Автореферат и диссертация по медицине (14.00.35) на тему:Взаимосвязь между антителостимулирующей и опиоидной активностями мелопептидов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ

'ЛЗТИТУТ ИИШШШ

На правах рукописи БЕЛЕВСКАЯ Раиса Григорьевна

ВЗАИМОСВЯЗЬ ЩЦУ АНГИТЕЛОСТИЬУЛИРУХЩЯ II ОПЙОИЛНОЙ АКТИВНОСТЯМИ МИЕЯШШЩОВ

14.00.35 - Аллергология и ишунодогия

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата недицинсют наук

1'осква, 1993 г.

Работа' шторма .. в Институте иммунологии ЫЗ РФ и Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.А.16псаАлова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Г.И.Кодяскина.» доктор медицинских наук, профэссор, академик АЕН РВ А.А.Ярилин Ведущая организация:

Российский государственный медицинские университет

Ращкта диссертации состоится " "_1993 г. в_

часов на заседании специализированного совета Д 074.09.01 при Ин-стигуе иммунологии Ш РЙ по адресу: П5478, г.Цосива, Кашрское иосйе, 24, корп. 2.

С диссертацией ыожн« ознакомиться в библиотеке Института иы-

о

муиологии ИЗ РФ.

Автореферат разослан "__1993 г.

УченыР секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Д.С.Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ.

В настоящее время ьсе большую значимость приобретают исследования по изучению механизмов взаимодействия медду иммунной и ней-роэндокринной систейа><и, и, в частности, выявление медиаторов этого взаимодействия. \

Известно, что медиатора иммунной системы обеспечивают созревание и дифференцировку Т и Б лимфоцитов, влияют на их пролифэра-тивную активность, регулируют развитие отдельных этапов иммуногенеза. Однако, в последние годы установлено, что иммуномедиаторы помимо выполнения своих регуляторньа функций внутри иммунной chcj теш участвуют таюга и в кексистемных взаимодействиях. Об этом свидетельствуют такие факты, как полифункциональность цитокшов, продукция их как в лимфоидных органах, так и в ЦШ, наличие рецепторов к медиаторам иммунитета на клетках нервной системы и т.д. (Bodrrer S. е. а, 1985, Parrar V.L. е. a, 1Ö87, HeíjnenC.J., 1991).

С другой стороны, показано влияние нейропептидов, в том числе и опиоидных, на функционирование иммунной системы, на иммуноком-пегентных клетках обнаружены рецепторы ко многим известным гормо-• нам и нейропептидан (Ader R., 1981, Hazum Е. s.a., 1979, Keijnen С.]., 1991, Plotnikoff N.P. е.а, 1986).

. В последние годы сложилось представление о наличии двусторонней передачи сигналов мевду нейрозндокринной и иммунной системами, которая обеспечивается нейропептидами, гормонами и медиаторами HHMyffitTeTá (Blalock J.E., 1980). В связи с этим чрезвычайно актуальной задачей становится.выяснение особенностей этих соединений, обеспечивакщх их способность осуществлять нейро-иммунные связи.

В начале 70-х годов в коллективе иммунологов, руководимом Р. В. Петровым, были обнаружены костномозговые медиаторы, миелопеп-тиды, обладающие голдаэсткмулирухщми свойства».«! (Михайлова А. А.

и др., 1972, Petrov R.V. «.a, 1972). Позднее било показано, что, пошю имцунорегудяторного действия, ииедопептиды обладает выра-язнным нейротропкш эффэкгоы, оказывая влияние на болевую чувствительность и связываясь с опиоидныш рецепторами на нервных и тфидных клетках (Василенко A.IL, 1984, __Петров. Р.Е , 1983, 1982} . Анализ накопленного экспериментального материала по имцу-норегуляторнш и нейротропнш эффектам ииелопептидов позволил авторам выдвинуть их на роль медиаторов нейрош-шунного взаимодействия (Захарова Л L , Петров Р.Е, 1390).

Однако, если сам факт участия ш-елопепадов в реалаацни ней-роишунных связей не вызывает сомнений, то остается шоюэство не-» яснш вопросов по конкретным механизма« имйуно- и нейротролного действия шшспептидов. Гак, пршдаиадьно вакныи является воп- ч рос: реадшуотся ли игиуностииугирукгЛ и цейротрошша эффекты ' ииелопептидов од"-1Ш к теш га молекулами, или для каждой из них сусествуЕЯ отдельные пептиды, вырабатываемые клетками костного шага Этот вопрос крайне актуаиен в настоящее вреия евз и потопу, что созданный на основе шшлопеподов шздтюгарршгрущш препарат Миелопид интенсивно применяется в клинической и Еетери-нарной практике, и дополнительная информация по иолекулярньш ие-' шшаиаи его действия дает возможность расширить сферу его признания, а также повысить эффективность данного препарата, разрабатывая научно обоснованные оптимальные схеш применения. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ДОСЛЕДОВАНИЯ. :

Цель» настоящей работы явилось изучение взаимосвязи между ач-тителостимулирущей и опиоидной активностями ииелопептидов. В процессе проведения работы решались следующие задачи:

1. Изучение влияния антагониста опиоидов - налоксона - нз ан- • • тителостимулирушую активность пептидов костного мозга

2. Оценка антителостимулируодзй способности смеси синтетичзс-» ких опиоидных пептидов в моделях in vitro и in vivo.

