Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Особенности морфофункционального состояния тромбоцитов у больных с антифосфолипидным синдромом разных возрастных групп

На правах рукописи

КАСТРИКИНА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ТРОМБОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ С АНТИФОСФОЛИПИДНЫМ СИНДРОМОМ РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП

14.01.30 - Геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2011

1 9 МАЙ 2011

4846855

Работа выполнена в Филиале ГОУ ВПО РГМУ Росздрава «Научно-клинический центр геронтологии» и Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт ревматологии Российской академии медицинских наук

Научный руководитель

доктор медицинских наук,

профессор Василенко Ирина Анатольевна

Научный консультант

доктор медицинских наук,

профессор Решетник Татьяна Магомедалиевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Гаврилов Александр Олегович

доктор медицинских наук,

профессор Ананьева Лидия Петровна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет им. МЛ.Семашко

Защита состоится сЛ-ЫХл£~ 2011 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.13 ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: г. Москва, ул. 1-я Леонова, д. 16, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке филиала ГОУ ВПО РГМУ Росздрава «Научно-клинический центр геронтологии».

Автореферат разослан 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н.М.Соколова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аетуальность проблемы

Антифосфолипидный синдром (АФС) - системное, аутоиммунное заболевание, клинические проявления которого, связаны с тромбозом сосудов любой локализации и калибра (Насонов Е.Л. и соавг., 2008; Myakis S., Lockshin M.D., 2006). Диагноз АФС достоверен при обязательном сочетании клинических признаков с лабораторными маркёрами. К клиническим критериям относятся тромбоз сосуда любого калибра и локализации (венозный и/или артериальный, или микроциркуляторного русла) и акушерская патология (синдром потери плода). Лабораторными маркерами АФС являются антифосфолипидные антитела (АФЛА), причем наиболее информативны волчаночный антикоагулянт (ВА), антителам к кардиолипину (аКЛ) и к Р2 гликопротену-1 (анти-Р2-ГП-1) (G.Ruiz-Irastorza et al., 2010, A.Mehdi et al., 2010). Ряд клинических проявлений, таких как: тромбоцитопения, сетчатое ливедо, пороки клапанов сердца, сосудистые головные боли по типу мигрени, хорееформные гиперкинезы, которые ассоциируются с АФЛА и могут быть в дебюте заболевания не включены в диагностические критерии АФС. Наличие этих клинических признаков с позитивными уровнями АФЛА при отсутствии другого заболевания верифицируется как «вероятный» АФС или «преАФС» (R.A.Asherson, 2006)

Тромбоцитопения в первых диагностических критериях АФС относилась к основным проявлениям симптомокомплекса. Тромбоцитопения встречается в 27,7% случаев первичного АФС и в 22,4% случаев вторичного АФС. Отмечено, что у 38% больных с идиопатической тромбоцитопенической пурпурой (ИТП) могут выявляться АФЛА, при этом у 60% из них в течение последующих 5 лет развивались тромбозы различной локализации, тогда как у больных без АФЛА тромбозы наблюдались в 2,3% случаев (С. Bueno et al, 1998; M.Deleze et al, 1988). Геморрагические осложнения, несмотря на тромбоцитопению, наблюдаются редко и, как правило, связаны с сопутствующим дефектом специфических факторов свертывания крови, патологией почек или передозировкой антикоагулянтов. В 20% случаев тромбоцитопения может предшествовать развитию достоверного АФС, что оправдывает выделение аФЛ-ассоциированной тромбоцитопении G. (Espinosa., R. Cervera, 2008).

Фосфолипиды активированных тромбоцитов стимулируют свертывающую систему и ускоряют образование тромбина. Следовательно, любые вещества, повреждающие клеточные мембраны, в том числе антитела к фосфолипидным детерминантам, потенциально способны повышать уровень образования тромбина и нарушать систему свертывания крови, ускоряя коагуляцию или замедляя фибринолиз (Раденска-Лоповок С.Г., Решетняк Т.М., 2003; Макацария А.Д., 2007; Harris E.N. et al. 1989; Khamashta M.A., Asherson R.A., 1995).

При изучении патогенеза АФС основное внимание обычно уделяется взаимодействию АФЛА с эндотелиальными клетками (ЭК), вопросы активации тромбоцитов остаются недостаточно изученными. В то же время

известно, что одной из причин приобретения интимой сосудов протромботических свойств является взаимодействие активированных тромбоцитов с эндотелием, что создаёт порочный круг, приводящий к прогрессирующим сосудистым нарушениям (Stephens G., 2005).

Достаточно важным и актуальным является изучение возрастного аспекта АФС. Установлено, что частота встречаемости многих антител увеличивается с возрастом человека и АФЛА не являются исключением. Гиперпродукция антител к фосфолипидам может встречаться у лиц старших возрастных групп: около 7-12% пожилых людей (старше 65 лет) позитивны по Ig-G и Ig-M антикардиолипиновым и антифосфолипидным антителам. Однако значение антифосфолипидных антител в крови пожилых людей представляется не до конца ясным, поскольку выявление АФЛА не всегда сочетается с характерной клинической картиной АФС (Решетняк Т.М., Штивельбанд И.Б., 2002; М. Ozguroglu и соавторы, 1999; Решетняк Т.М. и Штивельбанд И.Б., 2002) отметили связь между IgG- и IgM-aKJI с венозным тромбозом и неопластическими заболеваниями у лиц в возрасте 65 лет и старше. Поэтому дебют антифосфолипидного синдрома у пациентов старше 45 лет требует дифференциальной диагностики в первую очередь с неопластическими и лимфопролиферативными заболеваниями.

Специалисты отмечают неоднородность патогенетических механизмов, лежащих в основе АФС, полиморфизм клинических проявлений, отсутствие достоверных клинических и лабораторных показателей, позволяющих прогнозировать рецидивирование тромбозов (Доброхотова Ю.Э и соавт., 2006; Клюквина Н.Г, 2007; Насонов ЕЛ. и соавт., 2008). Всё это диктует необходимость проведения широкого дифференциального поиска, внедрения новых высокочувствительных лабораторных методов обследования.

Цель исследования

Установить диагностическую значимость витальных показателей морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови в оценке тромботических осложнений у больных различных возрастных групп с антифосфолипидным синдромом.

Задачи исследования

1. Оценить характер инволютивных изменений морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови практически здоровых добровольцев различных возрастных групп (юного и молодого, среднего и пожилого возраста) методом витальной компьютерной фазометрии (КФМ).

2. Охарактеризовать особенности морфологической структуры и функциональной активности тромбоцитов периферической крови больных с антифосфолипидным синдромом (изолированным и на фоне СКВ) старших возрастных групп методом витальной компьютерной фазометрии.

3. Оценить влияние антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител на морфофункциональное состояние циркулирующих тромбоцитов у больных с антифосфолипидным синдромом и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой (ИТП) в условиях in vivo и in vitro.

4. Сопоставить результаты компьютерной фазометрии тромбоцитов с данными традиционных методов клинико-лабораторного исследования (гемостазиограммами, исследованием уровня антитромбоцитарных антител(АТА) и др.).

Научная новизна

Определены особенности и закономерности течения антифосфолипидного синдрома (изолированного и на фоне СКВ) у больных различных возрастных категорий.

Выявлены и количественно оценены изменения структурной организации и функциональной активности тромбоцитов периферической крови при антифосфолипидном синдроме. Установлено, что нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза связаны с изменениями размерных параметров, морфологии и функционального состояния циркулирующих тромбоцитов.

Впервые проведена комплексная оценка гетерогенности тромбоцитарной популяции, ассоциированной с наличием возрастных, иммунологических и гемостазиологических изменений у пациентов с антифосфолипидным синдромом, системной красной волчанкой и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой.

Получены новые данные о субпопуляции макроформ тромбоцитов, позволяющие расширить сложившиеся представления об особенностях тромбоцитопоэза в норме и при развитии патологического процесса.

