Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Особенности развития разлитого перитонита у экспериментальных животных в условиях различных методов коррекции

На правах рукописи

ВАЛЕЕВ Игорь Рауфович

ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ РАЗЛИТОГО ПЕРИТОНИТА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ КОРРЕКЦИИ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005547858

Новосибирск - 2014

':' П -пн

* ,.- ,. I ¿_ ^ I 7

005547858

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лим-фологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Новосибирск

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,

профессор ЛЮБАРСКИЙ Михаил Семенович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, заведующий лабораторией структурных основ патогенеза социально значимых заболеваний ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН

доктор медицинских наук, профессор

старший научный сотрудник лаборатории стволовой клетки ФБГУ науки ИХБФМ СО РАН

ПОТАПОВА Оксана Валентиновна

МОРОЗОВ Виталий Валерьевич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Томск.

Защита состоится мая 2014 г. в 1400 часов на заседании диссертационного

совета Д.001.048.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, по адресу: ул. Тимакова, 2; г. Новосибирск, 630117; тел./факс (383) 333-64-56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН

Автореферат разослан «// » апреля 2014 г

Ученый секретарь

диссертационного совета, Л" *

доктор биологических наук Пальчикова Наталья Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Проблема перитонита, несмотря на совершенствование методов диагностики и лечения, хирургической техники, достижения анестезиологии и реаниматологии и фармакологии до сих пор остается одной из сложных и актуальных в неотложной абдоминальной хирургии. Статистические данные свидетельствуют о том, что летальность больных при перитоните достигает 20-58% (Тимербулатов В.М., 2000; Масля-кова Г.Н., 2002, Лаберко JI.A. и др., 2005, Савельев B.C. и др., 2006, Савченко A.A. и др., 2012, Robledo F.A. et al., 2007), а в послеоперационном периоде - до 60-86% (Буянов В.М., 1997, Савельев B.C. и др., 2006). Основными причинами столь неудовлетворительных результатов являются прогрессирование синдрома эндогенной интоксикации и генерализация инфекции, ведущие к декомпенсации жизненно важных органов и систем (Совцов А., 2001; Арутюнян Ю.А., 2001, Апарцин К.А. и др., 2009; Кчибеков Э.А., 2010, Власов А.П. и др., 2013). Источниками интоксикации служат: экссудат брюшной полости с микробами и их экзо - и эндотоксинами, содержимое парегического кишечника, ферменты, образующиеся при гибели клеток, тканей, лейкоцитов и самих микробов (Шашков A.A., 2000; Левин Ю.М., 2000; Дарвин В.В., 2002, Макаров А.Б., Дергунов A.B., 2010, Миминошвили А.О., 2010, Миминошвили О.И., Корчагин Е.П., 2011).

Показано, что сепсис, развивающийся на фоне острого инфекционного разлитого перитонита, приводит к эндогенной интоксикации с последующим развитием синдрома полиорганной недостаточности, который проявляется значительными системными нарушениями иммунной системы (Фрейдлин И.С., 2008; Шано В.П., Кучер Е.А., 2011, Фастова И.А., 2011, Гаджиев Н.Д., 2012, Савченко A.A. и др., 2012, Wiest R. et al., 2012). Установлено, что у больных перитонитом нарушены иммунорегуля-торные механизмы, что, в частности, выражается в развитии цитокин-зависимого иммунодефицита, связанного с нарушением продукции и рецепции этих медиаторов (Кетлинский С.А., 2005; Кулигин A.B. и др., 2012). Поток современной иммунологической информации способствует тому, что многие исследователи заинтересованы в изучении гуморальных и клеточных факторов специфического и неспецифического иммунитета (Ивашкин В.Т., 2008, O'Farrelly С., Doherty D.G., 2003).

Как известно, провоспалительные цитокины являются ключевыми медиаторами противоинфекционной защиты, однако их системная продукция не означает высокую эффективность противоинфекционного иммунитета. Напротив, избыточная и генерализованная продукция провоспалительных цитокинов может стать причиной бактериально-токсического шока и летального исхода. Для избежания избыточных проявлений системного воспаления в организме включаются механизмы негативного контроля, опосредованные продукцией противовоспалительных цитокинов и растворимых ингибиторов провоспалительных цитокинов, что подавляет системную воспалительную реакцию и приводит к восстановлению гомеостаза (Турмова Е.П. и др., 2004, Ивашкин В.Т., 2008). При чрезмерной и длительной выработке противовоспалительных цитокинов происходит угнетение иммунитета, иммунодепрессия способствует персистенции бактериального патогена, присоединению нозокомиальной инфекции, ослаблению дезинтосикационного потенциала организма и формированию полиорганной недостаточности (Томнюк Н.Д. и др., 2007, Симбирцев A.C., 2009; Гаджиев Н.Д., 2012, Косинец В.А., 2012).

В настоящее время доказана роль лимфатической системы как мощного дезин-токсикационного звена в организме (Бородин Ю.И. и др., 1999-2008, Авраменко Е.А.

и др., 2011). Установлено, что эндолимфатические инфузии лекарственных препаратов позволяют длительное время сохранять высокую концентрацию медикаментов в лимфатических сосудах и центральной лимфе (Бородин Ю.И., 2000-2008, Любарский М.С. и др., 2000, 2002; Белужников А.Б. и др., 2008). Отсюда, одним из перспективных подходов к лечению ряда острых и хронических воспалительных заболеваний относят лимфотропную терапию (Любарский М.С. и соавт., 2004-2006; Белужников А.Б. и др., 2009, Здзитовецкий Д.Э., Борисов Р.Н., 2010, Авраменко Е.А. и др., 2011). Однако до настоящего времени не дано патогенетическое обоснование действия лим-фотропной терапии при лечении острого разлитого перитонита.

Цель исследования: изучить особенности проявлений острого экспериментального разлитого перитонита при различных методах коррекции.

Задачи исследования:

1. Исследовать количественный и качественный состав лейкоцитов периферической крови и провести микроскопическое исследование брюшины крыс с острым разлитым перитонитом в динамике традиционной антибиотикотерапии и непрямой лим-фотропной терапии.

2. Изучить степень тяжести эндогенной интоксикации и активности воспаления у крыс с острым разлитым перитонитом по изменению содержания молекул средней массы и про- (IL-1 ß и TNF-a) и противовоспалительных (IL-4 и TGF-ßl) цитокинов в сыворотке крови в динамике традиционной антибиотикотерапии и непрямой лимфо-тропной терапии.

3. Исследовать изменение различных субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD24+ и CD25+) крови и тимуса (CD3+, CD4+ и CD8+) и параметров иммуно-регуляторных индексов в динамике традиционной антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии.

4. Изучить общее состояние животных и характер течения экспериментального разлитого перитонита в динамике традиционной антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии.

Научная новизна исследования

В результате проведенного исследования впервые установлено, что непрямая антибиотике- и иммуномодулирующая лимфотропная терапия способствует нормализации численности и клеточного состава периферической крови, ускоряет процесс смены популяции нейтрофилов в брюшине на макрофагальную, способствует восстановлению численности CD3+-, CD4+-, CD8+ и B-лимфоцитов памяти (CD24+-лимфоцитов) и баланс про- (IL-lß и TNF-a) и противовоспалительных (IL-4 и TGF-ßl) цитокинов, что свидетельствует о ее эффективности в коррекции проявлений воспаления у животных с острым разлитым перитонитом.

Показано, что непрямая антибиотико- и иммуномодулирующая лимфотропная терапия в отличие от традиционной антибиотикотерапии эффективнее снижает степень эндогенной интоксикации у крыс с острым разлитым перитонитом, о чем свидетельствуют снижение уровней молекул средней массы и провоспалительных цитокинов в сыворотке крови животных.

Показано, что использование непрямой антибиотико- и иммуномодулирующей лимфотропной терапии способствует эффективной коррекции эндогенной интоксикации и мобилизации иммунной системы крыс с острым разлитым перитонитом, что приводит к улучшению интегрального показателя общего состояния и снижает летальность животных.

Практическая значимость

Дано экспериментальное обоснование эффективности способа непрямой антибиотике)- и иммуномодулирующей лимфотропной коррекции иммуновоспалительных реакции и эндогенной интоксикации при остром разлитом перитоните у животных, предполагающий использование антибиотиков в меньших концентрациях.

Результаты исследования показали, что дополнительная к базовому лечению комплексная антибиотико- и иммуномодулирующая лимфотропная терапия повышают эффективность лечения и выживаемость крыс при остром разлитом перитоните.

