Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Эффекты различных фракций миелопида на рецепторную и пролиферативную активность лимфоцитов при онкологической и иммуноопосредованной патологии in vitro

На правах рукописи

АНТОНОВА Елена Алексеевна

ЭФФЕКТЫ РАЗЛИЧНЫХ ФРАКЦИЙ МИЕЛОНИДА НА РЕЦЕПТОРНУЮ И ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКОЙ и ИММУНООПОСРЕДОВАННОЙ ПАТОЛОГИИ IN VITRO

14.00.14 - онкология

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3474322

Ростов-на-Дону 2009

003474322

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ГОУ ВПО «РОСТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ» (ректор университета - доктор медицинских наук, профессор A.A. Сависько)

Научный руководитель: - доктор медицинских наук

профессор Л.П. Сизякина

Официальные оппоненты: - доктор медицинских наук

профессор ЕЛО. Златник

- доктор медицинских наук профессор Ю.В. Шатохин

Ведущая организация: Волгоградский государственный

медицинский университет

Защита диссертации состоится «-/¿Эъ У// 2009г. в Sчасов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.083.01 при Федеральном государственном учреждении «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Росмедтехнологий» (344037, г. Ростов-на-Дону, 14-линия, 63).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Росмедтехнологий».

Автореферат разослан:« SP » ^^ 2009г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций член-корреспондент РАМН, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Основные системы, ответственные за поддержание гомеостаза имеют единый механизм химической регуляции. Именно наличие универсального химического языка объединяет системы, управляющие жизнедеятельностью организма - нервную, эндокринную и иммунную - в единый механизм регуляции функций. Ключевым звеном данного механизма являются продукция и секреция клеточных медиаторов, объединенных общим названием регуляторные пептиды (Кветной И.М., Хавинсон В.Х., 2001; Морозов С.Ю., 2008). Для регуляторных пептидов характерны высокая эффективность в малых дозах, быстрота воздействия и полифункциональность (Ковалева C.B., 2005). Большое внимание уделяется иммунологически активным пептидам, участвующим в контроле и согласовании функций клеточных популяций на разных уровнях иммунного ответа. Особый интерес в этом отношении представляют низкомолекулярные эндогенные пептиды - миелопетиды (МП), источником которых является костный мозг. С помощью этих медиаторов реализуется регуля-торное влияние костного мозга на функциональную активность В-лимфоцитов, ответственных за антителообразование. Одной из обнаруженных биологических активностей МП явилась способность стимулировать продукцию антител на пике иммунного ответа (Михайлова A.A., 2001; Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2005).

В основе механизма реализации их иммунокорригирующих эффектов лежит общебиологический принцип - лиганд-рецепторные взаимодействия, обеспечивающие направленное и своевременное включение функций определенных типов иммунокомпетентных клеток за счет экспрессии на их поверхности специфических рецепторов к соответствующей иммунорегуляторной молекуле (Михайлова A.A., 2005). Это положение определяет одно из важнейших свойств эндогенных иммуномодуляторов: они направленно воздействуют на поврежденные звенья иммунной системы или кроветворения, реализуя свои корригирующие эффекты (Mikhailova A.A., Fonina L., Kirilina E.A., 2003).

Современная патология характеризуется ростом заболеваний, связанных с вторичной иммунологической недостаточностью. Известно, что рост опухолей сопровождается значительными иммунными нарушениями, главным среди которых является снижение функции Т-звена иммунной системы. Один из регу-ляторных пептидов -МП-2- обладает эффектом торможения роста опухолей, что обусловлено его способностью восстанавливать функциональную активность Т-лимфоцитов, подавленную продуктами опухолевых клеток (Михайлова A.A., 2006). Иммунорегуляторное действие МП-2 проявляется при наличии значимой иммуносупрессии, возникающей в организме опухоленосителя под влиянием опухоли (Петров Р.В., 2005). В настоящее время описаны корригирующие эффекты МП-1 и МП-3 при различных иммунодефицитных состояниях (ИДС), биологические активности которых реализуются за счет способности отдельных пептидных фракций направленно влиять на различные звенья иммуногенеза через взаимодействие с отдельными клеточными субпопуляциями (Гейн C.B., 2008).

Однако, детализация мишеней их действия, возможные эффекты на процессы распознавания, дифференцировки, пролиферации и эффекторную функцию иммунокомпетентных клеток остаются дискутабельными при различных иммуноопосредованных заболеваниях, таких как онкопатология, аутоиммунные заболевания, приобретенные иммунодефицитные состояния, среди которых вирусные инфекции, в частности ВИЧ- инфекция. Расшифровка интимных механизмов действия МП поможет уточнить показания к использованию данных препаратов в тех или иных случаях.

Цель работы. Целью настоящего исследования явилась оценка характера влияния отдельных фракций миелопида in vitro на свойства лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние миелопептидов (МП-1, МП-2, МП-3) in vitro на рецеп-торный аппарат иммунокомпетентных клеток больных раком молочной желе-

зы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

2. Исследовать влияние миелопептидов (МП-1, МП-2, МП-3) in vitro на продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

3. Изучить влияние миелопептидов (МП-1, МП-2, МП-3) in vitro на функциональную активность Т-лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

4. Определить возможные области клинического применения миелопептидов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В основе иммунокорригирующего эффекта миелопептидов лежит способность повышать in vitro спонтанную экспрессию а-цепи рецептора интер-лейкина-2 у больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

2. Миелопептиды обладают способностью in vitro стимулировать процессы пролиферации иммунокомпетентных клеток больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

Научная новизна работы

1. В работе впервые изучены механизмы действия миелопептидов (МП-1, МП-2, МП-3) in vitro на свойства лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

2. Установлено, что миелопептиды повышают in vitro спонтанную экспрессию а-цепи рецептора интерлейкина-2 у больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

3. Показано, что миелопептид-2 обладает in vitro выраженным стимулирующим действием на рецепторный аппарат и процессы пролиферации имму-нокомпетентных клеток больных раком молочной железы.

4. Миелопептид-3 обладает in vitro выраженным стимулирующим действием на рецепторный аппарат и процессы пролиферации иммунокомпетентных клеток больных с вторичными иммунодефицитными состояниями.

Научно-практическая значимость работы

Выполненная работа расширяет современные знания о биологических механизмах иммуномодулирующих эффектов миелопептидов. Проведенные исследования показывают, что миелопептиды оказывают корригирующий эффект на различные звенья иммунной системы в зависимости от индивидуального механизма действия. Выполненная работа позволила оценить области применения различных фракций миелопида.