Описаны и количественно оценены эффекты влияния антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител в условиях ¡n vivo и in vitro на морфологическую структуру и функциональную активность тромбоцитов периферической крови. Установлена корреляция между титром антитромбоцитарных антител и развитием нарушений морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови.

Практическая значимость

На основе полученных данных определен комплекс диагностических морфометрических критериев активации тромбоцитарного звена гемостаза у больных с антифосфолипидным синдромом разных возрастных групп.

Экспресс-метод витальной компьютерной морфометрии тромбоцитов апробирован в клинической практике как скрининговый при обследовании больных с антифосфолипидным синдромом и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой юного и молодого, среднего и пожилого возраста.

Повышение эффективности диагностики состояния тромбоцитарного гемостаза при антифосфолипидном синдроме на основе использования витальной компьютерной фазометрии позволит своевременно выявлять нарушения, проводить адекватную профилактическую или лечебную их коррекцию, будет способствовать уменьшению количества больных с тяжелыми формами заболевания, сокращению сроков временной нетрудоспособности, а также расходов пациентов и страховых компаний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Инволютивные изменения тромбоцитарного гемостаза в условиях физиологической нормы у лиц старших возрастных групп заключаются в снижении активности тромбопоэза, изменении функциональной полноценности и морфологической структуры клеток, увеличении гетерогенности циркулирующей популяции.

2. Предикторами тромбозов у больных с антифосфолипидным синдромом могут служить морфометрические показатели живых тромбоцитов периферической крови (увеличение их размерных параметров, повышение содержания активированных клеток).

3. Характер изменения морфофункционального состояния тромбоцитов у больных с антифосфолипидным синдромом и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой непосредственно определяется уровнем циркулирующих антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител, а также особенностями молекулярно-клеточных механизмов их взаимодействия с рецепторами тромбоцитов.

Внедрение в практику

Основные положения и материалы диссертации внедрены в клиническую практику ГОУ ВПО Российский университета дружбы народов, Учреждения РАМН «Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН», филиала ГОУ ВПО РГМУ Росздрава «Научно-клинический центр геронтологии».

Публикации

Результаты исследований отражены в 15 публикациях, из них три в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы

Основные материалы и положения работы доложены и обсуждены на 25-й научно-практической конференции «Морфометрия в диагностике болезней» (Москва, 2006); XXI Congress ISTH, (Geneva, Switzerland, 2007); I научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва (2008); XIII Congress ЕНА (Copenhagen, Denmark, 2008); II научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2009); XXII Congress ISTH (Boston, USA, 2009); VI Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых» (Москва, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2010).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 81 отечественных и 68 зарубежных источников литературы. Работа иллюстрирована 16 рисунками и^Р таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, материал и методы исследования

В диссертации обобщены данные обследования 206 пациентов, находившихся на лечении в Учреждении РАМН НИИ ревматологии РАМН в период с 2005 по 2010 гг.: 130 больных страдали АФС (58 изолированной формой заболевания, 72 - АФС на фоне СКВ), 76 - СКВ без АФС. Группы сравнения составили 67 пациентов с ИТП, проходивших лечение в Гематологическом научном центре РАМН (2007-2010 гг.) и 30 практически здоровых добровольцев различного возраста (Табл. 1).

Формулировка диагнозов соответствовала Международной статистической классификации болезней. Возрастная градация обследованных пациентов проводилась с учетом классификации, принятой на Международном симпозиуме по проблемам геронтологии ВОЗ (Москва, 1965). Больные и здоровые добровольцы при включении в исследование были распределены на 2 возрастные категории - 18-44 года - пациенты юношеского и молодого возраста (73%), и 45-74 лет - пациенты среднего и пожилого возраста (27%). Среди обследованных больных мужчин было 28%, женщин - 72%.

Таблица 1

Характеристика больных на момент включения в исследование

Группы (количество больных)

Параметры АФС АФС+СКВ СКВ ИТП зд

п=58 п=72 п=76 п=67 п=30

Женщины/мужчины 38/20 55/17 55/21 57/10 18/12

Возраст 18-44 лет 45 50 61 54 16

45-74 лет 13 22 15 13 14

Длительность течения изолированного АФС у пациентов юношеского и молодого возраста варьировала от 3 месяцев до 38 лет (средняя длительность - 8,8±4,5 лет), в группе среднего и пожилого возраста - от 1 до 46 лет (18,7±7,9 лет). Разброс длительности течения АФС+СКВ с момента появления первого признака заболевания составил: в юношеском и молодом возрасте - от 3 месяцев до 31 года (в среднем - 14±3,1 лет), в среднем и пожилом - от 9 месяцев до 39 лет (в среднем - 26±9,2 лет). У пациентов 4574 лет с дебютом заболевания в среднем и пожилом возрасте (длительность до 5 лет) чаще встречалось изолированное течение АФС (23% от всех пациентов данной возрастной группы).

Пациентам всех групп проводились стандартные клинико-лабораторные исследования: общий и биохимический анализ крови, общий анализ мочи, определение белковых фракций, печеночных ферментов, общего холестерина и холестерина липопротеидов высокой и низкой плотности, триглицеридов, вирусологическое и бактериологическое исследование. Всем пациентам определяли уровень антифосфолипидных антител класса IgM и IgG методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) ELISA. При исследовании плазменного звена системы

гемостаза определяли следующие показатели: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ); волчаночный антикоагулянт; количество фибриногена по Клаусу; тромбиновое время (ТВ); протромбиновую активность; уровень растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК). При исследовании тромбоцитарного звена гемостаза использовали витальную компьютерную фазово-интерференционную микроскопию тромбоцитов на базе отечественного компьютерного лазерного фазово-иятерференционного микроскопа "Цитоскан" (МГИРЭА, Москва).

Статистический анализ экспериментальных и клинических данных проводили с помощью алгоритмов среды Ма&аЬ и математического пакета '^а^БЙса 6". Стандартная обработка выборок включала подсчет значений средних арифметических величин, ошибок средних, а также величины среднего квадратичного отклонения и анализа асимметричности распределения. Различия между сравниваемыми группами рассчитывали по критериям Колмагорова-Смирнова или Стьюдента Уровень значимости устанавливался равным 0,05.

Основные результаты исследования и их обсуждение

На основании анализа клинико-анамнестических данных, выявлено, что у пациентов 45-74 лет, страдающих АФС, с дебютом заболевания в среднем и пожилом возрасте (длительность до 5 лет) чаще встречалось изолированное течение антифосфолипидного синдрома - 23% от всех пациентов данной возрастной группы. С увеличением возраста у больных возрастала частота встречаемости тромбозов: венозные тромбозы были в анамнезе у 64% и 85% больных с изолированной формой АФС молодого (1844) и старшего (45-74) возраста, соответственно; при АФС на фоне СКВ - у 56% и 68%, соответственно. Артериальные тромбозы встречались у 35% и 77% больных с АФС молодого и старшего возраста, соответственно; с АФС и СКВ - у 54% и 50%, соответственно. Также для пациентов среднего и пожилого возраста было характерным увеличение случаев острого нарушения мозгового кровообращения - 61% и 41% в группах с АФС и АФС+СКВ против 22% и 34% в аналогичных клинических группах, но у больных в молодого возраста (18-44 лет) (р<0,05).

При исследовании структуры акушерской патологии у женщин репродуктивного возраста (18-44) наблюдалось значительное преобладание случаев самопроизвольного прерывания беременности на ранних сроках по сравнению над численностью случаев гибели плода на поздних сроках беременности. У 45% пациенток этой возрастной группы наблюдались метроррагии, в то время как для женщин средней и пожилой возрастной категории это не было характерным.

