано с массовой гибелью

«111 /14^22306801

-нчгиг-н^ды I чи'нчггзеьвпз+ьг-нупл-нн&г «1ц/14/тгаэвв8вехчп.г-нчп.а-нч«ь»

• и»/\4/тггза&8в \ ?чг1г-нчпг-н# { дь е

з.

Ш— 10»__¡62_

тгт

а г.

гь з

я!

"Л» Иг

Рис.3. Доля гиподипловдных клеток (участок гистограмм М1) среди МНПК взрослого донора (А), новорожденного группы 1 (Б) и новорожденного группы 3 (В) через 48 ч. культивирования без активаторов (1) и с МКА ИК0-90 в концентрации 1 мкг/мл (2) и 10 нг/мл (3).

клеток в активированных культурах, начинающейся с 48 часов после активации.

* Гибель клеток, индуцированная активацией через молекулу СБЗ, осуществляется по механизму апоптоза. МНБК новорожденных отличаются большим уровнем спонтанного апоптоза в условиях клеточной культуры. Активация Т-лимфоцитов антителами к СОЗ молекуле вызывает существенное усиление апоптоза МНПК у всех новорожденных. У новорожденных третьей группы антитела ИК0-90 увеличивают долю клеток в алоптозе до размеров, близких к доле Т-клеток в составе свежевыделенных МНПК.

2. СВЯЗЬ ХАРАКТЕРА ОТВЕТА Т-КЛЕТОК НА АКТИВАЦИЮ С КЛИНИЧЕСКИМ СОСТОЯНИЕМ НОВОРОЖДЕННЫХ.

Исследовалась связь характера ответа МНПК новорожденных на активацию МКА ИКО-90 с патологиями беременности их матерей. Для этого было обследовано 75 новорожденных со сроком гестации 36 - 42 недели и их матери - женщины в возрасте от 18 до 30 лег.

В результате анализа патологий беременности у матерей новорожденных, разделенных на группы вышеуказанным образом, были выявлены различия частоты анемий, гестозов, пиелонефритов и перенесенных в последнем триместре беременности острых вирусных респираторных инфекций ( ОРВИ ) между группами (табл.1). Как видно из таблицы, частота этих патологий, выявленных в ходе беременности, последовательно увеличивается от первой до третьей группы. Частота анемий II и III степени во второй группе в 2,8 раза, а в третьей группе - в 4,7 раза выше, чем в первой группе. ОРВИ в последнем триместре беременности в группе 2 было в 2,5, а в группе 3 - в 5,9 раз больше, чем в группе 1. Сочетанные ОПТ гестозы были лишь в группе 3. ОГ гестозов во второй группе было в 1,7, а в третьей - в 2,7 раз больше, чем в первой группе. Кратность аналогичных различий для хронических и гестационных пиелонефритов составляли 3,4 и 4,0. Доля матерей с анемиями, гес-тозами и пиелонефритами в первой группе не превышает средних показателей распространенности этих патологий среди беременных. •

Табл.1. Связь патологии беременных с нарушением ответа лимфоцитов новорожденных на активацию.

1 ' 1 |Группы, |детей и |их матерей, |характер |ответа МНПК 1 количество матерей (%) с соответствующей | патологией беременности |

анемия II и III ст. t 0РВИ|0ПГ-гес-|тоз 1 1 1 0Г-гес-|хрон.пие-| | лонефриты| 1 I

|группа 1.(N=32) |первый тип ответа 9,4* 1 6,3*| 0 I 1 1 1 9,4 | 3,1 | I 1 I 1

|группа 2.(N=27) |второй тип ответа 25,9* 1 14,8*| 0 1 1 I 1 14,8 | 11,1 | I 1 1 1

|группа 3.(N=16) |третий тип ответа | 43,8* 1 37,5*| 18,8 1 1 1 1 25,0 | 12,5 | 1 1 . 1 1

* - различия между группами достоверны при р< 0,05.

Анализ сопряженности признаков показал, что индуцированное активацией глубокое подавление пролиферации лимфоцитов, наблюдаемое в группе 3, можно считать достоверно связанным с анемиями II и III степени и ОРВИ в последнем триместре беременности при уровне значимости 1 % (р<0,01) и достоверно связанным с ОПГ-гестозами при уровне значимости 5 % (р<0,05). Значение х. 2 для признаков "глубокое подавление пролиферации лимфоцитов" и "анемии беременных" равняется 7,64, для признаков "глубокое подавление пролиферации лимфоцитов" и "ОРВИ" - 7,5 и для признаков "глубокое подавление пролиферации лимфоцитов" и "ОПГ-гестозы" - 6,4.

Для изучения связи характера ответа Т-клеток на МКА к CD3 с клиническим состоянием детей нами были проанализированы 124 истории родов и развития детей, разделенных нами по характеру ответа на высокие концентрации МКА ИК0-90. 68 но-воровденных были отнесены к первой группе, 38 - ко второй и 18 - к третьей группе.

Подавляющее большинство новорожденных первой группы (88,2 %) при рождении находилось в удовлетворительном клиническом состоянии. У 5,9 % детей (4 ребенка) клиническое сос- . тояние было оценено как условно-удовлетворительное и у 5,9 % - как состояние средней степени тяжести. Состояние средней степени тяжести было связано с недоношенностью II степени и хронической внутриутробной гипоксией плода у одного ребенка (1,5 X) и с асфиксией в родах у трех детей (4,4 %).

У детей, вошедших во вторую группу, доля новорожденных в удовлетворительном клиническом состоянии составляла 68,4 %. Состояние 21,1 % детей второй группы при рождении было оценено как условно-удовлетворительное. В состоянии средней тяжести находилось 10,5 % новорожденных. Состояние средней степени тяжести было связано с хронической внутриутробной гипоксией и хронической внутриутробной гипотрофией плода, недоношенностью 1 и II степени.

