Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Особенности морфофункционального статуса тромбоцитов человека в норме и патологии

На правах рукописи

Макаров Максим Сергеевич

ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 НЛП 2014

Москва-2014

005547807

Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения «Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского» департамента здравоохранения города Москвы

Научный руководитель:

профессор, доктор медицинских наук Хватов Валерий Борисович Официальные оппоненты:

Калинин Николай Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом экстракорпоральных методов лечения Медицинского научно-образовательного центра МГУ имени М.В. Ломоносова

Василенко Ирина Анатольевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией компьютерной цитоморфометрии Государственного бюджетного общеобразовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «-/У у>ЫЛОН'<Я 2014 г. в 14.00 на заседании диссертационного совет Д 208.135.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» МЗ РФ по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский пр-д, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Буланов Андрей Юльевич

Актуальность проблемы

Успехи современной медицины, стремительный рост хирургической активности, особенно у наиболее тяжелого контингента больных, определяют применение в клинической практике различных методов траНсфузиологической клеточной гемокоррекции (В.Б. Хватов, 2003, 2011; Г.И. Козинец, 2005; H.H. Калинин, 2006; A.A. Рагимов, И.Н. Соловьева, 2008; В.М. Погорелов, Г.И. Козинец, 2012). Тромбоциты человека широко используются в гематологии, трансфузиологии, хирургии, реаниматологии, акушерстве и гинекологии, в педиатрии и неонатологии, травматологии, трансплантологии, кардиохирургии, гепатологии (А.И. Воробьев, 2002; А.Г. Румянцев, В .А. Аграненко, 2002; Е.Б. Жибурт, П.В. Рейзман, С.А. Голосова, 2005; A.A. Рагимов,2012; A.D. Shapiro,1999; S.J. Slichter, 2004). Под "защитой" переливаний концентрата тромбоцитов проводятся курсы интенсивной химиотерапии с заранее планируемым периодом длительного агранулоцитоза и тромбоцитопении (Е.А Лебедева, С.Ю. Ефимова, 2000; Г.И. Козинец, 2005; AJI. Левит, Т.С. Константинова, А.И. Костин, 2005; В.М. Городецкий, М.Ж. Алексанян, М.Ж. Ватагина и соавт., 2012). Клиническое использование тромбоцитов человека для обеспечения адекватной компенсации нарушений в системе клеточного гемостаза и лечебной эффективности ставит проблему оценки биологической полноценности этих клеток (Ю.Л. Шевченко, Н.Б. Жибурт, 2008; В. Kehrel, М. Brodde, 2013). Существует технический регламент требований к безопасности крови, ее продуктов, кровезамешающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии (приложение № 1 к постановлению правительства РФ № 29 от 26.01.2010 года). Однако в представленных параметрах нет данных, регламентирующих структурную целостность и функциональную активность тромбоцитов. Следовательно, имеется необходимость разработки и внедрения метода адекватной оценки качества тромбоцитов, используемых в клинической практике, а также оценки их биологической полноценности в норме и патологии.

Существуют различные морфомегрические методы оценки качества тромбоцитов человека с помощью световой (Ф.В. Коробова, Т.Н. Левина, Б.З. Соколинский, 2000), электронной (В.К. Вашкинель, М.Н. Петров, 1982; M.G. Egidi et al. 2010), и атомно-силовой микроскопии (М.Ю. Донников, С.А. Орлов, A.A. Зиновьев, 2009) фиксированных клеток, не позволяющие оценить их функциональную активность. Методы исследования нефиксированных клеток - фазово-контрастная и интерференционная микроскопия (И.А. Василенко и соавт, 2009; Е.И. Колосова, И.А. Василенко, Л.Г. Ковалева, 2011), проточная цитометрия (J. Delobel, О. Rubin, М. Prudent, 2010) - не позволяют напрямую связать регистрируемые параметры тромбоцитов с их основными функциями (агрегация,

В

адгезия). Возникает проблема параллельной оценки целостности структуры тромбоцита его функциональной активности, т.е. оценки морфофункционального статуса тромбоцит В клеточной биологии эта проблема решается путем использования витальнь красителей, которые позволяют дифференциально выявить отдельные структурны компоненты клеток без нарушения их жизнедеятельности (В. Alberts et at, 2002). Витально окрашивание клеток позволяет оценить различные формы клеточной активности пролиферативную, секреторную, локомоторную (M.D. Pollard, W.C. Earnshaw, 2007) а также целостность их внутреннего состава. Таким образом, имеются все основания разработке и внедрению витальных красителей для оценки морфофункционального стату тромбоцитов человека.

Цель работы. На основе витального окрашивания разработать метод оценк морфофункционального статуса тромбоцитов человека для характеристики биологическо полноценности этих клеток в норме и патологии.

Задачи исследования:

1. Разработать метод витального окрашивания тромбоцитов человека для оценки и морфофункционального статуса.

2. Разработать параметры оценки морфофункционального статуса тромбоцит человека.

3. Провести морфологический анализ витально окрашенных тромбоцитов

4. Оценить морфофункциональный статус тромбоцитов человека в норме и патологи

Научная новизна:

Разработан витальный краситель клеток на основе флуорохромов трипафлавина акридинового оранжевого (АО), позволяющий получать во флуоресцентном микроско дифференциальное свечение цитоплазмы и гранул тромбоцитов без нарушения активности. Анализ интенсивности свечения окрашенных трипафлавином-АО тромбоцит позволяет оценить их морфологию, целостность внутреннего состава, насыщет гранулами и мембранными структурами. Функционально полноценными являют тромбоциты с интенсивностью свечения 40-80 фут-кандел (баллов), содержащие более гранул. Отсутствие свечения гранул в тромбоцитах связано с их активацией ил повреждением.

Впервые в крови человека выявлена популяция клеток - тромбоциты богатые гранулами, обладающие повышенной морфофункциональной, адгезивной и агрегационной активностью, высоко устойчивые к токсическому действию ДМСО. Впервые разработан оригинальный способ оценки качества тромбоцитов, включающий исследование морфофункциональной активности тромбоцитов, выражающую структурную полноценность клеток, и морфологический анализ адгезивной активности клеток, в сумме отражающие функциональную полноценность тромбоцитов. Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов защищен Патентом РФ на изобретение №2485502 от 20.06.2013.

Впервые представлен анализ распределения доноров крови по биологической полноценности тромбоцитов. Выявлены три популяции: с референтным (82%) повышенным (2%) и пониженным уровнем (16%) морфофункционального статуса тромбоцитов. При этом относительное содержание функционально полноценных клеток в концентратах тромбоцитов, полученных от доноров 1-й и 2-й популяции, составляло 55-60%, тогда как от доноров 3-й популяции - не превышало 43%. Установлена взаимосвязь между морфофункциональными характеристиками тромбоцитов и их влиянием на пролиферативную активность культивируемых клеток.

