Особенности механизма действия миелопептидов, обладающих противоопухолевой активностью

Калюжная, Мария Викторовна

Диссертации по медицине → Аллергология и иммулология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Особенности механизма действия миелопептидов, обладающих противоопухолевой активностью

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Калюжная, Мария Викторовна Москва 2006 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.36

Автореферат диссертации по медицине на тему Особенности механизма действия миелопептидов, обладающих противоопухолевой активностью

На правах рукописи

КАЛЮЖНАЯ Мария Викторовна ^^

Особенности механизма действия миелопептидов, обладающих противоопухолевой активностью

14.00.36 — Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

003067277

Работа выполнена в Институте бноорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор биологических паук, профессор Михайлова А. А.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, про-

Защита диссертации состоится 28 февраля 2007 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.017.01 в Государственном, научном центре «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2.

С диссертацией моЖно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России».

Автореферат разослан «» «51 А ^ 2007 г.

фессор Ярилин А. А.; доктор биологических наук, профессор Сапо>кников А. А.

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет Рос-здрава.

УченЬш секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Актуальность работы

Известно, что иммунная система играет основную роль в защите организма против любых чужеродных агентов. К ним относятся баетерии и их токсины, вирусы, простейшие, паразиты, донорские ткани, мутированные собственные клетки организма (например, раковые) и т.п (Ройт А., Бростофф Дж„ 2000).

В 50-х годах XX века. М. Burnet сформулировал положение об иммунологическом надзоре, согласно которому главная задача иммунологической системы сводится к контролю за постоянством внутренней среды и уничтожению всего чужеродного для организма (Burnet FM, 1970). Это положение было экстраполировано и на злокачественные опухоли: если в организме появляются злокачественно трансформированные клетки, это значит, что иммунологическая система не справляется со своими функциями. Однако, наряду с понятием иммунологического надзора существует такое понятие, как «стратегия опухолевой клетки», включающее множество возможностей, которые опухоль мобилизует для продолжения своего роста. Опухолевая клетка способна реализовать свою «стратегию» на всех этапах взаимодействия с организмом, начиная с момента её распознавания иммунной системой. Есть все основания говорить о большом разнообразии механизмов «ускользания» опухоли от иммунологического контроля (Дейчман Г.И., 2000; Seliger, 2005).

требований к такого рода препаратам - наличие противоопухолевых и отсутствие опухолестимулирующих свойств. По прогнозам специалистов такой метод лечения позволит, как минимум, в 2 раза снизить смертность от онкологических заболеваний. Используя иммунотерапию даже при самой запущенной, IV стадии рака, можно значительно продлить или спасти жизнь 520% пациентов (Rosenberg S.A., 2001).

В начале 1970-х годов группой российских иммунологов под руководством Р.В. Петрова впервые были обнаружены иммунорегуляторные пептиды костного мозга - миелопептиды (МП) (Михайлова А.А., Петров Р.В. 1972, Михайлова А.А., Петров Р.В., 1976). МП синтезируются клетками костного мозга человека и млекопитающих без какой-либо стимуляции антигенами или митогенами. Они лишены видовой специфичности и, таким образом, могут быть использованы для иммунокоррекции при разпичных заболеваниях человека. В настоящее время структурно охарактеризованы и синтезированы шесть МП, каждый из которых обладает собственной иммунокорригирующей активностью. Многочисленные экспериментальные данные по биологическим свойствам МП показывают, что функциональная активность этого класса эндогенных регуляторов направлена на поддержание иммунного гомеостаза организма. При возникновении сдвигов в иммунной системе определенный МП взаимодействует с соответствующей клеткой-мишенью и индуцирует цепь реакций, приводящих к исправлению возникших нарушений. Показано, что один из МП (МП-2) обладает способностью восстанавпивать функциональную активность Т-лимфоцитов, подавленную продуктами опухоли (Стрелков Л.А., Михайлова А.А.,1996), и, тем самым, оказывает противоопухолевый эффект, подавляя рост различных типов трансплантированных опухолей in vivo (Михайлова А.А., Герасимова Г.К.,1998) . С помощью лазерной проточной цитометрии показано, что МП-2 действует на CD4*-, но не на С08+-клетки. Первичная структура гексапептида МП-2 (Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp) гомологична по четырем аминокислотным остаткам структуре пентапептида МП-5 (Val-Val-Tyr-Pro-Asp), что указывает на возможность наличия противоопухолевой активности и у МП-5. Для выяснения наличия такой возможности представляет интерес изучить влияние МП-5 на функциональную

активность Т-лимфоцитов, подавленных продуктами опухолевых клеток, а также исследовать некоторые механизмы реализации этого явления.

Цель исследования: сравнительное изучение способности миелопептидов МП-2 и МП-5 восстанавливать функциональную активность Т-лимфоцитов, подавленную продуктами опухолевых клеток, и выяснение возможных клеточных и молекулярных механизмов реализации данного эффекта. Для выполнения этой цели решались следующие задачи.

Задачи исследования:

1. Исследовать способность МП-5 восстанавливать пролиферативный ответ к митогену Т-лимфоцитов периферической крови человека, подавленный продуктами опухолевых клеток.

2. Определить клетку-мишень для МП-5 и изучить характер связывания этого пептида с клеткой-мишенью.

3. Исследовать влияние МП-2 и МП-5 на продукцию IL-2 и экспрессию IL-2R в СС)4*-лимфоцитах, сниженные под влиянием продуктов опухоли.

4. Исследовать сдвиги в цитокиновой сети, происходящие при реализации иммунокорригирующего эффекта МП-2 на Т-лимфоциты, поврежденные продуктами опухоли.

5. Изучить возможность иммунокорригирующего эффекта МП-2 и МП-5 на Т-лимфоциты после воздействия на них другого повреждающего фактора, вируса кори.

Научная новизна: Впервые было показано в системе in vitro, что МП-5 восстанавливает пролиферативный ответ митоген-стимулированных Т-лимфоцитов периферической крови человека, сниженный под влиянием продуктов опухолевых клеток. Впервые было показано, что МП-5, как и МП-2, способен восстанавливать уровень продукции IL-2 и экспрессию IL-2R в Т-лимфоцитах периферической крови человека, подавленные продуктами опухолевых клеток.

В работе определена неизвестная ранее клетка-мишень для МП-5, CD4*-лимфоцит, показано наличие специфического связывания этого пептида с клеткой-мишенью, построена изотерма полного насыщения для МП-5, рассчитана Kd (2.0 х 10"7М).

Экспериментально доказана общебиологическая значимость регуляторных пептидов МП-2 и МП-5: установлено, что эти пептиды исправляют нарушения в Т-лимфоцитах, вызванные различными повреждающими факторами (опухолевые клетки, вирус кори), если в основе этих нарушений лежит повреждение продукции 11.-2 и экспрессии И.-2Я.

Научная и практическая значимость: Расшифровка механизмов иммунокорригирующего эффекта миелопептидов МП-2 и МП-5 и доказательство общебиологической значимости этих регуляторных пептидов вносит вклад в понимание функционирования крайне сложной и совершенной системы иммунорегуляции. Выявление способности МП-2 и МП-5 восстанавливать продукцию эндогенного И-2, подавленную в результате опухоль-индуцированной иммуносупрессии, указывает на перспективность использования данных пептидов в качестве препаратов, альтернативных рекомбинантному 11.-2, токсичность которого доказана и является одной из основных проблем при его использовании в клинической практике.

Установленная в ходе данной работы клетка-мишень для МП-5 позволит в дальнейшем использовать его в качестве иммуномодулятора направленного действия при заболеваниях, связанных с нарушением функционирования Сй4*-клеток.

Материалы диссертации доложены: на 5-ом конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), на седьмом чтении, посвященном памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004), на 2-ом всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва. 2004), на 15-ом международном симпозиуме по регуляторным пептидам (Тулуза, 2004), на международной летней школе для студентоё, аспирантов и молодых ученых «Многогранные способы применения специфической иммунотерапии» (Дубровник, 2004), на конференции молодых специалистов Института иммунологии (Москва, 2005),. на 16-ом европейском иммунологическом конгрессе (Париж, 2006).

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных

исследований, обсуждения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 89 страницах машинописного текста, включая 14 рисунков. Список литературы содержит 130 работ отечественных и иностранных авторов.

Собственные исследования Материалы и методы

Пептиды МП-2, МП-5 и МП-4 были синтезированы методом классической химии в ФГУ Российском Кардиологическом Научно-Производственном Комплексе Росздрава (Москва), МП-5-FITC был синтезирован на химическом факультете в Государственном Университете г. Санкт-Петербурга, [3Н]-МП-5 был синтезирован твердофазным методом химического гидрогенолиза в атмосфере трития в Институте молекулярной генетики РАН (Москва).

Выделение фракции мононуклеарных клеток периферической крови

человека. Необходимое количество крови (25-30 мл от каждого донора) »

собирали из вены здорового донора в 3 стерильные пластиковые пробирки (BD Biosciences, USA) объемом 10 мл каждая, содержащая гепарин в концентрации 17МЕ/мл. Кровь разводили PBS (1:1) при комнатной температуре и подслаивали шприцем смесь фиколл-урографин (d=1.077), одну пятую от конечного объема, центрифугировали 20 мин (1000g, 20°С) с отключенным тормозом. Фракцию мононуклеарных клеток собирали на границе раздела фаз фиколл/среда, затем суспензию клеток дважды отмывали в PBS. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Выделение фракции С04*-лимфоцитов периферической крови человека. Метод негативной иммуномагнитной сепарации, основанный на применении парамагнитных полистирольных микрочастиц Dynabeads®, покрытых антителами к специфическим антигенам, был использован для выделения С04*-лимфоцитов периферической крови человека. В экспериментах использовали «Систему для негативного выделения С04+-клеток» фирмы DYNAL beads, USA. Мононуклеары периферической крови здоровых доноров были получены центрифугированием в градиенте плотности фиколл-урографина. В соответствии с протоколом, к образцу мононуклеаров были добавлены оптимизированный "коктейль" высокоспецифичных мышиных

антител и частицы Dynabeads®. После 20-минутной инкубации пробирка с образцом была помещена в магнитный сепаратор Dynal MPC®, где были захвачены все нежелательные клеточные популяции из образца мононуклеарной суспензии, связанные с магнитными частицами. Супернатант содержал С04+-лимфоциты, чистота клеточной популяции составляла 95% (оценку проводили методом лазерной проточной цитометрии). Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Кондиционная среда лейкозной клеточной линии человека HL-60. Из литературы известно, что опухолевые клетки вырабатывают ряд субстанций, подавляющих функции Т-лимфоцитов, оцениваемую по пролиферативному ответу Т-клеток к митогенам (Miescher S., Whitesside T.L., 1986; Chiao J.W., Arline Z., 1986). Кондиционная среда лейкозной клеточной линии человека HL-60 (КС HL-60) (Санкт-Петербург, Россия) была использована как супрессирующая субстанция в экспериментах по опухоль-индуцированной иммуносупресии. Культивирование клеток проводили в пластиковой посуде фирм Costar(CLUA), Nunclon (Дания). На вторые сутки культивации клетки были цетрифугированы 7 мин, при 500g, супернатант был отобран, разлит по аликвотам 1мл и заморожен при t= -28°С.