В третьей группе удовлетворительное состояние было лишь у 33,3 % новорожденных. У 22,2 X детей состояние было оценено как условно-удовлетворительное и у 44,4 % - как состояние средней степени тяжести и тяжелое, связанное с недоношенностью, хронической внутриутробной гипотрофией, хронической гипоксией и поражением центральной нервной систе». ы гипокси-ческого генеза, внутриутробным инфицированием и врожденной пневмопатией.

Причиной неудовлетворительного состояния ребенка после рождения могут быть как хронические нарушения условий внутриутробного развития, так и отрицательные воздействия в период родов, связанные с травмами и асфиксией. Время купирования последствий этих воздействий может варьировать в широких пределах от нескольких часов до нескольких лет. Для определения динамики клинического состояния новорожденных в раннем неонатальном периоде был проведен анализ состояния новорожденных на шестые сутки жизни. Результаты анализа представлены на рис. 4. Доля детей в удовлетворительном клиническом состоянии незначительно увеличилась в первой и второй группах новорожденных. Существенно уменьшилась доля детей в условно-удовлетворительном клиническом состоянии, что, по-видимому, связано с большей возможностью объективной и четкой

Группа 1. Дети с первым типом ответа МНПК на МКА ИКО-90 (стимуляция пролиферации). N=65.

91,2%

/ 8,8%

Группа 2. Дети со вторым типом ответа МНПК на МКА ИКО-90. (индекс подавления пролиферации <2). N=38.

71,1%

5.2% 23,7%

Группа 3. Дети с третьим типом ответа МНПК на МКА ИКО-90. (индекс подавления пролиферации > 2). N=18.

"ЯШ

33,3%

11,1%

38,8 %

16,6%

Рис. М . Сопоставление клинического состояния новорожденных на б день жизни с нарушением ответа их лимфоцитов на активацию МКА ИКО-90.

[ | - доля детей в удовлетворительном состоянии [-1 - доля детей в условно-удовлетворительном состоянии

- доля детей в состоянии средней степени тяжести и в тяжелом состоянии.

- летальный исход.

оценки состояния ребенка при динамическом наблюдении sa ним в течение нескольких дней. Доля детей в состоянии средней степени тяжести во второй группе увеличилась с 10,5 % при рождении до 23,7 Трое детей третьей группы (16,6 %) умерли в первые 6 дней жизни : двоим был поставлен диагноз : врожденная пнеЕмопатия, болезнь гиалиновых мембран, одному : врожденная атопия почек. Доля детей, находящихся в состоянии средней степени тяжести, тяжелом клиническом состоянии, а также умерших детей в третьей группе к шестым суткам жизни составила 55,4 % против 44,4 % при рождении.

Анализ сопряженности признаков показал, что индуцированное активацией глубокое подавление пролиферации лимфоцитов, наблюдаемое в группе 3, можно считать достоверно связанным с неудовлетворительным клиническим состоянием новорожденных (состояние средней степени тяжести, тяжелое состояние, летальный исход) при р<0,001. Значение х ^ для этой пары признаков составляет 20,53.

Таким образом, показано, что характер ответа МНПК пупо-винной крови на МКА к CD3 молекуле связан с клиническим состоянием новорожденных : во второй и, особенно, в третьей группе новорожденных доля детей, находящихся в неудовлетворительном состоянии, существенно выше, чем в первой группе детей. Патологии новорожденных, являющиеся причиной неудовлетворительного состояния детей Z и 3 группы, имеют тенденцию к прогрессированию в раннем неонатальном периоде.

Причинами неудовлетворительного клинического состояния ■детей первой группы была хроническая внутриутробная гипоксия и асфиксия в родах (табл.2). Во второй группе у 18,4 % детей были диагносцированы последствия хронической внутриутробной гипоксии и у 10,5 % - внутриутробное инфицирование, причем у одного ребенка была определена внутриутробная пневмония и нарушение кардио-респираторной адаптации. Последствия асфиксии в родах были обнаружены у 7,9 Z. У 5,3 X детей диагнос-цирована гемолитическая болезнь новорожденных - конфликт по системе ABO. В третьей группе была велика доля недоношенных и гипотрофичных детей - 66,6 %. У половины детей были обнаружены последствия хронической внутриутробной гипоксии ( поражение центральной нервной системы гипоксического генеза ).

Табл.2. Структура патологию* новорожденных в группах детей с различным ответом Т-клеток на МКА к СБЗ.

1 1 |Патология | 1 доля детей с соотв. патологией (%) |

группа 1 группа 2 1 группа 3 |

|недоношенность | 1,5 5,3 66,6 |

|хрон. внутриутробная| |гипоксия | 8,8 18,4 49,9 |

|асфиксия в родах | 4,4 7,9

|внутриутробное инфи-| |цирование | 10,5 11,1 1

|гемолитическая бо- | |лезнь новорожденных | 5,3

|болезнь гиалиновых | |мембран | 11,1 |

|врожденная атопия | |почек I 1 I 1 5,5 | I

Морфологические признаки массированного бактериального внутриутробного инфицирования (характер околоплодных вод, состояние пуповины и плаценты, кожных покровов ребенка) были обнаружены у 11,1 £ детей. Причинами смерти троих детей этой группы, как было указано выше, явились болезнь гиалиновых мембран (врожденная пневмопагия) и врожденная атопия почек.

Объективными показателями состояния ребенка являются такие параметры, как масса тела и потеря массы тела в раннем неонатальном периоде. В таблице 3 продемонстрированы статистически достоверные различия массы тела в трех обследованных нами группах новорожденных. Средняя в группе масса тела пос-

ледовательно уменьшалась от первой к третьей группе новорожденных .

Табл.3. Масса тела при рождении, потеря массы тела в первые 6 суток жизни и срок гестации детей первой, второй и третьей группы.