Проведен анализ морфофункционального статуса тромбоцитов (МФСТ) у пациентов с различными патологиями, показано, что при ряде патологий наблюдается достоверное изменение морфофункциональных параметров тромбоцитов. Показано нарушение структурной целостности и функциональной активности тромбоцитов (при гематологических заболеваниях, острых экзогенных отравлениях, процедуре искусственного кровообращения); степень снижения количества циркулирующих функционально пригодных клеток (при массивных кровотечениях); гиперактивация клеток (при тромбозах). Установлено, что снижение МФСТ у кардиохирургических больных после оперативного вмешательства с применением аппарата искусственного кровообращения не связано с уменьшением концентрации тромбоцитов в циркулирующей крови.

Разработан способ оценки чувствительности тромбоцитов крови к антиагрегантам как прямого, так и непрямого действия, которые вызывают снижение адгезивной активности тромбоцитов при сохранении их морфофункциональной активности. Степень чувствительности тромбоцитов крови к антиагрегантам широко варьируют у разных пациентов. Показана неоднородность популяции здоровых людей и пациентов с кардиохирургическими заболеваниями по степени чувствительности тромбоцитов к действию антиагрегантов. Предложенный способ оценки морфофункционального статуса

5

тромбоцитов человека является объективной оценкой биологической полноценности клето и перспективен для использования в производственной трансфузиологии и клиническо практике.

Практическая значимость работы:

Определены референтные значения морфофункциональных параметров витальн окрашенных тромбоцитов, соответствующие норме. Получено авторское свидетельств «Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека», разработан методические рекомендации «Применение аппликаций богатой тромбоцитами аутоплазм в лечении больных с хроническими ранами различной этиологии». Предложенный спосо оценки тромбоцитов используется в клинической практике.

Оценка морфофункционального статуса тромбоцитов с помощью витальног окрашивания позволяет оценить качество тромбоцитов, используемых в клиническо практике, определить биологическую полноценность и функциональную активно тромбоцитов в крови больного для коррекции и прогнозирования дальнейшей терапии. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод витального окрашивания тромбоцитов человека с помощь трипафлавина-АО, позволяющий дифференциально окрасить цитоплазму гранулы этих клеток без нарушения их биологической полноценности. На осно витального окрашивания разработан метод оценки морфофункционального стату тромбоцитов человека, который позволяет проводить параллельный анализ и структурной целостности и функциональной активности.

2. Выявлена неоднодность витально окрашенных тромбоцитов по биологическо полноценности. Окраска трипафлавином-АО позволила выявить клетки разнь морфологических типов. Функционально полноценными являются толь дискоциты и большие округлые тромбоциты с гранулами. Функциональ полноценные клетки различаются по интенсивности свечения. Выявлен тромбоциты, обогащенные гранулами и мембранными структурами, которь обладают повышенной устойчивостью к действию ДМСО.

3. Определены референтые значения морфофункциональных параметр тромбоцитов, определяющие норму. Популяция доноров является неоднородной уровню МФСТ. Сохранность КТ доноров в ходе хранения при 22°С криоконсервировании зависит от исходных морфофункциональных параметр тромбоцитов.

4. В ряде заболеваний наблюдается достоверное изменение параметров МФСТ. У больных с клинически выраженным геморрагическим синдромом значения МФСТ резко снижены, у больных с тромбозами - заметно повышены по сравнению с донорами. Анализ МФСТ позволяет объективизировать проведение трансфузий тромбоцитов пациентам с тромбоцитопений. Анализ МФСТ позволяет оценить чувствительность тромбоцитов человека к препаратам-антиагрегантам прямого и непрямого действия.

Апробация работы

Результаты исследования были представлены в виде устных и стендовых сообщений на отечественных и международных конгрессах и симпозиумах: V юбилейная конференция «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012); Конгресс гематологов России-2012 (Москва, 2012); VI научно-практическая конференция «Современная гематология. Проблемы и решения» (Москва, 2012); VI всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (Москва, 2013); 2-й Съезд врачей неотложной медицины (Москва, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 статей, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 патент РФ на изобретение, 7 тезисов в сборниках конференций, методические рекомендации Департамент здравоохранения города Москвы.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах, состоит из следующих разделов: введение; обзор литературы; материалы и методы; результаты; обсуждение; выводы; список литературы, включающий 132 источников, из них 55 отечественных и 77 зарубежных. Диссертация содержит 10 таблиц и 29 рисунков.

Диссертационная работа выполнена в научной лаборатории трансплантации клеток и иммунотипирования (зав. д.м.н. Н.В. Боровкова), научной лаборатории трансфузиологии, консервирования тканей и искусственного питания (зав. д.м.н., профессор В.Б. Хватов) ГБУЗ НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы.

Материалы и методы исследования

Для оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека исследовал образцы консервированной крови (CPD 1:7) и богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) 30 доноров крови; 50 концентратов тромбоцитов (KT), полученных с помощью аппаратног афереза у доноров тромбоцитов (афКТ) и 50 пулированных KT из ЛТС доноров кров (пулКТ); 15 доноров органов, а также у 340 пациентов с различными патологиям Аферезные KT получали у доноров тромбоцитов с помощью аппарата Cobe Trim пулированные KT - из лейкоцитарных слоев цельной крови 4-6 доноров путем мягког центрифугирования.

Для прижизненной окраски тромбоцитов использовали смесь 2-х флуорохромов трипафлавина и акридинового оранжевого на 0,15М фосфатном буфере Зеренсена (рН=7. близкий к pH крови) в соотношении 1:1. Прижизненную окраску тромбоцитов проводил как в пробирке, так и на предметном стекле. В работе использовали микроскоп "Niko Eclipse 80i" (фирма "Nikon", США) со встроенной флуоресцентной насадкой "Nikon eclipse СЫ'Хфирма "Nikon", США). Препараты рассматривали под объективом хЮ числовая апертура 1.25. Для получения флуоресцентного изображения использовал светофильтр (^возбуждения 450-490нм, Хэмиссии - от 520нм). Полученные изображени фотографировали с помощью цифровой фотокамеры "Nikon"("Nikon", США) пр экспозиции 0.25-0.5 сек. Для морфометрического исследования тромбоцитов использовал программу Adobe Photoshop 7. В ходе морфофункционального анализа тромбоците определяли следующие параметры: концентрацию тромбоцитов в образце, Стр. (тыс/мкл относительное содержание тромбоцитов с гранулами, Drp.rp. (%); концентрац тромбоцитов с гранулами, Стр.гр. (тыс/мкл); морфофункциональную активность, МФА (в фут-канделах или баллах); адгезивную активность, ААТ (в % или баллах морфофункциональный статус тромбоцитов, МФСТ (в баллах). Концентрац тромбоцитов осуществляли с помощью гематологического анализатора AcTdifE (фирм "Beckman Coulter", США). Оценку содержания витально окрашенных тромбоцитов и разделение в автоматическом режиме проводили на цитометрическом сепараторе клето MoFlo XDP. Агрегационную активность тромбоцитов проводили с помощью импедансног агрегометра 591 (Chrono-Log, США) и оптического агрегометра 470VS (Chrono-Log, США В качестве индуктора агрегации использовали 2мкг/мл коллагена (импедансный метод) ил 5мкМ/мл АДФ (оптический метод).

