Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Некоторые показатели тромбоцитарно-сосудистого гемостаза при экспериментальном сахарном диабете

г - - о д

— Л ■' I --1'

На правах рукописи

СТЕПАНЯН Марина Левоновна

НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ТРОМБОЦИТАРНО-СОСУДИСТОГО ГЕМОСТАЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

14.00.16-патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1995

На правах рукописи

СТЕПАНЯН Марина Левоновна

НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ТРОМБОЦИТАРНО-СОСУДИСТОГО ГЕМОСТАЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

14.00.16-патолоппеская физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Медицинском Университете им. акад.И.П.Павлова

Научный руководитель: доктор медицинских наук , профессор С.А. Шестакова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.В. Давыдов доктор медицинских наук , профессор A.M. Зайчик

Ведущая организация- Санкт-Петербургский НИИ кардиологии Министерства здравохранения и медицинской промышленности

РФ

Защита состоится "1Ъ" ССАСГ£$&995 г. в часов на заседаниии диссертационного совета Д 074. 16. 02 при Санкт-Петербургской Медицинской Академии последипломного образования (193015, Санкт-Петербург, ул. Салтыкова- Щедрина, 41 )

С диссертаций можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской Медицинской Академии последипломного образования

Автореферат разослан "ci7" U-^UXJL 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук А.И. Тюкавин

Общая характеристика работы

Актуальное!ь проблемы. Сахарный диабет'( СД) является широко распространенным эндокринным заболеванием и представляет важную медико-биологическую и социальную проблему . Нарушения метаболизма у больных СД приводят к повреждениям сердечно- сосудисто!! системы, что является основной причиной увеличения легальности и инвалидизации ( М.И. Балаболкпн. 1994). Известно, что у больных СД велик риск развития микроанпюпатий и макроанптопатий и связанных с ними тромбоэмболических поражениий сосудов различных регионов, в частности почек, сетчатки глаза, мозга, сердца и др. В патогенезе развития анпюпатий наряду с изменениями метаболизма важная роль принадлежит нарушениям микроциркуляции , гемореолопш и состояния гемостаза. Невозможность выполнения некоторых методов исследования у больных, а также применение лечебных препаратов, изменяющих картину заболевания, требуют привлечения экспериментальной модели для изучения в динамике состояния тромбоцитарно- сосудистого звена гемостаза. Результаты изучения функциональной актив-ности тромбоцитов при СД представлены в ряде обзоров( Colvvell et al.,1983; Osterman , Van der Loo, 1986,; Winocour , 1992, 1994), в которых авторы указывают на усиление агрегационной функции тромбоцитов под действием различных индукторов, однако , исследования агрег ации тромбоцитов проводились у больных С'Д однократно. Особенно важными являются параллельные исследования свойств сосудов и тромбоцитов на ранних этапах развития ИЗСД , которые представлены в литературе единичными наблюдениями ( Г.Ф.Задкова и соавт., 1993). Таким образом, несмотря на многочисленные экспериментальные и клинические наблюдения об изменениях отдельных показателей тромбоцитарно- сосудистого гемостаза при СД, механизмы , ответственные за изменения парамегров гемостаза на ранних стадиях СД и в динамике его течения остаются во многом неясными.

Важным показателем функционального профиля тромбоцитов

к реализации их динамической функции служит реакция высвобождения, в частности , серотонина из тромбоцитариых гранул. В литературе имеются противоречивые сведения о высвобождении серотонина из тромбоцитов у больных ИЗСД ( Rao et al., 1984; Wmocour et al.,1990 ) и у экспериментальных животных (Winocour

et al.,1986, 1987 ). Как известно, большое значение для функциональной активности тромбоцитов имеют метаболиты арахидоновой кислоты, в частности тромбоксан А2 ( Тх А 2). обладающий выраженными проаг-регантными и вазоконстрикторными свойствами и занимающий особое место среди механизмов тромбообразования. Несмотря на многочисленность исследовании продукцииТ хАо активированными тромбоцитами у больных СД ( Halushka et al., 1979, 1981; Wa-tanabe et al., 1984; A.A. Сергиенко, 1991 ) и у крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом ( Gerard et al., 1980; Ziboh et al., 1979) получены неоднородные данные, требующие дополнительных пояснений.

Показателем функциональной характеристики сосудистой стенки( преимущественно эндотелия) является продукция прос-тациклина (ПП2), обеспечивающего ее атромбогенный потенциал ( Moneada et al., 1978; Vane .Bounting, Moneada, 1982). При СД отмечается снижение продукции ПГ I2 у больных(Нагп50п et al.,1980; Porta et al., 1987; A.A. Сергиенко, 1991) и у крыс с экспериментальным СД ( Г.Ф. Задкова и соавт.1993 ). Тром-бопластнновая активность участвует, наряду с другими продуктами сосудистой стенки, в реализации тромбогенных свойств сосудов .В доступной нам литературе мы не встретили данных по тромбопластиновой активности сосудистой стенки ни у больных, ни у крыс с СД. В то же время параллельные иследования атромбогенных и тромбогенных свойств сосудистой стенки позволяют выявить механизмы изменения свойств эндотелия и сосудистой стенки в целом.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было изучение характера и возможных механизмов изменений параметров тромбоцитарно-сосудистого гемостаза у крыс с экспериментальным СД на ранних этапах его развития .