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась 15 мая 2009г. на заседании кафедры «Клинической иммунологии и аллергологии» ФПК и ППС ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет министерства здравоохранения и социального развития» (протокол №5).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследова-

ния, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 97 источников, из них 90 отечественных и 7 зарубежных. Работа содержит 30 таблиц и 46 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика материала и методов исследования

Настоящая работа проводилась в 3 этапа и основывалась на результатах клинико-иммунологических наблюдений 210 пациентов, страдающих иммунопатологическими состояниями различного генеза, находящихся на лечении в ГОУЗ «Онкологический диспансер» г. Ростов-на-Дону, в ГУЗ «ЦПБ со СПИДом и ИЗ» в РО, детской клиники Ростовского государственного медицинского университета. Первую группу наблюдения составили 60 первичных больных раком молочной железы (РМЖ) в возрасте от 44 до 49 лет в стадии Па до проведения хирургического вмешательства и химиотерапии.

Вторую группу составили 110 больных ВИЧ-инфекцией в возрасте от 37 до 42 лет. Клиническая диагностика, определение стадий ВИЧ-инфекции проводились по классификации В.И. Покровского (1989), в соответствии с которой все обследуемые пациенты были разделены на 2 подгруппы. Первую подгруппу составили 42 человек, находящихся в стадии Нв. Клинической манифестацией у этих больных явилась персистирующая лимфоаденопатия, гепато- и сплено-мегалия. Во вторую подгруппу включили 68 человек, находящихся в стадии Illa. Клинически эти больные характеризовались поверхностными бактериальными, грибковыми, вирусными поражениями кожи и слизистых, гепато- и спленомегалией, рецидивирующими фарингитами, синуситами, отитами, частыми ОРВИ.

Третью группу наблюдения составили 40 человек, болеюшцх частыми респираторными заболеваниями (не менее 5-10 эпизодов ОРВИ в год) в возрасте от 9 до 12 лет, находящиеся в периоде ремиссии. В данную группу подбирались дети, страдающие рецидивирующими респираторными заболеваниями, протекающими преимущественно в виде рино-фарингигов, тонзиллитов и бронхитов. У всех детей наблюдалось увеличение лимфашче-

ских узлов в семи группах: передав- и заане-шейные, подчелюстные, затылочные, подмышечные, над- и подключичные, паховые и подбородочные.

Пептиды МП-1, МП-2, и МП-3 были любезно предоставлены профессором Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина (Москва) A.A. Михайловой.

Для решения поставленных задач были использованы современные адекватные методы исследования, позволяющие наиболее полно раскрыть роль влияния отдельных фракций миелопида in vitro на свойства лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными НДС.

Оценку параметров иммунного статуса проводили согласно патогенетической концепции, разработанной А.Н. Чередеевым и JI.B. Ковальчуком (1999г.).

Мононуклеарные клетки (МНК) получали из гегаринизированной крови (5 ME/мл), взятой натощак путем локтевой венепункции. Лимфоциты выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин. Определение содержания СОЗ+-лимфоцитов, включая их основные регуляторные субпопуляции (CD4+, CD8+ -лимфоциты), CD20+, CD 16+, CD25+, CD45 RA+ проводили с помощью реакции непрямой имму-нофлюоресценции на проточном лазерном цитофлюориметре EPICS-XL фирмы «Coulter» с использованием мышиных моноклональных антител предоставленных фирмой МП "Сорбент" института иммунологии МЗ России, по методу Филатова A.B. с соавт. (1990).

Определение циркулирующих иммунных комплексов (Гриневич Ю.А. с соавт., 1981) проводили методом селективной преципитации в 4.16% ПЭГ 6000. Интегральную кислородзависимую микробицидность нейтрофилов оценивали в спонтанном и стимулированном НСТ-тесте с учетом адаптационных резервов нейтрофилов (Меньшиков В.В., 1991).

Уровни сывороточных иммуноглобулинов А, М, G определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле (Manchini et al., 1965) с помощью моноспецифических сывороток, изготовленных в НИИВС им. И.И. Мечникова.

Функциональную активность Т-лимфоцитов определяли в РБТЛ по общепринятой методике Strong et. al. (1973), Woody et. al. (1975). Оценивали влияние на пролиферативную активность лимфоцитов при индивидуальном применении МП-1, МП-2, МП-3 (Шмкг), ФГА в концентрации 20мкг\мл, а также совместном применении МП-1, МП-2, МП-3 (10 мкг) в сочетании с ФГА (2,5 мкг\мл).

После культивирования пробы центрифугировали, надосадочную жидкость сливали, клетки ресуспецдировали и методом проточной цитофлюометрии («Coulter» EPICS-XL, США) оценивали влияние МП на содержание CD3+, CD4+, CD8+, CD25+, CD45RA+ с использованием моноклональных антител АО «Сорбент». Содержание ИЛ-2, ИЛ-4, ИНФ-у в супфшгаше 24-часовой ^льтуры лимфоцитов определяли методом твердофазного ИФА при помощи диагностических наборов НПО «Век-тор-Бесг» (Новосибирск).

Обработка результатов исследования проведена общепринятым методом с определением средних арифметических (М) и относительных величин, ошибки средней (ш). Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием непараметрических критериев (Манн-Уитни, Вилкоксона) при помощи пакета прикладных программ Statistika.

Результаты и их обсуждение

При анализе содержания субпопуляций лимфоцитов больных РМЖ выявлены достоверные изменения (при р<0,05) в содержании CD3+ (59,7±2,2%); CD4+(35,4±3,5%); CD8+(20,1±2,1%); CD16+ (16,8±2,8%); CD25+(1,0±0,1%); CD45RA+(57,6±1,4%); CD20+(11,2±2,5%) по сравнению с показателями в группе здоровых доноров - CD3+(68,1±2,3%); CD4+(45,4±2,6%); CD8+(17,2±1,8%); CD16+(11,6±1,2%); CD25+(0,8±0,03%); CD45RA+ (63,6±2,4%); CD20+(18,3±4,5%). При оценке гуморального звена иммунной системы у больных РМЖ определяется незначительная гиперглобулинемия статистически достоверная для Ig А (РМЖ - 1,8±0,1 г/л; доноры - 1,1±0,2 г/л) р<0,05, и недостоверной для Ig G (РМЖ - 10,9±0,2г/л; доноры - 9,9±0,2 г/л) и Ig М (РМЖ - 1,3±0,2 г/л; доноры - 0,95±0,1г/л). При этом выявлено достоверное повышение уровня ЦИК по сравнению с показателями группы сравнения

(РМЖ - 125,0±9 у.е.; доноры - 68,0±6 у.е.) р<0,05. Анализ показателей фагоцитарного звена больных РМЖ выявил достоверное снижение адаптационных резервов нейтрофилов по сравнению с донорскими показателями (РМЖ - ко-эфф. стим. -1,5±0,09 у.е.; доноры -1,9±0,2 у.е) р<0,05.

При оценке влияния МП in vitro на экспрессию рецепторов лимфоцитами больных раком молочной железы установлено, что наиболее стимулирующий эффект действия зарегистрирован при использовании МП-2 (рис.1).