1 | Показатели ■ гр.1 гр.2 1 гр.з |

|Масса тела (г) 3530 +30 2927 +51 2764 | +65 |

|Потеря массы тела (%) 4,31 +0,44 6,66 +0,90 10,36 | +0,88 |

|Гестационный возраст 1 (нед.) 1 40,0 +0,2 38,0 +0,3 38,0 | +0,3 | I

При успешной адаптации здоровых детей к новым условиям существования потери массы тела незначительны и падение массы тела в первые дни жизни сменяется ее ростом. Стойкая тенденция к потере массы тела и снижение массы на 10 % от массы при рождении являются неблагоприятными прогностическими признаками и требуют врачебного вмешательства в процесс адаптации. Как видно из таблицы, средняя потеря массы тела в третьей группе новорожденных превышала 10 % , во второй группе составляла 6,66 % и в первой - 4,31 %.

Гестационный возраст новорожденных в первой группе соответствовал нормальному сроку внутриутробного развития, а во второй и в третьей группе составлял 38 недель.

При исследовании характера ответа МНПК недоношенных детей, находящихся на втором этапе выхаживания, подавление пролиферации высокими концентрациями МКА к СБЗ было обнаружено у 10 из 50 обследованных (табл.4). Возраст этих детей составлял от 15 до 45 дней. Таким образом было показано, что

эффект подавления пролиферации МНПК антителами к СБЗ, обнаруженный нами у новорожденных, может сохраняться у небольшой части детей , находящихся в неудовлетворительном состоянии в течение первых полутора месяцев жизни.

Табл. 4. Пролиферация МНПК недоношенных детей (N=50), находящихся на втором этапе выхаживания.

1 1 1 % от Есех| включение метки ( 1 имп./мин. ).|

|Группы детей| обследо- | среда I разведения МКА ИКО-90 .|

ванных | |в 200 раз | 1 1 В 3 200 раз |

|Группа А. | 80 | 907 + 50 1 1 | 3 936 + | | 536 | 1 | 10 140 + | 2 687 |

|Группа Б. | | ( 20 | 1 577 £ 95 1 1 | 383+| 1 57 | | | 1 655 + | 573 | 1

Поскольку в ходе выполнения работы было показано, что оценка уровня пролиферации и жизнеспособности МНПК новорожденных, активированных высокими дозами МКА ИК0-90, связана не только с особенностью реактивности Т-лимфоцитов новорожденных, но и может служить чувствительным биомаркером клинического состояния детей в раннем неонатальном периоде, нами был разработан метод, основанный на полученных экспериментальных данных. Метод был оформлен как пособие для врачей-лаборантов .

3. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ИНДУКЦИИ АП0ПТ03А АНТИТЕЛАМИ К МОЛЕКУЛЕ СБЗ.

Известно, что зрелые покоящиеся лимфоциты взрослых доноров не чувствительны к индукции апоптоза, и активация их через молекулу СдЗ может вызывать апоптоз в культуре уже активированных Т-лимфоцитов на пике пролиферации. В связи с этим было высказано предположение о том, что повышенная

чувствительность МНПК части новорожденных к индуцированному активацией апоптозу может быть связана с преактивацией лимфоцитов in vivo, например, в условиях внутриутробного инфицирования. Для проверки этой гипотезы нами исследовался уро вень пролиферации неактивироЕанных МНПК новорожденных и взрослых в первые 15 часов после выделения их из крови. Параллельно ставили стандартный пролиферативный тест для определения типа ответа МНПК на МКА ИК090.

Наибольшим оказалось включение метки клетками новорожденных первой группы с пролиферативным типом ответа на антитела ИК0-90, а не у детей 2 и 3 группы с повышенной чувствительностью к апоптозу. Уровень спонтанной пролиферации клеток новорожденных групп 2 и 3 не отличался от уровня пролиферации МНПК взрослых здоровых доноров.

Полученные результаты гс-Еорят о том, что выявляемая нами повышенная чувствительность лимфоцитов новорожденных к апоптозу не связана с воздействием МКА ИКО-90 на активно пролиферирующие преактивировакные iл vivo лимфоциты новорожденных.

Апоптоз лимфоцитов может быть следствием как специфических сигналов, запускающих программу гибели ( например апоптогенный сигнал через Fas-рецептор при межклеточных взаимодействиях или рецептор фактора некроза опухоли 1 типа ), так и недостатка фактороЕ, разрешающих пролиферацию активированных клеток ( интерлейкин-2 и -4, межклеточные рецептср-ные взаимодействия, запускающие продукцию лимфокинсв ).

Если причина описанной выше повышенной чувствительности к апоптозу состоит в избытке в культуре МНПК стимулирующих апоптоз сигналов, увеличение плотности культуры может привести к усилению гибели клеток, а уменьшение плотности может вызвать ее ослабление. Напротив, если причиной повышенной чувствительности к апоптозу является недостатк спасающих от апоптоза факторов, увеличение концентрации МНПК может ослабить гибель клеток и привести к смене характера ответа лимфоцитов на активацию.

Как увеличение, так и уменьшение концентрации клеток в культуре МНПК новорожденных периой и третьей группы не приводило к явным изменениям характера ответа клеток на МКА

ИКО-90. Во второй группе, у детей со слабо выраженным подавлением пролиферации, уменьшение плотности культуры приводило к незначительному падению уровня пролиферации, тогда как увеличение концентрации клеток в культуре в 2 раза вызывало уменьшение гибели клеток в присутствии высоких концентраций МКА ИКО-90, существенному росту уровня пролиферации при всех использованных концентрациях антител и к смене второго типа ответа МНПК на первый тип.

Полученные результаты являются косвенным свидетельством недостатка в культуре МНПК новорожденных костимулирующих сигналов, спасающих от апоптоза Т-лимфоциты, активированные антителами к молекуле CD3.

Антитела к CD28, костимулирующие активированные Т-клетки, не способны уменьшать гибель клеток при активации Т-лимфоцитов новорожденных через молекулу CD3. Костимуляция через CD28 оказывает различное по своему характеру действие на индуцированную антителами к CD3 проиферацию МНПК новорожденных:

* У большей части новорожденных костимуляция через CD28 усиливает пролиферацию МНПК, активированных через CD3.