Выявление искомых антител одновременно и частота встречаемости изолированных аВ2ГП1, аКЛ, ВА оказалась выше для пациентов с АФС юношеского и молодого возраста (16% и 49% против 8% и 30% у больных старшего возраста). И напротив, процент серонегативных (на момент исследования) случаев АФС был выше у пациентов среднего и пожилого

возраста (46% против 13%). Также обращает на себя внимание обнаружение ВА в крови лиц преимущественно юношеского и молодого возраста с АФС и АФС+СКВ (2% и 4%). В случае изолированного АФС в юношеском и молодом возрасте более половины пациентов были высокопозитивны по аКЛ (52%), в то время как у средневозрастных и пожилых больных с АФС преобладали низкие значения аКЛ (39%). При АФС на фоне СКВ процент высокопозитивных по аКЛ юных и молодых пациентов был ниже (32%), а у пациентов среднего и пожилого возраста чаще встречался высокий (37%) и средний (27%) уровень аКЛ.

У обследованных больных на момент их поступления в стационар были обнаружены нарушения в системе гемостаза, свидетельствующие об изменении потенциала свертывания крови (Табл.2 и 3).

Таблица 2

Показатели плазменного звена гемостаза у пациентов юношеского и

молодого возраста (18-44 лет)

Клинические группы АЧТВ сек ПТИ % Фибриноген г/л ТВ сек РФМК г/л

Контроль 36,3±3,3 98,5±6,8 2,8±0,8 16,6±1,7 3,6±0,8

ПАФС 48,1±3,8* 81,0±5,4* 3,1±1,0 15,9±1,5 6,4±1,1*

АФС+СКВ 41,5±3,2* 78,8±5,7* 3,1 ±0,9 15,3±1,5 6,1±0,9*

СКВ 40,2±3,3 83,5±5,1 2,9±0,8 15,9±1,6 5,7±1,0

ИТП 39,0±3,4 110±7,1* 3,3±1,2 18,0±1,8 4,5±0,8

Примечание: 'достоверно относительно контроля, при р<0,05

Таблица 2

Показатели плазменного звена гемостаза у пациентов старших возрастных __ групп (45-74 лет) __'

Клинические ппы АЧТВ сек ПТИ % Фибриноген г/л ТВ сек РФМК г/л

Контроль 36,6±4,0 96,9±6,2 3,9±0,9 17,8±1,0 4,4±0,9

ПАФС 38,6±4,2 92,0±5,4 2,3±0,6 15,5±0,8 6,0±1,0*

АФС+СКВ 38,1±4,1 72,5±5,0 2,8±0,7 15,8±1,1 4,8±0,5

СКВ 34,4±3,9 99,8±6,6 5,4±1,0* 17,5±1,0 5,5±0,8

ИТП 35,0±4,0 96,3±6,1 2,9±0,8 16,2±1,0 7,5±1,1*

Примечание: 'достоверно относительно контроля, при р<0,05

У пациентов юношеского и молодого возраста при анализе показателей плазменного звена гемостаза выявлено увеличение значений АЧТВ при изолированном АФС, АФС+СКВ, СКВ и ИТП на 32%, 14%, 11% и 7%, соответственно; РФМК - на 79% 70%, 59% и 25%, соответственно. Отмечено снижение ПТИ на 18%, 20%, и 15% при изолированном АФС, АФС+СКВ и СКВ, соответственно; ТВ - на 4%, 8% и 4% при изолированном АФС, АФС+СКВ и СКВ, соответственно. У больных с ИТП величины ПТИ и ТВ, напротив, увеличивались на 11% и 8%, соответственно (Табл.2).

Следует отметить, что для больных юношеского и молодого возраста изменения плазменного гемостаза при изолированном АФС являются более выраженными по сравнению с АФС+СКВ и СКВ. Удлинение АЧТВ рассматривают как один из предварительных лабораторных критериев при отборе пациентов с достоверным АФС. Показатель отражает активность факторов внутреннего пути свертывания, наличие в крови ингибиторов этих факторов и антикоагулянтов, но не позволяет судить о нарушениях в тромбоцитах, недостаточности проконвертина, фибринстабилизирующего фактора и недостатка кальция в системе.

Удлинение АЧТВ при антифосфолипидном синдроме, вероятно, можно объяснить присутствием в плазме пациентов ингибитора - волчаночного антикоагулянта, блокирующего фосфолипидную матрицу и парадоксально влияющего на баланс свёртывающей и противосвертывающей системы в сторону возникновения тромбозов. Механизм возникновения тромбоза у больных с ВА представляется не до конца ясным, однако известно, что антитела к фосфолипидам снижают продукцию простациклина эндотелиальными клетками за счет ингибирования фосфолипазы А2 и протеина Б и, таким образом, создают предпосылки к тромбообразованию.

Обращает внимание, что у практически здоровых добровольцев с возрастом наблюдается некоторое повышение регистрируемых величин тромбинового времени и уровня РФМК. Эти показатели взаимосвязаны, поскольку тромбиновое время отражает активность процессов полимеризации фибриногена/фибрина и антикоагулянтную активность плазмы. Увеличение ТВ может происходить в присутствии повышенной концентрации продуктов деградации фибрина (ПДФ). ПДФ взаимодействует с фибрин-мономерами, увеличивая количество РФМК. Оба показателя косвенно отражают незначительное увеличение активности тромбина, проявляемое с возрастом.

Мы не наблюдали статистически значимых различий между показателями плазменного гемостаза при изолированном и сочетанном с СКВ антифосфолипидном синдроме у больных старших возрастных категорий. В то же время для этих пациентов также было характерным увеличение АЧТВ на 5% и 4%, РФМК на 36% и 10% при изолированном АФС и АФС+СКВ, соответственно. Снижение фибриногена и ТВ по сравнению с нормальными значениями данных показателей в соответствующей возрастной группе практически здоровых людей составило 41% и 13%, 28% и 11,5% при изолированном АФС и АФС+СКВ, соответственно. У пациентов с СКВ анализируемые показатели оставались в пределах нормальных значений, за исключением повышенного фибриногена плазмы (на 36%) и АЧТВ, наоборот незначительно снизившегося (на 6%).

Суммируя выше изложенное, можно заключить, что информативными лабораторными показателями состояния системы гемостаза при АФС являются увеличение значений АЧТВ и РФМК, снижение ПТИ и ТВ. Однако у больных старших возрастных групп изменения плазменного гемостаза

имеют менее выраженный «стертый» характер, что может способствовать гиподиагностике и недооценке тяжести состояния пациента.

Витальная компьютерная фазово-интерфереиционная микроскопия тромбоцитов практически здоровых лиц различных возрастных групп

На основе анализа библиотеки полученных фазово-интерференционных портретов живых тромбоцитов было охарактеризовано 4 основных морфологических типа клеток, отражающих степень их активации в соответствии с различием вариантов их формы, характера рельефа поверхности, наличия псевдоподий, их количества и величины (Рис.1).

Рис.1 Схематическое изображение морфофункциональных типов тромбоцитов периферической крови: I - тромбоцит «покоя»; II - тромбоцит с низким уровнем активности; III - высоко активированный тромбоцит; IV - дегенеративно-измененные тромбоцит

Важно отметить, что фазовые портреты содержат информацию как о пространственно-объемных, так и об оптических свойствах цитообъектов, зависящих от концентрации, химического состава, агрегатного состояния внутриклеточного вещества, наличия органелл и включений.

В условиях физиологической нормы большая часть тромбоцитов периферической крови представлена «формами покоя» - плоскими, округлыми клетками с гладкой или складчатой поверхностью — «гладкие» и «рифленые» дискоциты (I морфологический тип). II морфологическому типу тромбоцитов соответствуют клетки округлой или неправильной формы с несколькими короткими и широкими (меньше диаметра клетки) отростками-псевдоподиями, являющимися выростами поверхностной мембраны -«эхиноциты» 1 класса. Тромбоциты III типа представляют собой разнообразные по форме клетки, обладающие большим количеством длинных отростков- «антенн» (больше диаметра тромбоцита) - «эхиноциты» 2 класса. Клетки II - III типов, отличающиеся изменением их формы и появлением отростков различного числа и длины, связанной с перестройкой цитоскелета и структуры грануломера, проявляют внешние признаки функциональной активности. Широкие распластанные тромбоциты неправильной формы с неровной бугристой поверхностью, большим количеством отростков различной длины и многочисленными вакуолями соответствуют IV морфологическому типу - дегенеративным тромбоцитам, исчерпавшим свой функциональный потенциал.