Вирус кори. В качестве источника вируса кори использовали живую коревую вакцину (ЖКВ) - вакцинный штамм вируса кори L-16 (Microgen, Moscow, Russia). Количество вируса, которое может инфицировать 50% посеянного в плашку монослоя культуры ткани - ТЦД5о- В лунки 96-луночного планшета, содержащие по 2х105 Т-лимфоцитов, добавляли от 100 до 200 ТЦЦм (500-1000 ТЦД50 на 1 млн клеток). Общий объем смеси составил 200 мкл/лунка.

Оценка пролиферативного ответа Т-лимфоцитов. ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека культивировали в атмосфере 5% С02 при t=37°C в 96-ти луночном планшете в количестве 150 тысяч клеток на лунку в объеме 200 мкл. 3Н-тимидин (Радиевый институт им. В.Г. Хлопнева) - 5мк Ки/мл добавляли за 4 часа до окончания инкубации. После окончания инкубации планшет охлаждали до t=-28°C, чтобы разрушить мембраны клеток. Содержимое каждой лунки при помощи харвестера переносили на целлюлозный фильтр Whatman min на 24 часа. Фильтры

помещали в отдельные флаконы со сцинтиллятом и ставили на счет. Измерение проводилось на жидкостном сцинтилляционном счетчике (LKB, Sweden). Для количественной оценки реакции использовали абсолютную величину включения радиоактивной метки (число импульсов в минуту).

Количественное определение продукции «свободного» IL-2. Уровень продукции «свободного» IL-2 проводили методом ИФА. ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии КС HL-60 (или вируса кори) и МП-2 (или МП-5) в течение 24, 48 или 72 часов при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали 7 минут, при 500g, при t=20°C, аккуратно отбирали надосадочную жидкость и использовали в коммерческой тест-системе для определения "свободного" человеческого IL-2 в супернатанте культуры клеток и сложных биологических жидкостях (Citimmune sei inc. USA). Оптическую плотность образцов измеряли на приборе Multiscan (Titertek", Швейцария).

Оценка экспрессии IL-2R alpha chain (CD25). Для измерения уровня экспрессии IL-2R (CD25) ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии супрессирующих агентов (КС HL-60 или вируса кори) и МП в течение 24 или 48 часов при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут при t=4°C. Супернатант аккуратно удаляли, клеточный осадок каждой пробы ресуспендировали в 1 мл буфера. Каждую пробу делили на две части по 0,5 мл («контроль» и «опыт»). В пробирки «опыт» Д9бавили антитела (изотип: mouse lgG2a, Immunotech & Coulter Com., USA) в количестве 10 мкл/тест. Пробирки «контроль» оставляли без изменения для определения аутофлюоресценции. Клетки инкубировали 40 минут при t=4°C в PBS, содержащем 0,02% азида натрия и 1% FSC. Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Весктап Coulter XL, Coulter, USA). Регистрировали флуоресценцию не менее 5 тыс. клеток, соответствующих по характеристикам светорассеяния жизнеспособным. Полученные гистограммы анализировали с помощью программы WinMDI.

антителами, специфичными к Д-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNFa или INFy, соответственно. Частицы были смешаны вместе, интенсивность флуоресценции регистрировали на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter XL Coulter, USA. На следующем этапе частицы с фиксированными антителами были смешаны с РЕ-конъюгатом регистрируемых антител, после чего были инкубированы с рекомбинантными стандартами цитокинов (для построения калибровочной кривой) или тестируемыми образцами, с образованием сэндвич-комплекса. ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии КС HL-60, МП-2 в течение 24, 48 или 72 часов при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут при t=20°C. Супернатант аккуратно отбирали и использовали (согласно протоколу) для одновременной регистрации IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNFa и INFy (BD Human Th1/Th2 Cytokine CBA Kit, BD Biosciences, USA). Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Результаты были проанализированы с помощью программы BD CBA Analysis Software (BD Biosciences, USA).

Анализ специфического связывания МП-5 с клеткой-мишенью.

1) Построение изотермы полного насыщения для [3Н]-МР-5. Для построения изотермы полного насыщения были использованы увеличивающиеся концентрации изотоп-меченного [3Н]-МР-5 (0.06x10"7M -117.5x10'7М) и С04*-лимфоциты здоровых доноров. Клетки были инкубированы в пластиковом 96-луночном планшете 1 час при 37°С. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут, супернатант аккуратно удаляли и добавляли аналогичный объем буфера. Планшет охлаяедали до t= -28°С, чтобы разрушить мембраны клеток. При помощи харвестера содержимое каждой лунки переносили на целлюлозный фильтр Whatman min на 24 часа. Каждый фильтр переносили в отдельный флакон со сцинтиллятом и ставили на счет. Измерение проводилось на жидкостном сцинтилляционном счетчике (LKB, Sweden). Результаты счета приведены в импульсах в минуту (срт). Изотермы были проанализированы методом нелинейной регрессии при помощи программы PRISM 4.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

2) Построение изотермы полного насыщения для MP-5-FITC.

Для построения изотермы полного насыщения были использованы увеличивающиеся концентрации MP-5-FITC (0.9х10"7М - 100х10"7М) и CD4V лимфоциты здоровых доноров. Клетки были инкубированы в пластиковом 24-луночном планшете 40 минут при t=4°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут при t=4°C. Супернатант аккуратно удаляли, клеточный осадок каждой пробы ресуспендировали в 500 мкл буфера легким встряхиванием. Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Интенсивность лиганд-рецепторного взаимодействия оценивали по изменению средней интенсивности флуоресценции (mean) клеток в опытных образцах по сравнению со свечением контрольных клеток (необработанных меченым пептидом). Относительный уровень экспрессии вычисляли по формуле Mean (опыт) - Mean (контроль). Изотермы были проанализированы методом нелинейной регрессии при помощи программы PRISM 4.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

3) Вытеснение MP-5-FITC с помощью МП-5, МП-2 или МП-4.

Фиксированная концентрация MP-5-FITC (10 мкг/мл), которая

использовалась для получения полного насыщения, и С04+-лимфоциты здоровых доноров были инкубированы в пластиковом 24-луночном планшете 40 минут при t=4°C. По окончании времени инкубации в каждую пробу были добавлены избытки немеченых пептидов: МП-5 (0.1 мкг/мл - 31.2 мкг/мл); МП-2 (Юмкг/мл - 100 мкг/мл); МП-4 (0.1 мкг/мл - 31.2 мкг/мл). Клетки были инкубированы еще 40 минут при t=4°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут при t=4°C. Супернатант аккуратно удаляли, клеточный осадок каждой пробы ресуспендировали в 500 мкл буфера легким встряхиванием. Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Интенсивность лиганд-рецепторного взаимодействия оценивали по изменению средней интенсивности флуоресценции (mean) клеток, обработанных мечеными пептидами, в опытных образцах по сравнению со свечением контрольных клеток (необработанных меченым пептидом). Относительный уровень экспрессии вычисляли по формуле Mean (опыт) - Mean (контроль).

Результаты

Сравнительная оценка способности МП-2 и МП-5 восстанавливать митоген-индуцированную пролиферативную активность Т-лимфоцитов периферической крови человека, подавленную продуктами опухолевых клеток. Для оценки способности МП-5 влиять на пролиферативную активность Т-лимфоцитов периферической крови человека, нарушенную продуктами опухолевых клеток, мы использовали метод включения радиоактивной метки в ДНК. В экспериментах были использованы Т- лимфоциты периферической крови человека в норме, при стимуляции ФГА, при воздействии кондиционной среды опухолевых клеток линии Н1.-60 (КС Ш-бО) на ФГА-стимулированные Т-пимфоциты в отсутствии или присутствии МП-2 или МП-5, (рис.1).

Рис.1 МП-2 и МП-5 восстанавливают пролиферативную активность ФГА-стимулированных Т-лимфоцитов. подавленную продуктами опухолевых клеток

Результаты опытов показали, что КС Н 1.-60 в концентрации 5% от объема реакционной смеси вызывает статистически значимое подавление митоген-индуцированной пролиферации Т-лимфоцитов до 25-50%. К ФГА-активированным Т-лимфоцитам, обработанным КС НЫЮ, добавляли различные

концентрации МП-2 или МП-5. Добавление МП-2 в дозе 100мкг/мл к ФГА-стимулированным Т-лимфоцитам, пролиферативный ответ которых был подавлен опухолью до 50%, приводит к увеличению этого ответа до 70-85%. Аналогичный эффект достигается и при добавлении МП-5 в дозе 1мкг/мл (рис.1).

Таким образом, МП-5, как и МП-2, обладает способностью усиливать митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов, подавленную продуктами опухолевых клеток, причем эффективная доза МП-5 на два порядка ниже, чем МП-2.

Характер связывания МП-5 с клеткой-мишенью. Ранее было показано, что МП-2 влияет на СРЗ*С04+-субпопуляцию Т-лимфоцитов и не влияет на СОЗ*С08*-субпопуляцию (Strelkov L.A., Mikhailova A.A., 1996). На основании этого, а также тесной гомологии между МП-2 и МП-5, можно предположить, что С03*С04*-лимф0цит является клеткой-мишенью и для МП-5. Для проверки этого предположения были поставлены эксперименты по оценке характера связывания МП-5 с С04*-лимфоцитами периферической крови человека (рис.2).