Полученные данные обработаны с помощью методов вариационной статистики с использованием пакета программ «Microsoft Excel 2000» и STATISTICA 6.0. Вычисляли средние арифметические значения (М), среднеквадратичные отклонения (а), уравнения регрессионной зависимости, коэффициент ранговой корреляции Спирмена (G). Различия значений считали достоверными при уровне значимости более 95% (р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка метода витального окрашивания тромбоцитов человека

Установлено, что окрашивание клеток смесью трипафлавина и АО вызывает в

тромбоцитах зеленое свечение цитоплазмы и красное свечение гранул, отчетливо различимое во флуоресцентном микроскопе. Смесь трипафлавина-АО позволяет проводить дифференциальную окраску тромбоцитов человека. Оптимальное соотношение трипафлавина и АО в готовом красителе составило 1:1 (рис. 16). При таком соотношении красителей окрашивание тромбоцитов позволяет отчетливо выявить границы отдельных клеток, а также гранулы в их составе. При других соотношениях трипафлавина и АО гранулы в составе тромбоцитов выявляются хуже или не выявляются вообще (рис. 1а, в). Окрашенные трипафлавином-АО тромбоциты проявляли такую же агрегационную и адгезивную активность, что и неокрашенные (табл. 1). Таким образом, предложенная витальная окраска тромбоцитов позволяет сохранить функциональную активность этих клеток. Анализ витально окрашенных тромбоцитов, хранившихся в течение 24 часов при 22°С, показал, что в течение 1 суток витально окрашенные тромбоциты сохраняли такую же интенсивность зеленого свечения цитоплазмы и красного свечения гранул, что и до хранения.

Рисунок 1. Свечение тромбоцитов человека при разном соотношении трипафлавина и АО в готовом витальном красителе: а - 2:1; б— 1:1; в - (:2. Масштабная линия - 10 мкм.

Таблица 1.

Сравнение функциональной активности неокрашенных и окрашенных тромбоцитов человека

Тромбоциты крови доноров (Концентрация клеток 250-275 тыс/мкл) Параметры функциональной активности тромбоцитов

Агрегационная активность (Ом*мин) Индуктор - 2мкг/мл коллагена Агрегационная активность (%) Индуктор - 5мМ АДФ Адгезивная активность на стекле,%

Неокрашенные клетки 62,4±7,7 78,0±7,1 50,5±9,5

Клетки, окрашенные трипафлавином-АО 60,7±7,3 77,5±6,8 50,4±9,3

Установлена прямая корреляционная связь между агрегационной активностью и морфофункциональными параметрами тромбоцитов доноров: Стр.гр (г=0,925, р<0,01), МФАТ (1=0,849, р<0,01), ААТ (1=0,741, р<0,01) и МФСТ (1=0,816, р<0,01). Показана регрессионная зависимость между агрегационной активностью и Стр.гр. в крови (Я2=0,915, у=-4Е-09х5+2е-06х4-0,0006х5+0,0842хМ,8091х+127,53), что позволяет использовать этот параметр для интегральной оценки функциональной активности популяции циркулирующих тромбоцитов. Также установлена регрессионная зависимость между ААТ и МФАТ (Я2=0,924, у=0,0059х3+0,1363х2+1,0936х-2,518). Следовательно, предложенный метод морфофункционального исследования тромбоцитов человека с помощью витального окрашивания является адекватным для оценки биологической полноценности тромбоцитов.

Морфологический анализ витально окрашенных тромбоцитов

Предложенный метод витального окрашивания трипафлавином-АО тромбоцитов человека позволяет отчетливо выявить в крови доноров 4 основных морфологических типа этих клеток: дискоциты, большие округлые тромбоциты, отросчатые тромбоциты, дегенеративно измененные тромбоциты. Во флуоресцентном микроскопе отчетливо выявляются границы отдельных окрашенных тромбоцитов, а также гранулы в их составе (рис. 2). Цитоплазма имеет зеленое свечение, гранулы - красно-оранжевое. Дискоциты обычно содержат 5-15 гранул на клетку, причем среди них выявлены мелкие (диаметр 2,02,9 мкм), средние (3,0-3,7 мкм) и крупные (3,8-4,5 мкм) клетки (рис. 2а-в). Среди дискоцитов нередко встречаются клетки, содержащие лишь 1 -2 гранулы, а также клетки без гранул (рис. 2д, е). В дискоцитах, имеющие 1 или 2 гранулы, очень часто наблюдается контакт гранул с клеточной оболочкой. Большие округлые тромбоциты обычно содержат более 10 гранул на клетку (рис. 2г), хотя среди них также встречаются клетки без гранул

или с 1-2 гранулами (рис. 2е). Отросчатые тромбоциты не содержат гранул или содержат 12 мелкие гранулы диаметром 300-320 нм (рис.2ж). Дегенеративные формы тромбоцитов также лишены гранул, цитоплазма таких тромбоцитов часто образует пузыревидные выпячивания и имеет меньшую яркость свечения (рис. 2з).

Рисунок 2. Флуоресцентная микроскопия тромбоцитов человека, витально окрашенных трипафлавином-АО. Верхний ряд - тромбоциты с гранулами: а - мелкие дискоциты; б - средние дискоциты; в - крупные дискоциты; г - большой округлый тромбоцит. Нижний ряд - тромбоциты без гранул: д — дискоциты без гранул; е -дискоциты с 1-2 мелкими гранулами; ж - отросчатые тромбоциты; з - дегенеративные тромбоциты. Масштабная линия - 2 мкм.

Витально окрашенные тромбоциты с гранулами полностью сохраняют способность к активации, что позволяет наблюдать адгезию тромбоцитов на предметном стекле. В ходе адгезии на стекле происходит распластывание тромбоцитов - их диаметр увеличивается в 1,5-2 раза. Одновременно с этим наблюдается постепенное смещение гранул к периферии тромбоцитов, затем гранулы связываются с клеточной оболочкой и выходят за пределы тромбоцита (рис. 3). После выброса гранул тромбоциты меняют форму: из распластанных они становятся более округлыми и образуют короткие выросты, которые впоследствии могут удлиняться. Такие тромбоциты обладают локомоторной (двигательной) активностью и могут собираться в тесные скопления на предметном стекле. Адгезивная активность тромбоцитов с гранулами не зависит от их линейных размеров. Тромбоциты без гранул или с 1-2 гранулами не способны к адгезии на стекле, независимо от их морфологического типа. Установлено, что в течение экспозиции 1-4 часа на предметном стекле при 37°С дисковидные тромбоциты (клетки "покоя") без гранул не проявляют морфологических изменений, характерных для адгезирующих клеток.