-5В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1.Изучение показателей функциональной активности тромбоцитов в различные сроки течения СД: агрегационной способности, реакции захвата и высвобождения серотонина, а также чувствительности тромбоцитов к простациклиноподобным веществам ин-кубата аорты.

2.0пределение содержания малонового диальдегида( МДА) в тромбоцитах как показателя интенсивности метаболизма ара-хидоновой кислоты в тромбоцитах, и содержания МДА в плазме крови у крыс в динамике развития СД.

3. Сопоставление ультраструктурных особенностей тромбоцитов с изменением их функциональной активности на ранних этапах развития СД.

4. Изучение антиагрегационной и тромбопластиновой активности аорты и нижней полой вены крыс в различные сроки СД.

5.Сопоставление показателей тромбоцитарно-сосудистого звена гемостаза у крыс с СД с структурно-функциональными изменени-ими клубочков почки, отражающих ранние проявления формиру-щейся диабетической нефропатии.

Научная новизна результатов. Впервые произведена комплексная оценка тромбоцитарно-сосудистого звена гемостаза в щшамике течения СД( через 15, 30, 60 сут после введения ал-юксана) по ряду показателей морфофункциональной и метаболической активности тромбоцитов и сосудистой стеки и выявлены некоторые механизмы их нарушений. Дана характеристика некоторых ультраструктурных особенностей тромбоцитов при аллок-:ановом диабете в сопоставлении с функциональной и метаболической активностью тромбоцитов in vivo и in vitro. У крыс с 1ЛЛоксановым диабетом установлен параллелизм между содержанием МДА в тромбоцитах и в плазме крови на ранних сроках ал-токсанового диабета ( 15 и 30 сут ). Дана параллельная оцен-<а свойств тромбоцитов и сосудистой стенки. В частности, зпервые рассмотрен один из аспектов их взаимодействия - со-юставлена характеристика чувствительности тромбоцитов к

нростациклиноподобным веществам аортальног о инкуба ia и анти-ai регационной активности аорты крыс в динамике развитая ал-локсанового диабета и установлено наличие обратно ирапорцио-нальных отношений между этими показателями , усу|-убляющихся в соответствии с продолжительностью диабета .Впервые проведено комплексное исследование антиагрегационных свойств сосудистой стенки, функционального статуса тромбоцитов и уль-фаструктурных особенностей клубочков почек в ранние сроки формирования диабетической ангиопатии.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенное исследование дополняет и углубляет современные представления

0 роли системы гемостаза, в частности ее тромбоцитарно-сосу-дистого звена , в механизме сосудистых изменений при СД и 1ем самым позволяет приблизиться к пониманию патогенеза диа-бешческой ангиопатии. Комплексный подход в исследовании системы тромбоцит-сосудистая стенка и морфофункциональных изменений в почечных клубочках позволил выявить роль пула 1тшерреактивных тромбоцитов в механизме микрососудистых повреждений в почке на ранних этапах формирования диабегическо-

1 о i ломерулосклероза.

Полученные данные представляют определенный практический интерес , так как указывают на то , что раннее использование антиагрегационных средств позволит предупредит!, развитие диабетической микроангиопатаи.в частности диабетическом нефропатии. Определенное практическое значение имени выявленные нами показатели активации тромбоцитов in vivo в ранние сроки развития СД: увеличение содержания МДА в неактивированных тромбоцитах и усиление реакции высвобождения серо-юмина из тромбоцитарных гранул . Они могут быть использованы в клинике в качестве маркеров функционального состояния тромбоцитов ( их активации), что может служить дополнительным диагностическим и прогностическим показателем развитая микроангиопатии, а также применяться с целью контроля эффек-шнносш терапии микрососудистых осложнений С'Д.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Изменения фомГюшпарно-сосудистого звена гемостаза у крыс с аллоксановым диабетом характеризуются нарушением равновесия в системе тромбоцит-сосудистая стенка : активацией и повышением функции тромбоцитов и снижением антишрегационных свойств сосудисто!! стенки, что способствует гиперагрегации тромбоцитов и микротромбозу.

2.В ранние сроки развития аллоксанового диабета(15, 30, 60 сут) отмечается динамика изменений показателе!! системы тром-боцитарно-сосуднстого гемостаза. При этом различные показатели изменяются неодновременно. В тоже время изменения некоторых показателей активности тромбоцитов и сосудистой стенки выявляю!ся одновременно- на 15 сут СД.