го о

Kd - 2.28 х Ю-7 М

Концентрация Mn-5-FITC(x10"7M)

Рис.2 Связывание МП-5-FITC с С04*-лимфоцитами периферической крови человека.

Очищенные методом негативной иммуномагнитной сепарации ССМ+-лимфоциты периферической крови человека инкубировали с различными концентрациями МП-5-Р1ТС в течение 45 мин. На рис.2 представлена изотерма полного насыщения для Р1ТС-меченого МП-5 с С04+-лимфоцитами (Кс) = 2.28 хЮ"7М).

Параллельно были поставлены эксперименты по оценке характера связывания [3Н]-МП-5 с С04+-лимфоцитами периферической крови человека, поскольку радиоактивная метка в отличие от флуоресцентной не оказывала влияния на пространственную структуру молекулы пептида. Таким образом, радиоактивномеченый пептид представлял собой практически нативный МП-5. На рис.3 представлена изотерма полного насыщения для [3Н]-МП-5 с С04*-лимфоцитами (Кс! = 2.03 х 10"7М).

2800

7.5 10.0 12.5 15.0

100 120

Концентрация [3Н]-МР-5(х10"7М)

Рис.3 Связывание [3Н]-МП-5 с С04*-пимфоцитами периферической крови человека.

Кривые насыщения Р1ТС- и 3Н-меченого МП-5, а также близкие значения Кс), рассчитанные с помощью этих кривых, указывают на наличие механизма специфического связывания пептида МП-5 с СБ4* -лимфоцитами. Для полного

доказательства специфичности связывания данного пептида с клеткой-мишенью были проведены опыты по вытеснению Р1ТС-МП-5 из мест связывания на поверхности С04+-лимфоцитов немечеными пептидами. Из данных рис.4 видно, что дозозависимое вытеснение метки наблюдается при добавлении избыточных количеств «холодных» пептидов МП-5 и МП-2, но не наблюдается при добавлении пептида с другой первичной структурой, МП-4, обладающего другой активностью (дифференцировочной).

о г

4.00 3.75 3.50 3.25 3.00 2.75 2.50

2.25

5.0 4.5

о- _ 4.0 9 с

~ 3.0 2.5

0.1 1.1 2.1 3.1 4.1 Н 19 24 а К

Концентрация пептидов (мкт/мл)

- МП-2 чг И14

» :5 50 75 100 125 160 175

Концентрация пептидов (мкПмл)

Рис.4 Вытеснение МП-5-РГГС (концентрация 1мкг/мл) пептидами МП-5, МП-4 (а) и МП-2, МП-4 (б).

Представленные результаты свидетельствуют о том, что МП-5 специфически связывается с сайтами на поверхности С04*-лимфоцитов, которые являются клетками-мишенями для данного регуляторного пептида. Вытеснение меченого МП-5 «холодным» МП-2, гомологичным по 4-м аминокислотным остаткам МП-5, указывает на наличие общих сайтов связывания этих эндогенных пептидов.

Влияние МП-2 и МП-5 на продукцию 1Ь2 и экспрессию 1Ь2Я в Сй4*-лимфоцитах, подавленные продуктами опухоли. Поскольку СР4+-

лимфоциты ответственны как за продукцию, так и за рецепцию 11.-2, мы предположили, что МП-2 и МП-5 восстанавливают сниженный под влиянием опухолевых продуктов Т-клеточный пролиферативный ответ к ФГА, воздействуя на систему \L-2IW--2R. Были проведены эксперименты по определению влияния МП-2 и МП-5 на уровень продукции "свободного" !1_-2 Т-лимфоцитами периферической крови человека в норме, при стимуляции ФГА, при воздействии супернатанта опухолевых клеток на ФГА-стимулированные Т-лимфоциты в отсутствии или присутствии МП-2 и™ МП-5. Из данных, представленных на рис.5, видно, что на 2-е сутки после ФГА-стимуляции Т-лимфОмитов значительно повышается синтез \\--2 в этих клетках, следствием чего является повышенная пролиферация Т-лимфоцитов на 3-й день после воздействия митогена Продукты опухоли подавляют синтез И-2 с последующим снижением пролиферации Г-лимфоцитов. МП-5, так же как и МП-2, восстанавливает синтез 11.-2 и повышаем пролиферацию клеток, подавленную супрессивным действием продуктов опухоли

1ВС ■

150 -

140-

120 ■

Н 1 сутки | 2 сутки □ з сутки

сч

о:

о с.

та-

80-

40-

20 ■

0--

Ъ I

г ——Г —---—Т-

клетки ФГА КС 41-60 КС Н1-60 КС Н1-60

без ФГА (контроль) + МП-2 + МП-5

Рис. 5. МП-2 восстанавливает уровень продукции )1_-2 з ФГА-стимулированных Т-лимфоцитах периферической крови человека сниженный под влиянием продуктов опухолевых клеток.

С помощью лазерной проточной цитометрии нами были получены результаты по влиянию МП-2 и МП-5 на экспрессию И-2Р на С04*-лиифоцитах (рис. 6).

6Й4% й

Ml s

- §

30%

М1

tУ^

19 JV.

2в.7% Ml

10°101 102 10* »* 10° 1С1 И* 10® 10" 10° 101 10г10* 10" 10° 101 102 101 19*

FL1LOO

FL1LOG

FL1 103

ЯП Юв

Рис. 6. МП-2 восстанавливает уровень экспрессии И-2Я на ФГА-стимулированных Т-лимфоцитах периферической крови человека, сниженный под влиянием продуктов опухолевых клеток. % С025-позитивных клеток: а - Т-лимфоциты (Контроль); б - Т-лимф.+ ФГА; в - Т-лимф.+ ФГА + КС НЫ50; г -Т-лимф.+ ФГА + КС НЬбО + МП-2.

На гистограммах, представленных на рис.6 видно, что количество CD25*-клеток увеличивается под воздействием МП-2 после подавления КС HL-60, что говорит о восстановлении экспрессии IL-2R, подавленной продуктами опухоли. Для МП-5 были получены аналогичные результаты (данные не^приводятся).

Сдвиги в цитокиновой сети, происходящие при реализации иммунокорригирующего эффекта МП-2 на CD4*-лимфоциты после воздействия на них продуктов опухоли. Поскольку выявленная in vitro способность МП-2 восстанавливать сниженную под влиянием продуктов опухоли выработку эндогенного IL-2, происходит, очевидно, и в организме опухопеносителя, представлялось важным проанализировать и учесть влияние МП-2 на сдвиги в цитокиновой сети после воздействия опухолевых продуктов. Для этой цели мы провели эксперименты in vitro по одновременной регистрации IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNFa и INFy в одной и той же пробе. Определение продукции цитокинов проводилось на 1-е и 2-е сутки после начала эксперимента

при различных вариантах опыта, Результаты, полученные нами на лимфоцитах 10-ти разпичных доноров, оказались не вполне однородны, поэтому мы разделили их на 2 группы, внутри которых наблюдапись сходные изменения. Данные, полученные нами на лимфоцитах в этих двух группах, представлены на рис.7 и рис.9.

126

100

£ о 76

г 3 60

1- о 26

ьг

II.

Т№-я1рЬя

д*тт*

11.-4

11.-6

11.-10

г 126

о 100

II ™ I!

я *

О £

о. о 26

? о

Г*1-

Г*1т

*1Г

11.-2

В*тт«

II. -4

И-6

(НО

Рис.7 Влияние КС Ш-60 и МП-2 на продукцию цитохиноа в ФГА-стимулироаанных С04+-лимфоцитах первой группы доноров (семь из десяти), а - 24 часа инкубации, 6-48 часов инкубации.

- неактивированные Т-лимфоциты (фон)

- Ф ГА-актив и ров а иные Т-лимфоциты (контроль 100%)

- ФГА-активироаанные Т-лимфоциты, обработанные КС Н1-60

- ФГА-активированные Т-лимфоциты в присутствии КС Ш-60 + МП-2

На рис,7 представлены результаты экспериментов, полученные на лимфоцитах 7 из 10 доноров (первая группа). Наиболее выраженные изменения в продукции цитокинов И-2 и наблюдались на вторые сутки эксперимента. Их уровень значительно снижался под действием КС НЬ60 и полностью

восстанавливался под влиянием МП-2. Что касается цитокинов (Ц-4, 11-5 и 11-10, то уровень их продукции мало менялся под действием опухолевых продуктов и МП-2.

fob

А,

*1г

TNF-»lph» INF-gamma

IL-4

IL-10

IL-Б

Гк

О,

IL-Z

TNF-alpha 1NF-gamm«

IL-6

tL-10

Рис.8 Влияние КС HL-60 и МП-2 на продукцию цитокинов в ФГА-стимулированных СйД'-лимфоцитах первой группы доноров (три из десяти), а - 24 часа инкубации, Ь -46 часов инкубации,

НИН - неактивирозанные Т-лимфоциты (фон) ь ! - ФГА-активированные Т-лимфоциты (контроль 100%)

□ - ФГА-активированные Т-лимфоциты, обработанные КС HL-60

ШШ} - ФГА-активированные Т-лимфоциты г присутствии КС Н 1.-60 + МП-2

На рис. б представлены результаты экспериментов, в которых использовались клетки других 3 из 10 доноров (вторая группа). Здесь на первые сутхи эксперимента уровни продукции И-2 и ТЫКй значительно снижались после воздействия продуктов опухоли, в то время как уровень продукции изменялся незначительно. МП-2 полностью восстанавливал сниженный уровень

продукции цитокинов IL-2 и TNFa, и несколько снижал повышенный уровень IL-4, IL-5 и IL-10. Парадоксальные результаты были получены по действию МП-2 на обработанные КС HL-60 клетки на вторые сутки эксперимента. В отличие от 1-ых суток, когда данный пептид восстанавливал сдвиги в продукции цитокинов, вызванные опухолевыми токсинами, на 2-е сутки эксперимента мы наблюдали не восстановление, а еще большее снижение уровня продукции цитокинов IL-2, IL-4, IL-5 и IL-10 под влиянием МП-2. Уровень продукции TNFa повышался, а INFy изменялся незначительно.

