Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Морфометрические характеристики тромбоцитов у больных с первичной иммунной тромбоцитопенией

На правах рукописи

Колосова Екатерина Николаевна

«Морфометрические характеристики тромбоцитов больных с первичной иммунной тромбоцитопенией»

14.01.21. - «Гематология и переливание крови»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степепп кандидата медицинских наук

9 ЯНВ 2014

Москва - 2013

005544330

005544330

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Минздрава России

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Ковалева Лидия Григорьевна

Доктор медицинских наук, профессор Василенко Ирина Анатольевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, кафедра клинической трансфузиологии Московского Государственного

Стоматологического Университета Погорелов Валерий Михайлович

Доктор медицинских наук, профессор, заведующая отделом оптимизации лечения гематологических заболеваний Федерального Научно-Клинического Центра детской гематологии,

онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева Сметанина Наталия Сергеевна

Ведущее научное учреждение:

Российский университет дружбы народов

Защита состоится « 12 » февраля 2014г в^^часов.

на заседании Диссертационного Совета Д 208.135.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Минздрава России по адресу: 125167, Москва, Ново-Зыковский проезд, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Федеральном государственном бюджетном учреждении Гематологический научный центр Минздрава России по адресу: 125167, Москва, Ново-Зыковский проезд, д.4.

Автореферат разослан декабря 2013г

Ученый секретарь диссертационного совета, И.О., доктор медицинских наук, профессор

Г.А. Клясова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность ппоблемы

Первичная иммунная тромбоцитопения (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП)) является аутоиммунным заболеванием, которое характеризуются срывом толерантности к собственным антигенам тромбоцитов. Несмотря на многочисленные исследования, причины этого процесса к настоящему времени остаются не установленными.

Специалисты отмечают неоднородность патогенетических механизмов, лежащих в основе ИТП, отсутствие достоверных клинических и лабораторных показателей, позволяющих прогнозировать рецидивирование заболевания. Всё это диктует необходимость проведения широкого дифференциального поиска, внедрения новых высокочувствительных лабораторных методов обследования.

Не вызывает сомнения, что новые и информативные данные об особенностях патогенеза этого заболевания можно получить, изучая морфофункциональное состояние тромбоцитов. До последнего времени с этой целью использовали визуальный анализ микроскопического изображения, который не позволял с достаточной надежностью количественно оценить изменения элементов структуры тромбоцитов, их роль в различных нарушениях, в том числе и иммунологических конфликтах.

С появлением современных компьютерных технологий, основоположником которых в нашей стране является профессор Г.И. Козинец, принципиальным образом расширились возможности количественного изучения морфологии клеточных элементов системы кроветворения. Применение новых объективных количественных показателей позволило повысить информативность микроскопического исследования поверхности, формы, площади, объема, высоты и оптических свойств цитоплазмы тромбоцитов, а также изучить, каким образом изменения указанных параметров отражают функциональные особенности кровяных пластинок.

Изучение морфо-функционального состояния тромбоцитов методом компьютерной морфометрии имеет как теоретическую, так и практическую значимость, поскольку способствует углублению представлений о патогенезе и особенностях течения первичной иммунной тромбоцитопении, проведению дифференциальной диагностики с другими тромбоцитопениями на качественно новом уровне, более детальному пониманию механизмов развития заболевания и оптимизации проводимой патогенетической терапии.

В связи с этим, несмотря на достигнутый за почти 25 лет прогресс в изучении механизмов развития, клинических особенностей и подходов к лечению, ИТП продолжает оставаться одной из актуальных дисциплинарных проблем современной гематологии,

требующих разработки и внедрения в практическое здравоохранение новых информативных критериев, исследовательских методик и современного диагностического оборудования.

Цель исследования

Установить диагностическую и клиническую значимость витальных (прижизненных) показателей морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови у больных первичной иммунной тромбоцитопенией.

Задачи исследования

1.Выявить особенности витального морфофункционального состояния тромбоцитов у больных первичной иммунной тромбоцитопенией при установлении диагноза до терапии, сравнить полученные данные с аналогичными показателями у здоровых лиц.

2.Сравнить особенности морфофункционального состояния тромбоцитов у больных первичной иммунной тромбоцитопенией и тромбоцитопениями другого генеза.

3.Оценить динамику морфомегрических показателей тромбоцитов при различных видах терапии больных с первичной иммунной тромбоцитопенией (глюкокортикостероиды, спленэктомия, иммуноглобулин, агонисты тромбопоэтина).

4,Оценить взаимосвязь уровня антитромбоцитарных антител и морфофункционального состояния циркулирующих тромбоцитов у больных с иммунной тромбоцитопенией.

5.Определить диагностическую и прогностическую ценность метода в сравнении с другими диагностическими тестами.

Научная новизна

Выявлены и количественно оценены структурные особенности и функциональная активность тромбоцитов периферической крови при первичной иммунной тромбоцитопении. Установлено, что при ИТП, нарушения в тромбоцитарном звене связаны с изменениями функционального состояния клеток и морфологического состава циркулирующей популяции.

Впервые проведена комплексная оценка тромбоцитов периферической крови у пациентов с первичной и вторичной тромбоцитопенией, а также установлена возможность их дифференциации на основе морфометрических параметров клеток.

Выявлена корреляция между титром антитромбоцитариых антител и нарушениями морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови.

Проведен мониторинг динамики показателей морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови у пациентов с ИТП в зависимости от методов лечения. Установлено, что показатели морфофункционального состояния тромбоцитов могут служить критериями эффективности проводимой терапии. При этом в более ранние сроки нормализация морфометрических параметров циркулирующих тромбоцитов наблюдалась у больных при использовании внутривенного иммуноглобулина по сравнению с проведением спленэктомии или терапии ГКС.