3. Выявленные функциональные, метаболические и улыраструк-турные особенности тромбоцитов у крыс с аллоксановым диабетом свидетельствуют о появлении при СД пула гиперреактивных тромбоцитов, участвующих в повреждении эндотелия микрососудов на ранних стадиях формирования диабетической микроанпю-патии.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и доложены на научно-практической кош|>еренцни" Актуальные пои росы эндокринологии" , посвященной памяти з.д.н. РСФСР, проф. Д.Я. Шурыгина( СПб, 1993), конференции РАМН " Физиология микроциркуляции и реолопти крови" ( СПб, 1994), на кафедре патологической физиологии СПГМУ им. акад. И.П. Павлова( 1994) и на совместном заседании проблемной комиссии" Патология сердечно- сосудистой системы" и кафедры патофизиологии ( апрель 1995)

Публикации»: По теме диссертации опубликовано 4 работы и 2 находятся в печати .

Структура и обьем диссертации: работа изложена на 175 страницах, построена по обычному плану и состоит из введения , обзора литературы, описания материалов и методов исследования , результатов собстпенных исследований , обсуждения, заключения, выводов и списка литературы,содержащего 70 отечественных н

2Л - зарубежных источников. Иллюстрирована 16 таблицами и 23 рисунками.

Материалы и методы исследования: Работа выполнена на 172 нелинейных белых крысах - самцах'массой 180-240 г, 60 из которых были контрольными и 112 с СД. Крысы находились на обычном рационе питания. В качестве экспериментальной модели СД была выбрана модель аллоксанового СД . Аллоксановыи диабет воспроизводили путем однократного введения 5% водного раствора аллоксана в дозе 150-180 мг/кг подкожно( U.M. Соко-ловерова, 1962, С.А. Шестакова, 1965, 1978). О тяжести СД судили по уровню гликемии, глкжозурии, протеинурин, изменению массы тела. В опыт отбирали животных с хронической формой аллоксанового диабета на 15-ые, 30-ые, 60-ые cyi после введения аллоксана . Уровень гликемии определяли утром натощак в крови, с помощью глюкооксидазного теста( "Reanal",

Венгрия), уровень глкжозурии и протеинурин оценивали с по- -мощью полосок-тестов "Lacherna" (Чехо-Словакия). Все исследования выполняли под анестезией калипсолом (Вешрия) из расчета 100 мг/кг внутримышечно. У крыс уровень гликемии натощак колебался от 8 до 22 ммоль/л, уровень глкжозурии в моче составил 6-12 ммоль/л, протеинурия колебалась от 0 до I г/л , уровень МДА в плазме был в пределах 32,3- 39,5 нмоль/л . Уровни гликемии , глкжозурии и МДА в плазме крови не зависели от продолжительности СД.

Агрегационную активность тромбоцитов определяли в обогащенной тромбоцитами плазме согласно методу Вот (1962). В качестве индуктора агрегации тромбоцитов использовали динат-риевую соль АДФ ( " Reanal", Вешрия) в конечной концентрации 1,2x10-5 М. Определение проводили в отечественном arpei омег-ре АТ-3.

Чувствительность тромбоцитов к простациклиноподобным веществам инкубата аорты определяли по количеству инкубата( в мкл) контрольных крыс, вызвавшего угнетение на 50% исходной aiperamni тромбоцитов( Bonne et al.,1979). Определение содержания серотонина в тромбоцитах проводили методом I .Ф. Ок-сенкруга( 1973) в флюориметре "Hitachi", а захват и высво-

бождение серо гонима определяли согласно U.M. Богоявленской (1979).

Метаболизм арахидоновои кислоты в тромбоцитах исследовали по продукции ими малонового диальдегида(МДА), одного из конечных метаболитов арахидоновои кислоты, образующегося в эк-вимолярнмх количествах с Тх Ат , в неактивированных и активированными тромбином'тромбоцитах ( Stuart et al.,1975). Одновременно определяли содержание МДА в плазме крови в реакции с пюбарбитуровой кислотой (Stuart et al.,1975).

Ультраструктуру фомбоцитов исследовали по методу White (1967) в модификации В. К. Вашкинель и М. Н. Петрова (1982). Количественный ультраструктурный анализ проводили на аппарате "М011-20"( Австрия). Оценивали размеры фомбоцитов, их кои-фигурацию( но коэффициенту формы), а также обьем секретирую-щих гранул.

Антиагрегационную и тромбопластиновую ( ТП) активности сегментов брюшного отдела аорты и нижней полой вены определяли по методу Ts'а о et ¿«1.(1981).

Почки от крыс с СД 15, 30 , 60 сут фиксировали в 10% формалине и залипали в парафин. Затем готовили срезы толщиной 5-7 мкм и окрашивали гематоксилином - эозином. Ставили PAS-реакцию. Морфометрическую оценку net|>pona проводили методом Iочечного счета по Вайбелю. Материал для электрон-номикроскопмческого исследования почки забирали немедленно у декапитированных крыс с СД продолжительностью 15 и 60 сут. Почки фиксиров али в 2% растворе глютарового альдегида с последующим осмированием и заливкой в эпон 812. Срезы приготавливали на УМПТ-3 и просматривали в микроскопе " Hitac-hi-300". Морфологические исследования структуры почек проводили в НИЦ СПб ГМУ им. акад. И.П. Павлова (рук. В.В. Томсон)

Статистическую обработку результатов проводили с учетом t критерия С'тыоденга и с использованием W- критерия Вилкоксо-на(Манна-Уитнн), с расчетом коэффициента корреляции- г, а также с использованием хи-квадрат-критерия Пирсона.

