Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Клиническое значение тромбоцитарного звена гемостаза при гемолитико-уремическом синдроме у детей

На правах рукописи

ТОЛСТОВА ЕВГЕНИЯ МИХАЙЛОВНА

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ТРОМБОЦИТ АРНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА ПРИ ГЕМОЛИТИКО-УРЕМИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ У ДЕТЕЙ

14.01.08 - Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 АПР 2015

005567451

Москва-2015г.

005567451

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Зайцева Ольга Витальевна

Официальные оппоненты:

Чугунова Ольга Леонидовна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра госпитальной педиатрии №1 педиатрического факультета, профессор.

Настаушева Татьяна Леонидовна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра госпитальной и поликлинической педиатрии, заведующая.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научный центр здоровья детей»

Защита состоится « ü» U/ubt i 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.071.01 при ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России по адресу: 125993, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России по адресу: 125445, г. Москва, ул. Беломорская, д. 19 и на сайте ГБОУ ДПО РМАПО http://www.rmapo.ru

Автореферат разослан « » U/VO^y^ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Зыков Валерий Петрович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Гемолитико-уремический синдром (ГУС), описанный в 50-х годах прошлого столетия, остаётся одной из главных причин острой почечной недостаточности (ОПН) у детей до 5 лет [Scheiring J, Rosales A. et al, 2010]. В основе ГУС лежит тромботическая микроангиопатия, развивающаяся в результате эндотелиальной дисфункции, активации тромбоцитов с тромбозом микроциркуляторного русла почек, механическим повреждением эритроцитов в результате контакта с тромбами.

Представления о патогенезе ГУС значительно расширились, что привело к разработке и введению в практику новых методов терапии. Однако летальность в остром периоде составляет 2,5-12%, у 10-20% пациентов формируется артериальная гипертензия и терминальная хроническая почечная недостаточность [Noris M., Mescia F. et al., 2012, Spinale J.M., Ruebner L.R. et al., 2013].

Одним из недостаточно изученных аспектов патогенеза ГУС является срыв гемостатического баланса и механизмов тромбообразования в результате генетически обусловленной тромбофилии [Худякова Ю.Ф., 2001; Латышева Н.М., 1989г., Эмирова Х.М., Попа А.В. с соавт., 2014]. Процесс окклюзионного тромбообразования микроциркуляторного русла преимущественно за счет тромбоцитарных тромбов приводит к полиорганности поражения. Изучение тромбоцитарного звена гемостаза при ГУС представляется достаточно важным с учетом риска неблагоприятного прогноза и исходов при отсутствии адекватного лечения.

Впервые в конце 60-х годов XX века по данным биопсийного и аутопсийного материала были описаны тромбоцитарные тромбы в гломерулярных сосудах у пациентов с ГУС [Vitsky В.Н., Suzuki Y. et al., 1969]. J.S. Fong et al. (1982) отметили увеличение дегенеративных форм тромбоцитов в остром периоде ГУС, a Walters M.D. et al. (1988) выявили подавление агрегации тромбоцитов, что отражает потенциальную гиперагрегацию, подтвержденную экспериментально стимуляцией донорскими тромбоцитами. B.Sassetti et al. (1999) установили причину изменения структуры тромбоцитов - снижение экспрессии мембранных гликопротеинов на их поверхности. Также установлено, что при типичном ГУС шига-токсин напрямую связывается с тромбоцитами, активизируя последние [Ghosh S.A.,

РсИапошБка-СгаЬошзка Я.К. а1. 2004]. У.Ь. вио а1. (2009) выявили снижение экспрессии С047 на поверхности тромбоцитов у пациентов с ГУС, приводящее к нарушению взаимодействия с протеином альфа макрофагов, усилению активации тромбоцитов и фагоцитозу.

Внедрение новых технологических решений в медицинскую практику, совершенствование биохимических и биофизических методов исследования позволяет расширить представления об особенностях перестройки гемостаза при ГУС, своевременно выявить факторы риска и выбрать рациональную терапию. Морфофункциональное состояние тромбоцитов с помощью витальной морфометрии оценивалось при антифосфолипидном синдроме, тромбоцитопенической пурпуре, маточных кровотечениях и др. [Кастрикина И.С., 2011г.; Колосова Е.Н., 2011 г., Лободина Е.М., 2008г.]. Однако при ГУС исследования функционального состояния и размерных параметров тромбоцитов не проводилось ни в России, ни за рубежом, что представляет большой теоретический и практический интерес.

Таким образом, более детальное исследование тромбоцитов необходимое для оценки динамики их активации, участия в реализации патологического процесса при ГУС. Все вышеизложенное позволит дополнить данные о патогенетической роли перестройки тромбоцитарного звена гемостаза при ГУС.

Цель исследования

Установить клиническую значимость тромбоцитарного звена гемостаза у детей с гемолитико-уремическим синдромом для оптимизации тактики лечебно-профилактических мероприятий, направленных на его коррекцию.

Задачи исследования

1) Выявить особенности морфологической структуры и функциональной активности тромбоцитов периферической крови больных с гемолитико-уремическим синдромом методом витальной компьютерной фазометрии.

2) Установить характер инволютивных изменений морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови у детей в динамике методом витальной морфометрии в зависимости от тяжести течения гемолитико-уремического синдрома.

3) Оценить состояние тромбоцитарного и плазменно-коагуляционного звена гемостаза у детей с гемолитико-уремическим синдромом.

4) Сопоставить результаты компьютерной морфометрии тромбоцитов с данными традиционных методов клинико-лабораторного исследования.

5) Обосновать диагностическую и прогностическую значимость исследования морфофункционального состояния тромбоцитов при гемолитико-уремическом синдроме у детей.

Научная новизна

Изучено морфофункциональное состояние тромбоцитов у детей с ГУС, что позволило расширить представления о состоянии системы клеточного звена системы гемостаза при этой патологии.