□ РМЖ спонт И РМЖ стимул. МП-1

□ РМЖ стимул. МП-2 ■ РМЖ стимул. МП-3

%

*

0-1-1-1-1-1-1-1

GD3 CD4 CD8 CD25 CD45RA ИРИ субпопуляции

Рис.1. Влияние миелопептидов in vitro на количество иммунокомпетентных клеток больных

раком молочной железы. * - достоверность различия между показателями спонтанного и стимулированного

МП культивирования лимфоцитов больных раком молочной железы (р<0,05). Так, количество зрелых Т-лимфоцитов не претерпело существенных изменений под воздействием МП-1 и МП-3 in vitro (CD3+ спотт«ж - 39,7±3,7%; CD3+Mn-i - 43,0±3,5; СОЗ+щм - 47,0±2,3%; CD3+Mn-3 - 41,8±6,0%) р<0,05. Добавление МП-2 в культуру лимфоцитов больных РМЖ достоверно увеличивало количество наивных клеток, экспрессирующих СВ45ЯА-рецептор (CD45+RA спонтанное - 48,8±3,9%; CD45RA+Mn., - 53,8±5,7; CD45RA+Mn-2 -57,2±4,0%; CD45RA+Mn-3 - 52,2±3,7%) р<0,05. Содержание С04+-лимфоцитов

при применении МП in vitro увеличивалось (CD4+ спонтанное - 18,8±2,3%; CD4+MU.] - 22,7±4,0; CD4+Mn-2 - 27,5±2,9%; CD4+Mn-3 - 23,5±1,9%). Применение МП-2 in vitro повышало количество клеток, экспрессирующих CD8-рецептор (CD8+ тотанте - 12,1±2,2%; CD8+ щ,., - 12,9±3,2; CD8+Mn-2 -15,2±1,8%; CD8+Mn-3 - 14,5±3,0%). Изменение соотношения основных имму-норегуляторных субпопуляций под влиянием МП-2 повлекло за собой изменение иммунорегуляторного индекса (ИРИ „от-анное - 1,5±0,1; ИРИМП-1 - 1,6±0,1; ИРИмп-2 - 1,7±0,1; ИРИМП-з - 1,6±0,1). Зарегистрирован стимулирующий эффект применения всех исследованных МП in vitro на содержание лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации CD25+ (CD25+ спонтанное 1,2±0,4%; CD25+Mn.i - 1,5±0,3%; CD25+Mn.2 - 3,1±0,8%; С025+мп-з - 1,7±0,3%).

Установлено, что максимально выраженные изменения процессов пролиферации иммунокомпетентных клеток больных РМЖ зарегистрированы как при индивидуальном использовании МП-2, так и в сочетании с ФГА (ИС мп-i -1,2±0,06; ИС мп-2 - 1,4±0,05; ИС мп-з - 1,2±0,06; ИС мп-нфга - Ю,5±2,0; ИС Мп-2+ФГА - 14,6±2,6 ; ИС мп-з+фга - 7,0±2,1 ; ИС ФГА2,5мкг/МЛ - 11,0±2,2; ИС ФГА2оМКГ/МЛ - 36,3±18,5).

□ спонт. МП-1 МП-2

имп-з

ИЛ-2

ИЛ-4

ИНФ-у

цитокины

Рис. 2. Влияние миелопептидов in vitro на продукцию ИЛ-2, ИЛ-4, ИНФ-у лимфоцитами больных раком молочной железы. * - достоверность различия между показателями спонтанного и стимулированного МП культивирования лимфоцитов больных раком молочной железы (р<0,05).

Влияние МП на продукцию цитокинов МНПК периферической крови больных РМЖ представлено на рис. 2. Внесение в культуры МП не оказывало влияния на продукцию ИЛ-4 лимфоцитами больных РМЖ. При этом отмечается повышение синтеза ИЛ-2 при добавлении в культуру клеток всех МП (спонт. - 2,6±0,9 пг/л; МП-1 - 4,2±1,2 пг/л; МП-2 - 6,5±1,5 пг/л; МП-3 - 3,3±0,7 пг/л) и ИНФ-у (спонт. - 7,8±0,5 пг/л; МП-1 - 39,8±1,7 пг/л; МП-2 - 52,9±1,2пг/л; МП-3 - 38,8±0,9 пг/л), но наиболее стимулирующим эффектом обладает МП-2.

Использование ФГА в различных концентрациях достоверно увеличивало продукцию ИЛ-2 (спонт. - 2,6±0,9 пкг/л; ФГА 20 мкг/мл - 267,6±28,7 пг/л; ФГА 2,5мкг/мл - 14,8±1,3 пг/л), ИЛ-4 (спонт. - 2,9±0,4 пг/л; ФГА 20 мкг/мл -69,6±8,1 пг/л; ФГА 2,5мкг/мл - 9,2±0,6 пг/л) и ИНФ-у лимфоцитами больных РМЖ (спонт. - 7,8±0,5пг/л; ФГА 20 мкг/мл - 1275,9±21,2 пг/л; ФГА 2,5мкг/мл -135,6±2,5пг/л).

Таким образом, совокупность представленных данных свидетельствует о способности МП-2 in vitro стимулировать процессы пролиферации, диффе-ренцировки и ранней активации Т-лимфоцитов больных раком молочной железы, а также интенсифицировать продукцию ИЛ-2 и ИНФ-у, что свидетельствует о стимуляции МП-2 Т-хелперов 1-го типа.

В связи с этим интерес представило проанализировать влияние МП in vitro на свойства лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией, характеризующейся дисфункцией иммунной системы по клеточному типу.

Анализ содержания популяций лимфоцитов ВИЧ-инфицированных выявил достоверное снижение содержания СОЗ-лимфоцитов на разных стадиях инфекционного процесса (ГЛАП - 62±1,2%,; пре-СПИД - 48,5±2,0%; доноры -68,1±2,3%). При этом субпопуляционным изменениям в клеточном звене, проявляющимся уже в стадии ГЛАП в виде достоверного снижения С04-клеток с дальнейшим снижением в стадии пре-СПИД (ГЛАП - 36,4±1,5%; пре-СПИД -14,4±1,6%; доноры - 45,4±2,6%) сопутствует увеличение количества CD8-лимфоцитов (ГЛАП - 25,1±2,1%; пре-СПИД - 34,0±3,0%; доноры -17,2±1,8 %), что приводит к существенному изменению ИРИ (доноры - 2,6±0,3; ГЛАП -

1,4±0,5; пре-СПИД - 0,8±0,05;). В динамике содержания клеток, обладающих киллерной активностью, были отмечены изменения, выражающиеся в увеличении содержания СО 16+-лимфоцитов по мере утяжеления инфекционного процесса (доноры -11,6±1,2%; ГЛАП -16,8±2,8%; пре-СПИД - 20,0±2,0 %).