Практическая значимость

Экспресс-метод витальной компьютерной морфометрии тромбоцитов апробирован в клинической практике как скрининговый при обследовании больных с первичной иммунной тромбоцитопенией.

Повышение эффективности диагностики первичной иммунной тромбоцитопении на основе использования витальной компьютерной фазометрии позволяет своевременно выявлять нарушения, проводить адекватную профилактическую или лечебную их коррекцию, способствует уменьшению количества больных с тяжелыми формами заболевания, сокращению сроков временной нетрудоспособности, а также своевременной смены лечебной тактики терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

Изменения тромбоцитов у пациентов с первичной иммунной тромбоцитопенией заключаются в нарушении функциональной полноценности и морфологической структуры клеток, увеличении гетерогенности циркулирующей популяции.

Предикторами тяжести заболевания у больных с ИТП могут служить морфометрические показатели живых тромбоцитов периферической крови (увеличение их размерных параметров, повышение содержания активированных клеток).

Характер изменения морфофункционального состояния тромбоцитов у больных с первичной иммунной тромбоцитопенией непосредственно определяется глубиной тромбоцитопении и титром циркулирующих антитромбоцитариых антител.

Публикации

Результаты исследований отражены в 7 публикациях, из них две в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы Апробация диссертации проведена 19 ноября 2012 года на заседании проблемной комиссии ФГБУ ГНЦ МЗ РФ "Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)".

Основные материалы и положения работы доложены и обсуждены на II научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции «Цитометрия в биологии и медицине: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2010).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 49 отечественных и 76 зарубежных источников литературы. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 18 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты, материал и методы исследования

В диссертации обобщены данные обследования 175 пациентов с тромбоцитопениями, находившихся на обследовании и лечении в научно-клиническом отделении амбулаторно-поликлинической помощи ГНЦ в период с 2007 по 2011 гг. Из них 135 пациентов с диагнозом первичная иммунная тромбоцитопения, 40 - с вторичными тромбоцитопениями. Для получения нормативных характеристик компьютерной морфометрии тромбоцитов взрослых здоровых лиц в контрольную группу были включены 30 доноров - практически здоровые лица без признаков аутоиммунного заболевания, тромбозов и не принимавшие на момент исследования какие-либо лекарственные препараты, средний возраст их составил 36,1±10,5 лет. Общая характеристика больных с тромбоцитопенией включенных в исследование по возрасту и соотношению полов представлена в таблице 1.

Таблица 1. Общая характеристика больных с тромбоцитопенией.

Характеристика ИТП Аплазия АФС Вирусный Поспдпосгашчэская

больных кроветворения гепатит тромбоцитопения

Число больных (175) 135 10 10 10 10

Мужчина: женщина 33:102 5:5 2:8 5:5 5:5

Средний возраст (лет) 35,7±11,5 27±5,4 26,8±6,3 33,9±7,7 33,7±6,7

Диагноз ИТП устанавливался согласно классификации на основании общепринятых критериев:

-изолированное снижение уровня тромбоцитов в периферической крови (с допустимой гипохромной анемией вследствие выраженного геморрагического синдрома), -раздражение или сохранение мегакариоцитарного ростка, -отсутствие увеличения размеров селезенки,

-отсутствие диагностических признаков системных, эндокринологических и онкогематологических заболеваний способных вызвать вторичную иммунную тромбоцитопению.

Обследование больных проводили согласно стандартному протоколу, включающего в себя:

-сбор анамнестических данных,

-оценку клинического статуса по выраженности основной клинической симптоматики,

-визуальный (ручной, неаппаратный) просмотр и подсчет показателей периферической крови

-биохимическое исследование крови с включением функциональных проб печени, почек, состояния поджелудочной железы и хотя бы основных показателей гемостаза

- цитологическое исследование пунктата костного мозга

- тесты на исключение СКВ и других коллагенозов,

-постановка реакции Вассермана, теста на ВИЧ-инфекцию и выявление антигенов вирусного гепатита,

- определение антител к фосфолипидам,

-определение функционального состояния щитовидной железы и антитиреоидных антител.

Помимо общепринятых клинических методов обследования больных применялись специальные методы:

- определение антител против гликопротеинов мембраны тромбоцитов методом радиоимунного анализа,

- для исследования морфофункционального состояния тромбоцитов использовали метод витальной компьютерной фазово-интерференционной микроскопии на базе отечественного компьютерного лазерного фазово-интерференционного микроскопа (КФМ) "Цитоскан" (МГИРЭА, Москва) (Василенко И.А., Тычинский В.П., 1995).

Выбор КФМ в качестве метода исследования был продиктован возможностью изучения живых нативных тромбоцитов, не подвергавшихся предварительной обработке,

окрашиванию или фиксации; реализацией принципа индивидуального подхода к детальному анализу характеристик каждого клеточного объекта; оперативному получению высокоточных и объективных количественных данных на основе компьютерной технологии (в течение 2-х часов); использованию универсальных критериев оценки клеток, характеризующих как морфологические, так и функциональные их особенности; потребностью малого (не более 1-1,5 мл) объема крови для проведения анализа; отсутствием необходимости использования дорогостоящих реактивов или длительной пробоподготовки.

Оценку морфофункционального состояния тромбоцитов периферической крови проводили в динамическом режиме: накануне начала терапии, через 5-7 дней и 1 месяц от начала терапии в лаборатории компьютерной цитоморфометрии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова (Руководитель - д.м.н., проф. Василенко И.А.). При исследовании использовали венозную кровь, заготавливаемую в пробирку из ареактивного пластика с антикоагулянтом (ЭДТА). Для приготовления плазмы, обогащенной тромбоцитами, кровь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5-7 минут. Взвесью клеток заполняли камеру Горяева, рабочая поверхность которой имеет зеркальное напыление. После 3-5 минутного интервала, необходимого для оседания клеток, производили съемку изучаемых цитообъектов. Оптимальный объем выборки составлял 50 — 100 клеток. Для проведения исследований использовали штатный 30-кратный микрообъектив с числовой аппертурой 0,65. Увеличение в канале регистрации составляет 500х. Комплексный алгоритм фазометрии тромбоцитов включал автоматическое определение заданных размерных параметров клеток, статистическую обработку данных и документирование результатов в виде протоколов I, II и III уровней:

I уровень обеспечивал визуализацию фазово-интерференционного образа тромбоцита (топограмму, 3-мерное изображение, профиль, гистограмму распределения фазовых высот).