* В активно пролиферирующих культурах МНПК новорожденных первой группы дефицит костимуляции через CD28 не обнаружен и добавление антител к этой молекуле не вызывает существенного увеличения пролиферации.

* При значительных потерях клеток в присутствии высоких концентраций антител к CD3, антитела к CD28 не оказывают стимулирующего эффекта на пролиферацию, по-видимому, из-за потери культурой клеток-мишеней для этих антител.

ИЛ-2 и, особенно, ИЛ-4 защищают активированные через CD3 МНПК новорожденных от гибели (рис.5.). При этом, у большинства новорожденных первой группы и у детей с подавлением пролиферации антителами ИКО-90 ( всего 22 из 26 обследованных), интерлейкин-2 вызывал увеличение пролиферации в культурах, активированных антителгзми к CD3 в .1,5 и более раз (табл.5). В то же время, ИЛ-4 ог^азывал модулирующее действие на пролиферацию активированных через CD3 МНПК новорожденных:

* У 12 из 26 обследованных интерлейкин-4 в концентрации 5 нг/мл вызывал дозозависимое увеличение пролиферации в

г 100

*

-ь

-Я»

11 /2 А Б

Рис. 3 ■ ИЛ-4 защищает активированные антителами ИКО-90 МНПК новорожденного от гибели. По оси ординат -жизнеспособность неприлипающих МНПК (%). А - клетки без МКА ИКО-90, Б - клетки с 1 мкг/мл МКА ИКО-90. 1 - клетки без ИЛ-4, 2 - клетки с 5 нг/мл ИЛ-4. * - различия достоверны при р<0,05.

культурах, активированных антителами к СБЗ в полтора и более раз. Это были новорожденные первой группы со слабой стимуляцией пролиферации МНШ антителами ИК0-90 (ИС от 1,1 до 1,8) и дети с подавлением пролиферации высокими дозами МКА ИК0-90.

* У 8 детей было обнаружено подавление индуцированной антителами к СБЗ пролиферации в 1,5 и более раз интерлейки-ном-4 в концентрации 5 нг/мл. Эти новорожденные входили в первую группу, их МНЛК отвечали мощной пролиферацией на антитела ИКО-90 (ИС от 4,7 до 13,6).

* У 6 новорожденных первой группы со средним и высоким уровнем ответа на МКА к СОЗ (ИС от 2,6 до 15,3) добавление рекомбинантного Ш1-4 в концентрациях 1,5 и 5 нг/мл не вызывало существенного изменения пролиферации.

Табл. 5. Стимуляция пролиферации МНЛК новорожденных (N=26) МКА К CD3, CD28, ИЛ-2 И ИЛ-4 (ИС, М + ш).

1 • 1 - ... 1 1 | концентрация МКА к CD3 ИКО-90 (нг/мл)| 1 1 1

1 г |костимуляторы 1 1 1 0 10 1000 |

1 1 | без костимуляторов | 1 1 1 5,50+0,22 4,58+0,32 |

1 1 1 1 |МКА к CD28 (40 нг/мл)| 1 1 1,79+0,08 ■* 8,85+0,47 * 1 12,31+1,181

1 1 1 1 1ИЛ-2 (5 нг/мл) | 1 1 4,19+0,32 * 9,52+0,41 * ) 10,06+0,61|

1 1 1 1 1ИЛ-4 (5 нг/мл) | 1 . 1 1,93+0,12 5,88+0,47 5,75+0,63 | |

* - различия ИС с костимуляторами и без них достоверны • при р < 0,05.

Результаты влияния ИЛ-2 и ИЛ-4 на жизнеспособность активированных МНПК новорожденных наводят на мысль о том,что обнаруженная нами повышенная чувствительность к индуцированному активацией апоптозу Т-лимфоцитов крови новорожденных может быть связана с дефицитом продукции ИЛ-2 и ИЛ-4 Т-лимфоцитами новорожденных при активации.

Интересно различие в действии этих интерлейкинов. ИЛ-2 оказывал мощное ростовое действие на культуры клеток с повышенной чувствительностью к апоптозу, в то же время относительно слабо восстанавливая жизнеспособность клеток. При этом нельзя исключить, что влияние на жизнеспособность, по крайней мере частично, связано не с защитой от апоптоза, а с бурным размножением оставшихся в живых клеток с меньшей чувствительностью к апоптозу. ИЛ-4 стимулировал рост культур лишь у части новорожденных, при этом уровень пролиферативного ответа на ИЛ-4 был ниже, чем на ИЛ-2. В то же время, существенное увеличение жизнеспособности клеток в присутствии ИЛ-4 наблюдалось во всех культурах, вне зависимости от ростового действия ИЛ-4. Таким образом, ИЛ-4 оказался наиболее эффективным агентом, защищающим от индуцированного активацией апоптоза Т-клетки новорожденных. Литературные данные о критической роли ИЛ-4 в пролиферации и продукции цитокинов Т-клетками пуповинной крови (Katantura К., et all., 1995; Annunziata F., et all., 1997), а также о слабой продукции ИЛ-4 (Roncarolo М.G., et all., 1994), и меньшей стабильностью ци-токинового профиля Гх2 у новорожденных (Sornasse Т., et all., 1996) также наводят на мысль о возможных дефектах продукции ИЛ-4, способных увеличить чувствительность Т-клеток к апоптозу. В то же время, уровень продукции ИЛ-2 у новорожденных и взрослых различается незначительно (Hassan J., et all., 1997). В дальнейшем планируется провести оценку уровня продукции этих интерлейкинов и количества клеток-продуцентов ИЛ-4 и ИЛ-2 у детей, различающихся по чувствительности Т-клеток к активационному апоптозу.

Суммируя изложенное выше, выделим наиболее принципиальные для обсуждения моменты :

* Т-клетки новорожденных обладают большей, чем взрослые

чувствительностью к апоптозу, индуцированному через TKP-CD3.