Установлено, что в стадии ГЛАП количество С045ЯА+ существенно не отличалось от донорских показателей, однако в стадии пре-СПИД их количество уменьшалось (ГЛАП - 57,2±1,1%; пре-СПИД - 50,2±1,5 %; доноры -63,6±2,4%).

Спонтанная активность окислительно-восстановительных процессов в моноцитах ВИЧ-инфицированных, определенная с помощью НСТ-теста, снижалась с развитием заболевания (ГЛАП -1,6±0,08; пре-СПИД -1,4±0,06; доноры - 1,9±0,2). Было установлено выраженное снижение содержания С020+-лимфоцитов уже в стадии ГЛАП (ГЛАП - 16,2±1,7%; пре-СПИД - 15,3±1,9%; доноры - 18,3±4,5%). Содержание иммуноглобулинов всех классов повышалось уже в стадии ГЛАП с последующим увеличением в стадии пре-СПИД (доноры ^ А - 1,1±0,2г/л; 1ц С - 9,9±0,2г/л; ^ М - 0,95±0,1 г/л; ГЛАП ^ А -1,4±0,1 г/л; в - 12,8±0,2 г/л; М -1,4±0,2 г/л; пре-СПИД ^ А - 1,7±0,1 г/л; 1£ в -16,4±0,2 г/л; М -1,6±0,2 г/л). Аналогичная закономерность прослеживается и в отношении содержания ЦИК, которое было повышено в стадии ГЛАП с последующим нарастанием в стадии пре-СПИД (доноры - 68±6 у.е.; ГЛАП -146±12 у.е.; пре-СПИД - 280±22 у.е.).

При оценке влияния действия миелопептидов на экспрессию рецепторов иммунокомпетентными клетками больных ВИЧ-инфекцией как в стадии ГЛАП (рис.3) (СЭЗ+ спонганное - 63,1±2,8%; СОЗщы - 67,4±2,5%; СЭЗ+мп-г -64,5±1,8%; СОЗ+Мп-з - 68,0±1,8 %), так и в стадии пре-СПИД выявлено повышение содержания количества зрелых клеток, экспрессирующих СБЗ+ Т-лимфоцитов при использовании МП-1 и МП-3(С03+ СПОнтанное - 59,1±3,4%; СОЗмп-1 - 66,0±3,5; СОЗ+мп.2 - 62,5±2,8%; СОЗ+Мп-з - 69,6±2,5%). При добавлении МП в культуры клеток больных ВИЧ-инфекцией в стадии ГЛАП (С045ЯА+ спонтанное - 64,4±2,8 %; СО 45ЯАМП., - 68,8±3,4%; С045ЯА+М11.2 -

65,7±2,4 %; CD45RA+ мп-з " 66,8±1,3 %), а также в стадии пре-СПИД (CD45RA+cnoHTaH„oe - 54,9±3,2%; CD 45RA +МП-1 - 55,8±5,7%; CD45RA+Mn-2 -56,4±2,7%; CD45RA+Mn-3 - 59,6±3,7%) отмечается тенденция к повышению содержания количества «наивных» Т-лимфоцитов.

Содержание С04+-лимфоцитов больных в стадии ГЛАП (CD4+ cnOTrra„„0e -31,2±1,2%; CD4+Mn-i - 36,2±4,0%; CD4+Mn-2 - 32,4±3,0%; CD4+Mn-3 -36,6±2,1%) и стадии пре-СПИД достоверно повышалось при применении МП-1 и МП-3 (CD4+ сшитатюс - 21±1,3%; CD4+ мп., - 31,0±5,0%; CD4+Mn-2 -36,2±2,1%; CD4+Mn.3 - 32,0±3,0%). Совместное культивирование с МП-1, МП-3 приводило к достоверному увеличению содержания С08+-лимфоцитов, при этом наиболее стимулирующим действием на данную субпопуляцию иммуно-компетентных клеток больных в стадии ГЛАП обладает МП-3 (CD8+cnoln.aHHoe -26,4±1,8%; CD8+Mn., - 28,6±2,2%; CD8+Mn.2 - 26,8±2,6%; CD8+Mn-3 -29,4±2,3%), в стадии пре-СПИД МП-1 (CD8+cn0HTaHH0e - 28,6±2,8 %; CD8+MIM -45,0±2,5%; CD8+Mn-2 - 34,1±,5%; CD8+Mn-3 - 41,0±,5%). При действии МП in vitro в стадии ГЛАП прослеживается отчетливая тенденция к увеличению количества клеток, экспрессирующих маркер ранней активации CD25+ (CD25+cn0irraHHoe - 1,0±0,2%; CD25+Mn-i - 1,2±0,1%; CD25+Mn-2 - U±0,1 %; CD25+Mn-3 - 1,3±0,1%), в стадии пре-СПИД изменение содержания CD25+-лимфоцитов носило достоверный характер (С025+споетакное - 0,7±0,3%; CD25+Mn-i -1,4±0,2%; CD25+Mn-2 -1,2±0,2 %; CD25+Mn.3 -1,7±0,2%).

Установленные особенности влияния МП на экспрессию рецепторов сопровождались изменениями продукции цитокинов лимфоцитами больных ВИЧ-инфекцией (рис.3 А). Установлено, что МП-1 и МП-3 обладают способностью повышать синтез ИЛ-2 лимфоцитами больных ВИЧ-инфекцией на разных стадиях инфекционного процесса, однако стимулирующий эффект был более выражен при использовании МП-3. Секреция ИНФ-у, являющегося синергистом ИЛ-2, у пациентов с ВИЧ-инфекцией под воздействием всех МП достоверно повышалась, однако наиболее активным в этом отношении оказался МП-1 как в стадии ГЛАП, так и в стадии пре-СПИД (рис. 3 Б). Следует подчеркнуть, что

при использовании МП in vitro не зарегистрированы изменения продукции ИЛ-4 МНПК ВИЧ-инфицированных на разных стадиях инфекционного процесса

(рис.3 В).

□ спонт. ИМП-1 ■ МП-2

амп-з

ГЛАП

Пре-СПИД

Рис.

.3. Влияние миелопептидов in vitro на продукцию ИЛ-2, ИЛ-4, ИНФ-у лимфоцитами больных ВИЧ-инфекцией в стадии ГЛАП и пре-СПИД. достоверность различия между показателями спонтанного и стимулированного МП культивирования лимфоцитов ВИЧ-инфекцией (р<0,05).

Применение ФГА в различных концентрациях значительно стимулировало синтез цитокинов лимфоцитами больных ВИЧ-инфекцией в динамике инфекционного процесса (табл. 1).