Проведена комплексная оценка гетерогенности тромбоцитарной популяции, гемостазиологических изменений в динамике острого периода ГУС и в катамнезе. Разнообразие популяции тромбоцитов проявляется изменениями морфологии и функциональной активности клеток-в циркуляции, а также размерных параметров. Выявлены сохраняющиеся изменения активности тромбоцитарного звена гемостаза при уже восстановленном диурезе. Прогрессирующее увеличение клеток, обладающих функциональной активностью, и восстановление размерных параметров тромбоцитов в динамике является прогностически благоприятным, отражая положительный эффект проводимой терапии.

Установлено, что активация тромбоцитов зависит от клинического течения заболевания и коррелирует с выраженностью патологического процесса.

Впервые определена диагностическая и прогностическая значимость исследования тромбоцитарного звена гемостаза при ГУС у детей, что позволяет расширить диагностические возможности при этом состоянии.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты проведенного исследования обосновывают необходимость оценки состояния тромбоцитарного звена гемостаза у пациентов с ГУС. Метод прижизненной компьютерной морфометрии позволяет оценить морфофункциональное состояние тромбоцитов в динамике патологического процесса, выявить факторы, обусловливающие различное течение болезни и прогноз почечной

выживаемости. Внедрение итогов работы в педиатрическую практику позволит увеличить диагностические возможности при ГУС у детей и улучшить качество лечения.

В работе продемонстрирована целесообразность катамнестического наблюдения пациентов после перенесенного ГУС с повторным определением морфофункционального статуса тромбоцитов для определения объема и продолжительности лечебных и профилактических мероприятий. Оптимизация терапии в соответствии с имеющимися изменениями тромбоцитарного звена гемостаза должна быть направлена на улучшение микроциркуляции и предотвращение развития почечной недостаточности, а также снижение риска прогрессии поражения почек у детей с сохраняющимися нарушениями их функции.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Состояние клеточного звена гемостаза при ГУС характеризуется нарушением морфофункционального профиля тромбоцитов, сохраняющимся при разрешении ОПН.

2. Метод прижизненной компьютерной морфометрии тромбоцитов служит объективным критерием состояния тромбоцитарного звена гемостаза при ГУС у детей, более полно характеризующим имеющиеся нарушения в сравнении с гематологическим анализатором и тромбоэластографией.

3. После перенесенного ГУС необходим мониторинг состояния клеточного звена гемостаза, в связи с сохраняющимися нарушениями и риском тяжелых осложнений, так как изменение мофрофункционального профиля тромбоцитов определяется клиническим течением синдрома.

Соответствие диссертации Паспорту научной специальности

Диссертационное исследование проведено в соответствии с формулой специальности 14.01.08 - "Педиатрия (медицинские науки)", изучающей здоровье ребенка в процессе его развития, физиологию и патологию детского возраста, а также разрабатывающей методы диагностики, профилактики и лечения детских болезней (п. 6 области исследования).

Внедрение результатов диссертационной работы в практику

Основные положения и практические рекомендации диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре педиатрии, а также в лекционный курс факультета усовершенствования врачей

ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, в клиническую практику ДГКБ св. Владимира г. Москвы.

Апробация результатов исследования Апробация диссертации проведена на заседании кафедры педиатрии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, протокол №13 от 15.10.2014г.

Клиническое исследование в рамках диссертационной работы одобрено на заседании комитета по этике ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, протокол №6 от 28.02.2012г.

Материалы диссертации обсуждены на XII Московской ассамблее «Здоровье столицы» (Москва, 2013г.), конкурсе молодых ученых XVII конгресса педиатров России с международным участием (3-е место в конкурсе молодых ученых, Москва, 2014г.), конкурсе молодых ученых Первого университетского фестиваля терапевтической науки (Москва, 2014г.), конференциях молодых ученых МГМСУ 2012-2014гг., международном конгрессе ЕИА-ЕОТА (Амстердам, 2014г).

Личное участие соискателя в получении результатов работы Е.М. Толстова разработала протокол исследования с научным обоснованием. Автор проводила клиническое обследование пациентов в динамике, самостоятельно работала с тромбоэластографом. Составление базы данных, обработка полученных результатов, статистический анализ, оценка клинической и научной значимости, подготовка материалов диссертационной работы к публикации проведены автором лично.

Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из которых 3 статьи в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура работы Диссертация изложена на 218 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа проиллюстрирована 56 таблицами и 50 рисунками.

Библиография включает 157 работ (30 отечественных и 127 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В диссертации обобщены данные исследования 79 пациентов, из них 64 с типичным ГУС, госпитализированных в отделение гравитационной хирургии крови и гемодиализа ДГКБ св. Владимира в период с 2011 по 2014гг. (рис. 1). Обследовано в остром периоде ГУС 43 пациента (основная группа), в катамнезе - 36 (16 - в раннем периоде после ГУС, в отдаленном - 20 пациентов). Группу сравнения составили 15 условно здоровых детей.

У всех детей основной группы (п=43) проведена оценка клинико-лабораторных показателей и морфометрия тромбоцитов в разных точках обследования: в периоде олигоанурии (1 точка), в начальной стадии восстановление диуреза (2 точка) и на этапе восстановленного диуреза (3 точка). Средний возраст больных основной группы составил 2.2±1,4 лет (6 мес. - 8 лет). Распределение по полу было одинаковым.

Рис. 1. Дизайн исследования

В подгруппу раннего катамнеза (срадний возраст 2,3±1,7 лет) вошло 16 пациентов, перенесших ГУС не более года назад (2-12 месяцев). В подгруппу позднего катамнеза (средний возраст 10,2±4,8 лет) вошло 20 пациентов через 1 год и более после перенесенного ГУС (1-16 лет).

