Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Миелопептиды, индуцирующие терминальную дифференцировку лейкозных клеточных линий

На правах рукописи

СУВОРОВ НИКОЛАЙ ИВАНОВИЧ • ^

Миелопептиды, индуцирующие терминальную дифференцировку лейкозных клеточных линий

14 00 36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2007

003057524

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова Российской Академии Наук

Научный руководитель-

доктор биологических наук, профессор Михайлова А А

Официальные оппоненты*

доктор медицинских наук, профессор Ярилин А А доктор биологических наук, профессор Стенина М А

Ведущая организация:

ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится « 2В » мая 2007 г в__часов на заседании диссертационного совета Д 208 072 05 при Российском государственном медицинском университете по адресу 117997, Москва, ул Островитянова, дом 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « »_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Кандидат медицинских наук Кузнецова Т Е

Общая характеристика работы

Актуальпость проблемы

Известно, что нарушение процессов пролиферации и дифференцировки клеток в костном мозге приводит к развитию тяжелых, а часто и неизлечимых заболеваний К таким заболеваниям относятся различные типы лейкозов, в частности острые нелим-фобластные (ОЛ или ОНЛЛ) и хронические (ХЛ) Это объясняет важность проблемы поиска новых дифференцировочных факторов, особенно эндогенной природы, которые могли бы быть использованы в комплексной противолейкозной терапии

ОЛ встречаются в разных странах с частотой от 2 до 4 на 100 ООО населения в год У детей лейкозы являются наиболее частым злокачественным новообразованием (38-40%), они обуславливают высокую летальность, уступая первое место среди причин смертности у детей старше 2 лет лишь травмам Частота лейкозов у детей составляет 3 2-4 4 на 100 000 У взрослых на долю ОНЛЛ приходится 80% среди всех острых лейкозов Заболеваемость ОНЛЛ увеличивается с возрастом, достигая частоты 10-15 на 100 000 в год в популяции старше 65 лет ОЛЛ составляют лишь 20% среди всех острых лейкозов взрослых Мужчины и женщины заболевают с равной частотой [£/-езпег Ю, СоЫвЮпе АН, 1997] В настоящий момент основой терапии всех ОНЛЛ, кроме варианта МЗ (острый промиелоцитарный лейкоз), является сочетание различных методов химиотерапии

Наряду с химиотерапией, приводящей к гибели опухолевых бластов, получает развитие терапия, вызывающая дифференцировку незрелых опухолевых клеток Однако, следует отметить, что таких препаратов в настоящее время сравнительно мало Так, терапия острого промиелоцитарного лейкоза основана на применении производных витамина А (АТКА) и Аэ20з, вызывающих созревание лейкозных клеток Ведутся активные исследования других соединений, потенциально способных к их использованию в клинике — это производные витамина Б, Е, сАМР, препараты на основе ци-токинов и др Однако, применение дифференцировочной терапии и противоопухолевых препаратов часто сопровождается развитием побочных реакций В связи с этим возрастает потребность в препаратах, применение которых в комплексной терапии лейкозов останавливает рост опухолевых клеток, вызывает их дифференцировку и в тоже время оказывает минимальный побочный эффект

В начале 1970-х годов группой российских иммунологов под руководством Р В Петрова впервые были обнаружены иммунорегуляторные пептиды костного мозга -миелопептиды (МП) (Рйгоу Я V , МЛЬа^оуа А А , 1972,) МП синтезируются клетка-

ми костного мозга человека и мчекопитающих без какой-либо стимуляции антигенами или митогенами Они лишены видовой специфичности и, таким образом, могут быть использованы для иммунокоррекции при различных заболеваниях человека В настоящее время структурно охарактеризованы и синтезированы шесть МП, каждый из которых обладает собственной иммунокорригирующей активностью Среди выделенных МП имеются два пептида, обладающие способностью индуцировать терминальную дифференцировку клеток линий миелобластного и эритробластного лейкозов HL-60 и К-562 МП-4 и МП-6 увеличивают уровень экспрессии дифференцировочных антигенов CD 14, CD38 и CD44, снижают уровень пролиферации бластных клеток, вызывают характерные морфологические изменения Это указывает на перспективу использования их в комплексной терапии лейкозов, однако, остаются неясными вопросы относительно механизма их действия на опухолевые клетки

2 Цели и задачи

Целью данной работы является изучение дифференцировочной активности миелопептидов МП-4 и МП-6 на лейкозных клеточных линиях HL-60 и К-562 и анализ возможных механизмов действия этих пептидов

В рамках данной работы решались следующие задачи

1 Изучить дифференцировочные свойства миелопептидов МП-4 и МП-6 на модели лейкозных клеточных линий HL-60 и К-562 по различным показателям дифференци-ровочного процесса,

2 Исстедовать характер связывания МП-4 с клетками линии HL-60 и оценить возможность его проникновения внутрь клетки,

3 Определить влияние МП-4 на активацию/ингибирование компонентов системы MAP - киназ в клетках линии HL-60,

4 Изучить роль ионов Са2+ в индукции дифференцировки клеток HL-60 под влиянием МП-4

Научная новизна

В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование дифференцировочной активности пептидов костномозгового происхождения миелопептидов МП-4 и МП-6 на лейкозных клеточных линиях HL-60 и К-562 и выявление некоторых механизмов их действия

Установлено, что клетки миело- и эритролейкоза человека под влиянием миело-пептидов останавливают свой рост, экспрессируют на своей поверхности ряд диффе-ренцировочных маркеров Морфологический анализ клеток линии HL-60 выявил достоверное увеличение количества клеток, которые приобрели характерные черты зрелых форм - моноцитов и макрофагов Показано что под влиянием МП-4 и МП-6 увеличивается функциональная активность клеток линии К-562, что говорит об их созревании