- 10 -

Результаты исследования и их обсуждение

Количество тромбоцитов у крыс с СД на 15-ые, 10-ые, ()0-ые сут его течения достоверно не отличалось <н |аконого в соотетствуклцих группах возрастного контролн(р>0,05).

На 15-ые и 30-ые сут течения СД не выявлено значимых изменении максимальной агрегиции(МА) тромбоцшои но сравнению с показателями в контроле . На 60-ые суг течения СД МА тромбоцитов увеличилась на 25 % по сравнению с контролем (¡КО,05). Максимальная амплитуда АДФ-нндуцированнои афегации фомбоцитов положительно

150% т

100% --1

50% --

МА

Агрегация

Процент животных

{Контроль □СД 15 сут В

□Контроль

□СД 30 сут □

■Контроль ВСД 60 сут

Дезагрегация

о%

50%

100%

Рис . I. Агрегация и дезагрегация тромбоцит ов в динамике течения СД у крыс

коррелировала с уровнем гликемии (г =+0,5; р < 0,05 ). Во всех группах конфоля у всех животных дезагрегация тромбоциюв начиналась не позднее 5 мин. от начала афегации тромбоциюв, ю| да как у крыс с СД на 15-ые и 30-ые сут его течения лишь у 70% животных,а на 60-ые сут СД у 66% крыс отмечалась дезагрегация фомбоцитов в эти сроки ( Рис.1)

Таким образом , при СД во все сроки исследования деза! -

регацмя тромбоцитов замедляется, гогда как агрегация достоверно увеличивается только на 60 -ые сут СД. Наши данные о неодновременном усилениии агрегации тромбоцитов при СД и замедлении дезагрегации тромбоцитов дополняют характеристику функционального профиля тромбоцитов на ранних этапах развития 1ПСД и согласуются с наблюдениями у крыс с СД( Н.Н. Петрищев , 1976) и у больных СД (Spangenbery et al., 1989)

В механизме повышения агрегации тромбоцитов при СД определенная роль может принадлежать ослаблению чувствительности тромбоцитов к простациклиноподобным веществам сосудистой стенки. Проведенное нами исследование чувствительности тромбоцитов к простациклиноподобным веществам аортального инкубата (И ВАМ ) показало, что у крыс с СД продолжительностью 15 и 30 сут для подавления MA на 50% требовалось 17,0±1,2 мкл аортального инкубата , что на 30% больше, чем в соответствующей контрольной группе. Следовательно, чувствительность тромбоцитов крыс к ПВАИ в эти сроки СД снижа-лась(р<0,05). Па 60-ые сут СД угнетение на 50% MA тромбоцитов вызывало уже 20,0 ±1,1 мкл аортального шгкубата, что на 53% больмте, чем в контрольной группе (р<0,01)и на 23% больше, чем в более ранние сроки СД(р<0,05).

Таким образом, в динамике течения СД у крыс прослеживается снижение чувствительности тромбоцитов к ПВАИ, особенно выраженное на 60-ые сут аллоксанового диабета . Аналогичные данные в клинике у больных СД отмечали Bonne et al.,( 1979), Onodera et al., (1982). По- видимому , снижение чувститель-ности тромбоцитов к ПВАИ при диабете является одним из факторов пшерагрегации тромбоцитов и способствует облегчению взаимодействия тромбоцитов и эндотелия уже на ранних стадиях развития СД.

Важным информативным показателем изменения функции тромбоцитов является реакция высвобождения серотонина из тромбо-цитарных гранул. Нами установлено, что содержание серотонина в интактных тромбоцитах во все исследуемые сроки СД статистически достоверно не изменялось ( табл.1). Активный захват серотонина тромбоцитами у контрольных животных составил

- 1228,317.7% от исходного содержания его в тромбоци 1ах, нрння-ююза 100% (р <0,05). На 15-ые сух течения СД активным ■»ахни I серотонина был равен 20,0 ± 4,4 % ог исходного ег о содержания (р<0,05) и значимо не отличался от величины показа-геля в контроле (р > 0,05). На 30-ые сут течения С"Д захва I сероюннна тромбоцитами возрос до 50,0±4,8% от исходною со-Дс-ржания (р<0,01), и достоверно отличался от величины захва-Iа серотонина в контрольной группе (р<0,05). На 60-ые сут |ечения СД захват серотонина составил 31,5±5,6% 01 исходного содержания в тромбоцитах (р<0,05) и существенно не отличался о г величины захвата серотонина в контроле (р < 0,05).

11ри изучении реакции высвобождения серотонина тромбоцитами под действием ЛДФ выявлены следующие изменения. Высвобож дение серотонина тромбоцитами контрольных крыс было равно 22,014,8% по отношению к исходному содержанию его в фомбо-ци Iах(р<0,05).У крыс с СД продолжительностью 15 су1 высвобождение серотонина увеличилось до 46,2±8,4°/ о о г исходного уровня (р<0,01), что выше, чем высвобождение в контрольной

Табл.1

Содержание, захват и высвобождение серотонина тромбоцитами крыс в разные сроки СД, М±Л1, мкг /109 кл.