* Аполтоз индуцируют высокие дозы МКА, моделирующих действие антигена.

* У недоношенных, гипотрофичных новорожденных, детей, развивавшихся в условиях, способных привести к задержке внутриутробного развития, обнаружена повышенная чувствительность Т-клеток к индуцированному активацией апоптозу. Апоп-тоз Т-клеток этих детей индуцируют меньшие дозы МКА к CD3; у этих детей большая доля клеток отвечает апоптозом на высокие концентрации активатора.

* Повышенная чувствительность к апоптозу не связана с активной пролиферацией .преакгивированных in vivo клеток; по-видимому, эта особенность реактивности Т-лимфоцитов связана с недостатком продукции цитокинов, защищающих активированные клетки от апоптоза.

На периферии иммунной системы Т-лимфоциты повышают свою чувствительность к апоптозу после вовлечения их в процесс иммунного ответа (Green D.R., et all., 1994). При этом апоп-тоз, по-видимому, играет роль регулятора, ликвидируя клетки выполнившие свой цикл функций (активация - пролиферация -эффекторная или регуляторная функция) и тем самым предотвращая продолжние иммунной реакции "по инерции". По-видимому, к этой разновидности активационного апоптоза имеет отношение лабораторная модель индукции апоптоза повторной активацией клеток во время их активной пролиферации.

Другая функция индуцированного активацией апоптоза Т-клеток на периферии иммунной системы исследована в меньшей степени - это участие апоптоза в процессе поддержания ауто-толерантности на периферии, дополняющем тимическую селекцию Т-клеток. До сих пор не ясна его локализация в организме и временные характеристики (действие на клетку осуществляется непосредственно после выхода из тимуса или лишь при наличии определенных условий, особых вспомогательных клеток). Точно неизвестно соотношение апоптоза и анергии, как механизмов поддержания аутотолерантности, хотя считается, что у Езрос-лых анергия играет большее значение в процессе инактивации аутореактивных зрелых Т-лимфоцитов, чем апоптоз (Rüssel J.H., et all. 1991; Webb S., et all., 1990). По-ви-

димому, лабораторной моделью аутотолерогенного, по своей функции, апоптоза можно рассматривать гибель Т-клеток в ответ на экстремально высокие дозы антигена (Lenardo M.J., et all., 1995; Mondino A., et all., 1996). В данной работе использовались высокие концентрации заменяющих антиген ША, недостаточные для запуска такого "высокодозового" апоптоза Т-клеток взрослых, но индуцирующие гибель клеток новорожденных, особенно детей недоношенных, гипотрофичных, развивавшихся в условиях, способных привести к отставаниям в развитии. В связи с этим, предлагается гипотеза, согласно которой, в ходе внутриутробного развития Т-лимфоциты периферии поставлены в особые условия внетимической селекции. Свойственная для этого периода повышенная чувствительность Т-кле-ток к апопгозу связана со снижением апоптогенной для этих клеток концентрации антигена. Такая особенность реактивности Т-лимфоцитов увеличивает эффективность элиминации потенциально аутореактивных Т-лимфоцитов в условиях отсутствия в организме плода существенных количеств чужеродных антигенов (в течение адаптивного периода развития иммунной системы). Этот период может начинаться после появления на периферии иммунной системы ос/в ТКР+ Т-лимфоцитов на 20 неделе беременности и должен закончиться к рождению ребенка, т.е. к моменту его контакта с множеством чужеродных антигенов. Однако, особенности внутриутробного развития и/или преждевременные роды приводят к рождению детей, Т-клетки которых еще не утратили повышенной чувствительности к индуцированному активацией апоптозу. В результате у таких детей специфичные к чужеродным антигенам Т-лимфоциты могут получить смертельный сигнал при контакте с высокими дозами этих антигенов и погибнут, подобно аутореактивным клеткам в ходе внетимусной селекции во время внутриутробного развития. Подобная ситуация создается и при внутриутробном инфицировании, когда инфекционный агент может активировать неготовые к пролифера-тивному ответу на антиген Т-лимфоциты плода. Результатом такого контакта служит элиминация антигенспецифических Т-клеток. Косвенным подтверждением реальности этих событий является длительная, иногда пожизненная персистенция возбудителя, характерная для внутриутробного инфицирования (Самсыгина

Г.А. с соавт., 1997).

Поскольку обнаруженный нами дефект реактивности Т-лимфоцитов у части детей может сохраняться в течение первых полутора месяцев жизни, а сроки появления в организме чужеродных антигенов измеряются, судя по скорости микробной колонизации новорожденного, часами, наличие обнаруженного нами дефекта реактивности Т-клеток не может остаться без негативных последствий для иммунной системы ребенка и после рождения. Особенно это становится актуальным при развитии инфекционного или гнойно-септического процесса и при дефиците поступающих от матери иммуноглобулинов, способных снизить концентрацию чужеродных антигенов. В дальнейшем нами планируется проведение многолетних работ, посвященных изучению иммунологических последствий повышенной чувствительности Г-клеток новорожденных к апоптозу.

4. ХАРАКТЕР ОТВЕТА Т-ЛЮЙОЦИГОВ НОВОРОЖДЕННЫХ НА ДРУГИЕ АКТИВ АНИОННЫЕ СИГНАЛЫ И ИОНИЗИРУЮЩЕЕ ОБЛУЧЕНИЕ.

Результаты исследования альтернативной активации Т-лимфоцитов новорожденных, разделенных на группы по характеру ответа на антитела к CD3, представлены в табл.6. Нами не было обнаружено достоверных различий доли детей,имеющих положительный (ИС>2) ответ на альтернативный активирующий сигнал, в трех группах новорожденных. Средний ИС, рассчитанный по отношению к контрольным значениям пролиферации в присутствии Шк без эритроцитов, у новорожденных первой группы был в 1,6 раз выше, чем в группах 2 и 3. Однако эти различия связаны с высоким уровнем пролиферации клеток в присутствии США в группах 2 и 3. Абсолютные значения пролиферации активированных по альтернативному пути Т-клеток у детей 2 группы превышают, а у детей 3 группы не отличаются от соответствующих показателей в группе 1.