II уровень - рассчет морфометрических показателей отдельных клеток (диаметр -Dmax, периметр - Per, высота - Height, площадь - Area, объем - Vol); оценку распределения объема и площади фазово-интерференционного образа клетки по уровням сканирования (взаимодействие с чужеродной поверхностью); контурное изображение топографии интерференционного поля (послойная интерферограмма клетки в псевдоцвете).

III уровень - интегральный анализ клеточной популяции по мерным признакам (Dmax, Per, Height, Area, Vol), построение тромбоцитограмм.

Статистический анализ экспериментальных и клинических данных проводили с помощью алгоритмов среды МаЛаЬ и математического пакета '^аизпса 6". Стандартная обработка выборок включала подсчет значений средних арифметических величин, ошибок средних, а также величины дисперсии, среднего квадратического отклонения и анализа асимметричности распределения. Различия между сравниваемыми группами рассчитывали по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. Уровень значимости устанавливался равным 0,05. Различия признавали достоверными при значении р < 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Из клинической характеристики больных следует, что возраст больных колебался от 17 до 77 лет, (средний возраст 35,7±11,5лет). Наибольшая частота встречаемости данного заболевания наблюдалась в возрасте от 20 до 40 лет и составила 68,9 %, что соответствует данным многих авторов. Несколько реже первичная иммунная тромбоцитопения встречалась у пациентов в возрасте - от 40 до 50 лет (14,1%). Наименее часто заболевание встречается в возрасте после 70 лет и составляет 2,9%.

При выполнении данного исследования учитывалась и степень тяжести течения ИТП. Критериями для условной оценки степени тяжести течения заболевания явились данные объективного осмотра, клинико-лабораторного обследования пациентов.

Под легкой степенью тяжести течения понималось отсутствие геморрагического синдрома, снижение уровня тромбоцитов не более чем до 50 тыс (тромбоцитопения в пределах 50-170х109 1/л).

Течение средней тяжести соответствовало наличию кожно-геморрагического синдрома в виде геморрагической сыпи на коже нижней половине туловища; умеренной интенсивности носовые, десневых кровотечений, а также тромбоцитопения (уровень тромбоцитов в пределах 20-50х 1091 /л). Количество рецидивов не более двух раз в год.

При тяжелой степени заболевания наблюдались выраженнный геморрагический синдром в виде геморрагической сыпи на верхней половине туловища, маточные, желудочно-кишечные, профузные носовые кровотечения, жалобы на головную боль, снижения остроты зрения и/или снижение уровня тромбоцитов ниже 20тыс (<20х1091/л). Течение заболевания постоянно рецидивирующее (более 3-х рецидивов в год). Распределение больных по группам в зависимости от тяжести течения заболевания представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, наибольшее количество пациентов, принимавших участие в исследовании было со средней степенью тяжести

течения илиопатичсской тромбоцитоиеинческой пурпуры — 56 (41.48 %), с легким течением наблюдались 38 пациент (28,15 %) н с тяжелой степенью течения в исследовании приняли участие 41 иациент. что составило (30,37%).

Таблица 2. Распределение больны! по группам с первичной иммунной тромбоцитопенией по шжгггм течения ибокваиия.

Тяжесть течения заболевания Общее кол-во больных

абс %

Легкая 38 28.15%

Средняя 56 41.48%

Тяжелая 41 30,37%

Всего 135 100%

При анализе анамнестических факторов, которые предшествовали началу заболевания и могли спровоцировать его дебют, выявлено, что более чем в половине случаев у 59% больных с ИТП начету заболевания предшествовала острая рсспираторно-вирусная инфекция, либо обострение хронических заболеваний; у 12% заболевание возникло в период гормональных перестроек (менархе, беременность, послеродовый и послеабортный период), после стрессовых ситуаций, на фоне психоэмоционального и физическою напряжения у 15%; у 4% проявилось после оперативных вмешательств; у 2% • после профилактического введения сывороток и вакцин

Клиническая картина заболеваний была разнообразной. Геморрагические осложнения в вине кровотечений и кровоточивости наблюдались у 78% бальных. Бессимптомно заболевание протекало у 22% больных с ИТП Клинико-лабораториые проявления обострений заболеваний в период наблюдения представлено на рисунке 1

Рис.1 Клиник»-.ибпра юрные проявления обоезреиий заболевания

Поскольку показаниями к началу лскния первичной иммунной тромбоцитопении является налн>мс геморрагическою синдрома и или снижении уровня тромбоцитов ниже 20-30 тыся<|. то дальнейшие исследования мы проводили у пациентов со средней и

тяжелой степенью заболевания. Все нациешм (97 человек) с ИТП, которым проводилась терапия, были разделены на 4 группы.

В Первую ГРУППУ бы.'М ВКЛЮЧСНЫ 66 ПШНеНТОВ. ПОЛуиВШИХ ТрОДИЦИОНИу ю

глюкокортикостсрондиуто терапию Втору ю группу составили 15 пациентов, у которых с лечебной целью была выполнена енленжтоми« Третью группу • 10 пациентов, получавших внутривенный иммуноглобулин Четвертую группу составили 6 пациентов, которые получали терапию атоинетами тромбопозтина (3 пациента на терапии ромипластином. 3 пациента на терапии -тромбона] ом).