Ч Показатели Группы \ животных \ Исходный уровень серотонина, мкг/ ю\л Содержание серотонина в тромбоцитах при инкубации с экзогенным серотонином (захват) Содержание серотонина в тромбоцитах после инкубации с АДФ (высвобождение)

Контроль п=21 2,19±0,56 2,81±0,17 1,7110,31

С'Д15сут п=9 2,45±0,26 2,94±0,42 1,37±0,34**

СД 30 сут п=9 2,70±0,60 4,08±0,34** 2,05±0,22

СД 60 сут п=9 2,24±0,31 2,97±0,66 1,68±0,21 '

Примечание: *р<0,05 , ** р<0,01

Данные результаты обработаны с применением I- крщерия

Сп.юдента и XV - критерия Вилкоксона (Манна-Уигни).

руппе (р < 0,05). У крыс с СД продолжительностью 30 сут 1Ысвобождение серотонина из тромбоцитов составило 25,5±3,2% >т исходного(р<0,05), и значимо не отличалось от такового в ;онтроле(р>0,05). У крыс с СД продолжительностью 60 сут выс-юбождение серотонина из тромбоцитов составило 24,9±3,8% от входного уровня (р < 0,05) и не отличалось от высвобождения еротонина тромбоцитами контрольных крыс(р<0,05). Таким образом, отмечается неодновременное усиление захвата I высвобождения серотонина тромбоцитами крыс : усиление зах-1ата серотонина отмечается на 30- ые сут развития СД, тогда ;ак усиление высвобождения - на 15-ые сут СД. У крыс с СД 60 ут захват и высвобождение серотонина существенно не отлича-1ись от соответствующих показателей в контроле. Захвати 1Ысвобождение серотонина тромбоцитами не коррелировали с ровнем гликемии . Таким образом, отсутствовал параллелизм 1ежду захватом и высвобождением серотонина тромбоцитами у рыс с различными сроками СД. В единичных исследованиях опи-ано усиление высвобождение серотонина тромбоцитами у детей

СД (\Vinocour Л а!., 1992) и у крыс со стрептозотоциновым :Д ( \Vinocour е1 а!., 1987).

Результаты исследования содержания МДА в интактных и активированных тромбином тромбоцитах у крыс с СД представлены | табл. 2. На 15-ые сут развития СД содержание МДА в неакти-¡ированных тромбоцитах было увеличено почти в 2 раза по равнению с контролем(р<0,01), а на 30-ые сут- в 1,7 раза по равнению с содержанием его в неактивированных тромбоцитах у :онтрольных крыс (р<0,01). На 60-ые сут течения СД количест-;о МДА в неактивированных тромбоцитах значимо не отличалось >т уровня его в контроле (р>0,05). Таким образом, наибольшее одержание МДА в неактивированных тромбоцитах обнаружено у рыс на 15-ые сут развития СД . Содержание МДА в активиро-анных тромбином тромбоцитах во всех исследуемых группах бы-ю больше, чем в неактивированных клетках (р<0,01) На 15-ые ут развития СД уровень МДА в активированных тромбоцитах был [а 75,8% больше, чем в контроле (р<0,05), на 30-ые сут он 'величился на 68,9% по сравнению с уровнем его в тромбоцитах

контрольных крыс (р<0,05). На 60-ые сут течения СД содержание МДА в активированных тромбоцитах значимо не отличалось от такового в контроле(р>0,05).

Табл.

Образование МДА тромбоцитами контрольных крыс

и крыс с СД различной длительности

Группы животных Содержание МДА , нмоль/10^ кл. неактиви- активированные рованные тромбоциты тромбоциты Образование МДА за 20 мин инкубации, нмоль/10^ кл

Контроль , п=18 1,2 ± 0,13 2,77 ± 0,25** 1,57 ± 0,14

СД 15 сут., п=9 2,35 ± 0,26* 4,87 ± 0,39** 2,518 ± 0,34*

СД 30 сут., п=9 2,04 ± 0,26* 4,57 ± 0,61** 2,024 ± 0,33

СД 60 сут, п=9 1,36 ± 0,28* 2,84 ± 0,31** 1,47 ± 0,45

Примечание : * р < 0,05 , сравнивали содержание МДА в неак тивированных тромбоцитах у крыс с СД и в контроле.

**р<0,01 , сравнивали содержание МДА в ак тивированных и неактивированных тромбоцитах. ■ При определении прироста МДА, образованного тромбоцитами за 20 мин инкубации в результате стимуляции тромбином, максимальная продукция его отмечалась в тромбоцитах крыс на 15-ые сут развития СД. В дальнейшем( 30-ые сут) продукция МДА тромбоцитами несколько снижалась , а через 60 сут фактически не отличалась от таковой в контроле. Увеличение исходного уровня МДА в неактивированных тромбоцитах при СД 15 и ЗОсут и повышение образования ими МДА при стимуляции тромбином позволяет полагать, что уже на ранних сроках СД происходит активация тромбоцитов в сосудистом русле.