Результаты исследования могут явиться теоретической основой для дальнейших экспериментальных и клинико-лабораторных исследований, необходимых для разработки новых подходов в области лимфотропной терапии не только острого разлитого перитонита, но, возможно, и других патологий инфекционной и неинфекционной этиологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Непрямая антибиотико- и иммуномодулирующая лимфотропная терапия крыс с острым разлитым перитонитом в отличие от традиционной антибиотикотерапии способствует: а) нормализации численности и клеточного состава периферической крови; б) активации смены популяции нейтрофилов в брюшине на макрофагальные клетки; в) восстановление численности СОЗ+-, СП4+-, СЭ8+ и В-лимфоцитов памяти (СП24+-лимфоцитов); г) снижению уровня провоспалительных (1Ь-1р и ТОТ-и) и повышение противовоспалительных (1Ь-4 и ТСР-Р1) цитокинов в сыворотке крови, что свидетельствует о снижении активности воспалительного процесса у животных и риска развития его осложнений.

2. В динамике непрямой антибиотико- и иммуномодулирующей лимфотропной терапии крыс с острым разлитым перитонитом происходит повышение интегрального показателя общего состояния и снижение их летальности до 44% при 84% смертности у животных без лечения за счет восстановления клеточного иммунитета, баланса про-и противовоспалительных цитокинов и снижения эндогенной интоксикации организма.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы внедрены в научно-исследовательский процесс отделов экспериментальной и клинической лимфологии ФГБУ «НИИ клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (г. Новосибирск).

Результаты исследования внедрены и используются в учебном процессе кафедры общей хирургии стоматологического факультета ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет МЗ РФ по теме: «Гнойные заболевания полостей».

Апробация работы

Основные положения диссертации и результатов исследования доложены и обсуждены на: конференции молодых ученых и аспирантов ФГБУ НИИ экспериментальной и клинической лимфологии СО РАМН (Новосибирск, 2012); XI Международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 6 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 45 таблицами, 9 рисунками и 1 схемой. Состоит из введения, 4 глав, выводов,

практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 160 работ, из них 129 отечественных и 31 иностранный источник.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 235 крысах-самцах линии Вистар массой 180— 200 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария ЦНИЛ Новосибирского государственного медицинского университета МЗ РФ в едином температурном и световом режиме со свободным доступом к воде и пище.

Модель острого разлитого перитонита. Для моделирования острого разлитого перитонита в брюшную полость крыс вводили 1,5 мл 5% каловой взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия по С. С. Ременнику (1965) в модификации В.А. Лаза-ренко и др. (2008). При бактериологическом исследовании вводимой взвеси высевались кишечная палочка, стафилококки, протей в количестве 106"7 микробных тел/мл.

Экспериментальные животные были разделены на группы:

I (контроль) группу составили 10 крыс, которым внутрибрюшинно вводили 1,5 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия;

II группа. Данную группу составили 55 крыс с острым разлитым перитонитом (ОРП) без лечения.

III группа. В этой группе были 55 крыс с ОРП, которым ежедневно в течение 7 сут внутримышечно (в латеральную область большой берцовой мышцы) вводили антибиотик цефалоспоринового ряда «Цефтриаксон» в составе 1-го болюса.

IV группа. В данной группе были 40 крыс с ОРП, которым проводили в течение 7 сут ежедневные межостистые подкожные инъекции (в грудном отделе позвоночника) в составе 2-го болюса.

В состав 1-го болюса входили: 10 % раствор лидокаина, 32 ЕД лидазы, антибиотик «Цефтриаксон» из расчета 50 мг/кг веса крысы; В состав 2-го болюса входили-10% раствор лидокаина, 32 ЕД лидазы, антибиотик «Цефтриаксон» из расчета 25 мг/кг веса крысы (вдвое меньше, чем у крыс III группы), иммуномодулятор «Глуток-сим» из расчета 2 мг/кг в одной инъекции. Объем, вводимых болюсов составил 1 мл.

Животных выводили из эксперимента на 1, 3, 5 и 14 сут наблюдения посредством декапитации. Выведение животных из эксперимента, внутрибрюшинные инфекции каловой взвеси и все манипуляции проводили под гексеналовым наркозом.

Исследования проводили в соответствии с «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1987 г.), Федеральному закону о защите животных от жестокого обращения от 01.01.1997 г., а также Директиве 86/609 ЕЭС, основанной на тексте соглашения «Dr. Robert Hubrecht, Current EU Legislation Controlling Animal Experiments». Проведение экспериментальных работ выполнены с одобрения этического комитета ФГБУ «НИИ клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН.

В качестве материала исследования использовали периферическую кровь, сыворотку крови, тимус и брюшину животных.

В динамике исследования проводили оценку клинического состояния и летальность экспериментальных животных. Для количественной оценки общего состояния (ОС) экспериментальных животных использовали критерии, предложенные С.Б. Фадеевым и Д.В. Волковым (2002). Данный метод основан на балльной оценке выраженности следующих показателей: 1) двигательная активность, 2) реакция на звуко-

вой и 3) болевой раздражитель, 4) питьевой и 5) пищевой режим. В каждом случае в зависимости от выраженности показателя выставляли баллы: отсутствие признака — О баллов; слабовыраженный признак — 1 балл; умеренно выраженный признак — 2 балла и активный (соответствующий норме) признак — 3 балла. Затем рассчитывали интегральный показатель ОС животных по формуле: ОС=£баллов по s критериям / 5. Данное исследование проводили совместно с сотрудниками ЦНИЛ ГБОУ ВПО НГМУ Минздрава РФ М.В. Битхаевой и Т.А. Кунц.

Подсчет количества лейкоцитов в стабилизированной гепарином крови крыс (5 ЕД/мл) проводили в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу рассчитывали на мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Проводился подсчет не менее чем 200 клеток с учетом рекомендаций по гематологическому и иммунологическому обследованию (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990, Луговская С.А. и др., 2002, Назарен-ко Г.И., Кишкун A.A., 2006).

Степень эндогенной интоксикации экспериментальных животных оценивали по содержанию молекул средней массы (МСМ) и по изменению уровней про- и противовоспалительных цитокинов.

Для определения уровня МСМ использовали скрининговый метод определения по Н.Г. Габриелян и др. (1985). Регистрировали спектрограммы супернатанта плазмы крови в монохроматическом световом потоке с длиной волны 254 (МСМ254) и 280 нм (МСМ28о)- Измерения проводились на спектрофотометре СФ-2000. Результаты выражали в условных оптических единицах (усл.ед.).

Содержание IL-lß проводили с использованием коммерческого набора IL-lbeta Rat ELISA Kit (фирма «Abcam», USA). Содержание TNF-a проводили с использованием коммерческого набора Rat TNFa ELISA Kit (фирма «Thermo Fisher Scientific Inc.», USA). Содержание IL-4 проводили с использованием коммерческого набора Rat IL-4 ELISA Kit (фирма «RayBiotech, Inc.», Австрия). Содержание TGF-ßl в сыворотке крови выполняли иммуноферментным методом с использованием коммерческих тест-систем «DGR International inc.» (Германия).

Все измерения цитокинов проводили с помощью автоматического вертикального фотометра «Multiscan Spectrum» («Thermo Fisher Scientific», USA) согласно инструкциям тест-систем. Количественное содержание цитокинов выражали в пкг/мл.

Иммуноцитохимический анализ лейкоцитов крови, предварительно освобожденных от эритроцитов и иммобилизированных на миллипоровых фильтрах, проводили непрямым стрептавидиновым методом (использована система визуализации Novocastra™ RTU, RE7100-K). Демаскировку исследуемых кластеров дифференци-ровки в клетках на цитологических препаратах проводили при использовании в качестве пермеабилизирующего реагента тритон Х-100: 0,3 % раствора в фосфатном буфере, в течение 2-х минут (Bibeau F. et al., 2006; Ramos-Vara J.A., 2005).

Для исследования иммунологического фенотипа иммунных клеток использовали мышиные моноклональные антитела к различным кластерам дифференцировки клеток («Becton Dickinson», США): к CD3 (Mouse Anti-Rat; Isotype: Mouse IgG3, к; клон G4.18), CD4 (Mouse Anti-Rat; Isotype: Mouse IgG2a, к; клоп 0X38), CD8 (Mouse Anti-Rat; Isotype: Mouse IgGl, к; клон OX-8); CD24 (Mouse Anti-Rat; Isotype: Mouse IgM, к; клон HIS50), CD25(Mouse Anti-Rat - IL-2R a chain; Isotype: Mouse IgGl, к; клон OX39). Препараты клеточных культур инкубировали в течение 1 часа с «первыми» антителами к CD3, CD4, CD8,CD24, CD25 и далее со «вторыми» антимышиными биотинилированными антителами лошади (Novocastra) во влажной камере (30 мин), со стрептавидин-пероксидазным комплексом (30 мин). Окраску препаратов проводили в растворе диами-

нобензидина (DAB) с субстратом, содержащим Н202, (использовали стандартный BD DAB Kit).