В группе здоровых добровольцев юношеского и молодого возраста соотношение морфологических типов тромбоцитов составило: 55% - формы «покоя», 35% - тромбоциты с низким уровнем активации, 9% - высоко активированные клеток и 1% - дегенеративные тромбоцитов. В старших

II

III

IV

возрастных группах (45-74 лет) морфологический состав клеточного звена гемостаза практически не претерпевал изменений: отмечалось небольшое увеличение числа тромбоцитов «покоя» (на 2,3%), недостоверное снижение высоко активированных форм (на 3%) и увеличение числа дегенеративно-измененных клеток (на 0,4%).

При анализе морфометрических параметров живых тромбоцитов периферической крови практически здоровых добровольцев разных возрастных групп мы не выявили достоверных изменений (Табл.4).

Таблица 4

Размерные параметры тромбоцитов периферической крови практически

здоровых лиц различных возрастных групп (М±а)

Группы Диаметр мкм Периметр мкм Высота мкм Площадь мкм2 Объем мкм3

Юношеский и молодой возраст (18-44 лет) 2,94±0,70 8,63±239 1,01*036 4,94±2,64 1,9941,25

Старшие возрастные группы (45-74 лет) 2,91 ±0,8 8,56±234 1,04±038 4,92±2,7 2,05±1,25

Все морфометрические характеристики тромбоцитов в группах сравнения были сопоставимыми. Можно отметить лишь некоторую тенденцию к снижению диаметра и периметра (на 1-2%) и увеличению (на 3%) фазовой высоты и объёма у лиц в возрасте 45-70 лет.

Фазовая высота клеток и их объём - оптические показатели, зависящие от состояния тромбоцитарного грануломера. Небольшое увеличение этих показателей с возрастом, вероятно, свидетельствует о преобладании в циркулирующей популяции старых тромбоцитов - клеток с узким гиаломером и огромным плотным грануломером, вследствие снижения у пожилых лиц скорости тромбопоэза, что соотносится с имеющимися данными научной литературы.

Поскольку усредненные значения клеточных показателей не всегда адекватно отражают имеющиеся изменения, был изучен характер распределения популяции циркулирующих в периферической крови тромбоцитов путем сравнительного анализа гистограммного распределения клеток по величине их морфометрических показателей в различных возрастных группах.

Характер гетерогенности тромбоцитов периферической крови в обеих группах в целом соответствовал закону нормального распределения, которое можно количественно оценить с помощью асимметричности (ее количественным показателем является индекс асимметричности - ИА) и эксцесса. Тромбоцитарное звено гемостаза в группе лиц среднего и пожилого возраста характеризовалось большей гетерогенностью, появляющейся увеличением правого эксцесса, особенно в гистограммах распределения клеток по величине их диаметра (0,62 против0,52), высоты (0,53 против 0,36), площади (1,70 против 1,55) и объема 1,67 против 1,41).

В основном, обнаруженные изменения имели характер тенденции: более выраженная гетерогенность циркулирующей популяции у обследованных добровольцев старших возрастных групп может быть связана с преобладанием в популяции старых тромбоцитов вследствие снижения у пожилых лиц скорости тромбопоэза.

Особенности морфофункционалыюго состояния тромбоцитов периферической крови больных с антифосфолипидным синдромом разных возрастных групп

Использование витальной компьютерной фазово-интерференционной микроскопии позволило количественно оценить изменения морфофункционального статуса клеточного звена гемостаза в присутствии АФЛА и ATA.

В таблице 5 представлен морфологический состав циркулирующей популяции тромбоцитов в клинических группах с учетом возрастных категорий обследованных больных.

Таблица 5

Соотношение морфологических типов тромбоцитов периферической крови практически здоровых лиц и больных разных возрастных групп с АФС, АФС+СКВ, СКВ и ИТП (М±а)

Тип клеток Контроль (%) (18-44 лет/ 45-74 лег) ПАФС (%) (18-44 лег/ 45-74 лег) АФС+СКВ(%) (18-44 лет/ 45-74 лег) СКВ(%) (18-44 лег/ 45-74 лег) ИТП(%) (1844 лег/ 45-74 лет)

I тип 55/57 49/45* 52/36* 43*/43* 32*/36*

II тип 35/35 28*/31 30/36 29V35 43 */41 *

III тип 9/6 13*/19* 14*/24* 18*/17* 23*/20*

IV тип 1/2 10*/5* 4*/4* 10*/5* 2/3

Примечание: 'достоверно относительно контроля, при р<0,05

У больных юного и молодого возраста при изолированном АФС, АФС+СКВ и СКВ отмечено снижение тромбоцитов «покоя» до 49%, 52% и 43%, соответственно. Содержание активированных клеток (II и III морфологический тип) остается в пределах значений практически здоровых лиц: 41%, 44% и 47% против 44%. При этом в 4-10 раз увеличен процент дегенеративных тромбоцитов.

В группе больных среднего и пожилого возраста с изолированным АФС, АФС+СКВ и СКВ отмечено выраженное изменение активационного статуса циркулирующих клеток: снижение числа форм покоя до 45%, 36% и 43%, соответственно, против 57% в группе здоровых добровольцев; увеличение активированных тромбоцитов до 50%, 60% и 52%, соответственно, против 41% и увеличение дегенеративных тромбоцитов до 5%, 4% и 5%, соответственно, против 2%. При этом, следует отметить, что если у больных юношеского и молодого возраста с АФС активация тромбоцитарного звена гемостаза была более выраженной при изолированной форме заболевания, то у пациентов среднего и пожилого

возраста значимое увеличение активационного статуса клеток наблюдалось при АФС на фоне СКВ.

Наиболее яркие изменения морфологической структуры популяции тромбоцитов зарегистрированы у больных с ИТП: процентное соотношение I, II-III и IV клеточных типов составляет 36%, 61% и 3%, соответственно. По-видимому, резкое увеличение функциональной активности тромбоцитов является компенсаторным в условиях выраженной тромбоцитопении.

В таблицах 6 и 7 суммированы результаты анализа морфометрических параметров живых тромбоцитов периферической крови обследуемого контингента больных.

Таблица 6

Размерные параметры тромбоцитов периферической крови у больных с АФС, АФС+СКВ, СКВ и ИТП молодого возраста (18-44 лет) (М+о)

Показатель АФС АФС+СКВ СКВ ИТП

Диаметр, мкм 3,5+1,3* 3,5+1,2* 3,7±1,3* 3,6+1,1*

Периметр, мкм 11,0±5,3* 10,8±5,0 11,8+5,5* 11,1+4,1*

Высота, мкм 1,2±0,6 1,0±0,6 1,0±0,5 1,3+0,5*

Площадь, мкм"1 7,9+6,4* 7,3+5,4* 8,3+6,1* 7,5+4,9*

Объём, мкм3 3,3±2,7* 2,8+2,1* 2,2+2,2 3,8+3,5*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

Во всех клинических группах выявлено изменение оптико-геометрических параметров циркулирующих тромбоцитов по отношению к их возрастным нормативным величинам. У пациентов молодого возраста средние в популяции диаметр, периметр, площадь и объем клеток при изолированном АФС были увеличены на 19%, 27%, 59% и 66%, соответственно. При АФС на фоне СКВ - на 19%, 25%, 47% и 41%, соответственно. Аналогичные изменения размерных показателей тромбоцитов наблюдались у больных с СКВ и с ИТП. Однако присутствие в сыворотке антитромбоцитарных антител вызывало более значительное увеличение диаметра, периметра, площади и объема циркулирующих тромбоцитов до 24%, 29%, 52% и 90%, соответственно.