Таблица 1

Влияние ФГА на продукцию цитокинов лимфоцитами больных _ВИЧ-инфекцией_

ГЛАП пре-СПИД

Е Ж 8 к Э" споет. ФГА (2,5 мкг\чл) ФГА (20 мкг\мл) спонт. ФГА (2,5 мкгЧп) ФГА (20ми*мл)

ИЛ-2 5,8±0,9 28,5±3,2* 348,5±18,4* 2,6±0,7 34,6±14,1** 124,8±12,8**

ИЛ-4 26,4±2,4 47,4±5,8* 480,5±22,1* 21,5±1,1 73,5±2,6** 417,2±28,4**

ИНФу 118,0±25,1 212,6±9,4* 1931,5±297, 5* 132,3±30, 2 187,6±17,4* * 1301,4±349,8 **

Условные обозначения:

* - достоверность различия между показателями спонтанного и стимулированного ФГА культивирования лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией в стадии ГЛАП (р<0,05).

** - достоверность различия между показателями спонтанного и стимулированного ФГА культивирования лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией в стадии пре-СПИД (р<0,05).

Установлено, что как в стадии ГЛАП (ИС Мп-1 - 1,6±0,05; ИС МП-2 -1,4±0,04; ИС мп-э - 1,8±0,2), так и в стадии пре-СПИД ( ИС М1Ы - 1,5±0,07; ИС мп-2 - 1,4±0,07; ИС мп-з - 2,0±0,05) под воздействием МП увеличивается спонтанная и ФГА-стимулированная пролиферативная активность лимфоцитов (табл. 2).

Таблица 2

Влияние МП в сочетании с ФГА на пролиферативный ответ лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией

н спонт. МП- МП- МП- ФГА(2,5) ФГАГ20)

1+ФГА 2+ФГА 3+ФГА ИС ИС

2 ИС ИС ИС

188,7±15,2 975.8±19.2* 5,2±0,3 878.8±14.5* 4,6±0,3 896.8±9.3* 4,7±0,7 865.3± 46.1* 4,5±1,4* 10057.7±543,2 53,3±8,3

пре- 132,0±18,0 888.5±21.6** 537.8±46.2** 657.6±15.6** 578.3± 56.4** 3009.6±78.4**

6,7±0,2 4,1±0,5 4,9±0,2 4,3±2,8 22,8±2,6

Условные обозначения:

* - достоверность различия между показателями спонтанного и стимулированного ФГА культивирования лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией в стадии ГЛАП (р<0,05).

** - достоверность различия между показателями спонтанного и стимулированного ФГА культивирования лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией в стадии пре-СПИД (р<0,05).

С учетом полученных результатов, очевидно, что выраженным действием на экспрессию рецепторов, процессов активации и пролиферации иммуноком-петентных клеток при ВИЧ-инфекции из всех изученных миелопептидов обладают МП-1 и МП-3. При этом регистируется способность МП-1 и МП-3 in vitro стимулировать синтез ИЛ-2 и ИНФ-у лимфоцитами как в стадии ГЛАП, так и в стадии пре-СПИД.

Значительная распространенность респираторно-вирусных инфекций, обладающих склонностью к рецидивированию и затяжному характеру течения, у часто болеющих детей (ЧБД) обусловлена формированием вторичной иммунологической недостаточности. Интерес представило оценить влияние МП in vitro на свойства лимфоцитов ЧБД.

При изучении субпопуляционного состава лимфоцитов у ЧБД существенных изменений в содержании С03+(цоноры-60,1±3,4%; ЧБД-59,1±2,3%) не выявлено. При этом документирована существенная реакция содержания С04+-лимфоцитов (доноры - 42,6±4,3%; ЧБД - 32,9±1,6%) и повышение содержания С08-ь-лимфощггов (доноры -16,2±2,8%; ЧБД - 23,5±1,5%) р<0,05. Иммунорегушпорный индекс оказался достоверно сниженным, что характерно для формирования вторичной иммунологической недостаточности по клеточному типу (доноры - 2,6±0,4; ЧБД -1,4±0,5) Следует отметить достоверное увеличение содержания CD 16+-лимфоцитов у ЧБД (доноры-12,5±1,4%; ЧБД -18,9±3,01%) при отсутствии значительных изменений в содержании С056+-лимфоцитов (доноры - 27,4±2,3%; ЧБД - 24,8±2,01 %). Обнаружено досто-

верное снижение количества «наивных» лимфоцитов CD45RA+ (доноры -62,5±3,2%; ЧБД- 50,4±3,5%) р<0,05. Содержание количества лимфоцитов, экс-прессирующих маркер ранней активации CD25+ не претерпевало существенных изменений (доноры-0,9±0,2%;ЧБД-0,8±0,1%). Содержа! ше CD 20+-лимфощггов у часто болеющих детей существенно не отличалось от физиологических показателей (доноры -17,3±4,0%; ЧБД -18,3±2,0%). Не обнаружено также существенных различий в содержании иммуноглобулинов трех основных классов Ig А (доноры -1,15±0,09 г/л; ЧБД -1,2±0,8 г/л), Ig М (доноры -1,04±0,05 г/л ; ЧБД -1,2±0,2 г/л) и Ig G (доноры - 9,4±0,4 г/л; ЧБД-10,3±2,0 г/л). Выявлено достоверное повышение уровня ЦИК (доноры - 65±5,0 у.е.; ЧБД - 83±12,0 у.е.). Состояние фагоцитарного звена характеризовалось достоверным снижением адаптационных резервов нейгрофипов в НСТ-тесге (доноры - коэфф. стим -2,0±0,15 у.е. ;ЧБД-козфф. стим - 1,5±0,05 у.е.)р<0,05.

При исследовании эффектов действия МП in vitro на рецепторную функцию иммунокомпетентных клеток ЧБД установлено, что наиболее стимулирующими свойствами в отношении данной нозологии обладает МП-3. Так, содержание зрелых Т-лимфоцитов достоверно увеличивалось при добавлении МП-3 в культуру клеток ЧБД (CD3+cno„TailHoe - 65,5±3,0 %; CD3+Mn-i - 61,8±3,0; CD3+Mn-2 - 61,2±2,0 %; CD3+Mn-3 - 70,0±2,0%) р<0,05. Установлена тенденция к увеличению содержания СЭ4511А+-лимфоцитов под воздействием МП-3 (CD45RA+ спо,па111ЮС - 78,3±1,7%; CD45RA+Mn-i - 76,6±1,5; CD45RA+Mn.2 -76,7±1,7%; CD45RA+Mn.3 - 80,2±1,2%). При применении МП-3 среди зрелых Т-лимфоцитов отмечается перераспределение субпопуляционного состава, выражающееся в достоверном увеличении содержания С04+-лимфоцитов (CD4+cnOHTaHHOe - 36,2±1,3%; CD4+Mn-i - 39,0±1,2%; CD4+ мп-2 -CD4+Mn-3 - 43,0±2,0%) и С08+-клеток (CD8+ c,ralrraimoe - 25,1±1,4%; CD8+Mn-i -25,8±1,2%; CD8+Mn-2 - 25,4+1,2%; CD8+Mn.3 - 28,4 ±1,0%). В результате такого распределения отмечается отчетливая тенденция к нормализации иммунорегу-ляторного индекса (ИРИсп0нта„„0е. - 1,4±0,2; ИРИМП_, - 1,3±0,1; ИРИМП-2 -1,2±0,1; ИРИмп-з - 1,6±0,3). Применение всех исследованных МП приводило к