3. Изучение аншелостимулирувдей способности отдельных синте-

тических опиовдных пептидов: альфа-, Сета-, гэ'гса-зндорфи-нов, мет- и лей-знкефашов.

4. Оценка аятигелостимулирущей активности миелопепшов после удаления из их состава бета-эндорфина с помощью специфической антиеыворотки.

5. Сравнительное изучение дозовых зависииостей в проявлении иммунорегулягорного действия опиокдных пептидов и пептидой костного мозга.

6. Оценка антителоспшулирушэй активности веществ, входящих в-состав миелопептидов, которые отличаются по хроматографи-ческим параметрам от бета-эндорфина. '

НАУЧНАЯ Н0Б13НА.

Проведено всестороннее исследование взаимосвязи иимуностиму-лируйцЭй и опиоидной активностей пептидов костномозгового проис-ходдения (1Л). Впервые проведен сравнительный анализ действия природных миелопепшов и смеси синтетических опиоидов на адтите-логенез. Еыявлен неизвестный ранее факт отмены антителостимулиру-щей активности Ш антагонистом опиоидов - налоксоном.

Впервые изучено, действие индивидуальных опиоидов на антитело-генез в продуктивную фазу иммунного ответа. Определена дозовая зависимость антителостимулирувдего эффекта бета-эндорфина и выявлена способность малых доз данного олиоида (2,4х10~4 - 2,4x10 "2 ф!.(/ш) стимулировать ангителообразование на уровне зрелых антите-лопродуцентов.

• Из смеси миелопепшов впервые выделена-группа веществ, не содержащих'в своей составе бета-зндорфияа, которые оказывают ярко выраженный эффект стимуляции антител на пике иммунного ответа.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Полученные в работе экспериментальные доказательства участия опиатзргической системы в реализации иммунорегуляторной активности миелопептидов могут быть использованы при анализе клинических эффектов иммунокорригирувдего препарата Миелопид, успешно.приме-

няешго в клинической и ветеринарной практике. Выявление тесной вэаишсвязи кеаду ангитедостиыулируодим и опиоидным действием ыи-елопептидов создает предпосылки для разработки на их основе новых препаратов с сочетают! ишуностшщирувдш и аналгезируадкы зф-фектои.

Шделение фракции шелопептидов, не содержащей бета-эндорфин, но обладающая андаелошшулируадей активностью, указывает на наличие в составе Ш шдунорегулягорных молекул не только опиоидной природы, что пшатся полезной информацией при изоляции индивидуальна биологически активных веществ костномозгового происходде-» »

ЙИЯ. •

ОСКОВШЕ НОШЕНИЯ, ШНОСИШЕ а ЗАЩИТУ. .

1. В реализации здтелостшулируюцэй к опиатоподобиой актив--», ностей ииелопептидов существует тесная взаимосвязь, о чем свидетельствует отмена аншелостимулирующего аффекта шелопептидов налоксоноы (антагонистоы опиощщшг веЕззсгв), а также стимуляция антктелообразовшшя в продуктивный период кшушга-го ответа сшсью синтетических олиоидных пептидов, соответствующей их содержанию в иативных МП.

2. Шш9 дозы синтетического бета-экдорфкиа (2,4x10 "3 -2,4x1 СГ2да)оказывает антителосгимулирущий налоксонзавиешй эффект на пике ишунного ответа. Альфа- и гамма-эндорфлны, а также мер; и лей-энкефалины подобным действием не обладают.

3. Бета-зндорфия играет, очевидно, существенную роль в реализации антителостимулирущего эффекта шелопептидов в продуктивный период иммунного ответа, поскольку обработка нативных Ш анти -бетаэндорфиновой сывороткой отменяет их иммуностимулирующее действие.

.4, В состав шелопептидов помимо бета-зндорфина, обладающего антителостимулирующей активностью, входят и другие компоненты, возможно, неопиоидной природы, которые принимают участие в реализации антителосгимулирухщего эффекта шелопептидов.

Настоящая работа выполнена в рамках Государег веяной научно-технической программы 0.69.07 раздела 01.05.Н "Разработать новые экспериментальные подходы к получению медиаторов иммунных реакций с целью их использования для иммунокоррекции", номер гос. регистрации N 01860086749.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

По теме диссертации опубликовано 12 работ, две из них - в зарубежной печати. Результаты исследований доложены на Всесоюзной конференции "Проблемы и перспективы иммуноневрологии в психиатрической клинике" (Воронеж, 1985) Г на конференции "Нейропептиды. Их роль в физиологии и патологии" ,(Томск, 1985), на IV Всесоюзно)! симпозиуме "Вгйрогуморальная регуляция иммунного гомеостаза" (Суздаль, 1986), на II Международном симпозиуме по нейроимммуно-. модуляции (Югославия,' 1985), на V Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммунной систем" (Оренбург, 1990), на конференции молода ученых Института иммунологии Минздрава РФ (1985, 1986), на научной конференции отдела иммунологии ИБХ РАН (Шсква, 1992).

ОБЪЕМ РАБОТЫ. ..

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 8 рисунков и 13 таблиц. Список литературы включает 162 источника, из которых 36 - работы отечественных авторов.'

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ..

Материалы и методы исследования. ■ •; . В экспериментах использовали мышей гибридов первого поколения (СВАхС57В1)Р1 - самок весом 10,0 -22,0 г.,- полученных, из питомника лабораторных, 'животных АМН СССР "Столбовая", кроликов породы Шиншилла (самки весом 2,5-3,0 кг) - для получения анти-^ сыворотки. Для: получений комплемента были использованы морские свинки.