Высокий уровень ответа МНПК новорожденных 2 и 3 группы на ФМА может говорить о том, что по крайней мере часть этих клеток до действия СЕМА находилась в состоянии "неполной" активации. Для активации покоящегося лимфоцита в экспериментальной модели необходима комбинация ФМА и ионофора Са2+,

при этом ФМА запускает MAP-каскад за счет действия на Ras-GAP-белок, тогда как ионофор Са2+ активирует кальмодулин и кальциневрин. Результатом действия двух этих агентов является образование различных ядерных факторов транскрипции -АР-1 при действии ША и NF-AT при действии ионов Са2+ (Rudd C.R., et all., 1994; Weiss A., et all., 1994; Mustelin Т., 1996). Можно предположить, что состояние МНПК детей 2 и 3 группы характеризуется наличием активного NF-AT.и для ответа на активацию они нуждаются липь в экспрессии АР-1. Интересно отметить, что NF-AT критически необходим не только для про-лиферативного ответа на активацию, но и для запуска актива-ционного апоптоза, как регулятор экспрессии FasL на лимфоцитах (NagataS., et all., 1995; Hodge M.R., 1996).

Табл. 6. Ответ Т-клеток новорожденных на активацию по альтернативному пути.

i-1-:-г

|Группы но- Включение метки (имп./мин.)| ИС наличие |

Iворожденных i среда | i ФМА ФМА+эритр.| i ответа(%)|

1 ¡Группа 1 1 1 510 | 5 634 1 17 604 | 2,93 45,5 |

1 (N=11) i + 347 | i + 987 ¿1 234 | i + 0,82

1 | Группа 2 1 3 357 | 14 919 1 23 529 ¡ 1,80 50 |

|(N=10) i +1 234| i +3 457 ±3 256 | i + 0,19 i

1 |Группа 3 1 1 756 | 10 348 1 18 849 | 1,74 1 50 !

| (N=10) + 549 | +3 673 +5 388 | + 0,32

i_i_i_i_i_L

МНПК новорожденных первой и второй группы отвечали на оптимальные дозы активирующего Т-лимфоциты митогена ( КонА в концентрации 7,5 мкг/мл ) мощной пролиферацией в 1,94 и в 1,62 раза превышающей уровень ответа на КонА Т-клеток взрослых доноров. Те же концентрации митогена вызывали достоверно меньший ответ Т-лимфоцитов, входящих в состав МНПК новорож-

денных третьей группы.

Необходимо отметить, что активация МНПК новорожденных митогеном КонА делала эти клетки более чувствительными к действию ионизирующего облучения, чем активированные тем же митогеном МНПК взрослых доноров. Поскольку обнаруженные нами различия жизнеспособности облученных МНПК связаны с действием КонА, мишенью которого являются, в основном, Т-лимфоциты и естественные киллеры, нам представляется возможным предположить существование различий в процессах активации этих клеток крови новорожденных и взрослых людей, делающих активированные МНПК новорожденных более уязвимой мишенью для действия ионизирующего облучения.

5. СРАВНЕНИЕ ДЕФЕКТА РЕАКТИВНОСТИ Т-КЛЕТОК НОВОРОЖДЕННЫХ С ПОРАЖЕНИЕМ Т-КЛЕТОК ИОНИЗИРУЮЩИМ ИЗЛУЧЕНИЕМ.

Известно, что преимущественное поражение Т-клеточного звена иммунной системы наблюдается у участников работ по ликвидации последствий катастрофы на Чернобыльской АЭС (далее : ликвидаторов). В частности, в поздние сроки после аварии у ликвидаторов выявлены нарушения процессов активации Т-клеток. При хронических заболеваниях дыхательной системы также были обнаружены сходные нарушения функции Т-лимфоцитов. Для сравнения поражений функции Т-лимфоцитов у ликвидаторов и больных хроническими заболеваниями дыхательной системы с выявленными нами особенностями Т-лимфоцитов новорожденных исследовалось состояние путей активации Т-лимфоцитов крови больных хроническим бронхитом (ХБ) ликвидаторов и не подвергавшихся облучению больных ХБ.

Выявленные нами отклонения в реактивности Т-лимфоцитов новорожденных отличаются от нарушений функции Т-клеток у взрослых больных ХБ и ликвидаторов.

Как было сказано выше, выявленный нами дефект реактивности Т-клеток новорожденных, в первую очередь, затрагивает классический, СОЗ-зависимый путь активации. Мощная активация Т-клеток по этому пути у части новорожденных вызывает не пролиферацию, а гибель большинства активированных клеток. В то же время, при хронических заболеваниях дыхательной

Табл.7. Пролиферация активированных Т-лимфоцитов ( М ± т).

г

Т

ПОКАЗАТЕЛИ

основная гр ликвидаторы

группа сравн больные ХБ

контр.группа здоровые

индекс ОТВЕТ НА стимуляции АЭ + ФМА-

1,58*+ 0,57

8,73*+ 1,53

18,05 + 0,34

наличие ответа

13,3 Z

86,7 X

80,0 %

индекс ОТВЕТ НА стимуляции

антитела-

к CD3 наличие ответа

5,06 + 1,07

8,53 + 1,5£

6,61 + 1,15

80,0 Z

80,0 %

90,0 %

ОТВЕТ НА индекс Кон А стимуляции

4,49 + 0,99

16,07 + 3,31

16,69 + 0,28

наличие ответа

80,0 1

86,7 7»

100 %

ОТВЕТ НА индекс ФМА стимуляции

2,86*+ 0,43 **

14,01 + 2,74

9,78 + 1,04

наличие ответа

18 чел

80,0 %

100 %

СПОНТАННАЯ имп/мин ПРОЛИФЕРАЦИЯ

1064 + 447

765 +146

963 + 215

* - достоверность различия р < 0,05 с группой здоровых, л* - достоверность различия р < 0,05 с больными ХБ группы сравнения

системы обнаруживается ослабление ответа Т-клеток на активацию по альтернативному, CD2-зависимому пути без существенного поражения CD3-зависимого пути (табл.7.). Ионизирующее излучение практически полностью блокирует этот путь активации клеток, что, по-видимому, приводит к снижению эффективности процессов межклеточной кооперации в ходе иммунного ответа.