В основной группе у 40 (93%) пациентов развитию ГУС предшествовала кишечная инфекция, в 1 (2.3%) случае - ОРВИ, в 2 (4,7%) - ОРВИ в сочетании с кишечной инфекцией. В

катамнестической группе у всех детей с ГУС развился на фоне кишечной инфекции. В первые трое суток от дебюта ГУС госпитализированы (79,1%), на 4-6 день - 11,6% детей и 9,3% пациента - через неделю и более. Из 43 детей 95,3% (п=41) госпитализированы в стадии анурии и только 2 пациентов - в олигурии. Длительность анурии в среднем составила 10 [7,5; 14] суток. Тяжелую форму ГУС перенесли 95,3% (п=41) пациентов, в 53,7% случаев течение осложнилось артериальной гипертензией, в 46,3% - артериальной гипертензией и судорожным синдромом. В 2 случаях тяжесть состояния соответствовала легкой форме. Продолженную вено-венозную гемодиафильтрацию (ПВВГДФ) получили 13 (30%) больных, 11 (26%) - перитонеальный диализ (ПД), 17 (39%) - ПВВГДФ с последующим переходом на ПД, 2 (5%) пациентам заместительная почечная терапия (ЗПТ) не проводилась.

Пациенты катамнестической группы были госпитализированы в профильный стационар через 2,4±0,9 дней от манифестации синдрома. Оценка клинического состояния в остром периоде ГУС в этой группе проведена ретроспективно. Четверть детей из подгруппы раннего катамнеза восстановила функцию почек, артериальная гипертензия отмечена у 18,7% пациентов, в 75% диагностирована ХБП I-III ст. Протеинурия выявлялась у 43,8% детей, микрогематурия с протеинурией - в 18,7%. В подгруппе позднего катамнеза (1-16 лет после ГУС) 2 пациентов не имели снижения почечных функций, артериальная гипертензия выявлена у 25% детей, протеинурия - у 50%, ХБП I-II ст. - в 50% случаев, ХБП III-1V ст. - в 25%, тХПН - у 15% пациентов.

Обследование включало стандартный набор клинико-лабораторных тестов, применяемых у всех больных с ОПН и условно здоровых детей (группа сравнения). Состояния гемостаза оценивалось с помощью тромбоэластографии и коагулограммы .Специальным методом витальной компьютерной фазово-интерференционной микроскопии тромбоцитов с помощью компьютерного лазерного фазово-интерференционного микроскопа "Цитоскан" (МГИРЭА, Москва) оценивался морфометрический статус тромбоцитов у детей в остром периода и катамнезе ГУС.

Статистический анализ проводился с помощью ПСП SPSS 21. Количественные данные описывались расчетными показателями: среднее значение и стандартное отклонение (М±а), медиана (Me), 25-

й и 75-й квартили [25%, 75%]. Соответствие данных нормальному распределению проверялось с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий переменных оценивалась с помощью ^критерия Стьюдента и методом Манна-Уитни. Для выявления и оценки связей между исследуемыми показателями проводился множественный дисперсионный анализ, линейная регрессия, рассчитывались коэффициенты корреляции Пирсона или Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Состояние тромбоцитарного и плазменного звена гемостаза у пациентов с ГУС

Для оценки состояния тромбоцитарного звена гемостаза всем пациентам проводился клинический анализ крови с определением абсолютного числа тромбоцитов и тромбоцитарных индексов (табл. 1).

Таблица 1

Показатели тромбоцитов и тромбоцитарных индексов в _динамике ГУС _

Значения п (%) 1 точка п(%) 2 точка п (%) 3 точка

PLT, хш'7 л (норма 180320) 43(100) 73,7±29,1* 43(100) 249,3±131*** 43(100) 347,3± 115,1Л

<50 6(14) 40,5±6,8 0 0

51-150 35(81,4) 84,0±23,1 14(32,6) 139,6±35,3 0

151-320 2(4,7) 160 [154; 1661 20(46,5) 230±45,3 21(48,8) 249,5±43

>320 0 9(20,9) 469,9±95 22(51,2) 428,9± 89,1

MPV, мкм3 (норма 6,011,0) 43(100) 9,5±2,9** 43(100) 8,6±1,0* 43(100) 8,21±0,8Л

6,0-11 28(65,1) 8,3±2,3 43(100) 8,6±1,0 43(100) 8,21±0,8

>11 15(34,9) 12,7±1,2 0 0

PDW, % (норма 11-18) 43(100) 15,8±4,1 43(100) 14,2±2,5

11-18 43(100) 15,8±3,3 37(86) 14,1±1,5

>18 0 6(14) 23±3,7

РСТ, л/л (норма 0,150,35) 43(100) 0,2±0,08***

<0,15 43(100) 0,07[0,05;0,1] * 10(23,3) 0,1 ±0,03 0

0,15-0,35 0 33(76,7) 0,2±0,07 43(100) 0,27±0,1л

Примечание: *р<0,001 при сравнении значений в 1 и 2 точках исследования; **р<0,05 при сравнении значений в 1 и 2 точках исследования; ***р<0,001 при сравнении значений во 2 и 3 точках исследования; # р<0,01 при сравнении значений во 2 и 3 точках исследования; л р<0,001 при сравнении значений в 1 и 3 точках исследования

Число тромбоцитов в динамике достоверно различалось: от тромбоцитопении - в периоде олигоанурии до нормо- или тромбоцитоза - при восстановленной диурезе (р<0,05).

Тромбоцитоз регистрировался в 51,2% (п=22) случаев при более длительной анурии (р<0,05). Длительность тромбоцитопении (от 5 до 24 суток) прямо коррелировала с длительностью анурии (11=0,5; р<0,05), была более выражена у детей на ПВВГДФ (р<0,05), с неврологическими осложнениями (г=0,4; р<0,05) и с кортикальным некрозом почек (г=0,4; р<0,05). Тромбокрит (РСТ) снижался в острой стадии, постепенно восстанавливаясь до нормальных значений при восстановленном диурезе (р<0,001).

Средний объем тромбоцитов (МРУ) в 1 точке приближался к верхней границе нормы, постепенно снижаясь к моменту выздоровления (р<0,05) и прямо коррелировал с продолжительностью анурии (г=0,4; р<0,05).