Рисунок 3. Витально окрашенные трипафлавином-АО тромбоциты человека до адгезии (а) и на разных стадиях адгезии (б-е). Масштабная линия — 2 мкм.

Морфофункциональные свойства витально окрашенных тромбоцитов в зависимости от интенсивности свечения

Морфологическое исследование витально окрашенных трипафлавином-АО | тромбоцитов крови доноров выявило 4 субпопуляции клеток с разной интенсивностью свечения. Две субпопуляции (клетки с яркостью свечения 18-25 и 26-38 фут-кандел) не проявляли функциональной активности. Две другие субпопуляции (клетки с яркостью свечения 40-59 и 60-80 фут-кандел) являются функционально пригодными клетками, обладающими адгезивной и агрегационной активностью. Установлено, что наибольшее | количество гранул содержится в клетках яркостью 60-80 фут-кандел - одна такая клетка часто имеет более 10 визуально различимых гранул. Поэтому для обозначения тромбоцитов яркостью свечения 60-80 фут-кандел нами предложен термин «тромбоциты богатые гранулами». Тромбоциты богатые гранулами (ТБГ) - это витально окрашенные трипафлавином-АО клетки с яркостью свечения 60 и более фут-кандел (рис. 4). ТБГ чаще всего содержат не менее 8-10 визуально различимых гранул диаметром 400-600 нм. Среди ТБГ встречаются мелкие (диаметр 2,2-3,0 мкм), средние (диаметр 3,1-3,7 мкм), а также крупные клетки (диаметр 4,0-4,5 мкм); в крупных тромбоцитах количество гранул на клетку может достигать 15-20. Все тромбоциты богатые гранулами обладают выраженной агрегационной и адгезивной активностью.

Рисунок 4. Тромбоциты богатые гранулами (ТБГ) во флуоресцентном микроскопе, а - интактные ТБГ; б — адгезия ТБГ на стекле Масштабная линия - 5 мкм.

Анализ интенсивности свечения ТБГ, витально окрашенных трипафлавином-АО, выявил насыщенность цитоплазмы этих клеток мембранными структурами, определяющими ряд функциональных свойств тромбоцитов. Известно, что применение криоконсервантов, в частности ДМСО, позволяет значительно удлинить сроки хранения тромбоцитов. Однако, ДМСО обладает токсическим воздействием на клеточные мембраны (L Asmis, F.C. Tanner, I. Sudano et al, 2010). В этой связи исследовано влияние ДМСО на клеточные мембраны различных субпопуляций тромбоцитов. Установлено, что под действием 5-6% ДМСО в тромбоцитах с гранулами наблюдается деформация плазматической мембраны, разрушение гранул или выход их содержимого за пределы клеток. В субпопуляции тромбоцитов с 3-7 гранулами (яркостью свечения клеток 40-59 фут-кандел) признаки деформации клеток отмечены уже через 10-15 мин экспозиции с 5-6% ДМСО. При этом их адгезивная активность начинала снижаться через 10-20 минут, а через 80-90 мин вся популяция этих клеток не проявляла адгезивной активности. В субпопуляции ТБГ признаки деформации клеток под действием 5-6% ДМСО наблюдались через 60-70 мин, адгезивная активность ТБГ сохранялась в течение 70-80 минут экспозиции с 5-6% ДМСО (рис. 5). Эти данные указывают на высокую устойчивость мембранной структуры ТБГ к токсическому действию ДМСО. Следовательно, отбор концентратов тромбоцитов (КТ), пригодных для длительного хранения с помощью ДМСО, может проводиться на основе оценки содержаниях ТБГ в этих клеточных компонентах крови.

1

ААТ (в в/о от исходного)

Тромбоциты с 3-7 гранулами ■ Тромбоциты с 8-20 гранулами (ТБГ)

I

Время жспоищии с 5-6»/. ДМСО при 224', мин

Рисунок 5. Адгезивная активность тромбоцитов в ходе экспозиции с 5-6% ДМСО при 22°С.

Структура тромбоцитов после индуцированной агрегации

Исследование агрегации тромбоцитов под действием разных индукторов с помощью предложенного морфофункционального метода показало, что под действием коллагена как в тромбоцитах неразделенной крови, так и в БоТП наблюдалась массовая дегрануляция витально окрашенных клеток. Через 5-10 мин после добавления коллагена в кровь или БоТП относительное содержание тромбоцитов с гранулами резко снижалось и не превышало 1 %. При этом наблюдалось заметное снижение интенсивности свечения клеток, МФАТ (в 2,1 раза) и полное отсутствие у них адгезивной активности. Одновременно с этим, в крови и плазме доноров выявлены крупные тромбоцитарные агрегаты диаметром до 100 мкм. Под действием АДФ агрегационная активность тромбоцитов и реакция высвобождения гранул носила дозозависимый характер. Так, относительное содержание тромбоцитов с гранулами (Огр.гр.) под действием 0,5мкМ АДФ снижалось в среднем в 1,12 раза, под действием ! мкМ АДФ - в 2,03 раза, под действием 5мкМ АДФ - в 24,0 раза. Установлено, что средний диаметр тромбоцитарных агрегатов увеличивается с повышением концентрации АДФ: при 0,5мкМ АДФ он составлял 10,1±1,3 мкм, при 1мкМ АДФ - 22,6±3,1 мкм, при 5мкМ АДФ - 45,5±5,4 мкм. Необходимо подчеркнуть, что в пробах БоТП, обработанных 0,5мкМ АДФ, неагрегировавшие тромбоциты с гранулами сохраняли свою структурную целостность и способность к адгезии на стекле. Под действием коллагена или 5мкМ АДФ в таких пробах отмечена вторая волна агрегации, а также дегрануляция всех тромбоцитов с гранулами и образование ими крупных тромбоцитарных агрегатов.

Морфофункцнональный анализ тромбоцитов доноров

У обследованных доноров общее содержание тромбоцитов в циркулирующей крови варьировало от 150 до 370 тыс/мкл. В ходе анализа биологической тромбоцитов доноров установлены следующие значения морфофункциональных параметров: Е>тр.гр. варьировало от 35 до 75 процентов ( в среднем 57,6±10,5 %), Стр.гр. - от 60 до 190 тыс/мкл (116,5±18,6 тыс/мкл). МФАТ варьировала от 37 до 60 баллов (48,6±5,2 баллов), ААТ - от 35 до 75 баллов (56,5±12,5 баллов), а МФСТ - от 85 до 130 баллов (109,1±11,5 баллов). В богатой тромбоцитами плазме (БоТП) значимых изменений Е>тр.гр., МФАТ, ААТ и МФСТ по сравнению с неразделенной кровью не выявлено (р<0,01). В крови доноров органов выявлено достоверное снижение всех морфофункциональных параметров тромбоцитов -так, Стр.гр. была снижена в 11 раз, адгезивная активность тромбоцитов - в 3,6 раз по сравнению с таковыми параметрами у доноров крови (табл. 2).