увеличению содержания С025+-лимфоцитов (С025+СПОнтанное - 1,5±0,3%; СЭ25+МП.1 - 2,6±0,3; СВ25+МП.2 - 2,4±0,3 %; СЭ25+мп-з - 2,7±0,4%). р<0,05

Добавление МП в культуру лимфоцитов ЧБД (рис. 4) не приводит к изменению синтеза ИЛ-4 (спонт. - 44,4±1,1пкг/л; МП-1 - 45,4±1,5пкг/л; МП-2 - 43,0±2,6 пкг/л; МП-3 - 47,5±2,1 пкг/л). При этом применение МП-3 существенно интенсифицирует процессы ранней активации и экспрессии рецепторов к итерлейкину 2 лимфоцитами часто болеющих детей (спонт. - 14,1±0,7пкг/л; МП-1 - 53,2±2,9пкг/л; МП-2 -14,9±0,8пкг/л; МП-3 - 69,8±2,1 пкг/л) и продукцию ИНФ-у (спонт. -24,2± 1,1 пкг/л; МП-1 - 70,5±2,4 пкг/л; МП-2 - 25,1±0,9пкг/л; МП-3 - 83,2±2,6 пкг/л).

пг/мл

ИЛ-2 ИЛ-4 ИНФ-у

Рнс.4. Влияние миелопептидов in vitro на продукцию ИЛ-2, ИЛ-4, ИНФ-у лимфоцитами часто болеющих детей.

* - достоверность различия между показателями спонтанного и стимулированного миело-пептидами культивирования лимфоцитов часто болеющих детей (р<0,05).

Вышеописанные данные подтверждаются в РБТЛ и выражаются в увеличении пролифера-тшюй активности лимфоцитов как при индивидуальном использовании МП-3, так и в сочетании с ФГА (ИС мп-i - 0,9±0,07; ИС Мп-2 - 0,8±0,05; ИС мп.3 - 2,8±0,1; ИС МП-кфга - 64,3±3,4; ИС мп-2+фга - 51,6±7,2; ИС МП-з+ФГА - 79,4±5,5; ИС ФГА 2,5мкг/мл" 48,3±3,4; ИС фга го мЫ/ш, - 83,2±8,5).

Таким образом, при сравнительном анализе эффектов различных МП обращает на себя внимание их однонаправленное действие как на пролифератив-ный ответ, так и на продукцию ИЛ-2 и ИНФ-у, что предполагает наличие единого механизма действия этих регуляторных пептидов. При этом МП-2 более активен в отношении лимфоцитов больных РМЖ, МП-1 и МП-3 в отношении

лимфоцитов ВИЧ-инфицированных, эффекты МП-3 проявляются в большей степени при культивировании с лимфоцитами ЧБД. Вероятно корригирующие эффекты МП при реализации хелпер-индукторного дисбаланса, свойственного иммунодефицитным состояниям различного генеза, проявляются за счет селективного связывания данных медиаторов со специфическими рецепторами на субпопуляциях Т-клеток, что приводит к нормализации соотношения основных иммунорегуляторных субпопуляций.

ВЫВОДЫ

1. Миелопептид-2 существенно интенсифицирует процессы дифференци-ровки (CD3+ спонтанное - 39,7±3,7%; CD3+Mn-2 - 47,0±2,3°/о), ранней активации Т-лимфоцитов больных раком молочной железы (CD25+ СП01Гташюе - 1,2±0,4%;) CD25+Mn_2 - 3,1±0,8%), пролиферации иммунокомпетентных клеток (ИС Мп-2 -1,4±0,05), нормализуя при этом соотношение хелперно-индукторных (CD4+ спонтанное - 18,8±2,3%; CD4+Mn.2 - 27,5±2,9%;) и цитотоксических Т-клеток(С08+ CII0KTamrae - 12,1±2,2%; CD8+Mn-2 - 15,2±1,8%;) р<0,05.

2. Культивирование лимфоцитов больных раком молочной железы с мие-лопептидом-2 вызывает усиление синтеза интерлейкина-2 (спонт. - 2,6±0,9 пг/л; МП-2 - 6,5±1,5 пг/л) и интерферона-у (спонт. - 7,8±0,5 пг/л; МП-2 -52,9±1,2пг/л) р<0,05, что свидетельствует о стимуляции миелопептидом-2 Т-хелперов 1-го типа.

3. Наиболее выраженное действие на процессы дифференцировки (ГЛАП -CD3+ спонтанное - 63,1±2,8%; CD3Mn-i - 67,4±2,5%; CD3+Mn-2 - 64,5±1,8%; СОЗ+мп-з - 68,0±1,8 %; пре-СПИД - CD3+ Сп„нта„н„е - 59,1±3,4%; CD3Mn-i -66,0±3,5; CD3+Mn-2 - 62,5±2,8%; CD3+Mn-3 - 69,6±2,5%), активации (ГЛАП -CD25+cnOHTaHHOe - 1,0±0,2%; CD25+Mn-i - 1,2±0,1%; CD25+Mn.2 - 1,1±0,1 %; CD25+Mn-3 - 1,3±0,1%) и пролиферации иммунокомпетентных клеток (ГЛАП ИС мп-1 - 1,6±0,05; ИС МП-2 - 1,4±0,04; ИС Мп-з - 1,8±0,2; пре-СПИД ( ИС Мгы -1,5±0,07; ИС мп-2 - 1,4±0,07; ИС мп-з - 2,0±0,05) при ВИЧ-инфекции из всех

изученных миелопептидов оказывают миелопептид-1 и миелопептид-3 (р<0,05).

4. Действие миелопептид-3 in vitro способствует восстановлению соотношения иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов и нормализации баланса продукции про- и противовоспалительных цитокинов иммунокомпе-тентными клетками часто болеющих детей (ИЛ-2 - спонт. - 14,1±0,7пкг/л; МП-1 - 53,2±2,9пкг/л; МП-2 - 14,9±0,8пкг/л; МП-3 - 69,8±2,1пкг/л; ИНФ-у - спонт. -24,2±1,1пкг/л; МП-1 - 70,5±2,4 пкг/л; МП-2 - 25,1±0,9пкг/л; МП-3 - 83,2±2,6 пкг/л) (р<0,05).