При анализе коагулограммы в периоде олигоанурии отмечена разнонаправленность таких гемостазиологических показателей как протромбиновая активность (ПА), активированное частичное тромбопластиновое время (табл. 2). При разрешении процесса ПА нормализовалась у 65% пациентов, получавших низкомолекулярные гепарины (НМГ), а у пациентов без терапии сохранялись признаки гиперкоагуляции.

Уровень фибриногена в острый период коррелировал с развитием кортикального некроза почек у детей (г=0,4; р<0,05). Гипофибриногенемия ассоциировалась с удлинением тромбинового времени (ТВ) (г=0,5; р<0,01). Увеличение ТВ было ассоциировано за счет продуктов деградации фибрина и коррелировало с длительностью тромбоцитопении (г=0,4; р<0,05). О -димер нормализовывался к моменту разрешения ОПН (р<0,01). Высокие его значения соответствовали повышению ЛДГ в сыворотке крови (г=0,5; р=0,02), отражая степень микроциркуляторных нарушений за счет тромбообразования. Недостаточность фибринолитической системы подтверждалась удлинением Хагеман-зависимого фибринолиза с постепенной нормализацией к периоду восстановленного диуреза (р<0,01). Истощение внутреннего пути фибринолиза было более выражено у пациентов с длительностью анурии >7 дней (11=0,4; р<0,05) и при потребности в ИВЛ (11=0,5; р<0,01).

Таблица 2

Показатели коагулограммы в динамике ГУС

Значе п (%) 1 точка п (%) 2 точка п (%) 3 точка

-ния

102,9±

43(100) 105,±22,5 43(100) 92,2±20,0 20(100) 19.2

ПА <70 10(23.3) 45,1±14,4 6(14) 60,9±5,6 0

(70%- 70- 85,7±

105%) 105 19(44,2) 90,6±9.5 30(69,8) 88,4±13,7 13(65) 10,6

123.6±

>105 14(32,6) 128,7±17,4 7(16,3) 120±8.5 7(35) 12.6

43(100) 33.2[23,6;32.71 43(100) 30,6±10,3

АЧТВ <23 10(23,3) 19,9±2,5 0

(23"-36") 23-36 24(55.8) 28,2±3,7 42(97,7) 28,6±4,1 20(100) 31,3±4,3

>36 9(20,9) 73±43 1(2.3) 78,8

16,0±

43(100) 22.3Г14.4:21.21 43(100) 3.0** 20(100) 17.2±3.2

ТВ <13,3 0 4(9,3) 10±0,4 0

(13,3"-13,6") 13,313,6 6(14) 13.3±0,1 8(18,6) 13,4±0.2 8(40) 13.6±0.6

>13.6 37(86) 18,4[15.7:21,6] 31(72,1) 22[14,9; 19.0] 12(60) 17,5±3,1

43(100) 27.6[9:60]* 43(100) 13.6±12,7 20(100) 8.8±3.5Л

ХЗФ <8 0 0 7(35) 6.0±1.0

(8-12) 8-12 13(30,2) 8,4±2,1 22(51,2) 7±2,0 13(65) 12±2,3

>8 30(69.8) 40.1±21.5' 21(48.8) 27,3±16.0 0

1654,4±

0- 43(100) 2109***

димер (до 250 <250 0 1 0 20(100) 129,4± 65.1^

нг/мл) 1764,7±

>250 43(100) 3059,4±2126,2* 42(97,7) 2134.8

Фибриноген 43(100) 2,9±1,1

<2 7(16,3) 1,7±0,2 0

(2-4 г/л) 2-4 31(72,1) 2.8±0,5 43(100) 3,1±0.7г/л 20(100) 3,1±0,7

>4 5(11.6) 5.0±0,4 0 0

102,9± 102.4±

43(100) 92,7±20,6 43(100) 23.6 20(100) 21.6

АТ III <75 7(16.3) 66,1 ±4.5 1(2.3) 62 0

(75%- 75-

122%) 122 36(83,7) 101.1±15.9 35(81.4) 90.3±11.8 16(80) 88±15,7

135,1± 123,1±

>122 0 7(16,3) 12,2 4(20) 10.9

РФМК 43(100) 8.3±4.5 43(100) 6.5±4,0 20(100) 6,9±4.05

(до 4 <4 2(4,7) 0 3(7) 0,85±1,7 2(10) 0

мг%) >4 41(95.3) 9,0±3,8 40(93) 7,64±3,32 18(90) 8,0±3,2

Примечание: *р<0,01 при сравнении значений в 1 и 2 точках исследования; * р<0,001 при сравнении значений в 1 и 2 точках исследования; **р<0,05 при сравнении значений во 2 и 3 точках исследования;*** р<0,01 при сравнении значений во 2 и 3 точках исследования; Лр<0,01 при сравнении значений в 1' и 3 точках исследования; ЛЛр<0,001 при сравнении значений в 1 и 3 точках исследования

Концентрация AT III в периоде олигоанурии снижалась у 16,3% пациентов, а при восстановлении диуреза и разрешении ОПН превышала норму в 16,3% и в 20% случаев, соответственно.

Тромбоэластография (ТЭГ) проведена 16 пациентам в 1 и 2 точках исследования (табл. 3). В периоде олигоанурии отмечалось снижение максимальной амплитуды (МА), обусловленное нарушением активационно-аггрегационных свойств тромбоцитов, уменьшение угла а в результате нарушения функционирования всех звеньев гемостаза, удлинение показателя кинетики увеличения прочности сгустка (К). При восстановлении диуреза (2 точка) все показатели ТЭГ нормализовались, отражая компенсацию гемостазиологических нарушений у пациентов.

Таблица 3

Показатели тромбоэластографии в динамике ГУС (п=16)

Показатель Норма 1 точка 2 точка

К, мин 1-3 3,9±2,9* 1,59±0,7

МА, мм . 51-69 49,3± 11,58* 63±6,7

Угол а, ° 55-78 53,2±16,2* 68,5±5,6

Примечание: *р<0,05 при сравнении значений в 1 и 2 точках исследования

Таким образом, степень участия плазменно-коагуляционного звена зависит от клинических проявлений и в большей степени выражена при тяжёлом течении ГУС.