Анализ распределения 300 доноров по морфофункциональной активности тромбоцитов крови выявил три популяции: основная популяция составила 82% (МФАТ=48,0±1,5 баллов); популяция с пониженной активностью - 16% (МФАТ=38,5±2,5 балла) и популяция с повышенной активностью клеток - 2% (МФАТ=59,1±0,9 баллов). Распределение доноров по МФАТ в полученных концентратах тромбоцитов было следующим: основная популяция доноров составила 80%, наблюдалось увеличение популяции с пониженной активностью клеток до 20%, отсутствовала популяции с повышенной активностью клеток. Распределение доноров по содержанию тромбоцитов богатых гранулами также выявило три популяции доноров: со средним содержанием ТБГ -41%, со сниженным содержанием ТБГ - 35% и с повышенным содержанием ТБГ - 24%. Таким образом, у доноров содержание тромбоцитов богатых гранулами в крови может различаться в 3-4 раза. Полученные данные указывают на явную неоднородность популяции доноров по биологической полноценности тромбоцитов. Следовательно, в производственной практике следует учитывать параметры морфофункционального статуса тромбоцитов при получении концентрата тромбоцитов.

В концентратах тромбоцитов, полученных методом афереза (афКТ), морфофункциональные параметры клеток (Е>тр.гр., МФАТ, ААТ и МФСТ) значимо не отличались (р>0,05) от таковых в крови доноров, что указывает на сохранность биологической полноценности тромбоцитов в процессе автоматического афереза. В образцах пулированных КТ (пулКТ) Стр. и Стр.гр. были выше аналогичных показателей в афКТ, тогда как ЕУгр.гр., ААТ и МФСТ - достоверно (р<0,05) ниже.

В процессе хранения КТ при комнатной температуре и постоянном перемешивании в афКТ и пулКТ не выявлено резкого снижения общей концентрации тромбоцитов. К концу

15

5-х суток хранения афКТ содержали 85-90% от исходного количества тромбоцитов, а пулКТ - 70-85%. В исследованных КТ в ходе хранения отмечено постепенное снижение концентрации тромбоцитов с гранулами (Стр.гр.), причем динамика уменьшения Стр.гр. была различной в разных группах КТ. Так, в афКТ Стр.гр. практически не снижалась в течение 2 суток хранения. Через 3 суток Стр.гр. в афКТ снизилась в среднем на 70%, через 4 суток - на 95%. Подчеркнем, что через 5 суток хранения афКТ не содержали тромбоцитов с гранулами. В пулКТ уменьшение количества тромбоцитов с гранулами наступало уже на 1-2-е сроки хранения.

Установлено, что в процессе криоконсервирования и криохранения КТ не выявлено резкого снижения общей концентрации тромбоцитов (Стр.). Предложенный морфофункциональный метод оценки тромбоцитом показал, что концентрация тромбоцитов с гранулами, МФАТ и ААТ до криоконсервирования составили соответственно 1,2±0,4*10|2/л, 50,6±4,5 и 58,5±6,1 баллов. После криоконсервирования в течение 7-10 суток Стр.гр., МФАТ и ААТ достоверно (р<0,05) снижались и составляли соответственно 0,6±0,2*10|2/л, 40,9±5,7 и 37,5±5,9 баллов. Сохранность количества тромбоцитов с гранулами варьировала от 30 до 60%, составляя в среднем 45%. Необходимо особо подчеркнуть, что наилучшая сохранность тромбоцитов с гранулами (60% от их количества до криоконсервирования) отмечена в КТ исходно содержавших более 30% тромбоцитов богатых гранулами (ТБГ). В КТ, содержавших менее 20% ТБГ, сохранность функциональной полноценных тромбоцитов не превышала 30%.

Морфофункциональный анализ тромбоцитов при различных патологических состояниях

Всех пациентов по морфофункциональному статусу тромбоцитов крови удалось разделить на три большие группы: с нормальным, сниженным и повышенным статусом. Нормальный МФСТ в крови имели пациенты с изолированными переломами костей нижних конечностей, с хроническими трофическими язвами венозной и смешанной этиологии, реципиентов почки на 21 день после трансплантации и больных с пороками клапанов сердца. Установлено, что параметры тромбоцитов в этой группе значимо не отличались от таковых у доноров крови. Морфофункциональный статус тромбоцитов таких пациентов оценивался как нормальный. В группу со сниженным МФСТ вошли пациенты с острыми экзогенными отравлениями, с абдоминальной травмой на высоте массивной кровопотери, больные ишемической болезнью сердца после оперативного вмешательства, гематологические больные с острым миелоидным лейкозом. Во всей группе выявлено достоверное (р<0,01) снижение содержания тромбоцитов с гранулами в циркулирующей крови: значения Шр.гр. и Стр.гр. были снижены у пациентов с острыми экзогенными

16

отравлениями в среднем в 2,1 и 2,8 раза, с абдоминальной травмой на высоте массивной кровопотери - в 2,1 и 1,7 раз; у больных ишемической болезнью сердца после оперативного вмешательств - в 8,0 и 9,1 раз по сравнению с аналогичными параметрами у доноров. Следует отметить, что у пациентов с абдоминальной травмой, осложненной массивной кровопотерей, требовалась коррекция клеточного звена гемостаза. Для этого интраоперационно с учетом объема учтенной кровопотери таким пациентам осуществляли внутривенное введение 0,5-1,5 дозы КТ с функционально полноценными тромбоцитами (Е)тр.гр.=60%). Непосредственно после проведения клеточной трансфузионной терапии Стр.гр. увеличилось в среднем в 2,4 раза, Е)тр.гр.- в 1,3 раз.

Среди больных с выраженным снижением МФСТ необходимо особо выделить гематологических больных, т.к. у этих пациентов отмечалось наиболее низкое содержание биологически полноценных тромбоцитов. Так, в группе гематологических больных без клинически значимого геморрагического синдрома (КзГС) значения Шр.гр. и Стр.гр. были снижены в 1,8 и 13,2 раз, в группе с КзГС-соответственно в 10,7 и 138 раз по сравнению с донорами (табл. 2). При этом общее содержание тромбоцитов в циркулирующей крови у этих групп гематологических больных значимо не отличалось. Таким образом, у гематологических больных без КзГС содержание биологически полноценных тромбоцитов было достоверно выше, чем у больных с КзГС как относительное, так и абсолютное.