Несомненный интерес представляет выявление ашитромбопитарных антител (аити ОР-НЬЛПа) при идиопатнчсской троибоцитопенической пурпуре на течение заболевания По уровню антитромбоцнтарных антител до начала проводимой терапии, пациенты были разделены на следующие группы: с низким уровнем анттлромбошларных (антитромбоцктариые антитела < 400%). средним (400-600%) и высоким (анпгтромбоцитарные антитела > 600%). Распределение больных ИТП в зависимости от уровня антитромбоцитраных антител представлено в (аблице 3

Габ.шца 3 Распределение больных ИТП и ивисимоои от уровня а н ■ н 1ро ибон м ■ р» н и 1 Ш11Н1Г.1

Уровень ATA Общее кол-во больных

абс. %

IJhikha {• 400*/.) 56 41.48%

Грслиий(400-600%) 48 35.56%

Высокий! 6004) 31 22,96%

Всего 135 100%

Мы проанализировали распределение геморрагического синдрома в зависимости от уровня антитромбоцитраных антител При сопоставлении уровня АТЛ и клинической картины, выявлена прямая корреляция - '«ем выше уровень ЛТА, тем более выражен к'моррагический синдром и тромбоцктопення, но вне зависимости от уровня антитромбоцитраных антител преобладали кожно-геморраги'кский синдром и носовые-дссневые кровотечения (рисунок 2).

Рисунок 2Л. Проявление тгморрат ическото синдрома при низком iHipr антитромбоцитраных антител

Рисунок 2В. Проанлемие геморрагического синдрома при среднем тигре антитромбоцитрямьп антитг.1

134

17%

?». 14

■ ®ТСуТ<ТВ>*Т

■ К0Ш1и1

■ носовые

■ МаТОЧВЫС

■ ПОГ.1Г иттракта гуЛ»

■ жкт

Рнонок 2С. Прияв книг теморра! нчеекпто синдрома при высоком пире антитромбоцитраных аитител

Витальная компьютерная фа иню-иитерференциониая микроскопия тромбоцитов периферической крови

Н» основе анализа полученных фазово-интерференцнонных портретов живых тромбоцитов и данных литературы было охарактеризовано 4 основных морфологических типа тромбоцитов, отражающих степень их активации в соответствии с различием вариантов их формы, характера рельефа поверхности, наличии псевдоподий, их количества и величины Важно отмстить, что фазовые портреты содержат информацию как о пространственно-объемных, так и об оптических свойствах цитообьектов. зависящих от конце1гтрацнн. химического состава. агрегатного состояния внутриклеточного вещества, наличия органстл и включений, поскольку ветчина коэффициента преломления, измеряемая в каждой точке, непосредственно зависит от клеточного содержимого. Установлено. >по в условиях физиологической нормы большая часть тромбоцитов периферической крови представлена плоскими, округлыми клетками с малкой или складчатой поверхностью — «гладкие» и «рифленые» лискоциты. относящиеся к I морфологн'ескому типу Ую так нашваемые «формы покоя» (Рис.3).

I II III IV

Hif.J Схгммгичгског пюбрмспнс чорфоф\нкнио|ы и.ны\ шпон тромГюциюп Ill рнф< |>ИЧ< с Кон криви: 1 тромбоцит «покоя»; II тромбоцит с иитким уровнем активности; Ш - высоко активированный тромбоцит; IV - лстсмсратикно-нтмсиенныс тромбоцит

Ко II морфолош'кскому типу тромбоцитов соответствуют клетки округлой или неправильной формы с гладкой н ш складчатой поверхностью и Несколькими короткими и широкими (меиыпе диаметра клетки) отростками-псеадоподиямн. являющимися выростами поверхностной мембраны - <охиношгты» I класса. Тромбоциты III морфологического типа представляют собой ратнообратные по форме клетки, обладающие большим количеством .глинных отростков- «антенн» (превышающих по длине р&тмер самого тромбоцита) - «охмпоциты» 2 класса Клетки II - III типов. от.ти>|ающнсся появлением отростков paiличного чис;и и длины, а также изменением н.ч формы, свямшюй с перестройкой цитоскслета и стр\*туры граиуломера, проявляют внешние признаки ф> нкиионалыой активности Широкие распластанные тромбоциты неправильной формы с неровной бугристой поверхностью, большим количеством отростков различной .пины а многочисленными вакуолями cootbctctbntot IV морфологическому типу - дегенеративным тромбоцитам, искрпавшим свой Ф> национальный потенциал.

На рисунке 4 представлен) соотношение морфологических типов тромбоцитов у практически здоровых добровольна

Рисунок 4. ( wit ношение морфо.ю1нчгскм1 типов (I, II, III, IV) TpoMi'muMioB периферической кропи у прлк нческн портил лиц (%).Установлсно. что в норме 63% тромбоцитов представлено котками «покоя». 21% - тромбоцитами с нилким уровнем активации (II тип). Количество меток с длинными отростками - «антеннами» - высоко

активированные тромбоциты - составляет 12% (III тип), а дегенеративно-измененные (IV тип) - всего 4%.

В группе лиц с ИТП (рис\нок 5) соотношение морфологических типов тромбоцитов составило: 51% - форм «покоя». 30% - тромбоцитов с низким уровнем активации. 17% - высоко активированных клеток и 2% - дегенеративных тромбоцитов.

Рисунок 5. Соотношение морфо.ю| нчески! типов (I, II. III. IV) тромбоцитов периферической крови > больных с ИТП (%).

Ahiliik морфологических типов тромбоцитов периферической крови у больных с ИТП в зависимости сл формы тяжести заболевания выявил статистически достоверные измеиения: с нарастанием тяжести течения заболевания наблюдается повышение актимциониого статуса циркулирующих тромбоцитов, и счет увеличения II - 111 типов тромбоцитов (рисунок 6) (р<0,03).