Таблица 7

Размерные параметры тромбоцитов периферической крови у больных с АФС, АФС+СКВ, СКВ и ИТП старших возрастных групп (45-74 лет) (М±а)

Показатель АФС АФС+СКВ СКВ ИТП

Диаметр, мкм 3,4+1,2* 3,7+1,4* 3,6+1,2* 3,5+1,1*

Периметр, мкм 10,5+5,0 12,0+6,2* 11,2+4,7* 11,1+4,3

Высота, мкм 1,2+0,7* 1,0+0,4 1,0+0,4 1,3+0,5*

Площадь, мкм2 7,2+6,2 8,1+6,4* 7,4+4,6 7,5+5,5

Объём, мкм3 2,9+2,4 2,6+1,9 3,1+2,1 3,9+3,7*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

Интересные данные получены при анализе фазовой высоты тромбоцитов, отражающей плотность гранулярного аппарата клеток. Так, в присутствии АФЛА у больных с изолированным АФС этот показатель увеличивался на 19% по отношению к возрастной норме, а при АФС+СКВ и СКВ, напротив, оставался в диапазоне нормативных значений. Воздействие ATA вызывало увеличение фазовой высоты на 29% по отношению к норме.

У пациентов среднего и пожилого возраста морфометрические показатели тромбоцитов изменялись аналогичным образом. Средние в популяции диаметр, периметр, площадь и объем клеток при изолированном АФС были увеличены на 17%, 23%, 46% и 41%, соответственно, а при АФС+СКВ - на 28%, 40%, 65% и 27%, соответственно. Т.е., у этой категории больных большие размеры тромбоцитов были зарегистрированы именно при вторичной форме заболевания.

Наиболее ярко неоднородность циркулирующей популяции тромбоцитов представлена у больных юношеского и молодого возраста. Возможно, это отражает активность адаптационных процессов перестройки тромбоцитарного звена гемостаза в условиях прогрессирования патологического процесса. В тоже время обращает внимание, что изменение морфофункционального состояния тромбоцитов у больных с АФС юношеского и молодого возраста более выражено при первичной форме антифосфолипидного синдрома, а у больных среднего и пожилого - при вторичной форме.

Одной из основных причин гетерогенности тромбоцитарной популяции может являться обнаруженное нами наличие в циркуляции макроформ тромбоцитов - клеток, значительно превышающих нормальные показатели диаметра (более 5 мкм), периметра и площади. Было установлено, что субпопуляция макротромбоцитов также является неоднородной - в ней были выявлены две категории тромбоцитов: с высокими или низкими значениями фазовой высоты и объема при практически соизмеримых величинах диаметра, периметра и площади

Считается, что макротромбоциты представляют собой молодые незрелые тромбоциты, осколки мегакариоцитов. Увеличение их процентного содержания в общем пуле циркулирующих клеток свидетельствует об активации процессов тромбоцитопоэза. Различие в оптических параметрах (фазовая высота и объем) этих клеток при равнозначных величинах геометрических параметров (диаметр, периметр и площадь) позволяют предположить, что клетки с более низкой оптической плотностью -тромбоциты с обедненным гранулярным аппаратом и наоборот.

Особенно яркое разделение тромбоцитарной популяции на две категории наблюдалось у лиц старших возрастных групп с системной красной волчанкой и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой: у пациентов с изолированным АФС процент гигантских тромбоцитов составил 15,6%, при АФС на фоне СКВ - 18,1%, у больных с СКВ - 22,2%. У пациентов с ИТП - всего 11 % против 2% у практически здоровых добровольцев.

При АФС соотношение макротромбоцитов высокой и низкой плотности составляло 44,5% и 55,5%, при АФС на фоне СКВ - 34,9% и 65,1%. У больных с СКВ - 36,4% и 63,6%. При ИТП соотношение макротромбоцитов высокой и низкой плотности составило 55% и 45%, соответственно.

Вважным аспектом изучения патогенетических особенностей антифосфолипидного синдрома является определение участия антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител в нарушении морфофункционального статуса тромбоцитов. Для исследования этих вопросов в условиях in vivo пациенты в зависимости от уровня антител (антифосфолипидных (антикардиолипиновых IgG) при АФС и СКВ и антитромбоцитарных (анти GP-IIb/IIIa) при ИТП) были разделены на две группы: с низким (антикардиолипиновые IgG<50, антитромбоцитарные антитела < 500%) и высоким (антикардиолипиновые IgG>50, антитромбоцитарные антитела > 500%) содержанием антител в сыворотке крови (Табл. 8 и 9).

Таблица 8

Морфометрические показатели тромбоцитов периферической крови при низком уровне антител (антикардиолипиновые IgG<50, антитромбоцитарные антитела < 500%) (М±о)

Показатель АФС АФС+СКВ СКВ ИТП

Диаметр, мкм 3,6±1,2* 3,5±1,3* 3,8±1,3* 3,9±1,2*

Периметр, мкм 11,0±5,0* 11,2±5,6* 12,4±5,9* 12,2±4,5*

Высота, мкм 1,1±0,4 1,1±0,6 1,2±0,6 1,3±0,5*

Площадь, мкм 7,9±6,1* 7,6±6,2* 9,0±6,7* 8,9±6,0*

Объём, mkmj 3,2±2,5* 2,8±2,2* 3,3±2,6* 4,1±4,0*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

Таблица 9

Морфометрические показатели тромбоцитов периферической крови при высоком уровне антител (антикардиолипиновые IgG>50, антитромбоцитарные антитела > 500%) (М±а)

Показатель АФС АФС+СКВ СКВ ИТП

Диаметр, мкм 3,1±1,3 3,5±1,2* 3,6±1,1* 3,5±1,2*

Периметр, мкм 10,0±5,0 10,9±4,9 11,3±4,4* 10,8±4,1

Высота, мкм 1,6±1,0* 0,9±0,4 1,0±0,5 1,2±0,5

Площадь, мкм2 6,7±6,3 7,2±4,9* 7,8±5,4* 7,2±5,0*

Объём, мкм3 3,2±2,9* 2,6±1,9* 2,6±1,7* 3,8*3,7*

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

При анализе морфофункциональных и активационных параметров тромбоцитов, мы не выявили зависимости между размерными показателями тромбоцитов и уровнем антикардиолипиновых антител в сыворотке крови.

Во всех клинических группах и при низком, и при высоком уровне антител тромбоциты в циркуляции отличались большими значениями диаметра, периметра, площади и объема.

Морфологическая структура популяции тромбоцитов и при низком и высоком уровне АФЛА также не претерпевала достоверных изменений (Табл. 10).

Таблица 10

Соотношение морфологических типов тромбоцитов периферической крови у больных с АФС, АФС+СКВ, СКВ и ИТП при низком (антикардиолипиновые ^С<50, антитромбоцитарные антитела < 500%) и высоком уровне антител (антикардиолипиновые ^0>50, антитромбоцитарные антитела > 500%) (%)

Тип АФС (%) АФС+СКВ (%) СКВ (%) ИТП (%)

клеток (низкий/высо- (низкий/высо- (низкий/высо- (низкий/высо-

кий титр AT) кий титр AT) кий титр AT) кий титр AT)

I тип 50,5/50 50/51 42/38,5 25/45

Ii тип 28,5/29,5 30/30 30/34 51/40

III тип 13/12,5 16/15 20/15 19/15

IV тип 8/8 4/4 8/12,5 5/0

У больных с ИТП при низком уровне ATA преобладали активные формы тромбоцитов (клетки I типа составили всего 25%, в то время как процент низко- и высокоактивированных клеток увеличился до 51% и 19%, соответственно), количество дегенеративно-измененных форм составило 5%. Особенностью тромбоцитов в группе пациентов с ИТП и высоким содержанием ATA было отсутствие дегенеративно-измененных тромбоцитов при небольшом снижении числа клеток покоя и повышении тромбоцитов с начальной степенью активности.