МФАТ и ААТ также были достоверно снижены (р<0,01) у больных второй группы. Наиболее выраженное подавление адгезивной активности тромбоцитов отмечено у больных ишемической болезнью сердца после оперативного вмешательства (ААТ=5,3±1,6 баллов, снижение в 10,6 раз) и у гематологических больных с клинически значимым геморрагическим синдромом (ААТ=1,5±0,9 баллов, снижение в 37,7 раза) по сравнению с нормой. Особо отметим, что у 20 из 40 обследованных гематологических больных с КзГС ААТ на стекле полностью отсутствовал. Морфологическое исследование тромбоцитов гематологических больных с КзГС показало, что практически вся популяция циркулирующих клеток таких больных имеет очень низкую интенсивность свечения. Это вызвано как дефектами цитоплазмы тромбоцитов, так и отсутствием в них гранул. У гематологических больных без КзГС эти структурно-функциональные нарушения тромбоцитов были выражены гораздо слабее.

Группу с повышенным МФСТ составили больные с тромбозами вен печени, у которых был повышен морфофункциональный статус тромбоцитов. Это выражалось в достоверном (р<0,05) повышении морфофункциональных параметров клеток: Е)тр.гр. - до 88,5±2,9%, Стр.гр. - до 503,5±25,4 тыс/мкл, МФАТ - до 60,2±4,5 баллов, ААТ - до 87,5±2,5 баллов, что превышало аналогичные параметры у доноров соответственно в 1,5,

17

4,5, 1,2 и 1,5 раза. При этом в тромбоцитах этих больных выявлено заметно увеличено количество гранул на 1 клетку.Если у доноров содержание гранул на 1 клетку составляло в среднем 8,5 гранулы, то у больных с тромбозами — 16,9 гранулы. Этот эффект может быть вызван гиперактивацией тромбоцитов в ходе тромбоза.

Таблица 2.

Морфофуикциоиальные параметры тромбоцитов человека в норме н патологии

Исследуемые группы Анализируемые параметры тромбоцитов человека

Стр., тыс/мкл М ± о Стр.гр., тыс/мкл М ± а Е>тр.гр., % М±а МФАТ, баллы М ± а ААТ, баллы М ± с

Доноры крови, N=300 248,5±24,6 116,5± 18,6 57,6±10,5 48,6±5,2 56,5±12,5

Доноры органов, N=15 101,5±10,1* 10,6±4,5* 14,8±5,9* 31,1±4,3* 15,5±10,2*

Больные с тромбозами вен печени, N=10 586,9±106,6 * 503,5±25,4* 88,5±2,9* 60,2±4,5* 87,5±2,5*

Гематологические больные безКзГС, N=60 23,6±4,6* 9,5±3,6* 34,0±14,9* 38,6±8,1* 33,8±15,6*

Гематологические больные с КзГС, N=40 20,6±5,9* 0,8±0,13*+ 5,4±2,6*+ 20,1 ±2,9*+ 1,5±0,9*+

♦достоверно относительно доноров крови при р<0,01 + достоверно относительно гематологических больных без КзГС при р<0,01

Прогнозирование развития геморрагического синдрома у гематологических больных с тромбоцитоиеиией.

Взаимосвязь между морфофункциональными параметрами тромбоцитов гематологических больных и наличием выраженного ГС оценивали на основе коэффициента ранговой корреляции Спирмена (в) при р<0,01. Тесная корреляционная взаимосвязь доказана между наличием ГС с одной стороны и 1)тр.гр.(0=0,87), Стр.гр. (0=0,9), ААТ (0=0,9), МФАТ (0=0,91) и МФСТ (0=0,91). В то же время взаимосвязь между наличием ГС и общей концентрации тромбоцитов в крови (Стр.) была слабо выраженной (0=0,21). Последнее указывает на то, что использование только концентрации тромбоцитов крови больных в качестве прогнозирующего ГС параметра не является объективным. В этой связи проведено ранжирование структурно-функциональных параметров тромбоцитов у гематологических больных для прогнозирования развития выраженного геморрагического синдрома. Основными параметрами для прогнозирования выбраны: адгезивная активность тромбоцитов (ААТ), относительное содержание тромбоцитов с гранулами (Отр.гр., %) при общей концентрации клеток от 2 до 50 тыс/мкл, морфофункциональный статус тромбоцитов (МФСТ). Использование этих параметров

позволило в 90-97% случаев объективно оценить возможность развития выраженного кровотечения на фоне тромбоцитопении.

Снижение концентрации тромбоцитов в крови (Стр. - менее 20 тыс/мкл) в крови больного не всегда приводит к развитию клинически выраженного ГС. Так, среди обследованных 60 гематологических больных без КзГС у 16 человек концентрация тромбоцитов (Стр.) варьировала от 8 до 19 тыс/мкл. Однако при этом, структурно-функциональные параметры циркулирующих клеток у этих больных были либо нормальными, либо умеренно сниженными (ААТ - 25-60 баллов, Е>тр.гр. - 30-60%, МФСТ - 60-90 баллов). С другой стороны, выраженный ГС II-III степени наблюдался у 10 больных с концентрацией тромбоцитов от 35 до 50 тыс/мкл, при этом структурно-функциональные параметры циркулирующих клеток у этих больных имели очень низкие значения ААТ (0 баллов), DTp.rp. (0-5%) и МФСТ (10-30 баллов). Отметим, что при низких значениях ААТ, DTp.rp. и МФСТ проведение трансфузии концентратов тромбоцитов обосновано даже в отсутствие выраженной тромбоцитопении (Стр.>50 тыс/мкл). Следовательно, развитие геморрагического синдрома в значительной степени связано с нарушением структуры и функций циркулирующих тромбоцитов.

Влияние процедуры искусственного кровообращения на морфофункциональный статус тромбоцитов кровн.

Изменение структуры и функции тромбоцитов во время искусственного кровообращения (ИК) может играть существенную роль в развитии послеоперационной геморрагии (G.J. Despotis, M.S. Avidan, 2001). В этой связи проведено исследование влияния ИК на биологическую полноценность тромбоцитов кардиохирургических больных с помощью предложенного метода оценки морфофункционального статуса тромбоцитов. У кардиохирургических больных до начала ИК морфофункциональные параметры тромбоцитов соответствовали норме: Стр.гр.=98,5±18,6 тыс/мкл, МФАТ=46,2±4,1 баллов, ААТ=54,2±12,5 баллов, МФСТ=100,9±9,7 баллов. После ИК у всех обследованных больных наблюдалось достоверное снижение общей концентрации тромбоцитов - у больных с ишемической болезнью сердца в среднем в 1,57 раз, у больных с пороками клапанов — в 1,59 раз (р<0,01). У больных с ишемической болезнью сердца (ИБС) отмечалось достоверное снижение параметров МФАТ, ААТ и МФСТ, которые составили соответственно 37,6±9,1, 36,1±10,5 и 72,4±9,8 баллов (р<0,01). У больных с пороками клапанов эти параметры сохранялись в пределах физиологической нормы и составили соответственно 50,5±8,6, 64,5±21,0 и 119,2±10,6 баллов (р<0,01). Послеоперационное кровотечение наблюдалось у 4 больных с ИБС и не наблюдалось у больных с пороками

клапанов, причем все кардиохирургаческие пациенты с кровотечениями имели очень низкие значения морфофункциональных параметров тромбоцитов (табл. 2). Не было выявлено тесной корреляционной связи между продолжительностью ИК и морфофункциональными параметрами тромбоцитов. Вероятно, повреждение тромбоцитов в ходе ИК, зависит не от длительности процедуры ИК, а от типа заболевания, характера проводимой операции и индивидуальных свойств больного.