. Шелопептиды (МП) получали из супернатазта культур клеток костного'мозга, .выделяемых т реберных костей свиней (возраст 1-2

года). Клетки КМ в концентрации lxlO7 а/с клеток на i мл помещали в культуральную среду, которую готовили на основе среды 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва) с добавлением 2 мМ глуташна, 10 Ш Гепес-буфера и 100-Ед/ыл пенициллина. Суспензию инкубировали в течение 20-22 часов при 37°С с 5Х С02 и влажности 9QZ. Супернатант концентрировали в 10 раз лиофилизацией и подвергали последовательной очистке гельфильтрацией на сефадек-сах G-25 и G-15, а также препаративным электрофорезом, являющимся модификацией широко известного метода "отпечатков пальцев" (Gray С., 1977, Lenfant N., 1983).

Для иммунизации шеей в качестве антигена использовали зрит-4 роциты барана (ЭБ). (¿шей иммунизировали подкожно в подушечки 4-х конечностей по 0,1 ил Ы суспензии ЭБ. Повторную иммунизации жи- ,s вотных проводили геи же антигенои и теп ие способом через 2 недели,

Биологическую активность Ш1 и опиоидных веврств оценивали по увеличению количества АОК m vitro в культурах клеток ЛУ, полученных от мышей на пике иммунного ответа к ЭБ, а также в системе in Vivo, вводя вещества в организм животного. Количество АОК определяли с помощью метода локального гемолиза в геле, предложенного N. R. Jerra (1963) в модификации D.W. Dresser и H.H.Vortis для оценки количества Ig 6 - синтезирующих клеток (1965).

Для тестирования антителостимулирущей активности Ш1 и синтетических опиоидных пептидов в культуре m vitro к клеткам иммунных ЛУ в концентрации lxlO6 добавляли МП в концентрации 60 мкг /мл или синтетические опиоидные пептиды в широком диапазоне концентраций. В отдельных экспериментах в культуру клеток иммунных -ЛУ добавляли налоксон, анти-бета-эндорфиновую сыворотку или нормальную кроличью сыворотку. Через 16-18 часов после совместного , культивирования клеток иммунных ЛУ и исследуемых препаратов в культурах определяли количество АОК методом Ерне.

В модели in vivo на 4-е сутки после вторичной иммунизации

эритроцитами барана мьшш вводили в различных концентрациях ЫП или опиоидные вещества в подушечку одной из задних конечностей. В контрлатеральнув конечность в качестве контроля вводили физиологический раствор. Через сутки после введения препаратов определяли количество АОК в подколенных ЛУ.' дренирующих песта инъекций. Коэффициент стимуляции рассчитывали как отношение количества АОКхЮ6 я/с клеток в опытном ЛУ к количеству АОКхЮ6 клеток в контрлатеральном ЛУ.

Для сравнительной оценки хроматографических свойств Ш и бета -эндорфина использовался метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЮО с обращенной фазой на хроматографе Gradient HPLS system (Gilson, Франция), с использованием колонки Zorbax ODS (5 mi) размером 10x250 мы (Du Pont, USA).

Перед нанесением образцов колонку промывали в ступенчатом' режиме:

1. изократический режим - 1002 CH3CN ¡в течение ÎO мин,

2. градиентный режим - гршвт CH3C1J or 100S до 57. р течение 25 мин,

3. изократический режим - K20/CH3CN/ТФУ-100/5/0,05.

Препарат МП или эндорфина наносили на колонку е изократичес-

ком режиме: Н20/0НЗСМ/ТФУ-100/5/0,05. Через 40 мин после нанесения препарата создавали градиентный режим: от 57. до 100Х СНЗСМ в течение 120 мин. Скорость потока составляла 4 мл/мин, детектирование проводили, при длине волны, равной 226пм, фракции собирали вручную. Полученные фракции замораживали и лиофилизовали, а затем оценивали их антителостимулирушую активность.

На каедом этапе очистки супернатанга культуры клеток костного мозга оценивали концентрацию белка определением содержания ароматических аминокислот по методу Лоури, а также веществ, содержащих пептидную связь - биуретовой реакцией. Результаты экспериментов статистически обрабатывали в соот ветствии с руководством- Ашмари-на и Воробьева (1962 г.).По вычисленному значению t (критерий

Стыодента) и соответствующему значению степени свободы (П определялась вероятность ошбки (р) по таблице Стыедента-Фишера. Разница считалась достоверной» если уровень значимости не превышал 5 X (Р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Для анализа роли опиоидов в антителостимулирунцем эффекте Ш прежде всего получили высскоочидэнную фракцию Ш, обладающих способностью к шмуносгиыудящш. В работе использовали препарат МП, полученный путем последовательной очистки супернатанта культур клеток костного иозга свиней гельфильграцией на сефадексах и электрофорезом. Полученный препарат обладал как антителостимули-1 рущэй активностью, так и аналгезирующш, опиатоподобньм действием и представлял собой многокомпонентную сиесь, в состав которой входят также и опиоадные пептиды или вещества, близкородственные им. Работая с такой смесью, сложно отдифференцировать активность кздой молекулы отдельно. В связи с этим мы использовали различные экспериментальные подходы, чтобы выяснить роль костномозговых опиоидов в реализации антителостииулирувдей активности Ш1

I. Влияние шлоксоиа на антителсютиыулирунцую активность Ж Как известно, аналгезирующий эффект Ш в присутствии налоксо-на'не наблюдается (Василенко А.И., 1984, Крыжановский Г.Н., 1986). , .