При сравнении гистограмм распределения тромбоцитов в группах с разным уровнем антител при АФС и СКВ существенных различий в распределении не наблюдалось. У пациентов с ИТП отмечалась большая вариабельность клеток. В группе с низким уровнем антител наблюдалась более выраженная неравномерность распределения тромбоцитов по размерным параметрам, что обусловлено, по-видимому, преобладанием тромбоцитов с разным уровнем активности. У больных с ИТП при высоком уровне антитромбоцитарных антител преобладали клетки с небольшими диаметром, периметром и объемом. В сочетании с полученными морфологическими данными: повышенным активационным статусом тромбоцитов и отсутствием дегенеративно-измененных форм, можно предположить, что активные формы тромбоцитов образуют комплексы «тромбоцит-антитело», которые с высокой скоростью элиминируются из кровяного русла.

Для оценки влияния АФЛА и ATA на тромбоциты была проведена серия экспериментов in vitro. Живые тромбоциты здоровых доноров

инкубировали в двух пробирках с сыворотками, содержащими высокие уровни АФЛА или ATA в течение 60 мин при t-37°C. Методом КФМ проводили съёмку тромбоцитов до и после инкубации. У тромбоцитов под воздействием ATA наблюдались изменения оптико-геометрических параметров, отражающие результат процессов дегрануляции клеток (Табл.11). Под воздействием АФЛА и ATA диаметр тромбоцитов уменьшился на 11% и 4%, периметр - на 8% и 9%, высота - на 3% и 11%, площадь - на 10% и 8%, объём - на 24% и 23%, соответственно.

Таблица 11

Морфометрические показатели тромбоцитов периферической крови практически здоровых добровольцев после инкубации с АФЛА и ATA (М±о)

Группы Клеточные параметры

Диаметр (мкм) Периметр (мкм) Высота (мкм) Площадь (мкм2) Объём (мкм3)

Контроль 3,4±1,07 10,4±3,90 1,40±0,60 6,80±4,65 3,60±3,00

После инкубации с АФЛА 3,05±1,3 9,6±5,12 1,36±0,66 6,12±5,8 2,73±2,46

После инкубации с ATA 3,28±0,98 9,72±3,2 1,25±0,48 6,26±4,25 2,79±1,97

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

Рисунок 2 иллюстрирует характер изменения активационного статуса тромбоцитов после инкубации с АФЛА и ATA.

Рис.2. Соотношение морфологических типов (I, II, III, IV) тромбоцитов до (внутренний круг) и после воздействия АФЛА (средний круг) и ATA (внешний круг) в условиях in vitro (%). Дискоциты I ~1 ; эхиноциты 1 классаШШПЗ ; эхиноциты 2 класса ЕЕШ; дегенеративно-измененные тромбоциты МИН •

После воздействия антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител на живые тромбоциты in vitro наблюдалось снижение (по сравнению с контролем) клеток покоя до 45% и 38%, соответственно. Процент слабо активированных тромбоцитов под действием АФЛА практически не менялся (32%), но увеличивалось число дегенеративных тромбоцитов (до 13%).

Действие ATA вызывало увеличение тромбоцитов с низким уровнем активации до 39%, а высоко активированных форм - до 20%.

Таким образом, установлены и количественно оценены особенности прямого влияния антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител на морфофункционалыюе состояние тромбоцитов. И АФЛА и ATA вызывают активацию тромбоцитов в условиях in vivo и in vitro, но степень выраженности и особенности проявления этого процесса различны. Использование метода витальной компьютерной фазометрии обеспечивает достаточную степень объективности и информативности при оценке нарушений тромбоцитарного гемостаза, что может способствовать улучшению диагностики АФС, оценки тяжести патологического процесса, своевременному назначению патогенетической терапии.

ВЫВОДЫ

1. Инволютивные изменения тромбоцитарного звена гемостаза у практически здоровых лиц среднего и пожилого возраста связаны с увеличением морфологической неоднородности циркулирующей популяции (индекс асимметричности увеличен в 1,2-1,5 раза), перестройкой структурной организации тромбоцитов (преобладанием клеток с узким гиаломером и большим плотным грануломером, характеризующихся измененными (на 1-3%, р>0,05) размерными показателями), снижением их функциональной активности (уменьшением активарованных тромбоцитов на 3%, р>0,05) и активности тромбопоэза.

2. У больных среднего и пожилого возраста с АФС (изолированным и на фоне СКВ) отмечено выраженное повышение активационного статуса циркулирующих клеток (50% и 60%, соответственно, против нормативных 41%) и увеличение дегенеративных форм (5% и 4%, соответственно, против 2%). Средние в популяции морфометрические показатели тромбоцитов (диаметр, периметр, площадь и объем) по сравнению с нормой при изолированном АФС были увеличены на 17%, 23%, 46% и 41%, соответственно (р<0,05), а при АФС+СКВ - на 28%, 40%, 65% и 27%, соответственно (р<0,05). Процент макротромбоцитов в циркулирующей популяции составил 15,6% и 18,1% при АФС и АФС+СКВ, соответственно, против 2% у практически здоровых добровольцев.

3. Количественными критериями воздействия антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител на морфофункциональное состояние тромбоцитов являются: изменение морфометрических показателей циркулирующих клеток (на 6-60% и 15%-105% для АФЛА и ATA, соответственно); повышение их функциональной активности (снижение форм «покоя» до 50% и 25-45%, увеличение активированных тромбоцитов до 30% и 50% для АФЛА и ATA, соответственно) и стимуляция тромбопоэза (увеличение содержания макротромбоцитов до 15,6% и 11%, для АФЛА и ATA, соответственно).

4. Витальная компьютерная фазометрия позволяет объективно оценить морфофункциональный статус тромбоцитов: выявлены достоверные

корреляции между морфометрическими параметрами тромбоцитов, содержанием морфологических типов клеток, показателями традиционной гемостазиограммы, наличием антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител: процент активированных тромбоцитов положительно коррелирует с величинами диаметра, периметра и площади (г=0,436, г=0,584, г=0,516, соответственно, р<0,05) и показателем тромбинового времени (г=0,543, р<0,05); количество тромбоцитов покоя отрицательно коррелирует с уровнем РФМК, отражающего активацию процессов свёртывания (г=-0,457, р<0,05); уровень антитромбоцитарных антител положительно коррелирует с количеством тромбоцитов «покоя» и отрицательно - с числом дегенеративно-измененных клеток (г=0,521 и г=-0,470, соответственно, р<0,05). Зависимости между изменениями морфометрических показателей тромбоцитов и титра антифосфолипидных антител не обнаружено.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Анализ клинико-лабораторных данных у больных с антифосфолипидным синдромом необходимо проводить с учетом возрастных категорий пациентов для исключения гиподиагностики и недооценки тяжести их состояния.

2. Для объективной характеристики гемостазиологических нарушений у больных с различными формами антифосфолипидного синдрома и выявления угрозы тромботических осложнений, наряду с исследованием состояния плазменного звена гемостаза рекомендован анализ показателей морфофункционального состояния тромбоцитарного звена.

3. Объективными критериями состояния напряжения клеточного звена гемостаза являются: увеличение диаметра, периметра и площади тромбоцитов с одновременным снижением их фазовой высоты, изменение процентного соотношения морфологических типов тромбоцитов в сторону повышения активированных форм.

4. Компьютерная морфометрия тромбоцитов может быть использована в качестве скринингового экспресс-теста при исследовании патологии тромбоцитарного гемостаза. Преимуществом метода является минимальный объем крови (до 1-1,5 мл), отсутствие необходимости применения реактивов и дополнительного оборудования, оперативная оценка особенностей морфофункционального состояния клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бычкова И.С., Василенко И.А., Метелин В.Б., Савушкин A.B., Модина М.А. Витальная компьютерная морфометрия тромбоцитов как метод ранней диагностики угрозы тромбозов при антифосфолипидном синдроме (АФС). // Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишений к органным и системным изменениям). Ярославль, 10-13 июня 2007. - С.119.