Такая разница в изменениях в цитокиновой сети в ответ на КС HL-60 и МП-2 между клетками 1-ой и 2-ой групп может быть связана с состоянием иммунного статуса доноров этих клеток. Не исключено, что доноры 2-ой группы перенесли какие-либо воспалительные процессы незадолго до проведения эксперимента, что отразилось на реакциях противовоспалительных цитокинов. Не случайно, что фоновый уровень IL-4, IL-5 и IL-10 был повышен у этих доноров по сравнению с таковым в 1-ой группе (рис.7, рис.8). Супрессирующему действию МП-2 на продукцию цитокинов на 2-е сутки эксперимента могли способствовать Т-регуляторные клетки, которые могли быть активированы в результате значительной секреции IL-2 на первые сутки эксперимента (рис.8а).

Иммунокорригирующее действие МП-2 и МП-5 на Т-лимфоциты, подавленные вирусом кори. Ранее было показано, что вирус кори подавляет митоген-индуцированную пролиферацию мононуклеаров периферической крови человека, а также ингибирует антиген-специфическую пролиферацию Т-лимфоцитов (Bell AF, Burns JB.1997). Установлено также, что эксперессия IL-2R была значительно снижена в активированных Т-лимфоцитах после воздействия вируса. Предполагается, что блокирование экспрессии IL-2R является одним из механизмов иммуно-супрессирующего действия вируса кори (Addae ММ, Komada Y.1998).

Для оценки общебиологической значимости МП-2 и МП-5 как эндогенных регуляторов были поставлены эксперименты, в которых . выяснялась возможность преодоления с помощью МП-2 и МП-5 вирус-индуцированной иммуносупрессии в моделях, используемых нами для изучения коррекции

опухоль-индуцированной иммуносупрессии. На рис.9 представлены данные по влиянию МП-2 и МП-5 на пролиферативную активность ФГА-сти мулированных Т-лимфоцитов периферической крови человека, подавленную вирусом кори. Можно видеть, что добавление МП-2 или МП-5 к ФГА-стимулированным Т-лимфоцитам, пролиферативный ответ которых был подавлен вирусом до 43%, приводит к увеличению этого ответа до 60-80%.

Рис.9 МП-2 и МП-5 восстанавливают пролиферативную активность Т-пимфоцитов, подавленную ЖКВ.

Подобный корригирующий эффект МП-2 и МП-5 проявляется и в отношении подавленных вирусом кори синтеза 11.-2 и экспрессии И-2Р? (данные не представлены). Таким образом, пептиды МП-2 и МП-5 отменяют супрессию С04*-лимфоцитов, индуцированную различными повреждающими факторами (продукты опухоли, вирус кори), действующими по сходным механизмам, что говорит об общебиологической значимости этих пептидных регуляторов.

5 тал ■

Т лимф *ФГД

♦ ЖКВ * МП-2 1м кг/мл I

*ЖКВ * МП. 5 (мкг'мл)

Т лимф +ФГД

Сравнительное изучение интенсивности связывания МП-5-ПТС с С04*-лимфоцитами периферической крови человека в норме и после воздействия на клетки продуктов опухоли. Для того, чтобы выяснить чем определяется направленность действия МП на поврежденные иммунокомпетентные клетки, мы провели сравнительный анализ связывания МП-5-Р1ТС с нормальными СР4+-лимфоцитами периферической крови здоровых доноров и после воздействия на них продуктов опухоли (КС Н1-60) (рис.10).

Рис.10 Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции С04*-лимфоцитов периферической крови человека, обработанные МП-5-ПТС (концентрация - 10 мкг/мл). а - С04*-лимфоциты в отсутствие опухолевых продуктов, б - С Р4'-лимфоциты, обработанные КС Н1_-60. По оси абсцисс -логарифм интенсивности флуоресценции, по оси ординат - % клеток.

С СИлимфоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии продуктов опухолевых клеток е течение 1 часа. 24 часов или 48 часов. На рис.10 представлены гистограммы распределения флуоресценции клеток, обработанных МП-5-Р1ТС, до и после их инкубации с повреждающими агентами.

Из данных рис.10 видно, что связывание МП-5 с СР4'-лимфоцитами увеличивается на 15-30% под действием продуктов опухолевых клеток на вторые сутки эксперимента, что, очевидно, связано с увеличением числа сайтов связывания данного пептида на поврежденной клетке-мишени. Таким образом,

именно лиганд-рецепторное взаимодействие лежит в основе направленного

влияния МП на поврежденное звено иммунитета.

Выводы:

1. МП-5 восстанавливает пролиферативный ответ к митогену Т-лимфоцитов периферической крови человека, подавленный продуктами опухолевых клеток.

2. МП-2, как и МП-5, восстанавливает продукцию IL-2 и экспрессию IL-2R в С04*-лимфоцитах, сниженные под влиянием продуктов опухоли, что является ключевым звеном иммуномодулирующего эффекта этих пептидов.

3. Клеткой-мишенью для МП-2, как и для МП-5, является С04+-лимфоцит, однако, аффинность рецептора к МП-2 значительно ниже, чем к МП-5.

4. С помощью радиактивно- и флуоресцентномеченного МП-5, а также методом конкурентного вытеснения метки показана специфичность связывания МП-5 с клеткой-мишенью.

5. Под действием продуктов опухолевых клеток увеличивается связывание МП-5 с С04\пимфоцитами на 20-30%, что, очевидно, обусловливает направленное действие МП на поврежденное звено иммунитета.

6. Сдвиги в цитокиновой сети, происходящие при реализации иммунокорригирующего эффекта МП-2 на Т-лимфоциты после воздействия на них опухолевых продуктов in vitro, происходят, главным образом, в отношении Th1 цитокинов, при этом выраженность эффекта тесно связана с состоянием иммунного статуса донора клеток.

7. МП-2, как и МП-5, оказывает иммунокорригирующее действие на пролйффативный.ответ СD4'-лимфоцитов к митогену, на продукцию IL-2 и экспрессию IL-2R, сниженные под влиянием различных повреждающих факторов (продукты опухоли, вирус кори), что указывает на общебиологическую значимость этих эндогенных регуляторов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кирилина Е.А., Хайдуков С.В., Калюжная М.В., Попова С.С., Суворов Н.И. Миелопептиды как индукторы дифференцировки лейкозных клеток. Материалы 5-го конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», 12-14 ноября 2002г., Москва, Россия, с.227.

2. Белевская Р.Г., Калюжная М.В., Ефремов М.А., Михайлова А.А. Миелопептид-2 - эндогенный иммунорегулятор, корригирующий нарушенные функции Т- лимфоцитов. Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, 17-19 ноября 2003 г., Москва, Россия, с.61.

3. Белевская Р.Г., Калюжная М.В., Ляшенко В.А., Михайлова А.А. "Миелопептид-2 - эндогенный иммунорегулятор, корригирующий поврежденные функции Т-лимфоцитов, подавленные вирусом кори". Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2003, №9, с. 63-67.

4. Kalyuzhnaya M.V., Belevskaya R.G., Fonina L.A., Mikhailova А.А. Immunocorrective action of myelopeptide-2 in damaged T lymphocytes. II World Congress on Immunopathology and Respiratory Allergy, May 14-17. 2004, Moscow, p.37.

5. Kalyuzhnaya M.V., Belevskaya R.G., Fonina LA, Mikhailova A.A. Immunocorrective action of myelopeptide-2 in damaged T lymphocytes. International Journal on Immunorehabilitation, 2004, vol. 6, № 2., p.236.

6. Kalyuzhnaya M.V., Belevskaya R.G., Mikhailova A.A. Immunocorrective effect of the bone marrow regulatory peptide (myelopeptide-2)". 15'h International Symposium on Regulatory Peptides, Toulouse, France. 2004, vol. 122, issue 1.

7. Калюжная M.B., Белевская Р.Г., Фонина Л.А., Михайлова А.А Иммунокорригирующее действие миелопептида-2 на поврежденные Т-лимфоциты. Аллергология и иммунология, 2004 г., т. 5, №1, с.104.

8. Mikhailova Augusta A., Belevskaya Raissa G., Kalyuzhnaya Maria, Fonina Larissa A., Liashenko Vsevolod A., Petrov Rem V. Myelopeptide-2 Recovers lnterleukin-2 Synthesis and lnterleukin-2 receptor expression in Human T Lymphocytes Depressed by Tumor Products or Measles Virus. Journal of Immunotherapy. 29(3):306-312, May/June 2006.

9. Kalyuzhnaya M., Belevskaya R., Mikhailova A. Myelopeptide-2 Recovers lnterleukin-2 Synthesis and lnterleukin-2 receptor expression in Human T Lymphocytes Depressed by Tumor Products or Measles Virus. 16th European Congress of Immunology, Paris, France, 2006, p.584.

10. M.B. Капюжная, Р.Г. Белевская, C.K. Александер, А.А. Михайлова Эндогенный костномозговой иммунорегулятор миелопептид-2 нейтрализует иммуносупрессивное действие живой коревой вакцины. Физиология и патология иммунной системы, 2006, в печати.

Оглавление диссертации Калюжная, Мария Викторовна :: 2006 :: Москва

Список сокращений, используемых в работе.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Миелопептиды- новый класс эндогенных иммуномодуляторов

1.1. История открытия МП.

1.2. Биологическая активность и механизмы действия МП.

Глава 2. Противоопухолевый иммунитет.

2.1. Естественный и специфический иммунитет. Иммунологический надзор и опухоли.

2.2. Свойства и стратегия опухолевой клетки. Механизмы уклонения опухоли от воздействия системы иммунитета.

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Калюжная, Мария Викторовна, автореферат

Актуальность работы. Известно, что иммунная система играет основную роль в защите организма против любых чужеродных агентов. К ним относятся бактерии и их токсины, вирусы, простейшие, паразиты, донорские ткани, мутированные собственные клетки организма (например, раковые) и т.п (Ройт А., Бростофф Дж., 2000).