Комплексная оценка морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови у детей с ГУС

С помощью метода витальной компьютерной фазово-интерференционной микроскопии выделено 4 типа тромбоцитов по степени их активации (рис. 2). За счет измерения коэффициента преломления оптические параметры тромбоцитов косвенно характеризуют их функциональную активность тромбоцитов.

В контрольной группе 46% [27,5; 51,5] тромбоцитов представлено клетками покоя (I тип), 35% [27,5; 44] низкоактивированными (II тип), 19% [8,5;30,5] -высокоактивированными (III тип), 0% [0; 6] - клетками, исчерпавшими функциональный резерв (IV тип).

I II III IV

Рис. 2 Схематическое изображение морфофункциональных типов тромбоцитов периферической крови: I - тромбоцит «покоя»; II — тромбоцит с низким уровнем активности; III - высоко активированный тромбоцит; IV-дегенеративно-измененный тромбоцит

Также оценены геометрические и оптические параметры циркулирующих тромбоцитов (диаметр, периметр, площадь, высота и объем).В дебюте ГУС распределение морфологических типов сравнимо с группой контроля (табл. 4). Различия состояли в небольшом увеличении клеток «покоя» и снижении высокоактивных форм. В динамике происходит уменьшение клеток I типа и повышение форм II типа, что свидетельствует о пополнении пула тромбоцитов, способных к активации. В 3 точке отмечается еще большее снижение дискоцитов, низкоактивированных эхиноцитов (р<0,05), кратное увеличение клеток III и IV типа что является прогностически неблагоприятным критерием.

Таблица 4

Соотношение морфофункциональных типов тромбоцитов

пациентов основной группы в динамике исследования

Морфофункциональные типы тромбоцитов 1 точка (п=29) 2 точка (п=26) 3 точка («=25) Контрольная группа (п=15)

I тип 49% 44% 40% 46%

11 тип 35% 41% 35%* 35%

111 тип 15% 14% 20% 19%

IV тип 0% 1% 5% 0%

Примечание: *р<0,05 при сравнении показателей во 2 и 3 точках

В дебюте ГУС геометрические параметры (диаметр, периметр, площадь) снижались по сравнению с контролем на 5,8%, 9% и 10,2%, соответственно, что связано с потреблением большинства функционально полноценных тромбоцитов и невозможностью пополнения кровяного русла новыми формами (табл. 5).

Таблица 5

Оптико-геометрическая характеристика тромбоцитов пациентов основной группы в динамике наблюдения

Параметр Диаметр, мкм Периметр, мкм Высота, мкм Площадь, мкм2 Объем, мкм3

Контрольная группа (п=15) 3.26±0.51 10.33±2.57 1.11 ±0.27 6.68±2.06 2.63±1.03

Основная группа (n=29). I точка 3.07±0.3 9.4±1.2 0.89±0,1 6.0±1.2 1.96±0,4

Основная группа (n=26). II точка 3.18±0.3 9,72±1.1 0.93±0,1 6.56±1.1 2.26±0.6

Основная группа (n=25). III точка 3.27±0,4 10.34±1,9 1.03±0.9 6,76±1.68 2.3 8± 1.0

При разрешении ОПН все геометрические показатели достигли контроля, а оптическая высота и объем тромбоцитов оставались ниже нормы на 7,2% и 9,5%, соответственно.

Соотношение результатов компьютерной морфометрии с показателями коагулограммы Увеличение оптической высоты тромбоцитов при восстановлении диуреза связано со снижением ТВ (г=-0,6; р=0,03), диаметр и периметр коррелировали с повышением РФМК (г=0,7; р=0,002 и г=0,5; р=0,03, соответственно), подтверждая продолжающуюся активацию тромбоцитов. Значения ТВ остаются высокими при увеличении содержания эхиноцитов I порядка (г=0,7; р=0,003).

В 3 точке больший процент тромбоцитов, исчерпавших функциональный резерв, отмечен при наименьших значениях D-димера в периоде олигоанурии. В этот период отсутствие дегенеративных форм коррелирует с высоким значениям AT III (r=-0,7; р=0,02), также как и более низкие показатели высокоактивированных эхиноцитов (г=-0,7; р=0,03). Уровень AT III ближе к нижней границе нормы соответствовал более высоким показателям размерных параметров: диаметра (г=-0,7; р=0,04), периметра (г=-0,8; р=0,01), высоты (г=-0,7; р=0,03).и объема (г=-0,8; р=0,01). Высокий уровень AT III соответствует более высоким значениям СКФ при восстановленном диурезе (г=0,7; р=0,02).

Морфометрнческие параметры тромбоцитов в зависимости

от клинических проявлений ГУС Длительность тромбоцитопении была выше при судорожном синдроме и развитии кортикального некроза (р<0,05). Распределение форм тромбоцитов не зависело от длительности тромбоцитопении. При тромбоцитопении <10 дней отмечено более выраженное снижением высоты в 1 точке (р<0,05), с увеличением к моменту

разрешения ОПН до уровня ниже контрольного (табл. 6). При тромбоцитопении > 10 дней высота снижалась в меньшей степени, увеличиваясь во 2 точке (р=0,02), затем достигая уровня контрольной группы. Оптический объем повышался при длительной тромбоцитопении во 2 точке (на 29,9%, р=0,02) и при восстановленном диурезе (на 39,7% по сравнению с 1 точкой).

Длительный период анурии у детей с ГУС был ассоциирован с более частым развитием неврологической симптоматики, сердечнососудистой и дыхательной недостаточности, выраженностью микроангиопатическим гемолиза (р<0,05), вовлечением в патологический процесс системы комплемента (р<0,05) и поражением печени (р<0,05).