Для проведения исследования по возможной отмене налоксонои антителостимулирущего действия Ж предварительно была отработана доза надоксона, в которой он сам по себе не влиял на антителооб-разование. Валоксон использовали в диапазоне концентраций от 0, 4 мкг/мл до 20 .мкг/мл. Лозы налоксона от 15 до 30 мкг /мл подавляли антителообразование (коэф. стимуляции равен 0,4-0,6). При добавлении налоксона в дозах 0,4-10 мкг/мл к клеткам иммунных ЛУ, полученным от ыьшй на пике иммунного ответа к эритроцитам барана, количество антителообразующих клеток в культуре не изменялось •(коэф. стимуляции равен 0,9- 1,2).' Исходя из этих данных, во всех

последующих• экспериментах налоксон использовали в дозе 0,4 мкг/мл, не оказывающей самостоятельного влияния на антителообра-зование в продуктивный период иммунной реакции.

В таблице 1 представлены результаты исследований по совместному культивированию клеток иммунных лимфатических узлов с Ш1 и/или налоксоном. МП использовали в концентрации 60 мкг/мл.

Таблица 1. Влияние налоксона на иммуностю^лирующую активность ииелопептидов.

Компоненты, добавляемые к ЛУ имм. *

Количество Число А0К/10 Коэффициент Р опытов я/с клеток** стимуляции

Среда культуральная

(контроль) 13

И1 (60 мкг/мл) 13

Налоксон (0,4 мкг/мл) 13 Ш + налоксон .13

183,2 + 5,2 366,4 + 17,6 199,8 ±8,7 206,1 +6,4'

2,0 1,1 1,1

< 0,001

> 0,05

> 0,05

* - 'клетки лимфатических узлов швей, полученные да 4-е сутки после повторной иммунизации;

• ** - ядросодержавде клетки

Как видно из таблицы,антагонист опиоидов отменяет иммуностимулирующий эффект МП Это свидетельствует о том, что в реализации антителостимулирующей активности Щ.задействованы опиатзргические ' механизмы. ■.. С, .

II. Влияние синтетических опиоидных пептидовда) антитело-

образование в продуктивную фазу иммунного ответа. • Поскольку антителостимулируший эффект МП отменялся налоксо? ном, в следующей серии экспериментов мы провели сравнение антите-

лостимулирущей активности синтетических опиоидов с антителости-иудируввдш действием Ш,

Учитывая разнородность литературных данных об эффектах опиоидных пептидов на « иммунологические реакции, обусловленную, в частности, используемой дозой опиоидов, в своих экспериментах ш составляли сшсь синтетических опиоидных пептидов в строгом соответствии с их содержание« £ составе ИИ

1. Влияние смесц синтетических опиоидных пептидов на

антителопродущю на пике иммунного ответа. Ранее было показано,' что 1 мг Ш содерззгг- 71+4 фиоля бе-та-ЖД2Ш6 фшля альфа-зндорфина, 39+16 ф>шя бета-эндорфина', 33+10 фуодя гаша-эндорфина [Зозуля Lk ¡¡ др. ,19853. В соответствии с этими данными наш была составлена сшсь синтетических, опиоидных пептидов ("Serva", ФРГ) в соотношении Оета-ЛШ/аль-фа-эвдорф1Ш/бзта-эндорф1ш/г£щиа-зндор4р1 равном 71/124/39/33, т. е. в количествах, определяемых в составе Ш. Шла изучена аати-телостимулируввзя активность данной смеси опиоидов в моделях in vitro и in vivo, которая сравнивалась с аналогичной активностью Ш1, выделенных из супернатанта культур шток костного шага свиней.

В модели injitro сшсь опиоидов в концентрациях от 3 до 55 фмолей/мд добавляли к клеткаы ЛУ »млей, полученным на 4-е сутки вторичного идоункого ответа к эритроцитам барана. Дня сравнения в параллельные пробы добавляли Ш! в концентрации 60 шг/мл, оптимальной для проявления эффекта усиления антителообразования. На рис. 1 представлены результаты дозовой зависимости эффекта стимуляции антителообразования опиоидных пептидов.

Как видно из рисунка 1, смесь опиоидных пептидов в концентрациях от 11 до 16 фмоль/мл усиливает.антителообразование. Наибольший эффект наблюдался при использовании смеси опиоидов в концентрациях 13 и 16 фмоль/мл, т. е. в дозах, равных их содержанию в активной смеси МЛ,- также вызывающей наибольший иммуностимулируо-

л -

Кол-во АОК/Ю6 Я^С кл-н

"Т-I I I ТЧ [-г

О 35 8111316 25

55ф моль

шшентрашя смеси-

синтетических опиоидов

Рис. 1. Влияние различиях доз осей синтетических олиоидяых

пеггщдов на продукции антител.

щий эффект. Коэффициенты стимуляции при это« были равны 1,7 и 1,9 соответственно. При использовании опиоидных пептидов в концентрации 25 фыолей/мл эффект антителостимуляции был менее выражен, а при 3-8 фмоль/мл, а также 55 фмоль/мл количество ангителообразую-да клеток в опыте и контроле было практически одинаковым.