В проблеме злокачественных новообразований важны как изучение этиологии и патогенеза опухолей, так и разработка новых методов лечения и реабилитации онкологических больных. В течение последних десятилетий 20-го столетия интенсивно разрабатывался новый подход к лечению злокачественных опухолей - иммунотерапия. (Rosenberg SA, 2001) Иммунобиологические препараты используются в настоящее время на различных этапах онкологических заболеваний в целях восстановления и поддержания противоопухолевого иммунитета (иммунореабилитации). При правильном выборе таких препаратов их терапевтическая эффективность не вызывает сомнений, свидетельством чему являются многочисленные работы по изучению механизмов иммунореабилитации и успешный практический опыт (Robin М, Schlageter МН, 2005; Roy Noy, Malka Eppel, 2005; . Одно из важнейших требований к такого рода препаратам - наличие противоопухолевых и отсутствие опухолестимулирующих свойств. По прогнозам специалистов такой метод лечения позволит, как минимум, в 2 раза снизить смертность от онкологических заболеваний. Используя иммунотерапию даже при самой запущенной, IV стадии рака, можно значительно продлить или спасти жизнь 520% пациентов (Rosenberg S.A., 2001).

В начале 1970-х годов группой российских иммунологов под руководством Р.В. Петрова впервые были обнаружены иммунорегуляторные пептиды костного мозга - миелопептиды (МП) (Михайлова А.А., Петров Р.В. 1972; Михайлова А.А., Петров Р.В., 1976). МП синтезируются клетками костного мозга человека и млекопитающих без какой-либо стимуляции антигенами или митогенами. Они лишены видовой специфичности и, таким образом, могут быть использованы для иммунокоррекции при различных заболеваниях человека. В настоящее время структурно охарактеризованы и синтезированы шесть МП, каждый из которых обладает собственной иммунокорригирующей активностью. Многочисленные экспериментальные данные по биологическим свойствам МП показывают, что функциональная активность этого класса эндогенных регуляторов направлена на поддержание иммунного гомеостаза организма. При возникновении сдвигов в иммунной системе определенный МП взаимодействует с соответствующей клеткой-мишенью и индуцирует цепь реакций, приводящих к исправлению возникших нарушений. Показано, что один из МП (МП-2) обладает способностью восстанавливать функциональную активность Т лимфоцитов, подавленную продуктами опухоли (Стрелков J1.A., Михайлова А.А.,1996), и, тем самым, оказывает противоопухолевый эффект, подавляя рост различных типов трансплантированных опухолей in vivo (Михайлова А.А., Герасимова Г.К.,1998) . С помощью лазерной проточной цитометрии показано, что МП-2 действует на CD4+-, но не на С08+-клетки. Первичная структура гексапептида МП-2 (Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp) гомологична по четырем аминокислотным остаткам структуре пентапептида МП-5 (Val-Val-Tyr-Pro-Asp), что указывает на возможность наличия противоопухолевой активности и у МП-5. Для выяснения наличия такой возможности представляет интерес изучить влияние МП-5 на функциональную активность Т-лимфоцитов, подавленных продуктами опухолевых клеток, а также исследовать некоторые механизмы реализации этого явления.

Цель исследования: сравнительное изучение способности МП-2 и МП-5 восстанавливать функциональную активность Т-лимфоцитов, подавленную продуктами опухолевых клеток, и выяснение возможных клеточных и молекулярных механизмов реализации данного эффекта. Для выполнения этой цели решались следующие задачи.

Задачи исследования

2. Определить клетку-мишень для МП-5 и изучить характер связывания этого пептида с клеткой-мишенью.

3. Исследовать влияние МП-2 и МП-5 на продукцию IL-2 и экспрессию IL-2R в С04+-лимфоцитах, сниженные под влиянием продуктов опухоли.

Научная новизна. Впервые было показано в системе in vitro, что МП-5 восстанавливает пролиферативный ответ митоген-стимулированных Т-лимфоцитов периферической крови человека, сниженный под влиянием продуктов опухолевых клеток. Впервые было показано, что МП-5, как и МП-2, способен восстанавливать уровень продукции IL-2 и экспрессию IL-2R в Т-лимфоцитах периферической крови человека, подавленные продуктами опухолевых клеток.

В работе определена неизвестная ранее клетка-мишень для МП-5, CD4+-лимфоцит, показано наличие специфического связывания этого пептида с клеткой-мишенью, построена изотерма полного насыщения для МП-5, рассчитана Kd (2.0 х 10"7М).

Научная и практическая значимость. Расшифровка механизмов иммунокорригирующего эффекта МП-2 и МП-5 и доказательство общебиологической значимости этих регуляторных пептидов вносит вклад в понимание функционирования крайне сложной и совершенной системы иммунорегуляции. Выявление способности МП-2 и МП-5 восстанавливать продукцию эндогенного IL-2, подавленную в результате опухоль-индуцированной иммуносупрессии, указывает на перспективность использования данных пептидов в качестве препаратов, альтернативных рекомбинантному IL-2, токсичность которого доказана и является одной из основных проблем при его использовании в клинической практике.

Обзор литературы

Заключение диссертационного исследования на тему "Особенности механизма действия миелопептидов, обладающих противоопухолевой активностью"

Выводы:

2. МП-2, как и МП-5, восстанавливает продукцию IL-2 и экспрессию IL-2R в СБ4+-лимфоцитах, сниженные под влиянием продуктов опухоли, что является ключевым звеном иммуномодулирующего эффекта этих пептидов.

3. Клеткой-мишенью для МП-2, как и для МП-5, является СБ4+-лимфоцит, однако, аффинность рецептора к МП-2 значительно ниже, чем к МП-5.

5. Под действием продуктов опухолевых клеток увеличивается связывание МП-5 с С04+-лимфоцитами на 20-30%, что, очевидно, обусловливает направленное действие МП на поврежденное звено иммунитета.

6. Сдвиги в цитокиновой сети, происходящие при реализации иммунокорригирующего эффекта МП-2 на Т-лимфоциты после воздействия на них опухолевых продуктов in vitro, происходят, главным образом, в отношении Thl цитокинов, при этом выраженность эффекта тесно связана с состоянием иммунного статуса донора клеток.

7. МП-2, как и МП-5, оказывает иммунокорригирующее действие на пролиферативный ответ С04+-лимфоцитов к митогену, на продукцию IL-2 и экспрессию IL-2R, сниженные под влиянием различных повреждающих факторов (продукты опухоли, вирус кори), что указывает на общебиологическую значимость этих эндогенных регуляторов.

Заключение.

В течение последних десятилетий 20-го столетия интенсивно разрабатывался новый подход к лечению злокачественных опухолей -иммунотерапия (Rosenberg SA, 2001). Иммунокорригирующие препараты играют в настоящее время ключевую роль при лечении иммунопатологических процессов, связанных с онкопатологией, в первую очередь там, где речь идет о воздействии на CD4+-, NK-клетки и регуляции Thl/Th2 системы. Иммунобиологические препараты используются в настоящее время на различных этапах онкологических заболеваний в целях восстановления и поддержания противоопухолевого иммунитета (иммунореабилитации). При правильном выборе таких препаратов их терапевтическая эффективность не вызывает сомнений, свидетельством чему являются многочисленные работы по изучению механизмов иммунореабилитации и успешный практический опыт (Robin М, Schlageter МН, 2005; Roy Noy, Malka Eppel, 2005,). Одно из важнейших требований к такого рода препаратам - наличие противоопухолевых и отсутствие опухолестимулирующих свойств. По прогнозам специалистов такой метод лечения позволит, как минимум, в 2 раза снизить смертность от онкологических заболеваний. Используя иммунотерапию даже при самой запущенной, IV стадии рака, можно значительно продлить или спасти жизнь 520% пациентов (Rosenberg SA, 2001).

Хотя иммунотерапия злокачественных опухолей - относительно новое научное направление, полученные в течение последнего десятилетия результаты позволяют рассчитывать на доминирующую роль иммунотерапевтических препаратов в лечении онкологических заболеваний.

При разработке новых иммунобиологических лекарственных средств большое значение имеет поиск прототипов эндогенных биологически активных веществ и познание механизмов биохимических реакций, происходящих в организме. В связи с этим в настоящее время лучшей основой для создания новых лекарственных средств являются природные биорегуляторы - вещества, которые в организме передают информацию и управляют многочисленными биохимическими реакциями. Эти вещества представляют собой пептиды с молекулярной массой 1000-10000 Da и обладают способностью регулировать функциональную активность клеточных популяций, служащих исходным материалом для их получения. В настоящее время эндогенные биологически активные вещества выделены из ткани головного мозга (коры белого вещества, эпифиза и гипоталамуса), органов иммунной системы (тимуса, костного мозга, селезенки, лимфатических узлов и небных миндалин), сердечно-сосудистой и дыхательной систем, мочеполовой системы, а также из сетчатки, кожи, печени и некоторых других тканей животных и человека (Яковлев Г.М., Морозов В.Г., 1986).

Первое место среди других систем организма по числу известных иммунорегуляторов занимает иммунная система. Основную их часть составляют пептидно-белковые вещества. Образование низкомолекулярных пептидов из белковых предшественников in situ вблизи клеточных рецепторов сегодня еще окончательно не доказано. Однако при разработке данного направления был открыт целый ряд высокоактивных олигопептидов -фрагментов иммуноглобулинов, тимусных гормонов, кининов и других соединений (Чипенс Г.И., Полевая Л.К., 1980).

К настоящему времени как в России, так и в других странах широкое практическое применение нашли факторы, секретируемые вилочковой железой, обладающие физиологической активностью. Результаты их испытаний свидетельствуют о продукции клетками тимуса целого ряда биологически активных веществ: тимозина, тимопоэтина, сывороточного фактора тимуса, Т-активина, тималина, тимоптина и других (Чипенс Г.И., Полевая Л.К., 1980; Hadden J.H., 1993).