2. Бычкова И.С., Кондратьева Л.В., Метелин В.Б., Решетняк Т.М., Василенко И.А. Особенности морфофункционального состояния тромбоцитов при антифосфолипидном синдроме. // Материалы Третьей Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и

гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием). М., 2007 - С.39-40

3. Кастрикина И.С., Василенко И.А., Решетняк Т.М. Применение витальной компьютерной морфометрии для оценки тромбоцитарного звена гемостаза при антифосфолипидном синдроме. // Сб. «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты. М.,: 2008. - С.41-43.

4. Vasilenko I., Kastrikina I., Pustovaya E. Alterations of morpho-functional status in circulating platelets associated with thrombocytopenias. // Haematologica. - 2008. - Vol., 93, Suppl.l. - P. 126

5. Кардашова 3.3., Власова E.A., Кастрикина И.С., Лысенко М.А., Модина М.А. Витальная компьютерная морфометрия клеток крови в решении клинико-диагностических задач. // Вестник последипломного медицинского образования,- 2008.- № 3-4. - С.75-77.

6. Кастрикина И.С., Василенко И.А., Решетняк Т.М. Оценка тромбоцитарного звена гемостаза у больных с антифосфолипидным синдромом методом компьютерной фазометрии. // Вестник Российской Военно-Медицинской академии - 2009,- Т.25, №1. - С. 704.

7. Гаспарян С.А., Чотчаева С.М., Василенко И.А., Кастрикина И.С. Структурно-морфологические особенности тромбоцитов периферической крови при неразвивающейся беременности. // Журнал акушерства и женских болезней. - 2009. - №3. - С.7-11

8. Vasilenko I., Kastrikina I., Metelin V., Reshetnyak Т. The role of antiphosolipid and antiplatelet antibodies in platelet dysfunction: computer-aided visualization. // Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2009. - Vol.7, Suppl.2. - PPWE-062

9. Василенко И.А., Кастрикина И.С., Ковалёва Л.Г., Пустовал Е.И., Колосова Е.Н., Сафонова Т.Н. Оценка тромбоцитарного звена гемостаза у больных идиопатической тромбоцитопеничской пурпурой методом витальной компьютерной морфометрии. // Материалы IV Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечнососудистой хирургии. М.:2009 - С.134-135.

10.Кастрикина И.С., Решетняк Т.М., Василенко И.А. Оценка состояния тромбоцитарного звена гемостаза у больных старших возрастных групп с антифосфолипидным синдромом. // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых». М.: 2009. - С.30-31.

11.Кастрикина И.С., Решетняк Т.М., Василенко И.А. Особенности морфофункционального состояния тромбоцитарного звена гемостаза при антифосфолипидном синдроме. // Материалы II Московской региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». М.: 2009. - С.38-39.

12.Ковалева Л.Г., Василенко И.А., Колосова Е.Н., Кастрикина И.С. Оценка тромбоцитарного звена гемостаза методом компьютерной морфометрии тромбоцитов при идиопатической тромбоцитопенической

Подписано в печать:

25.04.2011

Заказ № 5447 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы

Антифосфолипидный синдром (АФС) - системное, аутоиммунное заболевание, клинические проявления которого, связаны с тромбозом сосудов любой локализации и калибра [7, 11, 56, 104]. Диагноз АФС достоверен при обязательном сочетании клинических признаков с лабораторными маркёрами. К клиническим критериям относятся тромбоз сосуда любого калибра и локализации (венозный и/или артериальный, или микроциркуляторного русла) и акушерская патология (синдром потери плода). Лабораторными маркерами АФС являются антифосфолипидные антитела (АФЛА), причем наиболее информативны волчаночный антикоагулянт (ВА), антителам к кардиолипину (аКЛ) и к Р2 гликопротену-1 (анти-р2-ГП-1) [135, 125]. Ряд клинических проявлений, таких как: тромбоцитопения, сетчатое ливедо, пороки клапанов сердца, сосудистые головные боли по* типу мигрени, хорееформные гиперкинезы, которые ассоциируются с АФЛА и могут быть в дебюте заболевания не включены в диагностические критерии АФС. Наличие этих клинических признаков с позитивными уровнями АФЛА при отсутствии другого заболевания верифицируется как «вероятный» АФС или «преАФС» [83].

Тромбоцитопения в первых диагностических критериях АФС относилась к основным проявлениям симптомокомплекса. Тромбоцитопения встречается в 27,7% случаев первичного АФС и в 22,4% случаев вторичного АФС. Отмечено, что у 38% больных с идиопатической тромбоцитопенической пурпурой (ИТП) могут выявляться АФЛА, при этом у 60% из них в течение последующих 5 лет развивались тромбозы различной локализации, тогда как у больных без АФЛА тромбозы наблюдались в 2,3% случаев [82]. Геморрагические осложнения, несмотря на тромбоцитопению, наблюдаются редко и, как правило, связаны с сопутствующим дефектом специфических факторов свертывания крови, патологией почек или передозировкой антикоагулянтов. В 20% случаев тромбоцитопения может предшествовать развитию достоверного АФС, что оправдывает выделение аФЛ-ассоциированной тромбоцитопении [102].

Фосфолипиды активированных тромбоцитов стимулируют свертывающую систему и ускоряют образование тромбина. Следовательно, любые вещества, повреждающие клеточные мембраны, в том числе антитела к фосфолипидным детерминантам, потенциально способны повышать уровень образования тромбина и нарушать систему свертывания крови, ускоряя коагуляцию или замедляя фибринолиз [46, 65, 105, 114].

При изучении патогенеза АФС основное внимание обычно уделяется взаимодействию АФЛА с эндотелиальными клетками (ЭК), вопросы активации тромбоцитов остаются недостаточно изученными. В то же время известно, что одной из причин приобретения интимой сосудов протромботических свойств является взаимодействие активированных тромбоцитов с эндотелием, что создаёт порочный круг, приводящий к прогрессирующим сосудистым нарушениям [130].

Достаточно важным и актуальным является изучение возрастного аспекта АФС. Установлено, что частота встречаемости многих антител увеличивается с возрастом человека и АФЛА- не являются* исключением. Гиперпродукция антител к фосфолипидам может встречаться у лиц старших возрастных групп: около 7-12% пожилых людей (старше 65 лет) позитивны по ^-С и антикардиолипиновым и антифосфолипидным антителам.

Однако значение антифосфолипидных антител в крови пожилых людей представляется не до конца ясным, поскольку выявление АФЛА не всегда сочетается с характерной клинической картиной АФС [68]. М.Ог§иго§1и и соавторы (1999), Решетняк Т.М. и Штивельбанд И.Б. (2002) отметили связь между и ^М-аКЛ, венозным тромбозом и неопластическими заболеваниями у лиц в возрасте 65 лет и старше. Поэтому дебют антифосфолипидного синдрома у пациентов старше 45 лет требует дифференциальной диагностики в первую очередь с неопластическими и лимфопролиферативными заболеваниями [68, 133].

Специалисты отмечают неоднородность патогенетических механизмов, лежащих в основе АФС, полиморфизм клинических проявлений, отсутствие достоверных клинических и лабораторных показателей, позволяющих прогнозировать рецидивирование тромбозов [24, 35, 57]. Всё это диктует необходимость проведения широкого дифференциального поиска, внедрения новых высокочувствительных лабораторных методов обследования.

Цель исследования

Установить диагностическую значимость витальных показателей морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови в оценке тромботических осложнений у больных различных возрастных групп с антифосфолипидным синдромом.

Задачи исследования

1. Оценить характер инволютивных изменений морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови практически здоровых добровольцев различных возрастных групп (юного и молодого, среднего и пожилого возраста) методом витальной компьютерной фазометрии (КФМ).

2. Охарактеризовать особенности морфологической структуры и функциональной активности тромбоцитов периферической крови больных с антифосфолипидным синдромом (изолированным и на фоне СКВ) старших возрастных групп методом витальной компьютерной фазометрии.