Во все исследованные нами сроки СД отмечалось значительное увеличение уровня МДА в плазме крови, что свидетельствует об активации процессов перекисного окисления липидов плазмы при некомпенсированном СД. Уровень МДА в плазме высоко и положительно коррелировал с уровнем гликемии во все исследуемые сроки СД( 1=+ 0, 76, р< 0, 01 ). Существенно отметить, что уровень МДА в плазме на 15-ые сут развития СД высоко и

положительно коррелировал с уровнем МДА в неактивированных тромбоцитах ( г=+0,67; р< 0,05) и в активированных тромбоцитах ( г=+0,52; р < 0,05 ), тогда как в другие сроки СД такой корреляции не отмечалось. Увеличение образования МДА тромбоцитами у больных СД отмечали Makris et al., (1985) и у крыс со стрептозогоциновым СД (Honour et al., 1981). Учитывая , что увеличение метаболизма арахидоновой кислоты в неактнвнрованных тромбоцитах развивается в более ранние сроки СД у крыс по сравнению с агрегацией тромбоцитов, определение продукции МДА тромбоцитами может служить маркером активации тромбоцитов in vivo.

Исследование функциональной активности тромбоцитов на :овременном этапе требует дополнительного изучения особенностей ультраструктуры тромбоцитов, сведения о которой при в литературе единичны ( Coller et al., 1986).

При сравнении вариационных кривых распределения площадей .ечений тромбоцитов крыс на 15-ые сут СД и в контроле отменяюсь достоверное их различие (р<0,001 ). Содержание в попу-1яцин крупных тромбоцитов при СД 15 сут составляло 33% по равнению с 5% в контроле, причем отмечалось появление верхкрупных форм, не имеющих аналогов у контрольных живот-гых.(рис.2). Укрупнение тромбоцитов сопровождалось их округ-[ением. Количество тромбоцитов с псевдоподиями увеличивалось ia 21% по сравнению с контролем. Количество секретирующих ранул в тромбоцитарных срезах при СД во все исследуемые роки не отличалось от показателей в контроле. Однако вели-ина суммарных площадей сечений секретирующих гранул тромбо-итов у крыс на 15- ые сут С Д и у контрольных существенно тличалась(р<0,001 ): при СД число тромбоцитов с увеличением гого показателя было на 50% больше, чем в контроле ( рис. 2.). На 30-ые сут течения СД большинство тромбоцитов сохраняло искоидную форму , характерную для тромбоцитов контрольных рыс. В то же время отмечался рост на 22 % числа тромбоцитов псевдоподиями. Величина суммарной площади секретирующих эанул при этом увеличивалась (р<0,01), число тромбоцитов с

%

Отн. а

Примечание : по анализу величин тромбоцитарных срезов

Рис. 2. Изменения величин тромбоцитов в динамике развития С/]

большими значениями этого показателя составило 22% по сравнению с 3% их в контроле.

На 60-ые сут течения СД также отмечался рост содержания укрупненных форм тромбоцитов - до 70% по сравнению с контролем и увеличивалось количество округлых форм тромбоцитов. Отмечено увеличение на 26% числа тромбоцитов с множественными псевдоподиями. Содержание тромбоцитов с большей суммарной площадью секретирующих гранул оставалось таким же , как и при СД 30 сут( рис2.).

Анализируя полученные данные , можно отметить увеличение содержания крупных округлых форм тромбоцитов при СД, особенно на 15-ые и 60-ые сут. Несмотря на отсутствие достоверного различия между величинами тромбоцитов в эти сроки СД, отме-

чается достоверное различие величин коэфициента конфигурации : при СД 15 сут тромбоцитарные срезы имеют более округлую форму и, как правило, единичные псевдоподии.При СД 60 сут растет число тромбоцитов с увеличенным количеством псевдоподий. Хотя количественное содержание секретирующих гранул в тромбоцитах при СД не отличалось от данных контроля, количество тромбоцитов с большим суммарным обьемом секретирующих гранул достоверно увеличивалось, особенно на 15-ые сут СД.

По мнению некоторых авторов, округлые и более крупные формы тромбоцитов являются юными клетками с характерной для них выраженностью секреторного аппарата ( Karpatkin, 1969; Haver, 1982). Увеличение процента мегатромбоцитов описано также у больных СД ( Garg et al.,1972 ; Colwell, 1977). Возможно, что рост числа мегаформ при СД связан с усилением потребления тромбоцитов сосудистой стенкой и/или с уменьшением времени жизни тромбоцитов.

Исследование антаагрегационной активности аорты показало, что у крыс групп возрастного контроля угнетение МА тромбоцитов в 2 раза вызывало добавление инкубата аорты контрольных крыс в разведении 1:3; антиагрегационнная активность аортального инкубата ( AAA И) контрольных крыс была принята за 100% (рис.3).