Введение налоксона совместно с опиоидными пептидами в культуру клеток иммунных лимфатических узлов отменяло их ангителостиму-лирующий эффект. Смесь опиоиднух пептидов использовали при этом в концентрации 13-16 фуоль/мя, давдей максимальный антителостимули-. рухвдй эффект. Т.о. иммуностимулирующий эффект опиоидных пептидов - налоксонзависимый процесс. »

Антителостимулируший эффект смеси опиоидов был получен также in vivo при введении их мышам на пике вторичного иммунного ответа К эритроцитам барана. Опиоиды вводили подкожно в одну из задних' конечностей в гозе 30 фмоль на мьшь. Данная доза смеси олисидов соответствовала их содержанию в составе Ш1 при дозе, вызывающей стимуляцию антителообразования in vivo (100 ыкг на мышь). Кроме того, были использованы также дозы смеси опиоидных пептидов в 10 и 100 раз превышающие исходную. Результаты экспериментов представлены в таблице 2. i

Из представленных в таблице данных видно, что в системе in vivo смесь опиоидов во всех используемых концентрациях стимулирует антителосфразование. Коэффициенты стимуляции, при этом равны 1, 9-2,3 и достоверно отличаются от контроля.

2. Влияние индивидуальных опиоидных пептидов на антителообразование на пике иммунного ответа Для выяснения роли отдельных опиоидных пептидов, входящих в состав использованной нами смеси, в проявлении эффекта стимуляции аятителообразования была проведена серия экспериментов по . изучению влияния бета-, альфа- и гамма-эндорфинов на антителообразование в продуктивную фазу иммунного ответа.

Таблица 2. Аитителостимулирующкй эффект смеси синтетических опиоидных пептидов in vivo.

Компоненты, вводимые в организм животного Количество животных Коэффициент стимуляции Р

Физ. раствор 55 1.0

МП (100 мкг/мьшь) 10 3,26 + 0,61 < 0,001

Спесь синтетических

опиондных пептидов •

( в ют/ шш>)

30 . 20 1,92 ± 0,52 < 0,01

300 18 2,28 + 0,93 < 0,01

3000 17 2,31 ± 0,64 < 0,001

2.1. Влияние бета-эндорфина на ангителообразование в культуре in vitro и системе in vivo.

В экспериментах бал использован синтетический бета-эндорфин в диапазоне концентраций от 2,4хЮ до 2,4x10 фмолей/мл. Доза 2,4 Фешя соответствует содержанию бета-эндорфина в составе НП (в 60 икг).

На рисунке 2 представлена дозовая зависимость эффекта стимуляции антителообразования в присутствии бета-эндорфина'в модели in vitro.

Из рисунка видно, что бета'-эндорфин в доаах от 2,4х10~4 до 2, 4х10"2 фмолей/мл усиливает продукцию антител на пике иммунного ответа. Максимальный эффект наблюдается при концентрации бета-эндорфина 2,4x10"3 фмолей/мл (коэф. стимуляции равен 2,1), т.е. в дозе, уменьшенной в 1000 раз по сравнению с его содержанием в МП. Дозы 2,4хЮ~б - 2.4Х10"5 и 2,4х10-1 фмолей/мл не влияли на анти-

Нол-во АОН/Ю6 Я/С кл-к

кзивитрмш Л-эндорфина

Рис. 2. Влияние различных лоз синтетического бета-эншрфина на продукцию антител.

телопродукция (газф. стшгуллщи 1,1-1,2). При увеличении доз бета -зидорфииа до 24-240 фиолеп/мл наблюдалось подавление антителооб-разования (гсозф. стимуляции 0,7-0,8).

ЛнгетелостимулируюЕЛй эффект синтетического бета-зндорфина, подобно гЯ1 и смеси синтетических ошгаидш пептидов, оказался на-локсоя-зазлстм!. Добавление надоксона з доге, не вызывающей са-гастоятелыюго действия на антителообразование (0,4 мкг/мл) в культуру клеток иммунных ЛУ совместно с бета-эндорфнном (2,4x10 "3 фшей/шО отшшо ю.муностимулирущ!й эффект бета-зндорфина. -В системе m vivo . активной дозе Ш (100 кет на мышь) соот-ветсвует доза бета-зндорфина, равная 4 фиолей на мыеь. В зкспери-1 !.*.энтах была использована эта доза, а такта увеличенная или умень-сзшш в 10 п 100 раз. Результаты экспериментов представлены в таблице 3.

Таблица 3. А1ШГШ0стга.(у.юруюдий эффект синтетического бэта-эидорфяна в системе in vivo.