Иммуноцитохимическую окраску клеток проводили в соответствии с общепринятыми стандартами указанной методики (Bibeau F. et al., 2006; Ramos-Vara J.A., 2005) и в соответствии с инструкциями и рекомендациями, прилагаемыми ко всем моноклональ-ным антителам и системе визуализации Novocastra. После окраски мембраны с окрашенными клетками докрашивали метиловым зеленым (для визуализации ядер клеток), промывали в дистиллированной воде и помещали по покровное стекло.

Анализ полученных цитологических препаратов проводили на светооптическом микроскопе при увеличении х400 и хЮОО. Оценку содержания различных субпопуляций лимфоцитов в крови проводили по количеству клеток, в которых выявляли оцениваемый кластер дифференцировки.

Тяжесть нарушений в иммунной системе и состояние иммунного статуса оценивали по изменению величины иммунорегуляторного индекса (ИРИ, ИРИ= CD4+/CD8+) в крови. Тяжесть нарушений в иммунной системе и состояние иммунного статуса оценивали по изменению соотношения CD4+/CD8+ в Т-зависимых зонах тимуса (в медуллярной зоне), условно обозначенного как иммунорегуляторный коэффициент (ИРК).

Характер течения ОРП оценивали макроскопически при вскрытии брюшной полости крыс, а также производили микроскопическое исследование брюшины. Для микроскопического исследования кусочки ткани брюшины фиксировали в 10% нейтральном формалине. Фиксированные образцы ткани промывали под проточной водой; на аппарате АТ-4 осуществляли проводку материала, который в дальнейшем заливали в парафин и готовили блоки. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и заключали в бальзам.

Статистическая обработка результатов исследования осуществлялась с помощью лицензированных пакетов прикладных программ «Statistica 7.0» и «Microsoft Ес-xel 7.0». При этом определяли средние арифметические величины (М), стандартную ошибку средней величины (т). Проводили проверку данных по характеру распределения с помощью программы «Statistica 7.0». Оценку вероятности достоверности различий двух сравниваемых средних арифметических величин производили по t-критерию Стьюдента. При множественных сравнениях применяли дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса, а также проводили корреляционный анализ между исследуемыми показателями. Различия сравниваемых показателей считались достоверными при р<0,05.

Эксперименты и специальные лабораторные исследования проведены в ФГБУ «НИИ клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (г. Новосибирск) и на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава РФ.

Научные результаты и выводы, полученные при проведении диссертационного исследования, получены автором самостоятельно.

Диссертантом лично осуществлено: формулирование цели, разработка конкретных задач работы и плана их выполнения; проведение экспериментального исследования; обработка экспериментального материала: создание компьютерной базы, статистическая обработка полученных данных и интерпретация результатов; написание текста диссертации и автореферата.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общее состояние животных и характер развития острого разлитого перитонита до и после традиционной антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии

Начиная с первых суток развития ОРП, крысы были малоподвижными, заторможенными, группировались в углу клетки, выглядели вялыми, апатичными к еде. У животных отмечались частое поверхностное дыхание, сухость кожи и взъерошен-ность шерсти. В динамике развития ОРП клинические проявления крыс без лечения усугублялись, о чем свидетельствуют результаты интегральной оценки общего состояния крыс, представленных в табл. 1. Так, величина интегральной оценки общего состояния крыс II группы в динамике развития ОРП неуклонно снижалась и к 14 сут наблюдения снизилась в 4,3 раза относительно 1 сут наблюдения.

При проведении традиционной антибиотикотерапии величина интегрального показателя общего состояния крыс с ОРП (III группа) на 1 и 3 сут также снижалась, но менее значимо, чем у животных II группы. К 14 сут интегральный показатель общего состояния крыс III группы был в 4,5 раза выше, чем у крыс с ОРП без лечения (II группа). Через 1 сут после начала проведения непрямой лимфотропной терапии (IV группа) величина интегрального показателя общего состояния крыс с ОРП была достоверно ниже, чем у контрольных животных. Однако к 5 и 14 сут наблюдения величина интегрального показателя общего состояния крыс IV группы была выше, чем у крыс II и III группы (табл. 1).

Таблица 1

Общее состояние крыс с ОРП без лечения и в динамике антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии_

Группы животных Общее состояние крыс в баллах (М±т)

1 сут 3 сут 5 сут 14 сут

I. Контроль (п=8) 3,0±0,09

II (п=25) 1,7±0,3* 1,1±0,3* 0,6±0,03* 0,4±0,07*

III (п=25) 1,5±0,5* 1,3±0,2* 1,6±0,07*,** 1,8±0,04*,**

IV (п=25) 1,7±0,2* 1,8±0,4*,** 2,1±0,1*,**,х 2,4±0,08*,**,х

Примечание: п - количество животных в группе; * - статистические различия по сравнению с показателями контрольной группы, ** - по сравнению с данными у крыс II группы и х - по сравнению с данными у крыс III группы

Через 1 сут после индукции ОРП макроскопически отмечено полнокровие брюшины с наличием мелкоточечных кровоизлияний на ее париетальном и висцеральном листках с наличием смешанного фибринозно-гнойного экссудата распространённого характера. Кроме того, во всех отделах брюшной полости отмечалось вздутие петель кишечника с вялой перистальтикой. Таким образом, макроскопическая картина в брюшной полости крыс соответствовала распространенному фибринозно-гнойному перитониту.

На ранних сроках (1 и 3 сут) после проведения антибиотикотерапии (III группа) макроскопическая картина брюшной полости крыс с ОРП практически не отличалась от таковой у нелеченных животных II группы. В то же время, у крыс этой группы объем жидкости в брюшной полости на 5 и 14 сут развития ОРП был заметно меньше, чем у животных II группы. К 14 сут проведения непрямой лимфотропной терапии (IV группа) в брюшной полости крыс заметно снижался объем жидкости, и была отмече-

на гиперемия брюшины слабой выраженности.

При анализе гистологической картины брюшины крыс основное внимание уделяли изменению численности нейтрофилов (Нф) и макрофагов (Мф). Результаты микроскопического исследования ткани брюшины показали, что через 1 сут после индукции ОРП в брюшине крыс II группы численность Нф в среднем составила 51,6±3,24 клеток в поле зрения (кл/п.зр.), что было в 25,8 раза выше, чем у животных контрольной группы (2,0±0,5 кл/п.зр.). В дальнейшем, численность Нф в брюшине крыс этой группы постепенно снижалась и к 14 сут составила 11,8±3,5 кл/п.зр., что в 5,9 раза была выше контрольных значений. При проведении антибиотикотерапии численность Нф в брюшине крыс с ОРП снижалась и к 14 сут составила 7,1±2,2 кл/п.зр., что статистически значимо была ниже, чем у животных II группы, но оставалась выше, чем в контроле. После непрямой лимфотропной терапии у крыс IV группы численность Нф в брюшине крыс с ОРП снижалась более значимо. Так, к 5 и 14 сут их количество в брюшине крыс IV группы было соответственно в 1,5 и 1,6 раза ниже, чем у животных III группы. В то же время число Нф в брюшине крыс IV группы к 14 сут было в 2,2 раза выше, чем у животных контрольной группы (рис. 1).

Нсюрофилы

I □ Коетроль ■ II ШП □ IV груш

¡ О Контроль ■ П П1П □ IV группа |

Рис. 1. Количество нейтрофилов и макрофагов в брюшине крыс разных групп * - достоверные различия по сравнению с показателями у крыс контрольной группы; ** - по сравнению с данными у животных II группы и х - по сравнению с данными у крыс III группы

Через 1 сут после индукции ОРП в брюшной полости крыс II группы численность Мф в среднем составила 9,7±1,3 кл/п.зр., что была в 1,4 раза выше (р=0,05), чем у животных контрольной группы (6,8±0,4 кл/п.зр.). В дальнейшем, численность Мф в брюшине крыс данной группы постепенно возрастала и на 14 сут наблюдения составила 16,3±1,5 кл/п.зр., что была в 2,4 раза выше контрольных значений (р=0,006). При проведении антибиотикотерапии численность Мф в брюшине крыс с ОРП (III группа) также возрастала и к 14 сут в среднем составила 19,4±1,1 кл/п.зр., что достоверно была выше, чем у животных I и II группы. После непрямой лимфотропной терапии у крыс IV группы численность Мф в брюшине крыс с ОРП неуклонно возрастала и достигла до максимальных значений (35,4±1,7 кл/п.зр.) к 14 сут исследования. Отсюда видно, что у крыс IV группы смена популяции Нф на Мф происходит значительно активнее, чем у животных II и III группы (рис. 1).