Таблица 6

Оптико-геометрическая характеристика тромбоцитов у детей с ГУС в зависимости от длительности тромбоцитопении

Параметр Этапы исследования Контрольная группа 0»=15)

I точка II точка III точка

Твомбоцитопения < 10 дней

Диаметр, мкм 3,06±0,3 3,13±0,2 3,26±0,5 3,26±0,51

Периметр, мкм 9,36±1,36 9,56±1,03 10,46±2,2 10,33±2,57

Высота, мкм 0,86±0,06* 0,85±0,1** 1,0±0,2 1,11±0,27

Площадь, мкм" 6,87±1,08 6,34±0,97 6,67±1,9 6,68±2,06

Объем, мкм3 2,03±0,23 1,93±0,6** 2,03±0,8 2,63±1,03

Тромбоцитопении > 10 дней

Диаметр, мкм 3.12±0,3 3.25±0.3 3,34±0,4 3,26±0,51

Периметр, мкм 9,61±1,3 9,93±1,1 10,58±1,8 10,33±2,57

Высота, мкм 0,9±0,1 0,98±0,2 1,1±0,34 1,11±0,27

Площадь, мкм" 6.0±1,1 6,79±1,1 7,05±1,6 6,68±2,06

Объем, мкм3 1,94±0,5 2,52±0,6 2,71±1,1 2,63±1,03

Примечание: *р<0,05 при сравнении с группой контроля; **р=0,02 при сравнении в 1 и 2

точках исследования.

В периоде олигоанурии неактивные дискоциты преобладали в подгруппе пациентов с анурией <7 дней по сравнению с пациентами с более продолжительной анурией (р<0,05) и группой контроля, а число тромбоцитов с различной степенью активации, наоборот, было меньше. Нормализация диуреза была ассоциирована с выраженным снижением высокоактивированных форм при анурии <7 дней по сравнению с пациентами, имеющими более длительную анурию (р<0,05). При этом число тромбоцитов IV типа увеличивалось в обеих группах и в большей степени при длительной анурии.

Снижение геометрических параметров прослеживалось в обеих подгруппах, но в большей степени при коротком анурическом периоде. Снижение оптических параметров было сравнимо в обеих подгруппах. В динамике ГУС увеличивались диаметр (р<0,05), периметр (р<0,05) и площадь (р<0,05) тромбоцитов при сохраняющемся снижении высоты и объема пластинок (табл. 7).

У детей с анурией >7 суток геометрические параметры тромбоцитов в 3 точке превышали контрольные значения, что связано с увеличением числа дегенеративно-измененных форм и образованием полноценных молодых тромбоцитов.

Таблица 7

Оптико-геометрическая характеристика тромбоцитов у детей с ГУС в зависимости от длительности анурии

Параметр Этапы исследования Контрольная группа (п=15)

1 точка 2 точка 3 точка

Анурня < 7 дней

Диаметр, мкм 3.05±0.3 3.29±0.2* 3.03±0.18 3.26±0.51

Периметр, мкм 9.22±1.36 10.26±1.03* 9.25±0.52 10.33±2.57

Высота, мкм 0.93±0.06 0.93±0.71 0.83±0.03 1.11±0.27

Площадь, мкм' 5,9±1.08 6,95±0.97* 5.9±0.96 6.68±2.06

Объем, мкм3 2.09±0.23 1.96±0.64 1.8±0.38 2.63±1.03

Анурня > 7 дней

Диаметр, мкм 3.17±0.26 3.22±0.29 3.35±0,47 3.26±0.51

Периметр, мкм 9.73±0.89 9.69±0.98 10.6±2,1 10.33±2.57

Высота, мкм 0.94±0.21 0.94±0.14 1.09±0.34 1.11±0.27

Площадь, мкм'' 6.29±0.89 6.59±1.18 6.98±1.82 6.68±2.06

Объем, мкм3 2,16±0.29 2,49±0.59 2.77±1.27 2.63±1.03

Примечание: *р<0,05 при сравнении показателей в 1 и 2 точках исследования

Мофрометрическая характеристика тромбоцитов в зависимости от типа заместительной почечной терапии

Пациенты, получавшие различные виды ЗПТ различались по тяжести течения заболевания. У детей на ПВВГДФ длительность анурии составила 8,3±3,8 суток, на ПД - 20,8 [5; 32,8] суток, а при переводе с ПВВГДФ на ПД - 15,2 [9,5; 16,5]. Поражение ЦНС, сердечно-сосудистая и дыхательная недостаточность преимущественно встречались в подгруппах с использованием продолженных методов ЗПТ, кортикальный некроз - у детей на ПД.

Снижение высокоактивированных форм в период олигоанурии и восстановления диуреза отмечено у пациентов на ПВВГДФ, а при нормализации азотемии - у детей на ПД. При разрешении ГУС

независимо от вида ЗПТ в 5-6,5 раз увеличивалось относительное содержание дегенеративных форм (табл. 8).

Все размерные параметры тромбоцитов у пациентов на ПВВГДФ и ПВВГДФ/ПД оказались ниже, чем у пациентов, получавших ПД и в группе контроля (р<0,05 для высоты и объема).

Таблица 8

Соотношение морфофункциональных типов тромбоцитов пациентов у детей с ГУС в зависимости от вида ЗПТ

Морфофункциональные типы тромбоцитов ПВВГДФ (п=13) ПД (п=11) ПВВГДФ, ПД (п=17) Контрольная группа (п=15)

1 точка исследования

I тип 49% 50% 39,5% 46%

II тип 39% 30% 37% 35%

III тип 11.5% 18% 20% 19%

IV тип 0,5% 2% 3,5% 0%

2 точка исследования

I тип 49% 41% 41% 46%

II тип 41% 39,5% 39% 35%

111 тип 9,5%* 17% 17,5% 19%

IV тип 0,5% 2,5% 2,5% 0%

3 точка исследования

I тип 39% 52%** 31% 46%

II тип 35% 28%** 41,5% 35%

III тип 20% 16% 21% 19%

IV тип 6%* 4% 6,5% 0%

Примечание: *р<0,05 при сравнении групп пациентов, получавших ПД и ПВВГДФ; ** р<0,05 при сравнении групп пациентов, получавших ПД и ПВВГДФ с последующим переходом на ПД; "р<0,05 при сравнении показателей в разных точках исследования внутри группы

В дальнейшем отмечается увеличение геометрических параметров тромбоцитов, особенно в 1 и 3 подгруппах.