5. Наиболее активным регуляторным действием на лимфоциты больных раком молочной железы обладает миелопептид-2, на лимфоциты часто болеющих детей МП-3, а миелопептид-1 и миелопептид-3 проявляют корригирующее влияние на лимфоциты больных ВИЧ-инфекцией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Обоснован дифференцированный подход к выбору различных миелопептидов для коррекции иммунного статуса при раке молочной железы и приобретенных иммунодефицитных состояниях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Антонова Е.А. (Тетерева Е.А.) Влияние МП-1 на пролиферативную активность лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных / Е.А.Тетерева, В.В. Плаван // Медицинская иммунология. - май-октябрь 2004 г.- Том 6, №3-5. - С.467.

2. Антонова Е.А. (Тетерева Е.А.) Влияние миелопептидов МП-1, МП-2, МП-3 на пролиферативный ответ лимфоцитов часто болеющих детей острыми респираторными инфекциями / Е.А.Тетерева, Е.А.Чумакова, В.В. Плаван // Аллергология и иммунология. - март 2005 г.- Том 6, №2. - С.195.

3. Антонова Е.А. (Тетерева Е.А.) Пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro у часто болеющих детей при добавлении МП-3. / Е.А.Тетерева, В.В. Плаван, Е.А. Чумакова // Медицинская иммунология. - май 2005г.- Том 7, №2-3. -С. 277.

4. Антонова Е.А. (Тетерева Е.А.) Эффект МП-3 на свойства лимфоцитов периферической крови in vitro у часто болеющих детей. / Е.А.Тетерева, Е.А.Чумакова, В.В. Плаван // Иммунология. - октябрь 2005г.- Том 5, № 3-4. - С. 187.

5. Антонова Е.А. Влияние миелопептидов на спонтанную экспрессию CD25 в культурах мононуклеарных клеток периферической крови у часто болеющих детей / (Материалы 61-ой итогорвой научной конференции молодых ученых). - апрель 2007 г. - С.40.

6. Антонова Е.А. Влияние миелопептидов на спонтанную экспрессию CD25 в культурах мононуклеарных клеток периферической крови у больных раком молочной железы - (Материалы 62-ой итогорвой научной конференции молодых ученых) - апрель 2008 г. - С.28.

7. Антонова Е.А. Влияние различных фракций миелопида in vitro на свойства лимфоцитов периферической крови у часто болеющих детей / Е.А.Антонова, А.А.Михайлова, Л.П. Сизякина // Иммунология. - май-июнь 2008г.-Том 29, № 3. - С. 172.

8. Антонова Е.А. Влияние миелопептида-2 in vitro на свойства лимфоцитов периферической крови у больных раком молочной железы / Е.А. Антонова // Цитокины и воспаление.- сентябрь 2008. - Том 7, № 3. - С. 34.

9. Антонова Е.А. Влияние миелопептида-2 in vitro на функциональную активность лимфоцитов у больных раком молочной железы / Е.А. Антонова // Российский аллергологический журнал июнь 2009г. Сборник трудов X Международного конгресса - №. 3 - выпуск 1. - С. 197.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 1311. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88

Актуальность темы исследования.

Современная патология характеризуется ростом заболеваний, связанных с вторичной иммунологической недостаточностью (Вельтищев Ю.Е., 1991). Изменяющиеся условия окружающей среды, к которым человек не успевает или не может адаптироваться приводят к ослаблению иммунного ответа и росту иммунозависимой патологии (Челова Л.В., 2008). Развивающаяся на фоне дисфункции иммунной системы вторичная иммунная недостаточность не только осложняет клиническое течение, но и ухудшает прогноз заболеваний (Лусс Л.В., 2000).

Иммуноопосредованные заболевания характеризуются разнообразием клинических форм: аутоиммунные процессы и хронические вирусные инфекции, лимфопролиферативная и онкопатологии. Между тем в основе этих, внешне не связанных заболеваний лежат нарушения функционирования иммунной системы. Дефекты на этапе созревания, дисфункция распознавания, инверсия соотношения пролиферация-апоптоз, цитокиновый дисбаланс, нарушение эффекторных функций клеток — далеко не полный перечень причин, определяющих развитие клинической картины. При этом в основе различных клинических форм могут быть общие и специфические механизмы развития, требующие коррекции (Андреева И.И., 2006).

Согласно теории М. В игле! об иммунологическом надзоре, первостепенной задачей иммунной системы является контроль за постоянством внутренней среды и уничтожение чужеродных для организма агентов, в том числе и злокачественно трансформированных клеток. Однако в большинстве случаев иммунокомпетентные клетки не способны к эффективному распознаванию и уничтожению опухолевых популяций. Неудовлетворительная работа иммунокомпетентных клеток обусловлена стратегией опухолевой клетки», включающей разнообразные механизмы для ускользания опухоли от иммунологического контроля.

Чрезвычайная сложность канцерогенеза и проблема ранней диагностики опухолевого процесса обуславливает необходимость изучения этиологии и патогенеза опухолей, а также разработку новых методов лечения и реабилитации онкологических больных.

Одной из основных проблем современной клинической иммунологии является иммунокоррекция, направленная на физиологичное исправление дефектов иммунной системы без развития нежелательных побочных эффектов. Снижение эффективности стандартной для каждой конкретной патологии традиционной терапии явилось основанием для разработки принципов иммунокоррекции и методов ее назначения при вторичной иммунной недостаточности. Основополагающим методом коррекции иммунной системы является применение иммунотропных лекарственных средств (ИТЛС).

По происхождению их можно разделить на три группы: полимерные, экзогенные и эндогенные (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996). К полимерным ИТЛС, полученным с помощью направленного химического синтеза, относится препарат полиоксидоний, который активирует все факторы естественной резистентности (Петров Р.В., Хаитов P.M., Некрасов A.B. и др., 1999). К ИТЛС экзогенного происхождения относятся препараты бактериального и грибкового происхождения, такие как, пирогенал, нуклеинат натрия, рибомунил, бронхомунал, которые обладают способностью усиливать функциональную активность нейтрофилов и макрофагов. В качестве ИТЛС эндогенного происхождения для профилактики и лечения вторичных иммунодефицитов применяются иммунорегуляторные пептиды, полученные из центральных органов иммунной системы: тимуса (тактивин, тималин, тимоптин, тимактид и др.) и костного мозга (миелопид).

Накопленный к настоящему времени опыт по использованию различного рода иммуномодуляторов в клинике указывает на преимущества эндогенных препаратов по сравнению с чужеродными для организма химическими соединениями (Степаненко Р.Н., 1991). Разработка методов направленной иммунокоррекции при воспалительных процессах различного генеза и восстановление нарушенных функций иммунной системы без побочных эффектов — одна из важнейших проблем современной иммунологии (Киселева с соавт., 1999; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1998; Лебедев В.В., Немцова Е.Р., 2001).