В динамике развития ОРП крысы II группы постепенно погибали и к концу срока исследования (14 сут) летальность в этой группе животных составила 84%. При проведении традиционной антибиотикотерапии (III группа) к 14 сут исследования летальность крыс с ОРП составила 64%, тогда как после непрямой лимфотропной терапии летальность составила 44% (рис. 2).

% 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

—♦—II —•—III —*— IVrpyranj

Рис. 2. Летальность животных с экспериментальным разлитым перитонитом в динамике антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии

* - достоверные различия по сравнению с показателями II группы и х — по сравнению с данными у крыс III группы

Таким образом, при введении в брюшную полость крыс каловой взвеси развивается воспалительный процесс, соответствующий распространенному фибринозно-гнойному перитониту, которая характеризуется фазовым течением воспаления: отеком, гиперемией, эмиграцией нейтрофилов. При отсутствии лечения крыс с ОРП наблюдали постепенное ухудшение их общего состояния и высокую летальность. При проведении традиционной антибиотикотерапии отмечено снижение отека и объема экссудации. На фоне улучшения общего состояния летальность крыс с ОРП после проведения традиционной антибиотикотерапии снизилась в 1,3 раза. После проведения непрямой лимфотропной терапии у крыс с ОРП макроскопически отмечено снижение отека и экссудации, а микроскопически - более активная смена популяции нейтрофилов на макрофаги. Кроме того, судя по величине интегрального показателя, наблюдали улучшение общего состояния крыс данной группы, и летальность среди них снизилась в ] ,9 раза.

Изменение численности и клеточного состава периферической крови крыс с острым разлитым перитонитом в динамике антибиотике- и непрямой

лимфотропной терапии

Результаты исследования показали, что развитие ОРП сопровождается выраженным лейкоцитозом (рис. 3). Так, у крыс контрольной группы (I группа) общая численность лейкоцитов крови в среднем составляла 7,7±0,2 xl09/L и варьировала от 6,7 до 8,4 x109/L. В динамике развития ОРП общее количество лейкоцитов крыс (II группа) значительно возрастало, достигая до максимальных значений к 5 сут наблюдения, и сохранялось на высоком уровне вплоть до 14 сут. Так, через 1 сут после инициации ОРП общее количество лейкоцитов крови крыс составило 13,5±0,7 xl09/L, что в 1,75

1 3 5 14 сут

раз было выше, чем у крыс контрольной группы. К 3 сут наблюдения общая численность лейкоцитов возрастала до 14,6±0,8 х109/Ь, а к 5 сут — до 1 5,9±0,8 xl 0®/L, что соответственно было в 1,9 и 2,1 раза выше, чем у крыс контрольной группы. К 14 сут наблюдения общая численность лейкоцитов крови крыс с ОРП в среднем составила 11,6±0,4 xl09/L, что была достоверно ниже, чем в предыдущих сроках, но была выше, чем у крыс контрольной группы.

В динамике антибиотикотерапии у крыс Ш-ей группы общее количество лейкоцитов снижалось. Так, на 1 сут после начала антибиотикотерапии общая численность лейкоцитов крови крыс практически не отличалась от этих же данных у животных II группы и в среднем составила 13,05±0,7 xl09/L. В то же время, начиная с 3 сут наблюдения, у крыс III группы общее количество лейкоцитов крови снижалось до 12,3±0,6 x109/L, к 5 сут-до 11,9±0,6 xl09/L, а к 14 сут - до 10,1±0,3 xl09/L. На всех сроках наблюдения общее количество лейкоцитов крови крыс III группы было достоверно ниже, чем у животных с ОРП (II группа) (рис. 3).

14 сут

□ I. Контроль ■ П группа □ Ш группа □ IV группа

Рис. 3. Изменение общего количества лейкоцитов крови крыс с острым разлитым перитонитом в динамике антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии

* - достоверные различия по сравнению с показателями у крыс I группы (контроль); * * - по сравнению с данными у животных II группы и х - по сравнению с данными у крыс III группы

Общее количество лейкоцитов крови крыс IV группы после непрямой лимфотропной терапии неуклонно снижалось. Так, через 1 сут после начала лечения общее количество лейкоцитов крови крыс составило 12,1±0,3 х109/Ь, к 3 сут - 11,3±0,6 xl09/L, к 5 сут - 9,8±0,6 xl09/L и к 14 сут - 8,3±0,5 х109/Ь. На всех сроках наблюдения общее количество лейкоцитов крови крыс данной группы было достоверно ниже, чем у животных с ОРП (II группа). К концу срока исследования (14 сут) общее количество лейкоцитов крови крыс II и III групп оставалось на достоверно высоком уровне, чем у крыс контрольной группы (рис. 3).

Результаты исследования показали, что увеличение общей численности лейкоцитов у крыс с ОРП происходит за счет роста как относительного, так и абсолютного

количества всех клеточных элементов крови - Нф, эозинофилов (Эоз), лимфоцитов (Лф) и моноцитов (Мон) (рис. 4).

Развитие ОРП у крыс сопровождалось увеличением как относительной, так и абсолютной численности Нф крови крыс (II группа). Так, абсолютное количество Нф крови крыс II группы достоверно возрастало в 2,6, 3,1, 3,9 и 3,8 раза соответственно на 1, 3, 5 и 14 сут развития ОРП. В динамике антибиотикотерапии у крыс Ш-ей группы численность Нф крови, начиная с 3 сут наблюдения, снижалась. Так, у крыс III группы на 3, 5 и 14 сут после начала лечения абсолютное количество Нф крови было ниже в 1,4, 2,1 и 2,07 раза по сравнению с соответствующими данными у животных II группы без лечения. Однако у крыс III группы на всех сроках наблюдения абсолютная численность Нф крови была достоверно выше, чем у крыс контрольной группы (рис. 4).

1 3 5 14сут 1 3 5 14 сут

□ I. Контроль «Игр, а Шгц РГУгр] I □ I. Контроль _■ [] гр. Q Шгр. □ IV гр.

0,9 0,8

eä 0,5

Эозинофнлы

□ I. Контроль М П гр. И Ш гр. □ ГУ гр. ;

Лимфошпы

14 сут

□ I. Кошроль ■ IIгр. ИШгр. ОГУгр.

Рис. 4. Абсолютное количество клеточных элементов крови крыс с острым разлитым перитонитом в динамике антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии

* - достоверные различия по сравнению с показателями у крыс I группы (контроль); ** - по сравнению с данными у животных II группы и х - по сравнению с данными у крыс III группы

Абсолютное количество Нф крови крыс IV группы после непрямой лимфотроп-ной терапии закономерно снижалось до конца срока наблюдения. Так, на 1, 3, 5 и 14 сут после начала лечения абсолютное количество Нф крови было достоверно ниже в 1,25, 1,4, 2,45 и 3,4 раза по сравнению с соответствующими данными у животных II группы. К концу срока наблюдения (14 сут) у крыс IV группы общее количество Нф крови практически нормализовалось (рис. 4).

В динамике развития ОРП также возрастала относительная и абсолютная численность Мон крови крыс (II группа). Так, абсолютное количество Мон крови крыс этой группы достоверно возрастало в 3,95, 5,5, 7,5 и 8,5 раза соответственно на 1, 3, 5 и 14 сут наблюдения. Проведение традиционной антибиотикотерапии способствовала к снижению численности Мон крови крыс III группы, начиная с 3 сут наблюдения. Так, численность Мон крови крыс этой группы на 3, 5 и 14 сут соответственно в 1,57, 3 и 2,8 раза была ниже, чем у крыс с ОРП без лечения (II группа). При этом в динамике антиобиотикотерапии численность Мон у крыс данной группы оставалась выше, чем у животных контрольной группы (рис. 4).

Общее количество Мон крови крыс IV группы после межостистых подкожных инъекций антибиотика с иммуномодулятором (непрямая лимфотропная терапия) также как и Нф снижалось до конца срока наблюдения. Так, на 3, 5 и 14 сут после начала лечения абсолютное количество Мон крови было достоверно ниже в 11,8, 3 и 8,5 раза по сравнению с соответствующими данными у животных II группы. К концу срока наблюдения (14 сут) общее количество Мон крови крыс IV группы не отличалось от их численности у животных контрольной группы (рис. 4).