Мофрометрическая характеристика тромбоцитов у пациентов после перенесенного ГУС

В подгруппе раннего катамнеза соотношение морфометрических форм тромбоцитов было сравнимо с группой контроля. Неактивные дискоциты преобладали у детей после ГУС, с периодом анурии <7 дней (р<0,05), низкоактивированные эхиноциты -у пациентов после длительного периода анурии (р<0,05) (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость относительного содержания неактивных дискоцитов (а) и эхиноцитов I порядка (б) от длительности анурии в подгруппе раннего катамнеза

Процент дегенеративно-измененных форм был наибольшим при анурии > 7 суток (р>0,05).

У пациентов с сохраняющейся протеинурией число неактивных дискоцитов было понижено (р<0.05), а низкоактивированных форм -повышено (р<0,05) (рис. 5).

Рис. 5. Различия процентного содержания неактивных дискоцитов (а) и эхиноцитов I порядка (б) в подгруппе раннего катамнеза в зависимости от наличия или отсутствия протеинурии

Полученные результаты свидетельствуют о продолжающейся активации тромбоцитов в периферической крови на фоне нормализации мегакариоцитопоэза.

В подгруппе позднего катамнеза при ХБП IV-V степени по сравнению с пациентами с ХБП 1-Ш степени число тромбоцитов «покоя» и высокоактивированных тромбоцитов было ниже (р>0.05), а форм с низким уровнем активации выше (р<0.05) (рис. 6).

Рис. 6. Зависимость относительного содержании неактивных дисконтов (а) и эхиноцитов I порядка (б) от стадии ХБП в подгруппе позднего катамнеза

Геометрические характеристики тромбоцитов у пациентов с протеинурией были ниже по сравнению с детьми без протеинурии и группой контроля. Причем, периметр тромбоцитов у пациентов с протеинурией значимо отличался от периметра тромбоцитов детей без протеинурии (р<0,05).

Такую зависимость морфометрических параметров от нарушения функции почек можно расценивать как результат действия уремии на клеточное звено гемостаза.

ВЫВОДЫ

1. Для острого периода гемолитико-уремического синдрома характерно снижение размерных параметров тромбоцитов с последующей нормализацией геометрических параметров в динамике. Изменение морфофункционального состояния тромбоцитов характеризуется увеличением низкоактивированных (р<0,05) и высокоактивированных форм в стадии восстановления диуреза, кратным увеличением дегенеративно-измененных тромбоцитов и повышением высокоактивированных форм и при разрешении острой почечной недостаточности. Оптические характеристики сохраняются на низком уровне и при восстановленном диурезе.

2. Продолжающаяся активация тромбоцитов на этапе восстановления диуреза ассоциирована с гиперактивацией плазменно-коагуляционного гемостаза. Дисбаланс коагуляционного каскада при гемолитико-уремическом синдроме вторичен, варьирует в зависимости от клинических проявлений и в большей степени выражен при тяжелом течении патологического процесса.

3. Витальная компьютерная морфометрия тромбоцитов служит одним из объективных методов диагностики патологии гемостаза на клеточном уровне у детей с гемолитико-уремическим синдромом и обладает преимуществом перед стандартным гематологическим анализом в детальной оценке морфофункциональных свойств тромбоцитов периферической крови.

4. Тромбоэластография является объективным критерием состояния тромбоцитарно-сосудистого гемостаза в остром периоде гемолитико-уремического синдрома. Быстрая нормализация показателей тромбоэластография не позволяет использовать это метод для контроля функционального состояния тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза в динамике синдрома.

5. Характер изменений морфофункционального состояния в виде активации клеточного звена гемостаза зависит от тяжести течения синдрома. Более длительный период анурии характеризуется увеличением высокоактивированных форм (р<0,05) и дегенеративно-измененных форм. Длительный период тромбоцитопении ассоциирован с увеличением размерных параметров тромбоцитов. Снижение неактивных дискоцитов. увеличение высокоактивированных и дегенеративно-измененных тромбоцитов максимально выражено при изолированном проведении продолженной вено-венозной гемодиафильтрацип и комбинированном использовании продолженных методов заместительной почечной терапии с последующим переходом на перитонеальный диализ.

6. Изменение морфометрических параметров тромбоцитов имеет место в раннем катамнестическом периоде наблюдения в виде снижения неактивных дискоцитов (р<0.05). увеличения активированных форм (р<0.05) при анурии более 7 суток, что и подтверждает длительно сохраняющийся дисбаланс тромбоцитарного звена гемостаза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для объективной оценки и мониторинга гемостазиологических нарушений при гемолитико-уремическом синдроме у детей, наряду с исследованием состояния плазменного звена гемостаза рекомендован анализ показателей морфофункционального состояния тромбоцитарного звена.

2. Витальная компьютерная морфометрия тромбоцитов может быть использована в качестве дополнительного скринингового исследования при гемолитико-уремическом синдроме у детей для выявления патологии тромбоцитарного звена гемостаза.

3. Для характеристики периода реабилитации, прогнозирования риска развития ХБП, оптимизации терапии у детей, перенесших гемолитико-уремический синдром, следует проводить оценку особенностей морфофункционального состояния тромбоцитов.

4. Дезагрегантная терапия в период клинического разрешения гемолитико-уремического синдрома может быть рекомендована на основании сохраняющихся морфофункциональных нарушений тромбоцитов с целью предотвращения прогрессирования повреждения почек.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Толстова Е.М. Особенности морфофункционального состояния тромбоцитов при гемолитико-уремическом синдроме у детей // Врач скорой помощи. Избранные труды XXXIV итоговой конференции молодых ученых МГМСУ, г. Москва. - С. 167.