На 15- ые сут СД такое же угнетение МА тромбоцитов вызвало добавление инкубата в разведении 1:2- АААИ крыс с СД продолжительностью 15 сут снижалась на 25% по сравнению с контролем (р<0,05), а у крыс с СД продолжительностью 30 сут уменьшалась на 40% по сравнению с соответствующим контролем (р<0,01). При СД продолжительностью 60 сут АААИ уменьшалась на 50% по сравнению с контролем (р<0,001).

Следует отметить , что добавление неразведенного аортального инкубата контрольных крыс к контрольным тромбоцитам вызывало полное угнетение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, тогда как при добавлении такого же количества неразведенного инкубата нижней полой вены отмечалась лишь тенденция к уменьшению МА тромбоцитов и

уменьшение на 30± 5% периода полудезагрегации тромбоцитов ( р<0,05). Инкубат нижней полой вены крыс с СД во все

—♦—Аетиагрвгационная активность —Ш—Тромбо пласта новая активность

Рис.3. Изменение антиагрегацнониой и тромбопластиновой активности аорты у крыс в динамике течения СД исследуемые сроки не влиял на параметры агрегации и дезагрегации тромбоцитов контрольных крыс.

Таким образом, при СД отмечалось раннее( 15 сут) и прогрессирующее к 60-ым сут снижение АААИ и отсутствие антиагре-гационного эффекта инкубата нижней полой вены. Снижение антиагрегационной активности аорты отмечено у больных СД (1)о1-1егу е1 а1.,1979; Е. И. Соколов и соавт., 1991) и у крыс с СД (аЪоЬ е1 а1., 1981; Г.Ф. Задкова и соавт., 1993)

Нами не обнаружено значимого различия в тромбопластиновой активности артерий ( ТПА ) и вен у крыс контрольных групп(р>0,05). На 15-ые и 30-ые сут течения СД ТПА артерий и вен существенно не отличалась от таковой в контроле. На 60-ые сут течения СД ТПА артерий увеличилась на 19% по сравнению с контролем (р<0,05) (рис.2) и высоко и положительно коррелировала с уровнем гликемии (г=+0,94, р<0,001). ТПА нижней полой вены на 15-ые и 30-ые сут СД существенно не от-

личалась от показателей в контроле(р> 0,05), а на 60-ые сут СД увеличилась на 22% и положительно коррелировала с уровнем гликемии (г=+0,77; р<0,01).

Следовательно, ТПА аорты и нижней полой вены на 60-ые сут течения СД была увеличена, что, по- видимому, обеспечивает усиление тромбогенного потенциала сосудистой стенки.

Таким образом, при экспериментальном СД ранних сроков отмечаются некоррелируемые между собой изменения тромбогенного потенциала и атромбогенных свойств сосудистой стенки: анти-агрегационная активность аортального инкубата уменьшалась уже при СД 15 сут и прогрессивно снижалась к 60 сут, а изменения ТПА сосудистой сгенки аорты и нижней полой вены отмечались лишь при СД 60 сут. В доступной литературе нам не встретились сообщения о изменении ТПА при СД ранних сроков. Увеличение тромбогенного потенциала и снижение атромбогенных свойств сосудов способствуют наклонности к развитию тромбо-образования, которое наблюдается у больных СД.

Морфометрический анализ почек крыс с СД свидетельствовал о том, что во все исследуемые сроки СД наблюдается рост удельного объема мезангия( р< 0,05), в котором накапливается РАБ(+) вещество. Отмечалась гиалиново- капельная и зернистая дистрофия проксимального отдела почечных канальцев.

На ультраструктурном уровне на 15-ые сут развития СД отмечались деструкция фенестр эндотелия, вакуолизация и очаговое отслоение его от базалыюй мембраны ( БМ), которая местами была утолщена и пропитана электронноплотным мелкозернистым материалом.Наблюдалась сегметарная пролиферация ме-зангиоцитов.В отдельных петлях капилляров- скопления прилежащих к эндотелию тромбоцитов. Через 60 сут в клубочках нарастала деформация капиллярных петель вплоть до полной облитерации.БМ была утолщена и разрыхлена на обширных участках и местами лишена эпителиального покрытия. Отмечались скопления пристеночно расположенных тромбоцитов (до 10-20 в поле зрения), часть из которых была дегранулирована. Следовательно, в почках крыс с СД наблюдались изменения, эквивалентные описанным в литературе признакам диабетической микроангиопатии

- 20-

(M.X. Берулава, 1978, Stefíeret al., 1989).

Таким образом, нами выявлены существенные нарушения тром-боцитарно- сосудистого звена гемостаза в динамике течения СД у крыс . Они "характеризуются выраженной активацией и повышением ряда функций тромбоцитов , что создает потенциальную возможность для гиперагрегации . С другой стороны, отмечаются существенные изменения состояния сосудистой стенки: прогрессирующее снижение АААИ и более позднее повышение ТПА , что приводит к повышению тромбогенного потенциала сосудистой стенки . Описанные нарушения тромбоцитарнососудистого звена гемостаза, по- видимому, являются одним из важных механизмов развития ранних сосудистых поражений при СД.