1 см»-.

12 BUH наш

14 15

so». 60".

23 29 58

а«». 20». 0%

62 SI •10

-Kl KdM vpeane-DMie-lM ■ 1 ■ 11 ■ Ш ■ Л

Рисунок 6. отображает соотношение морфо. ют ических типов тромбоцитов периферическом крови > пациентов с ИТП в швисимостн от тяжести течения мболсвания

Для объективной количественной оценки динамики морфофункционального состояния тромбоцитов были проанализированы средние в циркулирующей популяции морфометрические параметры клеток: диаметр, периметр, высота, площадь и объем. В таблице 4 представлены средние размерные показатели тромбоцитов периферической крови у соматически здоровых лиц.

Поскольку усредненные значения клеточных показателей не всегда адекватно отражают имеющиеся изменения, нами был изучен характер распределения популяции циркулирующих в периферической крови тромбоцитов путем сравнительного анализа гистограммного распределения клеток по величине их морфометрических показателей в зависимости от тяжести заболевания.

Таблица 4, Размерные параметры тромбоцитов периферической крови у пациентов с ИТП в зависимости от степени выраженности глубины тромбоцитопении

Группы обследования Диаметр (Г)), мкм Периметр (Р), мкм Высота (Н), мкм Площадь (Э), мкм Объем (V), мкм

Контрольная группа (п=30) 2,6 ± 1,2 8,21± 3,7 1,31 ±0,6 5,01 ±3,9 2,61 ±1,4

С Ё Легкая (п=38) 2,8±1,3* 8,7±2,1* 1,2±0,4* 5,2±3,4* 2,6±0,7*

О £ Из Средней степени (п=56) 3,6±1,2* 10,2±3,1 1,14 ±0,5* 6,7±3,5* 2,3±1,2

Я ^ Я я с Глубокая степень (п=41) 3,9±1,4* 11,7±2,2* 0,93 ±0,6* 7,1±3,2 2,2 ±1,1

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

Анализ средних по популяции размерных показателей циркулирующих тромбоцитов выявил четкую закономерность: с нарастанием глубины тромбоцитопении наблюдается достоверное прогрессирующее увеличение диаметра, периметра при снижении их фазовой высоты (р<0,05). Следует отметить, что такие морфометрические параметры как диаметр, периметр и площадь клеток преимущественно указывают на их реальные геометрические размеры, в то время как высота и объем являются в большей степени оптическими показателями, которые отражают оптическую плотность внутриклеточного вещества тромбоцита и зависят от состояния его гранулярного аппарата. Поэтому увеличение средних геометрических размеров тромбоцитов свидетельствуют о появлении в циркуляции более высокого процента активных тромбоцитов, а снижение оптических параметров - о недостаточности или опустошенности плотных гранул.

Мы проанализировали динамику отдельных морфометрических показателей тромбоцитов в циркулирующей популяции на фоне проводимой терапии. Эффективность

проведения различных видов терапии оценивали в динамике на 5—7-е сутки от начала лечения и через 1 месяц после начала терапии. Как уже говорилось ранее, в зависимости от методов терапии пациенты с ИТП были разделены на 4 группы.

В таблицах 5 и 6 представлен морфологический состав циркулирующей популяции тромбоцитов и размерные параметры клеток у пациентов с ИТП, в зависимости от

методов терапии.

Таблица 5. Соотношение морфологических типов тромбоцитов пациентов с ИТП на фоне проводимой терапии до начала терапии, на 5 сутки, на 30 сутки

Тип клеток Контроль(%) ГКС(%) (до терапии / 5 день /30 дней) СЭ(%) (до терапии / 5 день /30 дней) ВИГ(%) (до терапии / 5 день /30 дней) ТПО(%) (до терапии / 5 день /30 дней)

I тип 63 47/49/54 49/50/65 44/62/63 48/50/55

II тип 21 32/28/24 32/29/22 31/23/22 30/28/24

III тип 12 18/19/18 17/12/10 20/13/12 19/18/17

IV тип 4 3/4/4 2/18/3 5/2/3 3/4/4

Таблица 6. Размерные параметры тромбоцитов периферической крови у больных с ИТП на фоне проводимой терапии до начала терапии, на 5 сутки, на 30 сутки (М±6)

Показатель гкс (до терапии / 5 день /30 дней) СЭ (до терапии / 5 день / 30 дней) ВИГ (до терапии / 5 день /30 дней) тпо (до терапии / 5 день /30 дней)

Диаметр, мкм 2,6 ±1,2 3,8±1,2*/ 3,7±1,3 */ 3,2±1,1* 3,9±1,2*/ 4,0±1,1/ 3,1±1,2* 4,1±0,7*/ 2,7±1,3*/ 2,9±1,4* 3,9±1,1*/ 3,9±1,4/ 3,6±1,3

Периметр, мкм 8,21 ±3,7 11,6±3,3*/ 11,1±2,7*/ 10,2±3,6 11,8±2,3*/ 12,1±3,6*/ 9,5±3,3* 10,8±4,3*/ 8,7±4,2*/ 9,4±2,8* 11,0±2,8*/ 10,8±3,7*/ 10,6±4,1*

Высота, мкм 1,31 ±0,6 1,14±0,6*/ 1,23±0,4*/ 1,22±0,7* 0,9±0,5*/ 0,7±0,2*/ 1,35±0,3* 0,9±0,6*/ 1,34±0,2*/ 1,32±0,5 1,12±0,7*/ 1,21±0,6*/ 1,23±0,5

Площадь, мкм2 5,01 ±3,9 7,03±3,4*/ 7,1±2,7/ 7,2±3,6 6,7±3,4 */ 7,1±3,7*/ 6,4±3,5 6,8±3,2/ 5,8±4,3 */ 6,5±3,2* 7,1±4,3 */ 7,2±3,6 */ 6,9±4,2