2. Эмирова Х.М., Толстова Е.М., Зайцева О.В., Панкратенко Т.Е., Зверев Д.В., Музуров A.JL, Абасеева Т.Ю., Макулова А.И. Прижизненная оценка морфологических параметров тромбоцитов при гемолитико-уремическом синдроме у детей// Научно-практический медицинский журнал Медицинский вестник юга России. - 2012. - Приложение. - С. 89.

3. Tolstova Е.М. .Platelets vital computer morphometry in children with hemolytic uremic syndrome// Nephrol Dial Transplant. -2012.-27.-2. C. 344.

4. Толстова E.M., Эмирова X.M., Попа A.B., Зайцева O.B., Панкратенко Т.Е., Зверев Д.В., Абасеева Т.Ю., Музуров A.J1., Лифшиц В.И. Особенности морфофункционального состояния тромбоцитов при ГУС у детей// Сборник тезисов XVI конгресса педиатров России с международным участием "Актуальные проблемы педиатрии". - Москва, 24-27 февраля 2012г. - С. 758.

5. Толстова Е.М., Эмирова Х.М., Зайцева О.В., Панкратенко Т.Е., Зверев Д.В., Музуров A.JI., Абасеева Т.Ю., Макулова А.И. Оценка морфометрических параметров тромбоцитов при гемолитико-уремическом синдроме у детей// Тезисы V

Всероссийской научно-практической конференции

«Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - М., 18 мая 2012. - С.136-137.

6. Толстова Е.М., Эмнрова Х.М., Василенко И.А., Зайцева О.В., Мстиславская С.А., Панкратенко Т.Е., Зверев Д.В., Музуров A.JL, Макулова А.И. Витальная компьютерная морфометрия тромбоцитов при гемолитико-уремическом синдроме у детей// Педиатрия. - 2013. -Том 92. -№5. -С. 53-58.

7. Толстова Е.М. , Эмирова Х.М, Зайцева О.В., Зверев Д.В., Панкратенко Т.Е., Музуров A.JL, Макулова А.И. Гетерогенность циркулирующей популяции тромбоцитов при гемолитико-уремическом синдроме у детей// Нефрология и диализ. - т. 15. - №4. -2013.-С. 377.

8. Эмирова Х.М., Толстова Е.М., Музуров АЛ., Зайцева О.В., Зверев Д.В., Панкратенко Т.Е., Генералова Г.А., Попа A.B., Абасеева Т.Ю., Макулова А.И. Гетерогенность циркулирующей популяции тромбоцитов при гемолитико-уремическом синдроме у детей// Тезисы Седьмого Российского Конгресса Педиатрической анестезиологии и интенсивной терапии, Третьих Михельсоновских чтений. 28 сентября-1 октября 2013г. - М. - С.232-233.

9. Музуров АЛ., Эмирова Х.М., Генералова Г.А., Панкратенко Т.Е., Зверев Д.В., Толстова Е.М. Эффективность экулизумаба при лечении атипичного гемолитико-уремического синдрома у детей// Тезисы Седьмого Российского Конгресса Педиатрической анестезиологии и интенсивной терапии, Третьих Михельсоновских чтений. 28 сентября-1 октября 2013г. - М. - С. 162163.

10. Эмирова Х.М., Попа A.B., Козловская H.JL, Толстова Е.М., Макулова А.И., Панкратенко Т.Е., Абасеева Т.Ю., Зайцева О.В. Наследственная тромбофилия как фактор риска тяжелого течения гемолитико-уремического синдрома у детей. Педиатрия. - 2014. - Том 93. - №2. - С. 11-19.

11. Панкратено Т.Е., Абасеева Т.Ю., Толстова Е.М., Зверев Д.В., Буров A.A. Неврологические осложнения диарея-ассоциированного гемолитико-уремического синдрома у детей. Актуальные вопросы нефрологии, диализа, хирургической гемокоррекции и гемафереза// Тезисы Ежегодной научно-практической конференции Центрального федерального округа РФ

совместно с 22-й конференцией Московского общества гемафереза 20-22 мая 2014г.-С.49.

12. Шпикалова И.Ю., Панкретенко Т.Е., Эмирова Х.М., Зверев Д.В., Толстова Е.М., Поражение ЦНС у больных с Шига-токсин ассоциированнымгемолитико-уремическим синдромом (STEC-ГУС): современные аспекты патогенеза, клиники и стратегии лечения (обзор литературы)// Нефрология и диализ. -2014г. - Том 16. - №3. - С. 328-338.

13. Толстова Е.М. Изменение морфометрических характеристик тромбоцитов у детей с гемолитико-уремическим синдромом// Сборник тезисов XXXVI конференции молодых ученых МГМСУ. М.-2014.-С. 89.

14. Emirova Kh., Tolstova Е., Zaytseva О., Muzurov А., Makulova A., Zverev D. Morphometric Profile of Platelets in Children with Hemolytic Uremic Syndrome// Pediatr Nephrol. - 2014. - 29. -C. 1787-1788.

15. Музуров A.JI., Эмирова X.M., Толстова E.M., Зверев Д.В., Панкратенко Т.Е., Генералова Г.А., Кварцхелия М.В., Попа A.B., Орлова О.М. Атипичный гемолитико-уремический синдром. Новые возможности терапии// Вестник интенсивной терапии. - 2014. -Приложение к №5. - С 37.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

AT III - антитромбин III

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

ГУС - гемолитико-уремический синдром

ЗПТ - заместительная почечная терапия

нмг - низкомолекулярные гепарины

опн - острая почечная недостаточность

ПА - протромбиновая активность

ПВВГДФ - продолженная вено-венозная гемодиафильтрация

пд - перитонеальный диализ

РФМК - растворимый фибрин-мономерный комплекс

ТВ - тромбиновое время

тэг - тромбоэластография

ХБП - хроническая болезнь почек

хпн - хроническая почечная недостаточность

Подписано в печать 08.04.2015 Тираж 100 экз. Заказ № 0452/15

Отпечатано в типографии «Сервис Принт» 127550 г. Москва, ул. Прянишникова 31а