В ходе развития ОРП в крови крыс (II группа) до конца срока наблюдения (14 сут) отмечен рост как относительной, так и абсолютной численности Эоз. Так, абсолютная численность Эоз крови крыс этой группы на 1, 3, 5 и 14 сут развития и течения ОРП была в 2,6, 3,8, 5,38 и 5,38 раза выше, чем у животных контрольной группы. При проведении антибиотикотерапии численность Эоз крови крыс III группы также как и другие клеточные элементы, постепенно снижалась, на 14 сут наблюдения оставалась выше контрольных величин. Так, абсолютная численность Эоз крови крыс этой группы на 1, 3, 5 и 14 сут соответственно в 1,1, 1,25, 2,3 и 1,75 раза была ниже, чем у крыс с ОРП (II группа). При этом при антиобиотикотерапии численность Эоз крови крыс данной группы на всех сроках наблюдения оставалась достоверно высокой, чем у животных контрольной группы. Общее количество Эоз крови крыс IV группы после непрямой лимфотропной терапии снижалось до конца срока наблюдения. Так, на 3, 5 и 14 сут после начала лечения абсолютное количество Эоз крови было достоверно ниже в 1,66, 2,3 и 5,38 раза по сравнению с соответствующими данными у животных II группы. К концу срока наблюдения (14 сут) общее количество Эоз крови крыс IV группы не отличалось от их численности у животных контрольной группы (рис. 4).

Развитие ОРП сопровождалось ростом абсолютных значений численности Лф в крови крыс. Так, на 1, 3, 5 и 14 сут развития ОРП абсолютное количество Лф крови крыс II группы соответственно было в 1,5, 1,48, 1,46 и 1,6 раза выше, чем у животных контрольной группы. В динамике антибиотикотерапии абсолютная численность Лф крови была достоверно выше, чем у животных контрольной группы и не отличалась от их количества у крыс II группы. Абсолютная численность Лф крови крыс IV группы на всех сроках наблюдения была достоверно выше, чем у животных контрольной. И только на 14 сут наблюдения количество Лф крови крыс IV группы была достоверно ниже, чем у животных II группы (рис. 4).

Таким образом, судя по результатам исследования, при индукции ОРП развивается острый воспалительный процесс с выраженными изменениями картины периферической крови. Как известно, рост общего количества лейкоцитов крови при перитоните является классическим проявлением экссудативно-деструктивного воспаления в ответ на массивное поступление антигенов, прежде всего, бактерий и их компонентов (Маянский Д.Н., 2007), которое наблюдается при парезе и повреждении кишечника (Суковатых Б.С. и др., 2012). В нашем случае индуктором воспаления стали бактерии и их компоненты, содержащие в каловой массе (Лазаренко В.А. и др., 2008).

Изменение степени тяжести эндогенной интоксикации и активности воспаления до и после традиционной антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии крыс с острым разлитым перитонитом

В настоящем исследовании, для оценки уровня эндогенной интоксикации, ввиду своей доступности и простоты измерения были выбраны следующие маркеры: молекулы средней массы и провоспалительные цитокины IL-lß и TNF-a в сыворотке крови крыс разных групп.

В динамике развития ОРП у крыс II группы уровень сывороточной МСМ280 возрастал, достигая максимума к 5 сут наблюдения. Так, на 1, 3, 5 и 14 сут содержание МСМ280 в сыворотке крови крыс этой группы было в 1,9, 2,3, 3,0 и 1,9 раза выше, чем у животных контрольной группы. В динамике антиобиотикотерапии содержание МСМ280 в сыворотке крови крыс III группы увеличивалось, но было ниже, чем у животных II группы. Так, на 1, 3, 5 и 14 сут содержание МСМ280 в сыворотке крови крыс этой группы было в 1,9, 2,5, 2,1 и 1,3 раза выше, чем у животных контрольной группы. В сыворотке крови крыс IV группы, которым проводили непрямую лимфотроп-ную терапию, содержание МСМ280 на 1, 3 и 5 сут исследования было выше, а к 14 сут - равным по сравнению с этими данными у животных контрольной группы. Так, на 1, 3, 5 и 14 сут средние значения МСМ280 в сыворотке крови крыс этой группы составили соответственно 0,442±0,021, 0,565±0,027, 0,43 8±0,022 и 0,231±0,01 усл.ед. Отсюда видно, что на ранних сроках исследования (1, 3 и 5 сут) содержание МСМ28о в сыворотке крови крыс IV группы было достоверно выше, а к 14 сут - практически равными по сравнению с данными у животных контрольной группы (рис. 5).

В сыворотке крови крыс контрольной группы среднее значение молекулы средней массы (длина волны Х=254 нм) (МСМ254) составило 0,182±0,016 усл. ед. В динамике развития ОРП у крыс II группы уровень сывороточной МСМ254 закономерно возрастал, достигая максимума, как и МСМ280 к 5 сут наблюдения. Так, на 1, 3, 5 и 14 сут уровень МСМ254 в сыворотке крови крыс этой группы соответственно был в 2,3, 2,9, 3,5 и 2,1 раза выше, чем у животных контрольной группы. В динамике антиобиотикотерапии содержание МСМ254 в сыворотке крови крыс III группы к 3 сут увеличивалось, а затем снижалось, достигая к 14 сут до уровня контрольных величин. Так, на 1, 3, 5 и 14 сут содержание МСМ254 в сыворотке крови крыс этой группы в среднем составило 0,396±0,016, 0,542±0,027, 0,466±0,041 и 0,191±0,017 усл.ед. В сыворотке крови крыс IV группы, которым проводили непрямую лимфотропную терапию, содержание МСМ254 на 1, 3 и 5 сут исследования было выше, а к 14 сут — равным по сравнению с этими же данными у животных контрольной группы. Так, на 1, 3, 5 и 14 сут среднее значение МСМ254 в сыворотке крови крыс этой группы составил 0,449±0,018, 0,506±0,025, 0,355±0,031 и 0,174±0,016 усл.ед. (рис. 5).

Таким образом, результаты исследования и данные научной литературы свидетельствуют о том, что накопление в тканях и биологических жидкостях эндогенных

токсических субстанций, в том числе таких продуктов нормального или извращенного обмена веществ или клеточного реагирования как МСМ28о и МСМ254 характеризуют развитие СЭИ при ОРП (Матвеев С.Б. и др., 2003, Кчибеков Э.А., 2010, Кулигин A.B. и др., 2012).

Рис. 5. Содержание молекул средней массы в сыворотке крови крыс разных групп в динамике антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии

* - достоверные различия по сравнению с показателями у крыс I группы (контроль); ** - по сравнению с данными у животных II группы и х — по сравнению с данными у крыс III группы

Развитие СЭИ во многом связано с дефектом клеточного иммунитета, а также с теми процессами, которые определяют процессы деструкции в очаге воспаления, способствующие генерализации токсических продуктов в организме больных (Маянский Д.Н., 2007). В работе А.П. Власова и др. (2013) показано, что развитие СЭИ во многом связано с процессами свбодно-радикального окисления, обусловленного генерацией активных форм кислорода в процессе респираторного взрыва, в частности у нейтрофилов очага воспаления (Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007).

Попадание антигенов в организм, в нашем случае в брюшную полость в составе каловой массы, приводит к активации клеток т эНи, в частности Нф и Мф, которые составляют резидентный клеточный пул перитонеальной полости (Маянский Д.Н., 2007). Активация этих клеток бактериальными антигенами приводит к продукции ими целого ряда биологически активных веществ - медиаторов воспаления, которые стимулируют дифференцировку костномозгового кроветворения и выходу из костного мозга Нф, Лф и Мон и усиливают их миграцию в очаг воспаления. Прежде всего, дифференцировку костномозгового кроветворения и выходу из костного мозга клеток индуцируют такие медиаторы воспаления как гранулоцитарно-моноцитарные коло-ниестимулирующие факторы (ГМ-КСФ), 1Ь-3, источниками которых являются фагоцитирующие клетки (Калинина Н.М. и др., 2005, Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007).

Ключевая роль цитокинов в развитии ОРП не вызывает сомнений. В настоящей работе было установлено, что развитие ОРП сопровождается увеличением концентрации провоспалительных цитокинов 1Ь-1|Зи ТОТ-а, особенно, на ранних сроках (1 и 3 сут) исследования (рис. 6), что свидетельствует, с одной стороны, об активном течении воспалительного процесса, а с другой — о выраженности эндогенной интоксикации. Увеличение противовоспалительных цитокинов 1Ь-4 и ТОР-(31 на 5 и 14 сут

развития ОРП у крыс свидетельствует о «включении» компенсаторно-восстановительных процессов организма (рис. 6). На ранних сроках (1 и 3 сут) развития ОРП у крыс баланс цитокинов смещается в сторону увеличения провоспалитель-ных, а на поздних (5 и 14 сут) - противовоспалительных медиаторов.