Объём, мкмЗ 2,61 ± 1,4 2,12±1,7*/ 2,34±1,9/ 2,43±1,7 2,3±1,7*/ 2,34±1,3/ 2,72±1,5* 2,2±1,5*/ 2,64±1,5*/ 2,56±1,6 2,34±1,7*/ 2,25±1,4/ 2,31±1,2

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

17

Полученные результаты демонстрируют, что на фоне применения ВИГ выявлена статистически достоверная, ранняя нормализация морф« функциональных и активационных параметров тромбоцитов у пациентов этой гр>тты по сравнению с друтнмн методами терапии, уже па 5 сутки. выявляется четкая положительная динамка в нормализации основных параметров тромбоцитов (р<0.05). Применение гормональных препаратов выявило нормализацию морфофуикциопального статуса тромбоцитов лишь к концу 1-ю месяца лечения

У пациентов с ИТП, в течении которых применялась 2-ая линия терапии (спленэктомня), на 5 сутки отмечены значительные изменения морфофунхциональиых и активационных параметров тромбоцитов: продолжает уменьшаться высота, при соответствующем нарастании геометрических параметров и резко возрастает процент форм IV типа максимально до 18%. возможно згто обусловлено выбросом этих форм тромбоцитов ил сосулпв селезенки в кровоток Однако через месяц и более при динамическом наблюдении соотношение всех форм постепенно нормалиювалось до нормальных значений. При анализе морфофункииональных и активационных параметров тромбоцитов на фоне терапии атонистами ТПО. мы не выявили существенных отличий при динамическом наблюдении.

При проведении сравнительного анализа ИТП с вторичными тромбацитоиениями, куда вошли 40 нацистов с диагнозом вирусным гепатит (1 труппа), апластическая анемия (2 группа), антифосфолипидным синдромом (3 группа) и с тромбоцитопенией. обусловленной предшествующей цитостатической терапией (4 группа) были выявлены достоверные отличия (рисунок 7).

Рисунок 7. отображает соотношение морфаюгических типов тромбоцитов периферической крови у пациентов с вторичными тромбоиигопеннями и первичной ИУ1У1Уиной тромбоцитопенией

При первичной иммунной тромбоцитопении, как уже говорилось ранее преобладают высокоакгивированные клетки (клетки II и III типа 30% и 17% соответственно), вследствие аутоиммунного конфликта, то при тромбоцитопении, обусловленной цитотоксическим воздействием лекарственных препаратов соотношение морфологических типов тромбоцитов остается в пределах значений практически здоровых лиц (64%, 19%, 9 % и 8% соответственно). У больных с апластической анемией (2 группа) отмечено незначительное снижение тромбоцитов «покоя» до 59%, за счет увеличения содержание активированных клеток (И морфологический тип) до 27%, против 21%

Наиболее яркие изменения морфологической структуры популяции тромбоцитов при вторичных тромбоцитопениях зарегистрированы у больных с вирусным поражением печени. Отмечено выраженное изменение активационного статуса циркулирующих клеток: снижение числа форм покоя до 39%, против 63% в группе здоровых добровольцев; увеличение активированных тромбоцитов до 49%, против 33% и увеличение дегенеративных тромбоцитов до 12%, против 4%. Не исключено, что резкое увеличение функциональной активности тромбоцитов и 2-х кратное увеличение дегенеративных форм является компенсаторным вследствие двоякого геНеза тромбоцитопении, связанного как иммунным генезом заболевания, так и с вирусным поражением печени.

У пациентов с АФС также отмечено выраженное изменение активационного статуса циркулирующих клеток: снижение числа форм покоя до 48%, против 63% в группе здоровых добровольцев; увеличение активированных тромбоцитов до 47%, соответственно, против 33%.

При сравнении морфометрических характеристик тромбоцитов у пациентов с ИТП и АФС, поскольку при этих заболеваниях ведущую роль занимает аутоиммунный механизм, тромбоцигопения обусловлена выроботкой антител (антитромбоцитраных, антифосфолипидных) в обоих случаях преобладают высокоактивированные клетки, но при ИТП больше за счет II типа тромбоцитов (начальная стадия активации), а при АФС преобладают клетки III типа, что возможно косвенно отражает длительность аутоиммунного процесса.

При анализе гетерогенности популяции тромбоцитов в циркуляции по величине их размерных параметров распределение морфофункциональных параметров тромбоцитов при вторичных тромбоцитопениях у пациентов в группах с апластической анемией и тромбоцитопении, вследствие цитостатического воздействия мы не выявили достоверных изменений их клеточных параметров. Можно отметить лишь некоторую тенденцию к

снижению фазовой высоты. Наиболее яркие изменения морфологической структуры популяции тромбоцитов зарегистрированы у больных с гепатитом (1 группа) и АФС (3 группа). Средние в популяции диаметр, периметр, площадь и объем клеток при АФС были увеличены на 40-50%, при вирусном гепатите - на 30-40%. Как уже говорилось ранее, фазовая высота клеток и их объём - оптические показатели, зависящие от состояния тромбоцитарного грануломера. Уменьшение этих показателей в этих группах скорее всего, свидетельствует о преобладании в циркулирующей популяции «юных» тромбоцитов - клеток с широким гиаломером и узким грануломером, вследствие повышения у этой категории больных скорости тромбопоэза.

Таким образом, при анализе морфофункциональных показателей живых тромбоцитов периферической крови у пациентов с вторичными тромбоцитопениями, является очевидным, что наиболее выражены изменения при АФС и вирусном поражении печени со значительным увеличением тромбоцитов III и IV типов. При вторичных тромбоцитопениях иного генеза (апластической анемии и тромбоцитопении, постцитостатического характера) соотношение морфологических типов тромбоцитов приближено к нормативным значениям (таблица 7).