Гормоны, цитокины, ферменты, являясь эндогенными регуляторами, стали в настоящее время практически незаменимыми лекарственными средствами. Рекомбинантные цитокины, такие как IL-1, IL-2, интерфероны, колониестимулирующие факторы, эффективно используются в клинической практике для лечения онкологических заболеваний. IL-2 - один из основных препаратов, включенных в современные схемы лечения иммуночувствительных опухолей, таких как меланома, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, некоторые виды опухолей головного мозга. Использование препаратов интерлейкина-2 при онкологических заболеваниях базируется, прежде всего, на том, что это основной цитокин, запускающий иммунный ответ и активирующй факторы, участвующие именно в противоопухолевой защите. Введение IL-2 обеспечивает ускорение пролиферации Т- и В-лимфоцитов, нарастание иммунного ответа на Т-зависимый антиген, восстановление функционального резерва макрофагов. Однако высокодозная иммунотерапия интерлейкином-2 сопровождается выраженными побочными эффектами. Наиболее ранние из них лихорадка и озноб. У ряда пациентов IL-2-терапия вызывает гастриты, что требует введения в схему лечения блокаторов Н-2 рецепторов. Высокие дозы IL-2 приводят к задержке жидкости в организме, вызванной олигурией, гипотензией и нарушением проницаемости сосудов. Также наблюдаются гемодинамические нарушения, сходные с септическим шоком (Rosenberg SA, Yang JC, 1994; White RL, Schwartzentruber DJ, 1994; Research initiative. Treatment Action! 1999).

Важно отметить, что миелопептиды как эндогенные пептидные регуляторы, действие которых направлено на сохранение иммунного статуса организма, чрезвычайно перспективны для использования в клинической практике. Отсутствие барьера гистосовместисмости при реализации их эффектов, низкая молекулярная масса, избирательное влияние на поврежденное звено иммунитета или кроветворения, природные механизмы действия - все эти свойства МП обеспечивают мягкую направленную коррекцию сдвигов в иммунной системе и полное отсутствие токсичности при их введении в организм.

Таким образом, исследование и внедрение в клиническую практику иммуномодуляторов направленного действия является сейчас актуальной проблемой. Подробное изучение физико-химических свойств, структуры и спектра биологических активностей пептидов, обладающих иммунорегуляторной активностью, позволит в будущем создать их нетоксичные синтетические аналоги для терапии различного рода заболеваний.

Материалы и методы

1 <5 г. Санкт-Петербурга, [ H]-Mn-5-de-hydro-proline (далее [ Н]-МП-5) был синтезирован твердофазным методом химического гидрогенолиза в атмосфере трития в Институте молекулярной генетики РАН (Москва).

Выделение фракции мононуклеарных клеток периферической крови человека. Необходимое количество крови (25-30 мл от каждого донора) собирали из вены здорового донора в 3 стерильные пластиковые пробирки (BD Biosciences, USA) объемом 10 мл каждая, содержащая гепарин в концентрации 17МЕ/мл. Кровь разводили PBS (1:1) при комнатной температуре и подслаивали шприцем смесь фиколл-урографин (d= 1.077), одну пятую от конечного объема, центрифугировали 20 мин (1000g, 20°С) с отключенным тормозом. Фракцию мононуклеарных клеток собирали на границе раздела фаз фиколл/среда, затем суспензию клеток дважды отмывали в PBS. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Выделение фракции СБ4+-лимфоцитов периферической крови человека. Метод негативной иммуномагнитной сепарации, основанный на применении парамагнитных полистирольных микрочастиц Dynabeads®, покрытых антителами к специфическим антигенам, был использован для выделения CD4+ лимфоцитов периферической крови человека. В экспериментах использовали «Систему для негативного выделения CD4+-клеток» фирмы DYNAL beads, USA. Мононуклеары периферической крови здоровых доноров были получены центрифугированием в градиенте плотности фиколл-урографина. В соответствии с протоколом, к образцу мононуклеаров были добавлены оптимизированный "коктейль" высокоспецифичных мышиных антител и частицы Dynabeads®. После 20-минутной инкубации пробирка с образцом была помещена в магнитный сепаратор Dynal МРС®, где были захвачены все нежелательные клеточные популяции из образца мононуклеарной суспензии, связанные с магнитными частицами. Супернатант содержал С04+-лимфоциты, чистота клеточной популяции составляла 95% (оценку проводили методом лазерной проточной цитометрии). Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Кондиционная среда лейкозной клеточной линии человека HL-60. Кондиционная среда лейкозной клеточной линии человека HL-60 (КС HL-60) (Санкт-Петербург, Россия) была использована как супрессирующая субстанция в экспериментах по опухоль-индуцированной иммуносупресии. Культивирование клеток проводили в пластиковой посуде фирм Costar(CLLIA), Nunclon (Дания). На вторые сутки культивации клетки были цетрифугированы 7 мин, при 500g, супернатант был отобран, разлит по аликвотам 1мл и о заморожен при t=-28 С.

Вирус кори. В качестве источника вируса кори использовали живую коревую вакцину (ЖКВ) - вакцинный штамм вируса кори L-16 (Microgen, Moscow, Russia). Количество вируса, которое может инфицировать 50% посеянного в плашку монослоя культуры ткани - ТЦД^о- В лунки 96-луночного планшета, содержащие по 2x105 Т лимфоцитов, добавляли от 100 до 200 ТЦД5о (500-1000 ТЦД50 на 1 млн клеток). Общий объем смеси составил 200 мкл/лунка.

Оценка пролиферативного ответа Т-лимфоцитов. ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека культивировали в атмосфере 5% СО2 при t=37°C в 96-ти луночном планшете в 7 количестве 150 тысяч клеток на лунку в объеме 200 мкл. Н-тимидин (Радиевый институт им. В.Г. Хлопнева) - 5мк Ки/мл добавляли за 4 часа до окончания о инкубации. После окончания инкубации планшет охлаждали до t=-28 С, чтобы разрушить мембраны клеток. Содержимое каждой лунки при помощи харвестера переносили на целлюлозный фильтр Whatman min на 24 часа.

Фильтры помещали в отдельные флаконы со сцинтилятом и ставили на счет. Измерение проводилось на жидкостном сцинтиляционном счетчике (LKB, Sweden). Для количественной оценки реакции использовали абсолютную величину включения радиоактивной метки (число импульсов в минуту).

Количественное определение продукции «свободного» IL-2. Уровень продукции «свободного» IL-2 проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА). ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии КС HL-60 (или вируса кори) и МП-2 (или МП-5) в течение 24, 48 или 72 часов при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали 7 минут, при 500g, при t=20°C, аккуратно отбирали надосадочную жидкость и использовали в коммерческой тест-системе для определения "свободного" человеческого IL-2 в супернатанте культуры клеток и сложных биологических жидкостях (Citimmune sci inc. USA). Оптическую плотность образцов измеряли на приборе Multiscan ("Titertek", Швейцария).

Оценка экспрессии IL-2R alpha chain (CD25). Для измерения уровня экспрессии IL-2R (CD25) ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии супрессирующих агентов (КС HL-60 или вируса кори) и МП в течение 24 или 48 часов при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут при t=4°C. Супернатант аккуратно удаляли, клеточный осадок каждой пробы ресуспендировали в 1 мл буфера. Каждую пробу делили на две части по 0,5 мл («контроль» и «опыт»), В пробирки «опыт» добавили антитела (изотип: mouse IgG2a, Immunotech & Coulter Com., USA) в количестве 10 мкл/тест. Пробирки «контроль» оставляли без изменения для определения аутофлюоресценции. Клетки инкубировали 40 минут при t=4°C в PBS, содержащем 0,02% азида натрия и 1% FSC. Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Регистрировали флуоресценцию не менее 5 тыс. клеток, соответствующих по характеристикам светорассеяния жизнеспособным. Полученные гистограммы анализировали с помощью программы WinMDI.

Одновременная регистрация IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNFa и INFy в одном образце (Cytometric Bead Array - СВА). Шесть популяций частиц с флуоресценцией определенной интенсивности были покрыты фиксированными антителами, специфичными к IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNFa или INFy, соответственно. Частицы были смешаны вместе, интенсивность флуоресценции регистрировали на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter XL Coulter, USA. На следующем этапе частицы с фиксированными антителами были смешаны с РЕ-конъюгатом регистрируемых антител, после чего были инкубированы с рекомбинантными стандартами цитокинов (для построения калибровочной кривой) или тестируемыми образцами, с образованием сэндвич-комплекса.

ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии КС HL-60, МП-2 в течение 24, 48 или 72 часов при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут при t=20°C. Супернатант аккуратно отбирали и использовали (согласно протоколу) для одновременной регистрации IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNFa и INFy (BD Human Thl/Th2 Cytokine СВА Kit, BD Biosciences, USA).

Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Результаты были проанализированы с помощью программы BD СВА Analysis Software (BD Biosciences, USA).

Анализ специфического связывания МП-5 с клеткой-мишенью.

1) Построение изотермы полного насыщения для [ Н]-МР-5.

Для построения изотермы полного насыщения были использованы

3 7 увеличивающиеся концентрации изотоп-меченного [ Н]МР-5 (0.06x10'М -117.5х10"7М) и С04+-лимфоциты здоровых доноров. Клетки были инкубированы в пластиковом 96-луночном планшете 1 час при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500 g 7 минут, супернатант аккуратно удаляли и добавляли аналогичный объем буфера. Планшет охлаждали до t=-28°C, чтобы разрушить мембраны клеток. При помощи харвестера содержимое каждой лунки переносили на целлюлозный фильтр Whatman min на 24 часа. Каждый фильтр переносили в отдельный флакон со сцинтилятом и ставили на счет. Измерение проводилось на жидкостном сцинтиляционном счетчике (LKB, Sweden). Результаты счета приведены в импульсах в минуту (срт). Изотермы были проанализированы методом нелинейной регрессии при помощи программы PRISM 4.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

2) Построение изотермы полного насыщения для MP-5-FITC.