Компоненты, вводимне в организм йиотного Количество животных Коэффициент стимуляции Р

<1из. раствор 30 1,0 -

Ш (100 мкг/мьшь) 10 3,06 ± 0,61 < 0,001

Бета-эндорфин

( в фмоль/1.шшь):

• 0,004 ч 12 » 1,82 + 0,37 < -0,05

0,04 14 2,16 + 0,52 < 0,05

0,4 28 1,55 ± 0,41 > 0,05

4,0 20 1,18 ± 0,25 > 0,05

40,0 31 1,42 + 0,31 > 0,05

400,0 12 1,35+ 0,47 > 0,05

Как видно из данных таблицы, наиболее выраженный антителости-мулирующий эффект бета-зндорфина набладался при его концентрации 0,04 фмолей на мышь, т.е. в дозе, уменьшенной в 100 раз по сравнению с его.содержанием в МП. Коэффициент стимуляции составлял 2, 2. Стимуляцию антителопродукции вызывала также доза, равная 0,004 фмолей на мышь, т.е. количество бета-эндорфина, уменьшенное в 1000 раз по сравнению с его содержанием в составе МП И незначительный антителостимулирующий эффект оказывала доза бета-эндорфина, равная 0,4 фмолей на мышь (коэф. стимуляции равен 1,6). В остальных дозах, используемых в экспериментах, бета-эндорфин был неактивен. 1

2.2. Елияние альфа- и гамма-эндорфинов, мет- и лей-энкефалинов на антителообразование.

Синтетические альфа-, гамма-экдорфины, а также мет- и лей-зн-кефалины, аналоги которых были обнаружены в МП, существенного влияния на продукцию антител в широком диапазоне концентраций, в том числе и физиологических,не оказыали. Полученные наш данные совпадают с множеством литературных сообщений о неактивности одних опиоидных пептидов по сравнению с ярко выраженным эффектом других, а также о противоположном эффекте различных опиоидных пептидов в одной тест -системе СВгото S. L., Van Epps D.E.6 1985, Jankovic B.D., Marie D., 1986, 1988, Johnson H.M., 1982].

3. Отмена антителостимулируюцего эффекта миелопептидов после удаления из их состава бета-эндорфина.

Эксперименты с использованием специфической анти-бета-зндор-финовой сыворотки показали, что смесь миелопептидов после "обработки сывороткой не обладала эффектом усиления антителообразова-ния в культуре клеток иммунных лимфатических узлов («ей, полученных от мышей на пике иммунного ответа к эритроцитам барана (табл. 4).

Таблица 4. Отмена антителостиыулирущего эффекта Ш в присутствии анти-бета-эндорфишвой сыворотки.

Компоненты, Количество Число А0К/106 Коэффициент . Р добавляемые опытов я/с клеток** стимуляции к Ш иш. *

Среда (контроль) Ш1 (60 мкг/ыл) АС*** (1хЮ"4усл. ед.) АС (1x10 "5 усл. ед.) Ш ♦ АС (ШО"4 ) ЦП + АС (1x10 "5 )

4 4 4 4 4 4

230 + 17,8 400 * 10,4 270 ± 13,4 259 £ 31,7 281 ± 17,6 281 + 17,6

1,7 1.2 1,1 1,2 1.2

< 0,001

> 0,001

> 0,00{

> 0,001

> 0,001

* - клетки лимфатических узлов шлей, полученные на 4-е

сутки после повторной иммунизации;

** - ядросодержавде клетки;

*** - анти-бета-зндорфиновая сыворотка

Отмена антителостимулирующего эффекта 1Ш анти-бета-зндорфино-вой сывороткой указывает на важную роль бета-эндорфина в процессе стимуляции продукции антител на пике ответа под влиянием МП.

Следует ответить, что анти-бета-зндорфиновая сыворотка оказывала самостоятельный дозозависимый разнородный эффект на продукцию антител . Так, в исходной концентрации она оказывала супрес-сорное действие на антителопродукцию, снижая ее практически на 90 X, при этом жизнеспособность клеток не изменялась. В Лозах, 'уменьшенных на 1 и 2 порядка по сравнению с исходной, анти-бета- эндорфиновая сыворотка стимулировала антителопродукцию, увеличивая ее на 60-80 X. Таким образом, несмотря на то, что в своих экспериментах мы использовали дозы антисыворотки, не оказывающие самостоятельного эффекта на антителопродукцию (уменьшенные на 4 и

5 порядков по сравнению с исходной), это не исключает ее неспецифического влияния на пептиды неопиоидного происхождения, принимающие участие в сложном, интегральном процессе стимуляции антите-лопродукции. Не исключено также существование на клетках-мишенях бета-эндорфиноподобных структур, взаимодействие с которыми ан-ти-бета-эндорфиновой сыворотки создает блок в сложной сети последовательных реакций, приводящих к стимуляции антителообразования.

III. Сравнительная оценка хроматографических свойств миелбпептидов и бета-эндорфина Для исключения возможного влияния'бета-эндорфина на антите-лостимулируюшую активность МП мы провели хроматографическое выде-' ление фракции МП, не содержащей бета-эндорфин.

Для сравнительной оценки хроматографических свойств Ш и бета., -эндорфина использовали метод высокоэффективной жидкостной хрома- ' тографии , который обычно используют при очистке пептидов, присутствующих в небольших концентрациях.

На рис. 3 представлен профиль элюции МП и бета-эндорфина при ' детектировании на 226 нм. Как видно из рисунка, препарат МП разделяется на целый ряд пиков, которые были объединены нами в отдельные группы. Так, первая группа пиков элюируется с 3-й по 18-ю минуту после нанесения препарата в изократическом режиме 51 СИЗСИ. Эта группа пиков была названа 1р. I. В градиентном режиме с 18 по 45% СНЗСИ выходит вторая группа пиков, которая была названа Ар. II. Как видно по поглощению, основное количество материала, выходящего в градиентном режиме, сосредоточено в пиках, выходящих при 23,7-27,87. СНЗСН и 32,3-35,ОХ СНЗСН, которые были названы А-4 и А-7 соответственно. -

Бета-эндорфин выходит в области злюции 28,0-32,77. СНЗСН. Таким образом, из представленных данных следует, что бета-зн-дорфин выходит в области, частично перекрещивающейся с областью выхода группы пиков Ш, обозначенных, как А-7. Но, кроме того, в составе Ш присутствует .группа пиков, обозначенных как к-А, "не

ч22бнм

% CHjCN

т-1-г»

80 мин

Рис. 3. Профиль агкиии s 1- млелопептидэв, 2- бета-эндэсФина щи (фракционировании мэтадсм ВЗЖХ.