Таблица 7. Размерные параметры тромбоцитов периферической крови у больных с вторичными тромбоцитопениями и ИТП

Показатель Гепатит АА Шсщигосипгвская терапия АФС ИТП

Диаметр,мкм 3,9±0,3* 3,0±0,4 3,1±0,4 4,1±0,3* 3,9±1,4*

Периметр, мкм 10,9±1* 10,1±1* 9,0*0,3 11,6±0,9* 11,7±2,2*

Высота, мкм 0,8±0,2* 1,0±0,3 1,2±0,2 0,8±0,2* 0,93±0,6*

Площадь, мкм2 7,4±0,2* 6,9±0,5 6,8±0,5* 7,4±0,3* 7,1 ±3,2

Объём, мкм3 2,3±0,1 2,2±0,2* 2,2±0,2 2,2±0,2* 2,2±1,1

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

Еще одним важным аспектом изучения патогенетических особенностей ИТП является роль антитромбоцитарных антител в нарушении морфофункционалыюго статуса тромбоцитов. Для исследования этих вопросов в условиях пациенты в зависимости от уровня антитромбоцитарных (анти вР-ПЬ/Ша) при ЙТП антител были разделены на три группы: с низким ( антитромбоцитарные антитела < 400%), средним (400-600%)и высоким (антитромбоцитарные антитела > 600%) содержанием антител в сыворотке крови.

Была проанализирована динамика отдельных цитоморфометрических показателей тромбоцитов в циркулирующей популяции в зависимости от уровня антитромбоцитарных антител (таблицы 8 и 9).

Таблица 8. Соотношение морфологических типов тромбоцитов периферической крови у больных с ИТП при низком (антитромбоцитарные антитела < 400%), среднем (400-600%) и высоком титре антител (антитромбоцитарные антитела > 600%) (%)

Тип клеток Низкий Средний Высокий

<400% 400-600% > 600%

I тип 61 46 42

II тип 25 32 39

III тип 10 15 18

IV тип 4 7 1

Таблица 9. Морфометрические показатели тромбоцитов у пациентов с ИТП периферической крови при низком, среднем и высоком титре антител

Показатель Низкий < 400% Средний 400-600% Высокий > 600%

Диаметр, мкм 2,7±1,3* 3,4±1,3* 3,8±1,2*

Периметр, мкм 8,7±2,2* 10,1±2,1* Н,2±2,3*

Высота, мкм 1,2±0,4* 1,1±0,3* 0,9±0,32

Площадь, мкм2 5,6±3,2 6,9±2,8* 7,1±3,1*

Объём, мкм3 2,7±1,5* 2,5±2,2* 2,3±2,6

Примечание: * - достоверно относительно контроля, при р < 0,05

При анализе морфофункциональных и акгивационных параметров тромбоцитов наиболее ярко неоднородность циркулирующей популяции тромбоцитов представлена у больных с высоким уровнем антитромбоцитарных антител. У больных с ИТП при среднем и высоком уровне антитромбоцитарных антител (таблица 9) отчетливо видно, что с нарастанием процента антитромбоцитарных антител изменяются морфометрические параметры: резко возрастает процент активных форм, за счет снижения тромбоцитов I типа. В группе с низким уровнем антител соотношение морфологических типов тромбоцитов остается в пределах значений практически здоровых лиц (61%, 25%, 10 % и 4% соответственно).

У больных с ИТП при низком уровне антитромбоцитарных антител преобладают клетки с небольшим диаметром, периметром и объемом. В группе со средним и высоким уровнем антител наблюдается более выраженная неравномерность распределения тромбоцитов по размерным параметрам, что обусловлено, по-видимому, преобладанием форм тромбоцитов с разным уровнем активности.

Таким образом с нарастанием титра ATA наблюдается активация тромбоцитов: прямопропорционально росту ATA возрастает процент активных форм тромбоцитов (II и III тип тромбоцитов), снижение высоты и увеличения геометрических параметров, что косвенно указывает на повышение скорости тромбопоэза у этой категории больных.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что компьютерная морфометрия в рамках одного метода предоставляет возможность оперативно оценить индивидуальные изменения размерных показателей и уровня функциональной полноценности циркулирующих тромбоцитов, проанализировать структуру их популяционного состава в режиме реального времени. Данный метод может эффективно использоваться в клинической практике позволяя оперативно получать результаты мониторирования гемостаза пациентов с ИТП при использовании различных методов терапии, а также для проведения дифференциальной диагностики тромбоцитопений, в основе которых лежит аутоиммунный компонент и тромбоцитопений без аутоиммунных нарушений.

ВЫВОДЫ

1 .Морфологический состав циркулирующей популяции тромбоцитов у пациентов с ИТП по сравнению со здоровыми лицами характеризуется повышением активационного статуса циркулирующих тромбоцитов за счет увеличения II — III типов тромбоцитов на 9 % и 5 %, соответственно (р < 0,05). Морфометрические параметры тромбоцитов отличаются увеличением геометрических параметров клеток (диаметр, периметр и площадь) и снижением оптических параметров (высоты), что свидетельствует о появлении в циркуляции более высокого процента молодых форм тромбоцитов.

2.Наиболее близко по морфофункциональным характеристикам тромбоцитов (соотношению форм и геометрическим характеристикам) к ИТП стоит тромбоцитопения на фоне АФС, у этой группы пациентов также преобладают высокоактивированные клетки, но при ИТП преобладают тромбоциты II типа (начальная стадия активации), а при АФС - клетки III типа, что может косвенно отражать длительность аутоиммунного процесса.