Препарат миелопид является иммунокорригирующим лекарственным средством, основным биологически активным компонентом которого являются эндогенные пептиды - вещества, вырабатываемые самой иммунной системой (Степаненко Р.Н., 1991). Иммуноактивные пептиды (миелопептиды), входящие в состав препарата, принимают участие в сложной сети процессов, направленных на сохранение иммунного статуса организма. Обнаружено, что каждый из выделенных миелопептидов вызывает различные иммунокорригирующие эффекты в поврежденном звене иммунной системы (Хомякова A.B., Москалева Е.Ю., Фонина JI.A., Михайлова A.A., 2007). Следует отметить, что несмотря на большое количество проведенных исследований, данные иммунорегуляторные фракции изучены недостаточно.

Дискуссионным является вопрос не только о мишенях действия, но и о зависимости функции от конкретного иммунопатологического процесса. В этой связи определенный практический и научный интерес представляет изучение влияния действия пептидов костного мозга - миелопептидов - при иммунопатологических состояниях различного генеза.

Цель работы:

Целью настоящего исследования явилась оценка характера влияния отдельных фракций миелопида in vitro на свойства лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

Задачи исследования:

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние миелопептидов (МП-1, МП-2, МП-3) in vitro на рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

2. Исследовать влияние миелопептидов (МП-1, МП-2, МП-3) in vitro на продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

3. Изучить влияние миелопептидов (МП-1, МП-2, МП-3) in vitro на функциональную активность Т-лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

4. Определить возможные области клинического применения миелопептидов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В основе иммунокорригирующего эффекта миелопептидов лежит способность повышать in vitro спонтанную экспрессию а-цепи рецептора интерлейкина-2 у больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

2. Миелопептиды обладают способностью in vitro стимулировать процессы пролиферации иммунокомпетентных клеток больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

Научная новизна работы.

1. В работе впервые изучены механизмы действия миелопептидов (МП-1, МП-2, МП-3) in vitro на свойства лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

2. Установлено, что миелопептиды повышают in vitro спонтанную экспрессию а-цепи рецептора интерлейкина-2 у больных раком молочной железы и больных с приобретенными и вторичными иммунодефицитными состояниями.

3. Показано, что миелопептид-2 обладает in vitro выраженным стимулирующим действием на рецепторный аппарат и процессы пролиферации иммунокомпетентных клеток больных раком молочной железы.

4. Миелопептид-3 обладает in vitro выраженным стимулирующим действием на рецепторный аппарат и процессы пролиферации иммунокомпетентных клеток больных с вторичными иммунодефицитными состояниями.

Научно-практическая значимость.

Выполненная работа расширяет современные знания о биологических механизмах иммуномодулирующих эффектов миелопептидов.

Проведенные исследования показывают, что миелопептиды оказывают корригирующий эффект на различные звенья иммунной системы в зависимости от индивидуального механизма действия. Выполненная работа позволила оценить области применения различных фракций миелопида.

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась 15 мая 2009г. на заседании кафедры «Клинической иммунологии и аллергологии» ФПК и ППС ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет министерства здравоохранения и социального развития» (протокол №5).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 97 источников, из них 90 отечественных и 7 зарубежных. Работа содержит 25 таблиц и 45 рисунков.

117 Глава 7. ВЫВОДЫ

1. Миелопептид-2 существенно интенсифицирует процессы дифференцировки (CD3+ спонтанное - 39,7±3,7%; CD3+Mn.2 - 47,0±2,3%), ранней активации Т-лимфоцитов больных раком молочной железы (CD25+ спонтанное - 1,2±0,4%; CD25+Mn2 - 3,1 ±0,8%), пролиферации иммунокомпетентных клеток (ИС Мп-2 - 1,4±0,05), нормализуя при этом соотношение хелперно-индукторных (CD4+ спонтанное - 18,8±2,3%; CD4+Mn-2 -27,5±2,9%) и цитотоксических Т-клеток (CD8+ спонтанное - 12,1±2,2%; CD8+Mn. 2- 15,2±1,8%)р<0,05.

2. Культивирование лимфоцитов больных раком молочной железы с миелопептидом-2 вызывает усиление синтеза интерлейкина-2 (спонт. -2,6±0,9 пг/л; МП-2 - 6,5±1,5 пг/л) и интерферона-у (спонт. - 7,8±0,5 пг/л; МП-2 - 52,9±1,2пг/л) р<0,05, что свидетельствует о стимуляции миелопептидом-2 Т-хелперов 1-го типа.

3. Наиболее выраженное действие на процессы дифференцировки (ГЛАП - CD3+ спонтанное - 63,1±2,8%; CD3Mn-i - 67,4±2,5%; CD3+M„.2 -64,5±1,8%; CD3+Mn-3 - 68,0±1,8 %; пре-СПИД - CD3+ Спонта„.юе - 59,1±3,4%; CD3Mn-i - 66,0±3,5; CD3+Mn-2 - 62,5±2,8%; CD3+Mn-3 - 69,6±2,5%), активации (ГЛАП - СЕ)25+спонтанное - 1,0±0,2%; CD25+Mn-i - 1,2±0,1%; CD25+Mn2 -1,1±0,1 %; CD25+Mn-3 - 1,3±0,1%; пре-СПИД - CD25+cn0irraiIH0e - 0,7±0,3%; CD25+Mn-i - 1,4±0,2%; CD25+Mn.2 - 1,2±0,2%; CD25+Mn.3 - 1,7±0,2%) и пролиферации иммунокомпетентных клеток (ГЛАП ИС МП-1 - 1,6±0,05; ИС мп-2 - 1,4±0,04; ИС мп.3 - 1,8±0,2; пре-СПИД ИС мл.! - 1,5±0,07; ИС МП-2 -1,4±0,07; ИС мп-з ~ 2,0±0,05) при ВИЧ-инфекции из всех изученных миелопептидов оказывают миелопептид-1 и миелопептид-3 (р<0,05).

4. Действие миелопептид-3 in vitro способствует восстановлению соотношения иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов и нормализации баланса продукции про- и противовоспалительных цитокинов иммунокомпетентными клетками часто болеющих детей (ИЛ-2 - спонт. -14,1±0,7пг/л; МП-1 - 53,2±2,9пг/л; МП-2 - 14,9±0,8пг/л; МП-3 - 69,8±2,1пг/л; ИНФ-у - спонт. - 24,2±1,1пг/л; МП-1 - 70,5±2,4 пг/л; МП-2 - 25,1±0,9пг/л; МП-3 - 83,2±2,6 пг/л) (р<0,05).

5. Наиболее активным регуляторным действием на лимфоциты больных раком молочной железы обладает миелопептид-2, на лимфоциты часто болеющих детей миелопептид-3, а миелопептид-1 и миелопептид-3 проявляют корригирующее влияние на лимфоциты больных ВИЧ-инфекцией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Обоснован дифференцированный подход к выбору различных миелопептидов для коррекции иммунного статуса при раке молочной железы и приобретенных иммунодефицитных состояниях.