Для построения изотермы полного насыщения были использованы увеличивающиеся концентрации MP-5-FITC (0.9x10"7М - 100х10'7М) и CD4+-лимфоциты здоровых доноров (п=3). Клетки были инкубированы в пластиковом 24-луночном планшете 40 минут при t=4°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут при t=4°C. Супернатант аккуратно удаляли, клеточный осадок каждой пробы ресуспендировали в 500 мкл буфера легким встряхиванием. Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Интенсивность лиганд-рецепторного взаимодействия оценивали по изменению средней интенсивности флуоресценции (mean) клеток в опытных образцах по сравнению со свечением контрольных клеток (необработанных меченым пептидом). Относительный уровень экспрессии вычисляли по формуле Mean (опыт) - Mean (контроль). Изотермы были проанализированы методом нелинейной регрессии при помощи программы PRISM 4.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

3) Вытеснение MP-5-FITC с помощью МП-5, МП-2 или МП-4. Фиксированная концентрация MP-5-FITC (10 мкг/мл), которая использовалась для получения полного насыщения, и CD4+ лимфоциты здоровых доноров были инкубированы в пластиковом 24-луночном планшете 40 минут при t=4°C. По окончании времени инкубации в каждую пробу были добавлены избытки немеченых пептидов: МП-5 (0.1 мкг/мл - 31.2 мкг/мл); МП-2 (10мкг/мл - 100 мкг/мл ); МП-4 (0.1 мкг/мл - 31.2 мкг/мл). Клетки были о инкубированы еще 40 минут при t=4 С. После окончания инкубации клетки о центрифугировали при 500g 7 минут при t=4 С. Супернатант аккуратно удаляли, клеточный осадок каждой пробы ресуспендировали в 500 мкл буфера легким встряхиванием. Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Интенсивность лиганд-рецепторного взаимодействия оценивали по изменению средней интенсивности флуоресценции (mean) клеток, обработанных мечеными пептидами, в опытных образцах по сравнению со свечением контрольных клеток (необработанных меченым пептидом). Относительный уровень экспрессии вычисляли по формуле Mean (опыт) - Mean (контроль).

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Калюжная, Мария Викторовна

1. Белевская Р.Г., Михайлова А.А. и др. Докл. АН, 1998, т. 358, с. 847 849.

2. Белевская Р.Г., Елкина С.И., Калина Н.Г., Михайлова А.А. Иммунология, 2003, №6, с. 342-327.

3. Белевская Р.Г., Михайлова А.А., Ляшенко В.А. и др. Иммунология, 2000, № 3, с. 23-26.

4. Бережная Н.М., Чехун В.Ф., Система интерлейкинов и рак, Киев: ДИА, 2000, с. 224.

5. Билынский Б.Т., Володько Н.А., Шпарик Я.В. Иммунологические механизмы естественной противоопухолевой резистентности. Львов, 1989.

6. Вит В.Т, Хеллман С., .Розенберг С.А. Биологические методы лечения онкологических заболеваний. М.Медицина, 2002

7. Дейчман Г.И. Естественный отбор и ранние изменения фенотипа опухолевых клеток in vivo: приобретение новых механизмов защиты. Биохимия, 2000, № 65, с. 92-111.

8. Кавецкий Р.Е. Взаимодействие организма и опухоли. Киев: Наук, думка, 1977.-235 с. 63.

9. Калюжная М.В., Белевская Р.Г., Александер С.К., Михайлова А.А. Эндогенный костномозговой иммунорегулятор миелопептид-2 нейтрализует иммуносупрессивное действие живой коревой вакцины. Физилология и патология иммунной системы, 2006 в печати.

10. Ю.Лебедев К.А., Понякина И.Д. "Иммунограмма в клинической практике" 1990г., М" "Наука"

11. ЬМанцевичюте-Эрингене Е.В. Возможные подходы к исследованию иммунологического статуса у онкологических больных и у здоровых людей. Эксп. онкол.-1984.-T.6.-N.2.-C.8-14

12. Манько В.М. Патология иммунной системы у бестимусных животных. ИНиТ-сер. Иммунология-Т .8.-1979

13. Маянский Д.Н. Хроническое воспаление. М.:Медицина, 1991., с.272.

14. Н.Михайлова А.А., Герасимова Г.К., Трещалина Е.М. и др. Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева), 1998, т.42, № 5, с. 176 178.

15. Михайлова А.А., Захарова J1.A., Петров Р.В. Докл. АН, 1971, т. 203, с. 948950.

16. Михайлова А.А., Петров Р.В., Захарова JI.A. Докл. АН, 1971, т. 197, с. 209 -220.

17. П.Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина Л.А., Степаненко Р.Н. Миелопептиды М.: Наука 2000, с. 181.

18. Молотковская И.М., Зеленова М.А., Михайлова А.А. Иммунология, 1998, № 4, с. 30-33.

19. Новиков Д.К. "Противоопухолевые реакции лейкоцитов". Минск, "НиТ", 1988.

20. Петров Р.В., Михайлова А.А., Захарова Л.А. Иммунология, 1980, № 4, с. 48 -50.

21. Петров Р.В., Михайлова А.А., Захарова JI.A. Гематология и трансфузиология, 1984, № 2, с. 43 45

22. Ройт А., Бростофф Дж., Д.Мейл. Иммунология, Москва «МИР» 2000

23. Сингер М., Берг П., Гены и геномы, т.2, Москва «МИР» 1998

24. Стрелков JI.A., Михайлова А.А. Иммунология, 1990, № 6, с.32

25. Стрелков JI.A., Михайлова А.А., Гурьянов С.А. и др. Докл. АН, 1998, т. 358, с. 134-136

26. Стрелков JI.A., Михайлова А.А., Сапожников A.M. и др. Докл. АН, 1996, т. 347, с. 278-271

27. Стрелков JI.A., Михайлова А.А., Фонина JI.A. и др. Бюл. эксперим. Биологии и медицины.1995.№5, с.530

28. Суслов А.П. Макрофаги и противоопухолевый иммунитет". ИНИТ,-1990.-т. 19.

29. Фонина JI.A., Балдин М.И., Ефремов М.А. и др. Биоорган, химия, 2001, т. 27, с. 403-407

30. Фонина JI.A., Гурьянов С.А., Ефремов М.А., Смирнов О.В. Биоорган, хим. 1998, т. 24, с. 403-407

31. Фонина JI.A., Михайлова А.А., Кирилина Е.А. и др. Докл. АН, 2001, т. 381, с. 834-836

32. Хабаров С.В., Герасимова Г.К., Михайлова А.А., Петров Р.В. Докл. АН, 2003, т. 390, с. 268-271

33. Чипенс Г.И., Полевая JI.K., Веретенникова Н.М. и др. Структура и функции низкомолекулярных пептидов. Рига 1980; 218.

34. Шпарик Я.В., Билынский Б.Т. "Некоторые методические подходы к изучению естественных клеток-киллеров в клинике." Лаб.дело.-1988.-н.5.-с.3-8.

35. Яковлев Г.М., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины. Функция в организме. Использование в клинической практике: Сб науч тр. Томск 1986; 9-11.

36. Ярилин А.А. Основы иммунологии. Москва «Медицина» 1999.

37. Abul К. Abbas, Andrew Н. Lichman. Cellular and Molecular Immunology. Fifth edition, ELSEVIER SAUNDERS, 2005.

38. Addae MM, Komada Y, Taniguchi K, Kamiya T, Osei-Kwasi M, Akanmori BD, Nkrumah FK. Surface marker patterns of T cells and expression of interleukin-2 receptor in measles infection. Acta Paediatr Jpn. 1998 Feb;40(l):7-13.

39. Antony Paul Andrew and Restifo Nicholas P CD4+CD25+ T Regulatory Cells, Immunotherapy of Cancer, and Interleukin-2 J Immunother. 2005 ; 28(2): 120— 128.

40. Bardoscia MT, Amstad P, Honegger P. Expression of the proto-oncogene c-fos in three-dimensional fetal brain cell cultures and the lack of correlation with maturation-inducing stimuli. Brain Res Mol Brain Res.1992 Jan;12(l-3):23-30).

41. Bell AF, Burns JB, Fujinami RS. Measles virus infection of human T cells modulates cytokine generation and IL-2 receptor alpha chain expression. Virology. 1997 Jun 9;232(2):241-7.

42. Biassoni R, Cantoni C, Human natural killer receptors and co-receptors. Review. Immunol Rev.2001 Jun; 181:203-14.

43. Во X, Broome U, Remberger M, Sumitran-Holgersson S. Tumor necrosis factor alpha impairs function of liver derived T lymphocytes and natural killer cells in patients with primary sclerosing cholangitis. Gut. 2001 Jul;49(l):131-41.

44. Borodai NV. Carpentier V, Vassard C, Plessis C, Motta G, Monsigny M, Roche AC. The characteristics of lectin distribution and level in breast dysplasias and cancers Tsitol Genet. 1998 Jan-Feb; 32(l):49-55.

45. Bottino C, Castriconi R Cellular ligands of activating NK receptors. Review. Trends Immunol. 2005 Apr;26(4):221-6.

46. Bryceson YT, March ME, Ljunggren HG, Long EO. Activation, coactivation, and costimulation of resting human natural killer cells. Immunol Rev. 2006 Dec;214(l):73-91.

47. Burgers, J.K., Marshall, F.F. and J.T. Isaacs. Enhanced anti-tumor effects of recombinant human tumor necrosis factor plus VP-16 on metastatic renal cell carcinoma in a xenograft model. J. Urol. 1989,142: 160-164.

48. Burnet FM The concept of immunological surveillance. Progress in Experimental Tumor Research 13:1-27,1970.

49. Chiao J.W., Arline Z., Lutten J.D. et. al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1986, vol. 83, p. 3432

50. Coffer PJ, Burgering BM. Forkhead-box transcription factors and their role in the immune system. Nat Rev Immunol 2004;4:889-899.

51. Cui S, Reichner JS, Mateo RB, Albina JEActivated murine macrophages induce apoptosis in tumor cells through nitric oxide-dependent or -independent mechanisms.Cancer Res. 1994 May l;54(9):2462-7.

52. Damoiseaux J., Regulatory T cells: back to the future. The Journal of Medicine. Review, 2006.

53. De Mejia EG, Prisecaru VI. Lectins as bioactive plant proteins: a potential in cancer treatment.Crit Rev Food Sci Nutr. 2005;45(6):425-45.;

54. Den van Eynde B. Identification of cancer antigens of relevance for specific cancer immunotherapy. Bull Mem Acad R Med Belg. 2001;156(10-12):548-55.)

55. Fetsch J., Maurer H.R. Exp. Hematol., 1990, v. 18, p. 322 327;

56. Filho JP, Correa ZM, Odashiro AN, Coutinho AB, Martins MC, Erwenne CM, Burnier MN Jr. Histopathological Features and P-glycoprotein Expression in Retinoblastoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Oct;46(10):3478-83.)