3. Оценить влияние антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител на морфофункциональное состояние циркулирующих тромбоцитов у больных с антифосфолипидным синдромом и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой (ИТП) в условиях in vivo и in vitro.

4. Сопоставить результаты компьютерной фазометрии тромбоцитов с данными традиционных методов клинико-лабораторного исследования (гемостазиограммами, исследованием уровня антитромбоцитарных антител (ATA) и др.).

Научная новизна

Определены особенности и закономерности течения антифосфолипидного синдрома (изолированного и на фоне СКВ) у больных различных возрастных категорий.

Выявлены и количественно оценены изменения структурной организации и функциональной активности тромбоцитов периферической крови при антифосфолипидном синдроме. Установлено, что нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза связаны с изменениями размерных параметров, морфологии и функционального состояния циркулирующих тромбоцитов.

Впервые проведена комплексная оценка гетерогенности тромбоцитарной' популяции, ассоциированной с наличием возрастных, иммунологических и гемостазиологических изменений у пациентов с антифосфолипидным синдромом, системной красной волчанкой и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой.

Получены новые данные о субпопуляции макроформ тромбоцитов, позволяющие расширить сложившиеся представления об особенностях тромбоцитопоэза в норме и при развитии патологического процесса.

Описаны и количественно оценены эффекты влияния антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител в условиях in vivo и in vitro на морфологическую структуру и функциональную активность тромбоцитов периферической крови. Установлена корреляция между титром антитромбоцитарных антител и развитием нарушений морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови.

Практическая значимость

На основе полученных данных определен комплекс диагностических морфометрических критериев активации тромбоцитарного звена гемостаза у больных с антифосфолипидным синдромом разных возрастных групп.

Экспресс-метод витальной компьютерной морфометрии тромбоцитов апробирован в клинической практике как скрининговый при обследовании больных с антифосфолипидным синдромом и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой юного и молодого, среднего и пожилого возраста.

Повышение эффективности диагностики состояния тромбоцитарного гемостаза при антифосфолипидном синдроме на основе использования витальной компьютерной фазометрии позволит своевременно выявлять нарушения, проводить адекватную профилактическую или лечебную их коррекцию, будет способствовать уменьшению количества больных с тяжелыми формами заболевания, сокращению сроков временной нетрудоспособности, а также расходов пациентов и страховых компаний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Инволютивные особенности тромбоцитарного' гемостаза в условиях физиологической нормы у лиц старших возрастных групп заключаются в снижении активности тромбопоэза, изменении функциональной полноценности и морфологической структуры клеток, увеличении гетерогенности циркулирующей популяции.

2. Предикторами тромбозов у больных с антифосфолипидным синдромом могут служить морфометрические показатели живых тромбоцитов периферической крови (увеличение их размерных параметров, повышение содержания активированных клеток).

3. Характер изменения морфофункционального состояния тромбоцитов у больных с антифосфолипидным синдромом и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой непосредственно определяется уровнем циркулирующих антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител, а также особенностями молекулярно-клеточных механизмов их взаимодействия с рецепторами тромбоцитов.

Внедрение в практику

Основные положения и материалы диссертации внедрены в клиническую практику ГОУ ВПО Российский университета дружбы народов, Учреждения Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт ревматологии Российской академии медицинских наук, филиала ГОУ ВПО РГМУ Росздрава «Научно-клинический центр геронтологии».

Публикации

Результаты исследований; отражены в 15 публикациях, из них три в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы

Основные материалы и положения работы доложены и обсуждены на 25-й научно-практической конференции «Морфометрия в диагностике болезней» (Москва, 2006); XXI Congress ISTH, (Geneva, Switzerland, 2007); I научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва (2008); XIII Congress ЕНА (Copenhagen, Denmark, 2008); II научно-практической конференции «Цитометрия в. биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2009); XXII Congress ISTH (Boston, USA, 2009); VI Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых» (Москва, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2010).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 81 отечественных и 68 зарубежных источников литературы. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 20 таблицами.

ВЫВОДЫ

1. Инволютивные изменения тромбоцитарного звена гемостаза у практически здоровых лиц среднего и пожилого возраста связаны с увеличением морфологической неоднородности циркулирующей популяции* (индекс асимметричности увеличен в 1,2-1,5 раза), перестройкой структурной организации тромбоцитов (преобладанием клеток с узким гиаломером и большим плотным грануломером, характеризующихся измененными (на 1-3%, р>0,05) размерными показателями), снижением их функциональной активности (уменьшением активарованных тромбоцитов на 3%, р>0,05) и активности тромбопоэза.

2. У больных среднего и пожилого возраста с АФС (изолированным и на фоне СКВ) отмечено выраженное повышение активационного статуса циркулирующих клеток (50% и 60%, соответственно, против нормативных 41%) и увеличение дегенеративных форм (5% и 4%, соответственно, против 2%). Средние в популяции морфометрические показатели тромбоцитов (диаметр, периметр, площадь и объем)- по сравнению с нормой при изолированном АФС были? увеличены^ на 17%, 23%, 46% и 41%, соответственно' (р<0,05), а при АФС+СКВ - на 28%, 40%, 65% и 27%, соответственно (р<0,05). Процент макротромбоцитов в циркулирующей популяции составил 15,6% и 18,1% при АФС и АФС+СКВ, соответственно, против 2% у практически здоровых добровольцев.

3. Количественными критериями воздействия антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител на морфофункциональное состояние тромбоцитов являются: изменение морфометрических показателей циркулирующих клеток (на 6-60% и 15%-105% для АФЛА и ATA, соответственно); повышение их функциональной активности (снижение форм «покоя» до 50% и 25-45%, увеличение активированных тромбоцитов до 30% и 50% для АФЛА и ATA, соответственно) и стимуляция тромбопоэза (увеличение содержания-макротромбоцитов до 15,6% и 11%, для АФЛА и ATA, соответственно).

4. Витальная компьютерная фазометрия позволяет объективно оценить морфофункциональный статус тромбоцитов: выявлены достоверные корреляции между морфометрическими параметрами тромбоцитов, содержанием морфологических типов клеток, показателями традиционной гемостазиограммы, наличием антифосфолипидных и антитромбоцитарных антител: процент активированных тромбоцитов положительно коррелирует с величинами диаметра, периметра и площади (г=0,436, г=0,584, г=0,516, соответственно, р<0,05) и показателем тромбинового времени (г=0,543, р<0,05); количество тромбоцитов покоя отрицательно коррелирует с уровнем РФМК, отражающего активацию процессов свёртывания (г=-0,457, р<0,05); уровень антитромбоцитарных антител положительно коррелирует с количеством тромбоцитов «покоя» и отрицательно - с числом дегенеративно-измененных клеток (г=0,521 и г=-0,470, соответственно, р<0,05). Зависимости между изменениями морфометрических показателей тромбоцитов и титра антифосфолипидных антител не обнаружено.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Анализ клинико-лабораторных данных у больных с антифосфолипидным синдромом необходимо проводить с учетом возрастных категорий пациентов для исключения гиподиагностики и недооценки тяжести их состояния.

2. Для объективной характеристики гемостазиологических нарушений у больных с различными формами антифосфолипидного синдрома и выявления угрозы тромботических осложнений, наряду с исследованием состояния плазменного звена гемостаза рекомендован анализ показателей морфофункционального состояния тромбоцитарного звена.

3. Объективными критериями состояния напряжения клеточного звена гемостаза являются: увеличение диаметра, периметра и площади тромбоцитов с одновременным снижением их фазовой высоты, изменение процентного соотношения морфологических типов тромбоцитов в сторону повышения активированных форм.

4. Компьютерная морфометрия тромбоцитов может быть использована в качестве скринингового экспресс-теста при исследовании патологии тромбоцитарного гемостаза. Преимуществом метода является минимальный объем крови (до 1-1,5 мл), отсутствие необходимости применения реактивов и дополнительного оборудования, оперативная оценка особенностей морфофункционального состояния клеток.