Полученные нами данные подтверждают уже имеющиеся наблюдения о возможности избирательного поражения CD2-зависимого пути

передачи сигнала (Литвина М.М. с соавт.,1994; Яковлева Н.И.

с соавт.,1994; Arnaiz-Villena к., et all.,1992). Известно, что путь передачи этого сигнала зависит от компонентов ТКР-мудътимодекулярного комплекса и на своих начальных этапах, а также в дистальных звеньях не имеет отличий от ТКР-зависимых путей передачи сигнала (Ley S.C. et all., 1991). В то же время, получены данные, о сигнальной активности CD2 в клетках лишенных CD3-TKP (Turka L.A., et all.,1992) и об участии в процессах CD2-зависимой активации, на уровне действия ZAP-70 на PLC, белков, уникальных для CD2-зависимого варианта внутриклеточной передачи сигнала (Hubert P.,et all., 1996). Способность ионизирующего облучения к столь избирательному влиянию на молекулы, участвующие в передаче активационного сигнала требует своего дальнейшего изучения.

вывода.

1. Мононуклеарные клетки луговинной крови части новорожденных отвечают на активацию входящих в их состав Т-лимфоцитов антителами к молекуле CD3 не усилением пролиферации, как это наблюдается у всех взрослых здоровых доноров и большей части новорозденных, а падением пролиферации ниже контрольных значений неактивированных культур. Подавление пролиферации вызывают высокие концентрации моноклональных антител ИК0-90 (1 мкг/мл и более).

2. Подавление пролиферации вызвано массовой гибелью активированных клеток, начинающейся с 48 часов после активации. Гибель клеток происходит по механизму апоптоза.

3. У матерей новорожденных с повышенной чувствительностью Т-клеток к индуцированному активацией апоптозу в ходе беременности чаще выявлялись анемии II и III степени, гесто-зы, пиелонефриты и ОРВИ в последнем триместре беременности.

4. Среди новорожденных с повышенной чувствительностью Т-лимфоцитов к апоптозу, доля детей, находящихся в неудовлетворительном гслиничесгсом состоянии существенно выше, чем среди остальных новорожденных. Неудовлетворительное состояние детей с повышенной чувствительностью Т-клеток к апоптозу обусловлено отклонениями внутриутробного развития, способными привести к задержке развития плода и к преждевременным родам. Дети с повышенной чувствительностью Т-клеток к индуцированному активацией апоптозу имеют меньшую массу тела, меньший гестационный возраст и большую потерю массы тела в раннем неонатальном периоде.

5. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов к индукции алоптоза свойственна для периода новорожденное™, однако, у части детей может сохраняться в течение первых полутора месяцев жизни.

6. Костимуляция через молекулу С023 не защищает от гибели активированные через молекулу СБЗ Т-лимфоциты новорожденных с повышенной чувствительностью к апоптозу, но усиливает пролиферацию активированных клеток у большинства новорожденных. При значительных потерях клеток в присутствии высоких концентраций антител к СИЗ, антитела к СБ28 не оказывают стимулирующего эффекта на пролиферацию, вероятно, из-за потери культурой клеток-мишеней для этих антител.

8. ИЛ-2 и ИЛ-4 залдоцают от гибели активированные клетки новорожденных при активации через молекулу СБЗ и усиливают пролиферацию активированных антителами к СОЗ МНПК у новорожденных с низким уровнем ответа на эти антитела.

9. Выявленные нами отклонения в реактивности Т-лимфоцитов новорожденных по своему спектру отличаются от нарушений функции Т-клеток у взрослых больных хроническими бронхитами и лиц, подвергшихся действию ионизирующего облучения (ликвидаторов катастрофы на ЧАЭС). При хронических заболеваниях дыхательной системы обнаруживается ослабление ответа Т-клеток на активацию по альтернативному пути. Ионизирующее

излучение практически полностью блокирует этот путь активации клеток. В то же время, дефект реактивности Т-клеток новорожденных заключается в повышенной чувствительности их к апоптозу при активации по классическому пути.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ярилин A.A., Талаев В.Ю., Шарова Н.И. Идентификация фактора роста тимоцитов и кс гониестимулирующего фактора, продуцируемого внутритимусными предшественниками Т-лимфоци-тов. // Тез. докл. конференции "100 лет институту эпидемиологии и микробиологии АМН СССР".- Ленинград, 1990.- с. 136.

2. Ярилин A.A., В.Ю. Талаев, Н.И. Шарова, В.П. Шичкин, Бифункциональность гуморального фактора, продуцируемого предшественниками Г-лимфоцитов.// Биологический журнал Армении.- 1991.- Т.44, N 2. - с. 100-105.

3. Талаев В.Ю., Ярилин A.A., Шичкин В.П., Шуваева Т.М. Характеристика митогенной активности очищенного фактора роста тимоцитов. // Бюлл. эксп. мед.- 1992.- N 5.- с. 516 -517.

4. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Мазепа В.Н., Талаева Е.Б. Индуцированный активацией апоптоз лимфоцитов крови новорожденных. Зависимость характера ответа от клинического состояния новорожденных. // Иммунология.- 1997.- N 1. - с.47 -50.

5. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Мазепа В.Н., Талаева Е.Б. Пролиферация или гибель мононуклеарных клеток крови новорожденных под влиянием моноклональных антител к молекуле CD3. // Педиатрия,- 1997.- N 3.- с. 5-8.