Антибиотикотерапия крыс с ОРП (III группа) сопровождается повышением уровня как про-, так и противовоспалительных цитокинов. При этом в отличие от животных других групп у крыс III группы отмечается максимальное увеличение концентрации TGF-ßl к 14 сут наблюдения. Подобная картина, но менее значимая по выраженности изменения уровней про- и противовоспалительных цитокинов наблюдали в динамике непрямой лимфотропной терапии крыс с ОРП (IV группа) (рис. 6).

* * А

14 сут

_□ I. Контроль

I Игр, ашгр. пгугр.

□ I. Контроль ИПгр. ИШгр. РГУгр.

14 сут

□ I. Контроль И Пгр. НШгр. РГУгр. 1

450 400 350 300 I 250

I 200

150 100

□ I. Контроль

1Пгр. ПШгр. ПГУгр.

Рис. 6. Изменение содержания про- (IL-lß и TNF-а) и противовоспалительных (IL-4 и TGF-ßl) цитокинов в сыворотке крови крыс разных групп в динамике антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии

* - достоверные различия по сравнению с показателями у крыс I группы (контроль); * * - по сравнению с данными у животных II группы и х - по сравнению с данными у крыс III группы

В динамике антибиотикотерапии (III группа) и непрямой лимфотропной терапии (IV группа) отмечено снижение индексов соотношения про- и противовоспалительных цитокинов (1Ь-1|3/1Ь-4, 1Ь-1(3/ТОР-(31, Т№-а/1Ь-4 и Т№-а/ТСР-р1). Эти резуль-

таты свидетельствуют о снижении активности воспалительного процесса и СЭИ у крыс с ОРП при проведении им антибиотикотерапии (III группа) и непрямой лимфо-тропной терапии (IV группа). При этом исследование показало, что применение непрямой лимфотропной терапии эффективнее, чем антибиотикотерапия оказывает действие, направленное на нормализацию баланса про- и противовоспалительных ци-токинов.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о том, что экспериментальный ОРП характеризуется развитием экссудативно-деструктивного воспаления, которое сопровождается СЭИ. Ключевыми медиаторами развития развитием экссудативно-деструктивного воспаления при экспериментальном ОРП являются про-и противовоспалительные цитокины, которые в зависимости от их соотношения определяют функциональное состояние клеток специфического и неспецифического иммунитета.

В результате проведенного исследования в настоящей работе было установлено, что развитие ОРП у крыс сопровождается снижением количества CD3+-, CD4+- и С08+-лимфоцитов крови (табл. 2).

Проведение традиционной антибиотикотерапии и, особенно, непрямой лимфотропной терапии приводило к восстановлению численности CD3+- и CD4+ и снижению CD8+- субпопуляции лимфоцитов.

Кроме того, в динамике развития ОРП у крыс отмечено увеличение относительной численности B-лимфоцитов памяти (CD24+-лимфоцитов), а также рост количества регуляторных Т-клеток (С1)25+-лимфоцитов).

Численность CD24+ и CD25+ лимфоцитов в динамике развития ОРП возрастала и оставалась на высоком уровне до конца срока исследования. При проведении традиционной антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии происходило снижение количества С024+-лимфоцитов до контрольных величин. В то же время, традиционная антибиотикотерапия и, особенно, непрямая лимфотропная терапия способствовала еще большему росту количества С025+-лимфоцитов (табл. 2).

В динамике развития ОРП значение ИРИ неуклонно снижалось. Так, на 1,3,5 и 14 сут ИРИ крыс с ОРП (II группа) в среднем составил 1,25±0,1, 1,1±0,02, 0,9±0,10 и 0,8±0,10 усл.ед., что соответственно было в 1,28, 1,45, 1,77 и 2 раза ниже, чем у животных контрольной группы.

В динамике антибиотикотерапии ИРИ у крыс III группы закономерно увеличивался. Так, на 1, 3, 5 и 14 сут ИРИ крыс этой группы в среднем составил 1,4±0,1, 1,6±0,2, 2,2±0,3 и 1,9±0,1 усл.ед. соответственно. Отсюда видно, что через 3 сут после начала антибиотикотерапии ИРИ у крыс данной группы нормализовался, а к 5 и 14 сут - достоверно был выше, чем у животных контрольной группы. Подобная картина была выявлена у крыс IV группы, которым проводили непрямую лимфотропную терапию. Так, на 1, 3, 5 и 14 сут ИРИ крыс IV группы в среднем составил 1,5±0,2, 1,6±0,01, 1,9±0,01 и2,1±0,1 усл.ед. соответственно.

Таким образом, результаты исследования показали, что развитие ОРП у крыс сопровождается снижением количества CD3+-, CD4+- и С08+-лимфоцитов крови. Отсюда, видно, что развитие ОРП у крыс характеризуется снижением ИРИ. В динамике развития ОРП у крыс отмечено увеличение относительной численности В-лимфоцитов памяти (С024+-лимфоцитов), а также рост количества регуляторных Т-клеток (С025+-лимфоцитов). Эти результаты свидетельствуют о снижении клеточного звена иммунитета при индукции ОРП у крыс с косвенным подтверждением активации гуморального звена иммунитета.

Таблица 2

Изменение количества разных субпопуляции лимфоцитов крови крьтс с острым

разлитым перитонитом в динамике антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии, % (М±гп)__

Клетки Группы животных Срок исследования, сут

1 | 3 | 5 | 14

CD3+ I. Контроль (п=8) 54,3±3,3

П (п=40) 42,5±1,9 Рп 1=0.005 39,2±2,3 Pn-i=0,001 36,8±1,7 PII-I<0,001 35,7±1,6 pni<0,001

III (п=40) 45,5±1,8 Pm.rO,02 44,3±1,2 Рш-1=0,01 Pin-if=0.04 48,7±2,2 pra-^O^Ol 53,2±1,4 рш-ц<0,001

IV (п=40) 44,6±1,4 piv-rO,01 45,3±1,9 Piv-i=0,02 Pn-u=0.03 50,6±2,2 piv-u<0,00] 56,8±2,6 Piv-rr<),001

CD4+ I. Контроль (п=8) 33,6±0,8

II (п=40) 23,4±0,6 PII-I<0,001 20,4±1,3 Рп-1<0.001 17,4±0,8 РП-1<0.001 16,3±0,7 рп.<0,001

III (п=40) 25,5±1,1 рш-|<0.001 25,5±0,9 Рш.1<0,001 Рш-п=0,003 30,6±0,9 Рш-1=0,01 Рш-ц<0,001 30,8±1,0 pmj-0,005 рга.п<0,001

IV (п=40) 26,1±0,8 PIV-I<0,001 Piv-zi=0,005 27,9±1,2 piv-i<0,001 Р,„.1,<0,001 33,1±1,3 Piv-n<001 35,3±1,4 prv.n<001 p,v-m<0,001

CD8+ I. Контроль (п=8) 21,8±1,1

II (п=40) 19,5±1,3 18,7±1,1 pn-i=0,03 19,2±0,9 Рп-1=0.05 20,2±0,9

III (п=40) 19,6±1,9 18,3±2,21 18,0±2,7 16,1±0,6 Рш-1=0,002 Ршп<0,001

IV (п=40) 18,7±1,8 17,3±0,8 рм=0,003 17,3±0,6 Prv-r=0,003 Prv-u=0,05 16,8±0,4 P1V-1=0,001 Pt\'-n=0,002

CD24+ I. Контроль (п=8) 25,5±0,9

II (п=40) 32,9±1,6 Рп.1<0,001 33,6±3,2 Рп-гО.03 35,4±1,8 Рп-1<0,001 37,1±1,5 pn-i<0,001

III (п=40) 31,0±1,7 рш-ГО.ООб 30,1±1,7 Рш-1=0,02 27,1 ±0,97 Pm-ii=0,0005 27,1±1,2 Рт-П<0,001

IV (п=40) 29,1 ±0,8 р™=0,003 Pjv-Ü=0,02 29,0±1,7 piv-i=0,05 25,3±1,1 prv-u<0,001 24,1±1,3 prv-n<0,001 Prv-nfO.OS

CD25+ I. Контроль (п=8) 3,8±0,3

II (п=40) 5,1±0,2 Рп .[=0,002 5,9±0,3 Рп.|<0,001 6,1±0,5 Рп-1=0,001 7,2±0,7 Рп [<0,001

III (п=40) 5,8±0,2 pm-i<0,001 Рш-п=О,01 6,2±0,3 P,I,J<0.001 8,8±0,4 Pm-I<0,001 Рт.п<0.001 9,7±0,4 Pni-^OjOOl Рт-п<0,001

IV (п=40) 7,2±0,3 p,v.,<0,001 piv-n<0,001 pw-in<0,001 8,7±0,6 prv-i<0,001 РП-П<0,001 Piy-ni=0,002 11,8±0,6 Piv-I<0,001 Piv-u<0,001 Piv-m<0,001 13,5±0,6 prv.i<0,001 piv.n<0,001 Piv-iii<0,001

Примечание: р - статистические различия между данными у крыс сравниваемых

групп на соответствующих сроках исследования; В скобках — число животных в группах; На каждом сроке исследования были по 10 крыс

Кроме того было показано, что величина ИРК тимуса снижалась при развитии ОРП за счет возрастания количества СЭ8 ^-лимфоцитов при сохранении количества С04+-

лимфоцитов на уровне контрольных величин. Это может свидетельствовать как об определенной «консервативности» тимуса в отношении механизмов, регулирующих процессы дифференцирования тимоцитов в С04+-фепотипы при ОРП, так и о более быстрой эмиграции Т-хелперов из тимуса в кровяное русло при указанном патологическом процессе.