Влияние антиагрегантов на морфофункциональный статус тромбоцитов человека

В настоящее время распространено использование антитромбоцитарных препаратов (антиагрегантов) для коррекции системы клеточного гемостаза в клинической практике. Изменение активности тромбоцитов под действием одного и того же антиагреганта у разных людей имеет широкую вариабельность - так, оценка числа пациентов, резистентных к клопидогрелю, колеблется от 4 до 40% (В.А. Сулимов, Е.В. Мороз, 2012). В связи с этим нами предложена морфофункциональная оценка статуса тромбоцитов крови в присутствии антиагрегантов непрямого (клопидогрель) и прямого (тикагрелор) действия.

У всех кардиохирургических больных, принимавших клопидогрель, наблюдалось достоверное снижение адгезивной активности тромбоцитов и морфофункционального статуса тромбоцитов. Так, ААТ и МФСТ через 6 часов после приема клопидореля составили 36,3±12,5 и 89,3±11,6 баллов, через 24 часа - 20,5±11,5 и 70,4±11,2 баллов, через 7 суток - 49,6±9,4 и 99,1±10,1 баллов (р<0,01), тогда как до назначения препарата ААТ и МФСТ составляли 54,3±9,7 и 103,4±10,4 баллов. При этом концентрация тромбоцитов с гранулами (Стр.гр.) и морфофункциональная активность тромбоцитов (МФАТ) не претерпевали существенных изменений. Последнее объясняется тем, что под действием клопидогреля наблюдалось снижение функциональной активности тромбоцитов при сохранении общего количества функционально полноценных клеток и их структурной целостности. У всех больных максимальное падение ААТ отмечено через 24 часа после приема клопидогреля по сравнению с ААТ у этих же больных до назначения препарата. Отмептим, что степень снижения ААТ у больных варьировало от 1,5 до 9 раз. Широкая вариабельность ААТ на стадии максимального действия клопидогреля может быть связана с разной чувствительностью больных к данному препарату.

С помощью разработанного метода оценки морфофункционального статуса тромбоцитов in vitro исследована чувствительность этих клеток к воздействию антиагреганта прямого действия (тикагрелор) у доноров крови и больных с острым коронарным синдромом на фоне ИБС. Для этого нами был предложен коэффициент ЧТТ — чувствительность тромбоцитов крови к тикагрелору, который отражает долю тромбоцитов

20

с гранулами, способных превратиться в отросчатые клетки в ходе индуцированной адгезии на стекле в присутствии тикагрелора. ЧТТ рассчитывают по формуле: ЧТТ = (Тр.отр-2 -Тр.отр-1) : Е)тр.гр., где Тр.отр-1 - содержание отросчатых тромбоцитов (%) до начала адгезии; Тр.отр-2 - содержание отросчатых тромбоцитов (%) через 25 минут экспозиции витально окрашенных клеток на стекле при 37°С в присутствие тикагрелора. Коэффициент ЧТТ может варьировать от 0 (при Тр.отр-2=Тр.отр-1) до 1 (при Тр.отр-2-Тр.отр-1=П>тр.гр.).

Предложено оценивать чувствительность тромбоцитов крови к тикагрелору с помощью коэффициента ЧТТ, который отражает долю функционально пригодных клеток, способных в присутствии тикагрелора доходить до стадии 2 (дегрануляция клеток на стекле и формирование ими отростков). На основании этого предложена классификация степени чувствительности тромбоцитов к тикагрелору: при значениях ЧТТ=0-0,09 чувствительность тромбоцитов к тикагрелору считается высокой, при 0,1-0,3 - средней, при 0,31-0,5 -сниженной, при >0,5 — низкой. Распределение доноров по коэффициенту ЧТТ было следующим: у 23-ти человек чувствительность тромбоцитов к тикагрелору была высокой, у 3-х человек - средней, у 2-х человек - сниженной, и у 2-х - низкой. У больных с острым коронарным синдромом на фоне ИБС отмечено сходное распределение по коэффициенту ЧТТ. Таким образом, как у доноров крови, так и у больных с острым коронарным синдромом наблюдалась явная неоднородность по чувствительности циркулирующих тромбоцитов к тикагрелору.

Проведенное морфофункциональное исследование тромбоцитов в норме и патологии показало широкую вариабельность всех предложенных морфофункциональных параметров тромбоцитов как у доноров, так и у пациентов с различными патологиями. Анализ тромбоцитов доноров позволил установить референтные значения этих морфофункциональных параметров, соответствующие норме. Показано, что при различных заболеваниях наблюдается достоверное изменение морфофункциональных параметров тромбоцитов. При кровотечениях количество функционально полноценных тромбоцитов и их морфофункциональный статус резко снижены, при тромбозах - заметно повышены, что позволяет прогнозировать развитие у пациента геморрагических или тромбоэмболических осложнений. С другой стороны, снижение общей концентрации циркулирующих тромбоцитов не всегда сопровождается снижением их биологической полноценности. Оценка морфофункционального статуса тромбоцитов также позволяет оценить воздействие антиагрегантов на биологическую полноценность этих клеток.

выводы

1. Разработан витальный краситель на основе трипафлавина и акридинового оранжевого (АО), позволяющий получать дифференциальное свечение цитоплазмы и гранул клеток во флуоресцентном микроскопе. Окрашенные этим красителем тромбоциты человека сохраняют свою адгезивную и агрегационную активность.

2. Анализ свечения окрашенных трипафлавином-АО клеток позволяет оценить их морфологию, целостность внутреннего состава, насыщение гранулами и мембранными структурами т.е. морфофункциональную активность тромбоцитов. Функционально полноценными являются тромбоциты, содержащие более 3 гранул с интенсивностью свечения 40-80 фут-кандел (баллов). Отсутствие свечения гранул в тромбоцитах связано с их активацией или повреждением. Клетки интенсивностью свечения 60-80 фут-кандел -тромбоциты богатые гранулами (ТБГ) - обладают повышенной морфофункциональной, адгезивной и агрегационной активностью.