6. Талаев В.Ю. Индуцированный активацией апоптоз лимфоцитов крови новорожденных. Зависимость характера ответа лимфоцитов от клинического состояния новорожденных.// В материалах рабочего совещания "Пробл. охраны материнства и детства." - Нижний Новгород, 1998. - с. 18.

7. Романова Т.Е., ЧучалинА.Г., Костина В.В., Талаев В.Ю. Клинико-морфологические и иммунологические особенности хронического бронхита у ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС в отдаленные сроки. // Тез. докл. научно-практической

конференции "Экология и здоровье".- Н.Новгород, 1998.- с.35

8. БлохинаИ.Н., Миловидова И.В., Талаев В.Ю., Чуднер A.B. Иммунологический дисбалланс новорожденного и его коррекция в системе предупреждения неонатальной заболеваемости и младенческой смертности.// Доклад на седьмой (LXX) сессии общего собрания Российской академии медицинских наук, 14 -16 апреля 1998 г.- Москва. // Вестник Российской Академии медицинских наук. - 1999,- N 5 - с. 37 - 40.

9. Елисеева Т.И., Изволенская М.Н., Талаев В.Ю., Шиле-нокИ.Г., Добротина H.A., Нестеров С.Л., Кропотов В.А., Га-лахова H.H. Жизнеспособность мононуклеаров при бронхиальной астме у детей в присутствии глюкокортикоидов.// Тез. докл. конференции "Гомеостаз и инфекция".- Саратов, 19 мая 1993.-с. 21.

10. Талаев В.Ю., Романова Т.Е., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е. Функциональное состояние Т-лимфоцитов периферической крови у больных хроническим бронхитом ликвидаторов аварии на ЧАЗС// Иммунология.- 1999,- N 2,- с. 39 - 40.

11. Талаев В.Ю., Заботина Т. Е., ТалаеваЕ.Б., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е. Влияние костимуляции антителами к CD 28 и интерлейкинами-2 и -4 на мононунлеарные клетки кроЕи новорожденных детей, активированные антителами к CD3. // Иммунология. - 1999. - N 3. - с. 29-31.

12. Талаев В.Ю., ТалаеваЕ.Б., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е., Заботина Т.Е, Тагиров О.Т. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов части новорожденных к активационному алоптозу. Связь с заболеваниями матери и ребенка. // Нижегородский медицинский журнал. - 1999. - N 2. - с. 13 - 18.

13. Тагиров 0.Т., Талаев В.Ю. Характерные для апоптоза морфологические изменения и межнуклеосомная фрагментация ДНК мононуклеарных клеток пуповинной крови новорожденных при активации антителами к молекуле Т-клеток CD3. // Сборник трудов биологического факультета Нижегородского государственного университета им. Лобачевского. - г. Н. Новгород.- 1999. -с. 34

14. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е. Метод определения функционального состояния иммунной системы детей раннего возраста.// Методические рекомендации. Министерство здравоохране-

ния РФ.- 1999. - 12 с.

15. Талаев В.Ю. , Романова Т.Е., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е. Дефекты реактивности Т-лимфоцитов больных хроническим бронхитом (ХБ), подвергавшихся и неподвергавшихся действию ионизирующего излучения.// Нижегородский медицинский журнал. - 1999.- N 3 - С. 18-21.

16. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., ТалаеваЕ.Б., Тагиров О.Т. Пролиферативный ответ на форболмиристатацетат, конкана-валин А и активацию по альтернативному пути мононуклеарных клеток пуповинной крови (МНБК) новорожденных с различным характером ответа МНПК на антитела к CD3.// Иммунология. -1999. - N 4.- с. 33 - 35.

17. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Талаева Е.Б., Чуднер A.B. Пролиферация мононуклеарных клеток крови недоношенных детей первых двух месяцев жизни при активации Т-лимфоцитов антителами к CD3. // Иммунология. - 1999.- N 5,- с. 52 - 53.

18. Талаев В.Ю. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов части новорожденных к активационному апоптозу.// Тез. доклада на II съезде иммунологов России, 6-10.9. 1999 г.- Russian Journal of Immunology.- 1999. - V. 4 - Supl. 1 - p. 32.

19. Талаев В.Ю., Лебедева И. E., ТалаеваЕ.Б. Связь патологии беременности с характером ответа на активацию Т-лимфоцитов пуповинной крови новорожденных.// Педиатрия. - 1999. -N 5. - с. 110 - 111.

20. Миловидова О.В., Талаев В.Ю., Тимофеева Л.А., Корот-коваТ.В., Кочеткова Т. А. Отечественный имуноглобулин для внутривенного введения в интенсивной терапии недоношенных новорожденных с иммунологическим дисбалансом. Статья в сборнике докладов конференции "Перинатальная анестезиология. Интенсивная терапия матери, плода и новорожденного."- г. Екатеринбург.- 20-2 1.10.1999 г.- с. 45.

21. Талаев В.Ю., Талаева Е.Б., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е., Заботина Т.Е, Тагиров О.Т. Отклонения в ходе беременности и клиническое состояние' новорожденных с повышенной чувствительностью Т-лимфоцитов к индуцированному активацией апоптозу.// Иммунология. - принято к публикации.

22. Талаев В.Ю. Внутриклеточные пути передачи сигналов у Т-лимфоцитов в норме и при патологии. - Иммунология.- приня-

то к публикации.

23. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., ТалаеЕа Е.Б., Чуднер A.B. Характер ответа мононуклеарных клеток крови недоношенных детей первых двух месяцев жизни на активацию антителами к CD3 и конканавалином А. // Нижегородский медицинский журнал. - принято к публикации.

24. Талаев В.Ю. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов части новорожденных к активационному апоптозу.- Педиатрия. -принято к публикации.

25. Талаев В.Ю. , Лебедева И.Е. Связь клинического состояния новорожденных с чувствительностью Т-лимфоцитов к активационному апоптозу,- Тез. доклада на I Российском форуме "Мать и дитя".- г. Москва. - 21-23 сентября 1999 г.

Подписано в печать 21 октября 1999 г.