Для уточнения механизмов развития ОРП и влияния традиционной антибиоти-котерапии и непрямой лимфотропной терапии проводили анализ корреляционных связей между изучаемыми параметрами. При проведении корреляционного анализа результатов учитывали критическое значение коэффициента корреляции, которое при выборке объемом 10 объектов исследования составляет 0,648.

Результаты корреляционного анализа свидетельствовали о тесных прямых взаимосвязях между изменениями содержания провоспалительных цитокинов (1Ь-1р, ТЫБ-а) и основными их продуцентами — лейкоцитами крови, особенно, Мон, Нф и Лф крови в динамике развития ОРП у крыс.

В динамике развития ОРП у крыс установлены тесные прямые корреляционные связи между содержанием провоспалительных цитокинов (1Ь-1 [3, ТЫР-а) и субпопуляциями Лф СОЗ+, С04+ и СБ8+ и С024+.

В то же время у крыс наблюдали усиление положительных связей между численностью лейкоцитов и их клеточных элементов и противовоспалительными цито-кинами (1Ь-4 и ТОР-р1) на поздних сроках развития ОРП, что свидетельствует об их участии в процессах заживления и/или репарации. Кроме того, статистически значимые связи между относительной численностью С025+-лимфоцитов крови и уровнями сывороточного 1Ь-4 свидетельствуют о роли этих клеток в компенсаторно-восстановительных процессах при ОРП.

Антибиотикотерапия и непрямая лимфотропная терапия крыс с ОРП приводила на ранних сроках наблюдения к ослаблению связей между провоспалительными ци-токинами и метками продуцентами (Мон, Нф и разные субпопуляции Лф).

В результате корреляционного анализа были установлены тесные прямые связи между общим количеством лейкоцитов и МСМ28о на 5 сут, и отрицательные — с МСМ254 на 3 сут развития ОРП у крыс. Однако практически на всех сроках развития ОРП были выявлены сильные положительные связи общего количества нейтрофилов и моноцитов с показателями сывороточного содержания МСМ28о У крыс. На 3 сут развития ОРП была установлена отрицательная, а на 5 и 14 сут - положительная связь между общим количеством нейтрофилов и моноцитов и показателями сывороточного содержания МСМ254 у крыс.

При анализе результатов данного исследования были установлены тесные прямые связи между общим количеством лимфоцитов и МСМ280 на 5 сут, и отрицательные - с МСМ254 на 3 сут развития ОРП у крыс. В то же время общая численность таких субпопуляций лимфоцитов как СБЗ+, СБ4+, СБ8+ и СЭ24+ прямо коррелировали с содержанием МСМ280 в сыворотке крови практически на всех сроках развития ОРП. А СВ4+- и С08+ субпопуляции лимфоцитов прямо коррелировали с содержанием МСМ254 в сыворотке крови практически на всех сроках развития ОРП.

Эти результаты свидетельствуют о прямом участии Нф, Мон, СОЗ+-, С04+-, СБ8+- и СГ)24+-лимфоцитов крови в развитии эндогенной интоксикации в динамике развития ОРП у крыс. Антибиотикотерапия (крысы III группы) и, особенно, непрямая лимфотропная терапия (IV группа) приводит к существенным изменениям корреляционных связей между этими популяциями клеток и показателями содержания МСМ280 и с МСМ254, отражающими степень эндогенной интоксикации организма крыс в ходе развития ОРП. Отсюда можно констатировать, что лечебные мероприя-

тия, особенно, проведение непрямой лимфотропной терапии способствует снижению эндогенной интоксикации организма крыс, о чем свидетельствуют не только изменения абсолютной численности разных популяции клеток и оценочных параметров интоксикации, а также существенные смещения корреляционных связей между ними.

В итоге, позитивные эффекты антибиотикотерапии и непрямой лимфотропной терапии, вероятно, связаны с действием противовоспалительных цитокинов IL-4 и TGF-ß 1, которые подавляют секрецию противовоспалительных медиаторов, в том числе IL-lß и TNF-a . Так, известно, что специфические иммунные ответы оканчиваются посредством сигналов, подаваемых противовоспалительными цитокинами, такими как TGF-ß и IL-10, которые секретируются антигенпрезентирующими и анти-генспецифичными Т-клетками (Tri и Th2). Эти цитокины уменьшают выраженность воспалительных реакций и, в конечном счете, способствуют их окончанию и инициируют восстановление тканей (Ивашкин В.Т., 2008, O'Farrelly С., Doherty D.G., 2003).

Эффективность непрямой лимфотропной терапии крыс с ОРП, в том числе, снижение выраженности СЭИ, также возможно, связано с усилением моторики лимфатической системы, поскольку известно, что при воспалении угнетается деятельность лимфатических сосудов на фоне перитонита по сравнению с интактными лимфатическими сосудами (Савельев B.C. и др., 2006, Авраменко Е.А. и др., 2011). Слабая эффективность традиционной антибиотикотерапии, вероятно, связано с тем, что такие антибиотики как пенициллин, ампициллин, линкомицин и клафоран (цефотаксим) обратимо угнетают моторику лимфатических сосудов, а гентамицин и канамицин ин-гибируют ее необратимо (Яковлев, C.B., 2002). Сведений о характере влияния антибиотиков последующих поколений значительно меньше, несмотря на наличие публикаций и, следовательно, сохраняющийся интерес к практическому применению рассматриваемых методик в лечении острой хирургической патологии (Материалы III съезда..., 2008). В связи с этим, в настоящей работе использовали антибиотик в концентрации вдвое меньшей, чем у крыс III группы (антибиотикотерапия). В работе Авраменко Е.А. и др., 2011) было показано, что при действии антибиотика амикацина в диапазоне низких концентраций интактные лимфатические сосуды демонстрировали преимущественно стимулирующие реакции, высокие концентрации приводили к существенному возрастанию тонического напряжения при выраженном угнетении фазной активности.

Восстановление неспецифического и специфического иммунитета у крыс с ОРП при проведении непрямой лимфотропной терапии может быть связано включением в состав болюса иммуномодулятора глутоксима. Работа клетки в новом окислительно-восстановительном режиме и изменение динамики фосфорилирования ключевых блоков сигнал-передающих систем и транскриптационных факторов, в первую очередь иммунокомпетентных клеток, определяет иммуномодулирующий и системный цитопротекторный эффект данного препарата (Винник Ю.С. и др., 2002).

К основным иммунофизиологическим свойствам этого препарата относятся: высокая его тропность к клеткам центральных органов иммунитета и системы лимфоид-ной ткани; усиление костномозгового кроветворения: процессов эритропоэза, лимфо-поэза и гранулоцитомоноцитопоэза; активация системы фагоцитоза, в том числе в условиях иммунодефицитных состояний. Среди иммунобиохимических эффектов глутоксима следует выделить: стимулирующее действие препарата на каскадные механизмы фосфатной модификации ключевых белков сигнал-передающих систем; инициацию действия системы цитокинов, в том числе IL-1, IL-6, TNF, интерферонов, эритропоэтина, IL-2. Стимулируя процессы экзоцитоза внутриклеточно паразити-

рующих возбудителей инфекционных болезней, тем самым делая их доступными для эффекторов иммунной системы и средств специфической фармакотерапии (Глуток-сим..., 2005, Громов М.И., Каплина Э.Н., 2006, Юшков В.В., 2010). При иммуномоду-лирующей терапии больных с оппортунистическими инфекциями, в частности с использованием глутоксима, в работе А.П. Топтыгиной и др. (2011) было достигнуто восстановление нарушений клеточного звена иммунитета.