57. Glycoconj J. Characterization and cellular localization by monoclonal antibodies of the 60 kDa mannose specific lectin of human promyelocytic cells, HL60. 1994 Aug;ll(4):333-8.;

58. Goldstein A.L., Slater F.D., White A. Natl. Acad. Sci., 1966, v.69, p.1800-1803

60. Hadden J.H. Immunol Today 1993; 14: 275-280.

61. Howell WM, Rose-Zerilli MJ. Interleukin-10 polymorphisms, cancer susceptibility and prognosis. Review. Fam Cancer. 2006;5(2): 143-9.

62. Huff Т., Muller C.S., Otto A.M. e.a. Int. J. Biochemistry, 2001, v. 33, p. 205 -220.

63. Jager D, Jager E, Knuth A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J Clin Pathol. 2001 Sep;54(9):669-74.

64. Janson D Fontenot, Jeffrey P Rasmussen, Marc A Gavin, Alexander Y Rudensky, A function for interleukin 2 in foxp3-expressing regulatory T cells, Nature Immunology, vol.6, num.11, nov.2005.

65. JOHNSEN, A.K., TEMPLETON, D.J, SY, M, and HARDING, C.V. (1999). Deficiency of transporter for antigen presentation (TAP) in tumor cells allows evasion of immune surveillance and increases tumorigenesis. J Immunol 163, 4224-4231.

66. Jurianz K, Ziegler S, Garcia-Schuler H, Kraus S, Bohana-Kashtan O, Fishelson Z, Kirschfink M. Complement resistance of tumor cells: basal and induced mechanisms. Review. Mol Immunol. 1999 Sep-Oct;36(13-14):929-39.

67. Kalland Т. Physiology of natural killer cells. In vivo regulation of progenitors by interleukin-3//J.Immunol.-1987.-V.139.-P.3671 3675.

68. Kaver R. EMF and current cancer concepts., Bioelectromagnetics, 1996; 17(5), p. 339-357.

69. Kirk A. Landon AACR Prize for Basic Cancer Research Lecture Blackburn Telomerase and Cancer. Mol Cancer Res.2005; 3: 477-482.

70. Kosmaczewska A, Frydecka I, Bocko D, Ciszak L, Teodorowska RCorrelation of blood lymphocyte CTLA-4 (CD 152) induction in Hodgkin's disease with proliferative activity, interleukin 2 and interferon-gamma production. Br J Haematol. 2002 Jul;118(l):202-9.

71. Krensky AM. The HLA system, antigen processing and presentatio. Kidney Int Suppl. 1997 Mar;58:S2-7.

72. Kuo L.M., Robb R.J.// J. Immunol. 1986. Vol. 137. P. 1558.

73. Larsson Anna-Karin Early life cytokines, viral infections and IgE-mediated allergic disease Doctoral thesis from the Department of Immunology, the Wenner-Gren Institute, Stockholm University, Stockholm, Sweden 2006. ISBN 91-7155304-5 ppl-74

74. Malik S.T, Naylor M.S., East N, Oliff A, Balkwill F.R. // Eur. J. Cancer. 1990. V.26. P.1031-1034.

75. Miescher S, Whitesside T.L, Carrel S, von Fliedner V.J. J. Immunol. 1986, vol. 136, p. 1899

76. Mikhailova A, Fonina L., Kirilina E. e. a. Reg. Peptides, 2003, v. 114, p. 183 -187.

77. Mikhailova A, Fonina L, Kirilina E. e. a. Reg. Peptides, 1994, v. 53, p. 203 -209.

78. Mullins DW, Martins RS, Elgert KD Tumor-derived cytokines dysregulate macrophage interferon-gamma responsiveness and interferon regulatory factor-8 expression.Exp Biol Med (Maywood). 2003 Mar;228(3):270-277.

79. Muller, H.J. (1938). The remaking of chromosomes. Collecting Net to be found. 13,181-198.

80. Naito Z. Role of the small leucine-rich proteoglycan (SLRP) family in pathological lesions and cancer cell growth. J Nippon Med Sch. 2005 Jun;72(3):137-45.

81. Paul S, Sodhi A. Immunol. Letters, 2002, v. 2, p. 171 182.

82. Paukovits W.R, Laerum O.D. Naturforsch, 1982, v. 37C, p. 297 300.

83. Perri RT. Impaired expression of cell surface receptors for В cell growth factor by chronic lymphocytic leukemia В cells. Blood. 1986 Apr;67(4):943-8.

84. Petrov R.V, Mikhailova A.A. J.Immunol. 1969, v. 103, p.679.

85. Petrov R.V, Mikhailova A.A. Cell Immunol, 1972, v. 5, p. 392 401.

86. Petrov R.V, Mikhailova A.A, Stepanenko R.N, Zakharova L.A. Ibid, 1975, v. 27, p. 342.

87. Petrov R.V, Mikhailova A.A, Zakharova L.A. L. e. a. Ann. Immunol, 1980, 131 D, p. 161-171.

88. Petrov R.V, Mikhailova A.A, Zakharova L.A. L. e. a. Scand. J. Immunol, 1986, v. 24, p. 237-243.

89. Petrov R.V, Mikhailova A, Kirilina E. Folia Biologica, 1994, v. 40, p. 455 -461.

90. Phillips J.H., Gemlo G.T., Myers W.W. et al. In vivo and in vitro activation of natural killer cells in advanced cancer patients undergoing combined recombinant interleukin-2 and LAK cell therapy//J.Clin.Oncol.-1987.-V.5.-P.1933.

91. Rosenberg SA, Yang JC, Topalian SL, et al. Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using high dose bolus interleukin-2. JAMA. 1994;271:907-913.

92. Rosenberg SA. Progress in human tumor immunology and immunotherapy. Nature 411:380-384,2001.

93. Routes JM, Morris K, Ellison MC, Ryan S.Macrophages kill human papillomavirus type 16 E6-expressing tumor cells by tumor necrosis factor alpha-and nitric oxide-dependent mechanisms. J Virol. 2005 Jan; 79(1): 116-23.

94. Sakaguchi S. Naturally arising CD4 regulatory T cells for immunological self-tolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol 2004;22:531-562.

95. Schuld A, Haack M, Hinze-Selch D, Mullington J, Pollmacher T, Experimental studies on the interaction between sleep and the immune system in humans, Psychother Psychosom Med Psychol. 2005 Jan;55(l):29-35.

96. Seliger В. Strategies of tumor immune evasion. BioDrugs. 2005; 19(6):347-54.

97. Sentman CL, Barber MA, Barber A, Zhang T.NK cell receptors as tools in cancer immunotherapy. Adv Cancer Res. Review. 2006;95:249-92.

98. Sersa, G., Willingham, V. and L. Milas. Anti-tumor effects of tumor necrosis factor alone or combined with radiotherapy. Int. J. Cancer. 1988,42:129-134.

99. Simmons Paul, RN, ACRN Research initiative. Treatment Action! Volume 5 No.2, Aprill 1999 Interleukin-2 for the treatment of HIV infection.

100. Spies Thomas, Hutchinson Fred Cancer Research Center, Seattle, WA Relevance of NKG2D and its Ligands in Tumor Immunity, Cancer Vaccines 2004, Abstract Book, S-09.

101. Stella Pelengaris, Mike Khan & Gerard Evan.Cell, C-MYC: MORE THAN JUST A MATTER OF LIFE AND DEATH. Nature Reviews Volume 109, Issue 3,3 May 2002, Pages 321-334.

102. Stella Pelengaris' and Mike Khan. The many faces of c-MYC. Archives of Biochemistry and Biophysics. Volume 416, Issue 2,15 August 2003, Cancer 2, 764-776 (2002) p. 129-136.

103. Strelkov L.A., Mikhailova A.A., Sapozhnikov A.M. e. a. Immunol. Letters, 1996, v. 50, p. 143-147.

104. Strelkov L.A., Mikhailova A.A., Fonina L.A., Petrov R.V. FEBS Letters, 2000, v. 470, p. 281 -284.

105. SUMMARIES FOR PATIENTS, Genetic Risk Assessment and BRCA Mutation Testing for Breast and Ovarian Cancer Susceptibility: U.S. Preventive Services Task Force Recommendations Ann Intern Med. 2005 Sep 6;143(5):I47.

106. Szoke T, Kayser K, Baumhakel JD, Trojan I, Furak J, Tiszlavicz L, Horvath A, Szluha K, Gabius HJ, Andre S. Prognostic significance of endogenous adhesion/growth-regulatory lectins in lung cancer. Oncology. 2005;69(2): 167-74.

107. Takatsu K. Role of interleukin-5 in immune regulation and inflammation Nippon Rinsho. Review 2004 Oct; 62(10): 1941-51.

108. Taytor-Paradimitiou J. The interferons//Biochem. Soc. Symp.-1984.-V.49.-P.109.

109. Winkelhake, J.L, Stampfl, S. and R.J. Zimmerman. Synergistic effects of combination therapy with human recombinant interleukin-2 and tumor necrosis factor in murine tumor models. Cancer Res. 1987,47: 3948-3953.

110. White RL, Schwartzentruber DJ, Guleria A, et al. Cardiopulmonary toxicity of treatment with high dose interleukin-2 in 199 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell carcinoma. Cancer. 1994;74:3212-3222.

111. Whiteside TL Immune suppression in cancer: Effects on immune cells, mechanisms and future therapeutic intervention. Semin Cancer Biol. 2005 Sep 6.

112. Wootton SK, Halbert CL, Miller AD. Sheep retrovirus structural protein induces lung tumours. Nature. 2005 Apr 14;434(7035):904-7.

113. Wyatt HA, Sampson AP, Balfour-Lynn IM, Price JF.Production of the potent neutrophil chemokine, growth-related protein alpha (GROalpha), is not elevated in cystic fibrosis children. Respir Med. 2000 Feb;94(2): 106-11.

114. Xu Y, Sette A, Sidney J, Gendler SJ, Franco A. Tumor-associated carbohydrate antigens: a possible avenue for cancer prevention. Immunol Cell Biol. 2005 Aug;83(4):440-8.

115. Yamada K, Brink I, Engelhardt R. Factors influencing F-18. 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose (F-18 FDG) accumulation in melanoma cells: is FDG a substrate of multidrug resistance (MDR)? J Dermatol. 2005 May;32(5):335-45.

116. Zimmermann VS, Benigni F, Mondino A. Immune surveillance and anti-tumor immune responses: an anatomical perspective. Immunol Lett. 2005 Apr 15;98(l):l-8.