0 1 - 20 -

имеющих перекреста с областью выхода бета-эндорфина. Дальнейшие эксперименты были проведены, чтобы выяснить, присутствуют ли в составе МП вещества, обладающие антителостимулируюш,ей активностью и не содержаще в своем составе бета-эндорфин,

С этой целью мы определяли влияние на антителопродукцию на пике иммунного ответа к эритроцитам барана фракции, условно обозначенной как А-4,т.е. группы пиков, не содержащих в своем составе бета-эндорфин. Результата экспериментов представлены в таблице 5.

Таблица 5. Влияние фракции миелопептидов А-4 на антителопродукцию.

Компоненты, Количество Число А0К/106 Коэффициент 1 Р'.

добавляемые опытов я/с клеток** стимуляции

к Ш имм.*

Среда (контроль) 4 188,3 £ 32,9 -- - •.

А-4 (в мкг/мл):

ЮхЮ2 4 199,9 ±36,4 1,1 > 0,05

ЮхЮ1 .. 4 , 240,0 + 36,8 . 1,3 > 0,05

10 4 316,9 ± 31,1 1,7 <0,05

ЮхЮ"1 4 329,6 + 36,3 1,8 <0,05

ЮхЮ"2 4 250,3 + 44,6 1,3 > 0,05

ЮхЮ"3' 4 212,8 ± 35,8 1,1 > 0,05

10x10 4 203,8 + 38,3 > 0,05

ЮхЮ"5 4 232,0 ± 50,4 1,2 . >0,05

ЮХЮ"6 4 336,0 ± 41,2 1,8 < 0,05

ЮхЮ"7 4 310,7 + 47,9 1,7 ' > .0,05

ЮхЮ'8 4, 247,5 ± 53,4 . 1,3 > 0,05

* - клетки лимфатических узлов мышей, полученные на 4-е

сутки после повторной иммунизации;

** - ядросодержаше клетки.

Как видно из таблицы, фракция А-4 обладала антителостимулиру-юшим эффектом в продуктивную фазу иммунного ответа к ЭБ. Эффективными концентрациями были 10 ют/мл, 10x10 ¡«г/мл, а тагасе 10x10 мкг/ыл (Коэф. стимуляции равны 1.7, 1,8 и 1,8 соответсвен-но).

Таким образом, из полученных данных следует, что, в состав МП помимо бета-зндорфина, обладающего антителостимулируюлей активностью, входят и другие компоненты, возможно, неопиоидной природы, которые принимают участие в реализации антителостимулирующей активности МП. -N '

Данный вывод подтвердился результатами, полученными в настоя-цее время в лаборатории Медиаторов иммунной системы ИБХ РАН. Из супернатанта ¡культуры клеток костного мозга свиней изолировано 5 индивидуальных соединений, обладающих антителостимулирующей активностью, 3 соединения, обладающие' дифференцировочной активностью и 4 соединения, обладающие нейротропной активностью . Из субстанции, шшпкщей на болевую чувствительность, выделено 2 индивидуальных соединения, определена их аминокислотная последовательность и получены синтетические аналоги - гексапептиды СФонина 'ДА. и др. ,19913. Всестороннее изучение биологических свойств синтезированных гексалептидов показало, что один из них,'с аминокислотной последовательностью Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp,обладает аналгезирущим эффектом и стимулирует антителообразование в индуктивную фазу иммунного ответа. Другой гексапептид- Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Tyr - обладает выраженным антителостимулируквдм эффектом на пике иммунного ответа, но не влияет на болевую чувствительность. Очевидно, что в состав МП входит несколько соединений, об-ладаюдах иммунорегуляторной активностью и проявление их действия моиет происходить по различным механизмам.

Таким образом, в работе безусловно доказано наличие тесной взаимосвязи в реализации антителостимулирующей и опиоидной актив-

костей миелопептидов. Опиоиды, входящие в состав МП и, в частности, бета-эндорфин,играют существенную роль в механизме антителос-тимулирущзго эффекта 121. Однако, полученные данные не дают оснований утверждать, что стимуляция антителопродукции под влиянием МП происходит только лишь за счет опиоидных пептидов, входящих в их состав. Роль опиоидов может сводиться к "включению" ряда последовательных реакций, конечным результатом которых является стимуляция продукции антител на пике иммунного ответа. Не исключено, что опиоиды являются необходимым звеном в сложной цепи имму-норегуляторных событий, ■ развивающихся в иммунном организме при введении МП.

Окончательное реиение этого вопроса возможно лишь после выделения и структурной характеристики индивидуальных миелопепти- -> дов и изучения их иммуно и нейротропных эффектов.

ВЫВОДЫ.

1. Антителостимулирутощая активность миелопептидов, выделенных из супернатанта культуры клеток косного мозга свиней, отменяется антагонистом опиоидных веществ - налоксоном,что указывает на участие опиатзргической'системы в реализации иммунорегуляторной активности миелопептидов.