На основании результатов собственного исследования и данных научной литературы последовательность эффекта действия непрямой антибиотико- и иммуномодулирующей лимфотропной терапии крыс с ОРП можно представить следующим образом:

- Индукция ОРП, введением каловой массы, содержащей бактерии и их антигенные компоненты приводит к активации миграции и приток лейкоцитов в зону воспаления. В циркулирующей крови крыс с ОРП увеличивается численность нейтрофилов (нейтрофи-лия), моноцитов (моноцитоз) и эозинофилов (эозинофилов). Активация миграции и приток лейкоцитов в зону воспаления сопровождается снижением численности СЮЗ+-, СБ4+- и С08+-лимфоцитов, на фоне увеличения количества относительной численности В-лимфоцитов памяти (СБ24+-лимфоцитов), а также рост количества регуляторных Т-клеток (СГ)25+-лимфоцитов). Это приводит к лейкоцитозу, угнетению клеточного звена иммунитета и, возможно, к активации гуморального иммунитета;

- Активация эффекторных клеток воспаления (Нф и Мон/Мф с усилением их ци-тотоксической и секреторной функций;

- Усиление цитотоксической функции за счет активации свободно-радикального окисления и секреция провоспалительных цитокинов приводит к развитию СЭИ и ССВО;

- Антибиотикотерапия крыс с ОРП на ранних сроках усиливает лейкоцитоз и продукцию провоспалительных цитокинов и угнетение клеточного звена иммунитета. На поздних сроках — нормализует клеточный состав крови, стимулирует продукцию противовоспалительных цитокинов;

- Непрямая антибиотико- и иммуномодулирующая лимфотропная терапия крыс с ОРП за счет активации фагоцитирующих клеток и лимфодренирующей функции лимфатической системы приводит к устранению СЭИ и ССВО.

Таким образом, непрямая антибиотико- и иммуномодулирующая лимфотропная терапия крыс с ОРП способствует: а) нормализации клеточного звена иммунитета; б) активации клеток неспецифического звена иммунитета (Нф и Мон/Мф), что приводит к усилению их фагоцитарной функции и модуляции их секреторной активности, а также в) активации лимфодренирующей функции лимфатической системы. Все эти события, в совокупности, приводят к снижению активности острого воспаления.

ВЫВОДЫ

1. Проведение непрямой антибиотико- и иммуномодулирующей лимфотропной терапии крыс с острым разлитым перитонитом, в отличие от животных получавших традиционную антибиотикотерапию, способствует нормализации численности лейкоцитов и клеточных элементов (нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов) крови. Наряду с этим в брюшине крыс отмечается ускорение смены популяции нейтрофилов на макрофагальные, на что указывает снижение численности нейтрофилов в 1,6 раза и увеличение количества макрофагов в 1,8 раза по сравнению с животными после традиционной антибиотикотерапии.

2. Непрямая антибиотико- и иммуномодулирующая лимфотропная терапия, в отличие от традиционной антибиотикотерапии, приводила к неуклонному снижению

концентраций молекул средней массы (МСМ28о и МСМ254) в сыворотке крови крыс с острым разлитым перитонитом, что свидетельствует об эффективной коррекции эндогенной интоксикации организма животных

3. Применение непрямой антибиотико- и иммуномодулирующей лимфотропной терапии способствует более эффективному восстановлению нормального баланса ци-токинов, чем традиционная антибиотикотерапия, за счет увеличения содержания противовоспалительных (IL-4 и TGF-ßl) и снижения провоспалительных цитокинов (IL-lß и TNF-a) в сыворотке крови, что свидетельствует о снижении активности воспалительного процесса на фоне мобилизации противовоспалительных медиаторов.

4. Развитие острого разлитого перитонита у крыс сопровождается системным нарушением клеточного звена иммунитета, о чем свидетельствуют снижение количества CD3+-, С04+-лимфоцитов крови и тимуса, увеличение численности В-лимфоцитов памяти (CD24+) и регуляторных Т-клеток (CD25+) крови со снижением показателей иммунорегуляторного индекса крови и иммунорегуляторного коэффициента тимуса. Проведение непрямой антибиотико- и иммуномодулирующей лимфотропной терапии способствует эффективному восстановлению клеточного иммунитета у крыс с острым разлитым перитонитом, чем традиционная антибиотикотерапия.

5. В динамике непрямой антибиотико- и иммуномодулирующей лимфотропной терапии крыс с острым разлитым перитонитом величина интегрального показателя общего состояния животных постепенно повышалась и к 14 сут была в 6 и 1,3 раза выше, чем у животных без лечения и после традиционной антибиотикотерапии соответственно. После непрямой антибиотико- и иммуномодулирующей лимфотропной терапии на фоне восстановления клеточного иммунитета, баланса про- и противовоспалительных цитокинов и снижения эндогенной интоксикации организма летальность крыс с острым разлитым перитонитом при 84% смертности животных без лечения составила 44%, а после традиционной антибиотикотерапии — 64%, что свидетельствует о высокой эффективности использованного метода непрямой лимфотропной терапии острого разлитого перитонита.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты экспериментальных данных применения непрямой антибиотико- и иммуномодулирующей лимфотропной терапии, свидетельствующие об эффективности коррекции иммуновоспалительных реакции и эндогенной интоксикации при остром разлитом перитоните необходимо продолжить в доклинических и клинических исследованиях у больных разлитым перитонитом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние серебросодержащего сорбента на уровень лейкоцитов периферической крови в терапии острого разлитого перитонита у крыс / A.A. Аникеев, М.С. Любарский, М.Г. Пустоветова, С.А. Архипов, И.Р. Вялеев, И.А. Голубева, И.П. Жура-ковский, М.В. Битхаева, Т.А. Кунц, Т.В. Шантурова // Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии: Материалы X Международной конференции, посвященной 20-летию НИИ клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМН.- Новосибирск, 2011,- С.77.

2. Маркеры повреждения печени при остром экспериментальном перитоните у крыс / A.A. Аникеев, И.Р. Валеев, М.В. Битхаева, М.Г. Пустоветова // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Сборник трудов III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием.- Новосибирск, 20П.- С. 124-125.

3. Реакция регионарного лимфатического русла в условиях экспериментального острого перетонита / A.A. Аникеев, И.Р. Вялеев, М.Г. Пустоветова, И.А. Голубева, П.А. Елясин, И.П. Жураковский // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Сборник трудов III Всероссийской конференции с международным участием. -Новосибирск,2011,- С.126-128.

4. Оценка эффективности серебросодержащего сорбента в комплексной терапии острого разлитого перитонита в эксперименте / A.A. Аникеев, М.С. Любарский, М.Г. Пустоветова, С.А. Архипов, И.Р. Валеев, И.А. Голубева, И.П. Жураковский, М.В. Битхаева, Т.А. Кунц, Т.В. Шантурова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.- 2011,- №3 (79), часть 1,- С.172-178 (Из списка ВАК).

5. Иммунологические аспекты комплексной коррекции нарушений иммунного статуса при остром разлитом перитоните методами лимфотропной терапии в эксперименте / A.A. Аникеев, М.С. Любарский, М.Г. Пустоветова, С.А. Архипов, И.А. Голубева, И.Р. Валеев, И.П. Жураковский, М.В. Битхаева, Т.А. Кунц // Бюллетень СО РАМН,- 2012.-Т. 32, № 4,- С. 5-10 (Из списка ВАК).

6. Экспериментальная оценка эффективности различных схем лечения больных с острым перитонитом / A.A. Аникеев, И.Р. Валеев, М.С. Любарский, М.Г. Пустоветова, С.А. Архипов, И.А. Голубева, И.П. Жураковский, М.В. Битхаева, Т.А. Кунц, Т.В. Шантурова // Вестник НГУ Серия: Биология, клиническая медицина.- 2012.- Т.10, Вып.1.- С.42-48 (Из списка ВАК).

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ИРИ - Иммунорегуляторный индекс

ИРК - Иммунорегуляторный коэффициент

Лф - Лимфоцит

Мон - Моноцит

МСМ - Молекулы средней массы с длиной волны 254 (МСМ254) и 280 нм (МСМ28о)

Нф - Нейтрофил

ОС - Общее состояние

ОРП - Острый разлитой перитонит

ПОН - Полиорганная недостаточность

СРО - Свободно-радикальное окисление

ССВО - Синдром системного воспалительного ответа

СЭИ - Синдром эндогенной интоксикации

Эоз - Эозинофил

ОМ-СБР - Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

1РЫ - Интерферон(ы)

1Ь - Интерлейкин(ы)-1Р,-4

ТОР-Р1 - Трансформирующий фактор роста-р1

ТИР - Фактор некроза опухоли

Соискатель

Валеев И.Р.

Подписано в печать 25.03.2014. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Гарнитура Times. Ризография Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Изд. № 56п.

Отпечатано в типографии НГМУ Новосибирск, Залесского, 4 Тел.: (383) 225-24-29