3.При оценке влияния применяемых методов лечения на морфофункциональное состояние тромбоцитов установлено, что самым эффективным методом, вызывающим полную количественную и качественную нормализацию тромбоцитов в ранние сроки от момента начала терапии (5 сутки), является внутривенный иммуноглобулин. При более

длительном динамическом наблюдении (30 сутки) все виды терапии вызывают положительные изменения морфофункциональных характеристик тромбоцитов

4.Влияние антитромбоцитарных антител на морфофункциональное состояние тромбоцитов проявляется в изменении морфометрических показателей циркулирующих клеток в виде повышении их функциональной активности прямопропорционально росту ATA. При высоком титре ATA (> 600%), отмечается снижении форм «покоя» (I тип тромбоцитов) на 21% и 2-ух кратное увеличение активированных тромбоцитов (II и III тип) до 60%, снижение высоты и увеличения геометрических параметров, что косвенно указывает на повышение скорости тромбопоэза у этой категории больных.

5.Экспресс-метод витальной компьютерной морфометрии тромбоцитов обладает диагностичесской и прогностической ценностью, поскольку резкое увеличение активизированных форм тромбоцитов в условиях нормального/ субнормального уровня тромбоцитов свидетельствует о возможности рецидива заболевания (развития резистентности к проводимой терапии) и тем самым диктует необходимость об изменении лечебной тактики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Компьютерная морфометрия тромбоцитов может быть рекомендована в качестве скринингового экспресс-теста при исследовании патологии тромбоцитарного гемостаза. Преимуществом метода является минимальный объем крови (до 1-1,5 мл), отсутствие необходимости применения реактивов и дополнительного оборудования, оперативная оценка особенностей морфофункционалыюго состояния клеток.

2,Особенностями морфофункциональных характеристик тромбоцитов при ИТП являются увеличение диаметра, периметра и площади тромбоцитов с одновременным снижением их фазовой высоты, изменение процентного соотношения морфологических типов тромбоцитов в сторону повышения активированных форм, в основном за счет тромбоцитов II типа.

3.Предикторами тяжести заболевания у больных с ИТП могут служить морфометрические показатели живых тромбоцитов периферической крови (увеличение их размерных параметров, повышение содержания активированных клеток).

4.Для проведения дифференциальной диагностики между первичной и вторичной тромбоцитопенией, а также для объективной характеристики оценки степени тяжести течения у пациентов с первичной иммунной тромбоцитопенией помимо общепринятых клинических методов обследования целесообразно использовать дополнительные методы диагностики: определение антител против гликопротеинов мембраны тромбоцитов методом радиоимунного анализа и исследование морфофункционального состояния

тромбоцитов. Также эти методы позволяют косвенно оценить эффективность проводимой терапии, что в свою очередь помогает в решении вопроса о более быстром переводе на следующую линию терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Василенко И.А., Кастрикина И.С., Ковалёва Л.Г., Пустовая Е.И., Колосова E.H., Сафонова Т.И. Оценка тромбоцитарного звена гемостаза у больных идиопатической тромбоцитопеничской пурпурой методом витальной компьютерной морфометрии. // Материалы IV Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, Москва, 4-6 февраля, 2009г. - С. 134-135.

2.Ковалева Л.Г., Василенко И.А., Колосова E.H., Кастрикина И.С. Оценка тромбоцитарного звена гемостаза методом компьютерной морфометрии тромбоцитов при идиопатической тромбоцитопенической пурпуре. // Материалы II Московской региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 28-29 мая 2009г./ Москва: ООО Амалайн. - С.46-47.

3.Кастрикина И.С., Василенко И.А., Ковалёва Л.Г., Колосова E.H., Пустовая Е.И. Оценка клеточного звена гемостаза у больных идиопатической тромбоцитопеничской пурпурой методом витальной компьютерной морфометрии. // Материалы III всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфомеггрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 13-14 мая 2010г. -С.28-29.

4.Ковалева Л.Г., Пустовая Е.И., Сафонова Т.И., Колосова E.H. Принципы ведения больных идиопатической тромбоцитопенической пурпурой. // Проблемы гематологии и переливания крови, М.: 2005г-№1. - С. 54.

5.Ковалева Л.Г., Сафонова Т.И., Колосова E.H., Пустовая Е.И., Рядненко A.A. Клинико-статистические данные и оценка различных методов терапии идиопатической тромбоцитопенической пурпуры. //Терапевтический архив. -2011. -№4. С.60-65.

6.Колосова E.H., Василенко И.А., Ковалева Л.Г. Оценка морфофункционального состояния тромбоцитов у больных идиопатической тромбоцитопенической пурпурой методом витальной компьютерной морфометрии. // Бюллетень СО РАМН. - 2011. - Том 31,№2. -С.58-63.

7.Ковалева Л.Г., Пустовая Е.И., Сафонова Т.И., Колосова E.H. Пути совершенствования терапии первичной иммунной тромбоцитопении. // Материалы Конгресса гематологов России, 2-4 июля 2012г., Москва. - №3. - С.52.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ATA - антитромбоцитарные антитела

ГПр - мембранные гликопротеиды

ИТП - первичная иммунная тромбоцитопения

ИФА - иммунофермнтного анализа

МКЦ - мегакариоцит

ПФ - плазмоферез

РИА - радиоимунный анализ

TA-IgG - тромбоцит-ассоциированных иммуноглобулины Тц - тромбоцит

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы MPV - средний объём тромбоцитов ГКС - глюкокортикостероиды СЭ - спленэкгомия

ВИГ - внутривенный иммуноглобулин ПФ - плазмаферез ТПО - агонисты тромбопоэтинов АФС - антифосфолипидный синдром АА - апластическая анемия

Отпечатано в типографии ООО «Бафи-Арт» ул. Академика Ильюшина, 5-24 (495) 971-5635 Заказ №2051

Подписано в печать 18.12.2013 Тираж 80 экз. Усл.п.л 1,0