2. Смесь синтетических опиоидных пептидов, количественное соотношение которых соответствует их содержанию в миелопептидах, вызывает стимуляцию антителообразования в продуктивную фазу иммунного отЕета. Коэффициенты стимуляции антителообразования при использовании смеси синтетических опиоидов и природных миелопептидов практически одинаковы (1,7 и 1,9 соответсвенно).

3. Из всех синтетических опиоидов, выявленных в составе смеси МП, только бета-эндорфин обладает адтителостимулирующей напоксон-зависимой активностью. Оптимальная доза синтетического бета-эндорфина, вызывающая антителостимуляцию, на 3 порядка ниже, чем его содержание в эффективной дозе миелопептидов. Альфа- и гам-ма-эндорфины, а также мет- и лей-энкефалины не оказывают влияния

- яэ -

на антителообразование ни в одной из испытанных концентраций.

4. Обработка яативных шюлопепгндоз специфической анти-бета- зндорфиновой сывороткой приводит к отиеке их антителостимули-руюдаго эффекта

5. В составе ииелопептидов, обладающих антителостимулирущэй активностью, присутствуют вещества, отличающиеся по хроыатографи-ческим параметрам от бета-эндорфш.

6. Существует тесная взаимосвязь в реализации антителостиму-лнрувдзй и опиатоподобной активностей ниелопептидов. Входящие в' состав ииелопептидов опиоиды и, в частности, бета-эндорфин играют существенную роль в механизме антителоетимулирующего эффекта ¡же-' лопептидов. Однако, наряду с бета-зндорфином, в состав ииелопептидов входят и другие кммунорэгуляторныэ шлзкулы, антителостиму--ч лирухвдй эффект которых' ногат осуществляться и по иным кнаннз.мам.

Список работ, опубликованных по тене диссертации.

1. Михайлова A.A., Захарова Ji А., Сергеев С. Ю., Белевская Р. ГЛ Иммунорегуляторные свойства пептидов костного мозга У/ "¡.'¿ханизмы иицуностимуляции", тезисы сообщений, Киев, 1985, 2.

2. Дмитриев А. Д., Белевская Р. Г., Кизим Е. А., Теннов А. В. // Дексаметазои подавляет секрецию зндорфинов в культуре клеток костного мозга свиньи. // "Кейропепады. Их роль в физиологии и патологии", Тезисы докладов, Томск, 1985, 2.

3. Захарова JL А., Белевская Р. Г., Михайлова А. А. // Миелопеп-тиды, обладающие эндорфиноподс?ной активностью. // "Теоретические проблемы иммуноневрологии.", тезисы докладов, Воронеж,'1985.

4. Иващенко М. Е., Лиознер A. JL, Белевская Р. Г., Хаитов Р. Я //. Стимуляция иммунного ответа на иммобилизованный антиген в системе in Vitro В-актиаином. // ВШ, 1986, N 2, 84-87.

5. Петров Р. В., Михайлова А. А., Захарова Л. А., Катлинский А.Е , Сорокин С.В. Белевская Р.Г.// Миелолептиды - регуляторные

медиаторы, вырабатываемые клзткаш костного мозга. // ЛАЯ СССР, 1986 , 287, N 2, 489-492.

6. Захарова Л. А., Белевская Р. Г. // Роль миелопептидов в ней-роиммунном взаимодействии. // IV Всесоюзный симпозиум: Нейрогумо-ральная регуляция иммунного гомеостаза, тезисы докладов, Суздаль, 1986, 138-139.

7. Zakharova L.А., Mikhailova A.A., Belyovskaya R.G.// Interrelations of antibody stimulating and opiatelike activities of myelopeptides.// Second International Workshop on-lie uro i nrainomodu 1 at i on, Scientific programme and abstracts, Dubrovnik, 1986, 156.

8. Захарова JL A., Михайлова A. A., Белевская P. Г. 11 Влияние опиоидных пептидов костного мозга на антителообразование в про-ч дуктивную фазу иммунного ответа // Вюлл. экспер. биол. и мед., ' 1988, HI, 50-53.

9. Василенко A.M., Белевская Р.Г.// Влияние опиоидных пептидов на иммунный ответ. //"Проблемы нейрогормональной и метаболической регуляции иммунной системы в клинике", Межвузовский сборник научных трудов п/р Вогралика Ü В., Горький, 1988, 44-48.

10. Катлинский А. В., Сорокин С. Е , Белевская Р. Г., Шанин С. С. // Структурная характеристика иммунорегуляторных пептидов: взаимосвязь структуры и функции.// Итоги науки и техники, ВИНИТИ, 1988, 26, 6-9.

И. Захарова Л А., Яновский 0. Г., Белевская Р. Г.//Влияние опиоидных пептидов костного мозга на антигелогенез и болевую чувствительность. // Тезисы V Всесоюзного симпозиума "Взаимодействие нервной и иммунной систем", Оренбург, 1990, 93. •

12. Zakharova L. А., Belyovskaya R.B., Yanovskiy О.й // Panticipation by opioids in the irounostinflatory activity of myelopeptides.// Biwed. Sei nee, N 1, 1930,. 139-1«

участок июнитсльной'гехники OHU paim ■ поет, к ПЕЧАТИИ95»АК. 3 ГНР«/ООЗК1.