3. Разработан способ анализа адгезивной активности тромбоцитов на стекле, который основан на регистрации морфологических изменений витально окрашенных тромбоцитов с помощью флуоресцентного микроскопа. Адгезивную активность оценивают по доле клеток, способных к распластыванию на стекле с последующим выбросом гранул и образованием отростков.

4. Разработан оригинальный способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов (МФСТ), включающий оценку морфофункциональной активности тромбоцитов, выражающую структурную полноценность клеток, и морфологический анализ адгезивной активности тромбоцитов на стекле, отражающий функциональную полноценность клеток. В норме МФСТ составляет 85-130 баллов.

5. Выявлена прямая корреляционная связь (г=0,741-0,925, р<0,01) между агрегационной активностью и морфофункциональными параметрами тромбоцитов, подтверждающая объективность использования морфофункционального статуса тромбоцитов для интегральной оценки их биологической полноценности.

6. По морфофункциональному статусу тромбоцитов крови доноры распределялись на три популяции: с референтным (82%), повышенным (2%) и пониженным уровнем (16%) биологической полноценности клеток.

7. Под действием антиагрегантов происходит снижение адгезивной активности тромбоцитов при сохранении их морфофункциональной активности. Степень

чувствительности тромбоцитов крови к антиагрегантам широко варьирует у разных пациентов.

8. Способ оценки МФСТ позволяет количественно и качественно охарактеризовать тромбоциты независимо от их концентрации в пробе при различных патологиях. Показано нарушение структурной целостности и функциональной активности тромбоцитов (при гематологических заболеваниях, острых экзогенных отравлениях, процедурах искусственного кровообращения); степень снижения количества циркулирующих функционально пригодных клеток (при массивных кровотечениях); гиперактивация клеток (при тромбозах).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах и изданиях

1. Хватов В.Б., Журавель C.B., Гуляев В.А., Кобзева E.H., Макаров М.С. Биологическая полноценность и функциональная эффективность клеточных компонентов крови доноров органов // Трансплантология. -2011. -№4. -С. 13-19.

2. Макаров М.С.. Боровкова Н.В., Высочин И.В., Кобзева E.H., Хватов В.Б. Способ оценки морфофункционапьного статуса тромбоцитов человека и его применение в клинической практике // Медицинский Алфавит. Современная лаборатория. -2012. -№3. -С.32-34.

3. Ермолов A.C., Хватов В.Б., Кобзева E.H., Валетова В.В., Макаров М.С. Аппаратная реинфузия в неотложной хирургии // Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова-2012. -№11. -С.8-14.

4. Макаров М.С.. Сторожева М.В., Конюшко О.И., Боровкова Н.В., Хватов В.Б. Влияние концентрации тромбоцитарного фактора роста на пролиферативную активность фибробластов человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2013.-№2.-С. 111-115.

5. Макаров М.С.. Боровкова Н.В., Хватов В.Б., Ларин А.Г., Коков Л.С. Способ оценки чувствительности тромбоцитов к тикагрелору in vitro // Медицинский Алфавит. Современная лаборатория. -2013. -№2. -С.34-37.

6. Макаров М.С. Флуоресценция в исследовании клеток: пути и возможности. // Молекулярная медицина. -2013. -№4. - С.10-15.

7. Хватов В.Б., Макаров М.С.. Боровкова Н.В. Морфологическая оценка адгезивной активности тромбоцитов с помощью витального окрашивания // Клиническая лабораторная диагностика. -2013. -№7. - С.58- 61.

8. Макаров М.С.. Кобзева E.H., Высочин И.В., Боровкова Н.В., Хватов В.Б. Морфофункционапьный анализ тромбоцитов человека с помощью витального окрашивания // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2013. -№9. -С. 388-391.

9. Хватов В.Б., Макаров М.С.. Костин А.И., Кобзева E.H., Боровкова Н.В. Прогнозирование геморрагического синдрома у гематологических больных на основе морфофункционального флуоресцентного анализа тромбоцитов // Молекулярная медицина. -2013. -№5. - С.28-31.

Патент РФ на изобретение № 2485502 «Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека», авторы Хубутия М.Ш., Макаров М.С.. Хватов В.Б., Высочин И.В., Кобзева E.H., Боровкова Н.В., Конюшко О.И., 20.06.2013.

Методические рекомендации

Оболенский В.Н., Ермолова Д.А, Макаров М.С.. Конюшко О.И., Сторожева М.В., Лаберко Л.А., Боровкова Н.В. Применение аппликаций богатой тромбоцитами аутоплазмы в лечении больных с хроническими ранами различной этиологии. - М., Департамент здравоохранения города Москвы, 2013. -16с.

Тезисы и доклады конференций

1. Костин А.И., Макаров М.С.. Хватов В.Б., Кобзева E.H. Роль оценки морфофункционального статуса тромбоцитов у больных с тромбоцитопенией в прогнозировании геморрагического синдрома // Материалы Конгресса гематологов России - Москва, 2012.-С.54.

2. Волков К.С., Макаров М.С.. Боровкова Н.В. Определение содержания функционально активных витально окрашенных тромбоцитов в автоматическом режиме // Материалы V юбилейной конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» - Москва, 2012. -С. 20-21.

3. Конюшко О.И., Макаров М.С.. Сторожева М.В., Ермолова Д.А., Хватов В.Б. Морфометрическая оценка пролиферативной активности клеточного компонента в составе биотрансплантатов на основе коллагена 1 типа человека // Материалы V юбилейной конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты»-Москва, 2012. -С. 59-60.

4. Макаров М.С.. Хватов В.Б., Боровкова Н.В. Способ оценки морфофункционального статуса витально окрашенных тромбоцитов // Материалы V юбилейной конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». -Москва, 2012. -С. 80-81.

5. Костин А.И., Макаров М.С.. Хватов В.Б., Кобзева E.H. Эффективность нового способа прижизненной окраски гранул тромбоцитов для прогнозирования тромбоцитопенического геморрагического синдрома // Материалы VI научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения» — Москва, 2012.-С. 17-18.

6. Макаров М.С.. Ларин А.Г., Боровкова Н.В., Коков Л.С., Хватов В.Б. Оценка клеточного звена гемостаза у кардиохирургических больных с помощью морфофункционального анализа тромбоцитов // Материалы VI всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии». -Москва, 2013. -С.225-226.

7. Биткова Е.Е., Макаров М.С.. Мазанов М.Х., Бранд Я.Б., Боровкова Н.В.. Морфофункциональный статус тромбоцитов при операциях коронарного шунтирования у пациентов с острым Q-необразующим инфарктом миокарда // Материалы 2-го Съезда врачей неотложной медицины. 2013. С. 15.

Подписано в печать: 17.04.2014 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 958 Отпечатано в типографии «Реглет» 101000, г. Москва, Пл. Мясницкие Ворота д.1, стр.3 (495) 971-22-77 www.reglet.ru