ВЫВОДЫ:

1. У крыс с хроническим аллоксановым диабетом в динамике его течения функциональная активность тромбоцитов повышается: усиливается АДФ-индуцированная агрегация и ослабляется дезагрегации тромбоцитов; повышается захват серотонина и реакция его высвобождения. Снижается чувствительность тромбоцитов к ПВАИ.

2. При аллоксановом диабете усилены процессы ПОЛ в тромбоцитах и плазме крови крыс. Это проявляется в повышении содержания МДА в нестимулированных и стимулированных тромбином тромбоцитах и в плазме крови.

3. Различные функции тромбоцитов в динамике течения аллокса-нового диабета изменяются неодновременно: к наиболее ранним изменениям (15-ые суг ) относятся ослабление дезагрегации, усиление высвобождения серотонина и продукции МДА, снижение чувствительности тромбоцитов к ПВАИ , тогда как усиление захвата серотонина и агрегации происходит в более поздние сроки - соответственно на 30-ые и 60-ые сут.

4. Выявлен комплекс функционально-метаболических и ультра структурных изменений тромбоцитов у крыс с СД , свидетельствующий о появлении пула гиперреактивных тромбоцитов. Показателями активации тромбоцитов in vivo являются повышенный уровень МДА в нестимулированных тромбоцитах, появление мега-

форм тромбоцитов , изменение формы у части тромбоцитов, увеличение числа псевдоподий и суммарной площади секретирующих гранул, а также появление тромбоцитарных агрегатов и дегра-нулированных форм тромбоцитов в микрососудастом русле.

5. У крыс с аллоксановым диабетом прослеживается прогрессирующее снижение простациклиноподобной активности инкубатов аорты и нижней полой вены и повышение их тромбопластиновой активности на 60-ые сут течения СД, что ведет к повышению тромбогенного потенциала сосудистой стенки.

6.Сочетание снижения антиагрегационной активности сосудистой стенки с понижением чувствительности тромбоцитов к антиагре-гантным веществам сосудов , а также повышение тромбогенного потенциала сосудистой стенки в сочетании с гиперреактивностью тромбоцитов способствуют гиперагрегации и тромбообра-зованию при экспериментальном аллоксановом диабете.

7. Наблюдается параллелизм между появлением ранних признаков диабетической ангиопатии в почечных клубочках - утолщением мезангия , изменениями эндотелиоцитов и других структур клубочков, протеннурией и наличием гиперреактивных тромбоцитов в сосудистом русле. Это позволяет полагать , что пул гиперреактивных тромбоцитов, наряду с другими факторами, участвует в повреждениях сосудов клубочков на ранних этапах формирования диабетической микроангиопатии.

Практические рекомендации:

1.Выявленные показатели активации тромбоцитов in vivo в ранние сроки развития СД - увеличение содержания МДА в неактивированных тромбоцитах , усиление реакции высвобождения серотонина из тромбоцитарных гранул могут быть использованы в клинике в качестве " ранних " маркеров повышенного функционального состояния тромбоцитов.

2. Изменения атромбогенных и тромбогенных свойств сосудистой стенки при СД (прогрессивное уменьшение антиагрегационной активности аорты, увеличение тромбопластиновой активности) указывают на целесообразность раннего использования средств, корригирующих изменения тромборезистентности сосудов.

3. Проведенные исследования тромбоцитарно- сосудистого звена гемостаза на ранних сроках СД определяют дальнейшее переспективное направление в изучении механизмов ранних повреждений сосудов при СД .

4. Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе при изучении разделов патологической физиологии : " Патофизиология системы гемостаза" , " Нарушения углеводного обмена" и " Патофизиология эндокринной системы" .

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Агрегация тромбоцитов и антиагрегационная активность аорты крыс с аллоксановьмдиабетом.// Тезисы докладов научно-практической конференции"Актуальные вопросы эндокринологии",посвященной памяти з.д.н.РСФСР, проф.Д.Я. Шурыгина,--Санкт-Петербург.- 1993.-С. 196 - 197. (соавт. С. А. Шестакова )

2.Состояние микроциркуляции в брыжейке крыс и агрегация тромбоцитов при гипогликемичекой коме.// Физиологический журнал им. И. М. Сеченова - 1995-Т. 81,- N 6.- С. 99- 104( всоавт.

Ш'Ч. '¡м Г.:

с С. А .Шестаковой , И.Ф. Михайловым )

3.Роль тромбоцитов в патогенезе диабетической ангиопатии "Впервыев медицине"-1995-.Ы. I-С. 76-77 (в соавт. с С.А.Шестаковой, В.А.Титовой, Н.В. Бойковой),

4.Атромбогенные свойства и тромбогенный потенциал сосудистой стенки при сахарном диабете." , там же , С. 60

5.3ахват и высвобождение серотонина тромбоцитами крыс при экспериментальном сахарном диабете. Тезисы Всероссийской конференции молодых ученых "Биофизические и биохимические механизмы функции ", СПб ГУ , в печати.

б.Антиагрегационная активность аортального инкубата и чуст-вительностъ к нему тромбоцитов крыс с экспериментальным сахарным диабетом.(в соавтор, с С.А.Шестаковой), там же (в печати).