Впервые показано вовлечение в процесс дифференцировки различных сигнальных путей - компонентов системы MAP киназ - ERK, JNK, р38 как в общей, так и в фосфорилированной форме Инкубация HL-60 клеток с МП-4 в течение 72 часов сопровождалась увеличением амплитуды Са2+ ответов на формил пептид, что свидетельствует об изменении состояния дифференцировки этих клеток В то же время, изменение базального уровня Са2+ в клетках HL-60 под влиянием МП-4 было незначительным и недостоверным, что показывает, что этот пептид практически не влияет на данный жизненно важный показатель

В работе установлен факт специфического связывания МП-4 с поверхностью клеток HL-60, построена кривая полного насыщения для МП-4, рассчитана Kd =1,Зх10"9М Методом конфокальной микроскопии с использованием ФИТЦ-меченого МП-4 показано проникновение этого пептида в клетку и его локализация в околоядерной области

Практическая значимость

Результаты, полученные в данной работе, представляют интерес не только для фундаментальной науки, но и для возможного использования их в медицине В настоящее время терапия лейкозов с помощью дифференцировочных агентов является одним из наиболее перспективных направлений в лечении данного вида опухолевых заболеваний

Понимание механизмов дифференцировочного действия МП-4 и МП-6 на клетки лейкозных линий необходимо для разработки наиболее эффективных методов терапии острых миелобластных лейкозов Результаты диссертации целесообразно использовать для создания новых лекарственных средств, вызывающих дифференциров-ку опухолевых клеток и направленно действующих на определенные компоненты сигнального каскада в опухолевой клетке

Материалы диссертации доложены на 5-ом конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на

седьмом чтении, посвященном памяти академика Ю А Овчинникова (Москва, 2004), на 2-ом всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004), на международной летней школе для студентов, аспирантов и молодых ученых «Многогранные способы применения специфической иммунотерапии» (Дубровник, 2004, Хорватия), на международном семинаре «Иммунология для онкологов» (Аскона, 2005, Швейцария), на 15-й конференции по протеин-киназам «Пространственная и временная регуляция сигнализации» (Осло, 2006, Норвегия)

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и библиографического указателя Работа изложена на_страницах машинописного текста, включая_таблиц и_рисунков Список цитируемой литературы содержит 141 ссылку

Материалы и методы.

Пептиды МП-4 и МП-6 были синтезированы методом классической пептидной химии в ФГУ Российском Кардиологическом Научно-Производственном Комплексе Росздрава (Москва) ФИТЦ-меченый МП-4 синтезирован в лаборатории медиаторов иммунной системы ИБХ РАН

Культивирование клеток

Культивирование клеток линии HL-60 (миелобластный лейкоз человека) и К-562 (эритробластный лейкоз) проводите в стандартной среде RPMI-1640 (ICN, США), содержащей 7% эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO, Англия), 20мМ HEPES-буфер (Flow Laboratories, Англия), 2мМ L-глутамина Flow Laboratories, Англия) и 50 мкг/мл гентамицина (Брынцалов Ферейн, Россия) Клетки культивировали в полистироловых флаконах в С02-инкубаторе при температуре 37°С во влажной атмосфере и 5% С02 Клетки поддерживались в логарифмической фазе роста МП-4 и МП-6 добавляли к клеткам в различной концентрации и инкубировали в течении 72 часов Оценка пролиферативного ответа клеток линии HL-60 и К-562. Клетки лейкозных клеточных линий культивировали в атмосфере 5% СО2 при 37°С в 24-х луночном планшете в количестве 50 тысяч клеток на лунку в объеме 1 мл в течении 72 часов После чего клетки переносили в 96-ти луночный планшет в объеме 200 мкл на лунку и добавляли 3Н-тимидин (Радиевый институт им В Г Хлопнева) -5мк Ки/мл на 4 часа После окончания инкубации планшет охлаждали до -28°С, чтобы разрушить мембраны клеток Содержимое каждой лунки при помощи харвестера переносили на целлюлозный фильтр Whatman mm на 24 часа Фильтры помещали в от-

6

дельные флаконы со сцинтилятом и ставили на счет Измерение проводили на жидкостном сцшггиляционном счетчике (LKB, Sweden) Для количественной оценки реакции использовали абсолютную величину включения радиоактивной метки (число импульсов в минуту)

Морфологический анализ

Морфологию клеток HL-60 определяли на 8 сутки ведения культуры (после 3 сут воздействия миелопептидов) Готовили мазки клеток на покровных стеклах, фиксировали метанолом в течение 5 мин и окрашивали азур-эозином по Романовско-му-Гимзе Подсчет промоноцитов, моноцитов и макрофагов проводили под иммерсией на микроскопе Leitz (Германия)

Цитофлуориметрический анализ

Действие МП-4 на фенотип клеток изучали по изменению уровня экспрессии антигенов зрелых клеточных форм - CD14 [Bufler Р, Stiegler G, et al, 1995] и CD38 [Malavasi Fabio, Funaro Ada, et al, 1994] - для клеток линии HL-60 и CD44 [Mallmson G, Soo KS, et al, 1995] - для клеток линии K-562 В качестве контролен использовали известные факторы терминальной дифференцировки клеток ФМА (форболмиристил ацетат) и ДМСО (диметилсульфоксид) соответственно Клетки, взятые в логарифмической фазе роста (3 сут), культивировали в 24-луночных планшетах в стандартной среде RPMI-1640 в присутствии МП-4 (дозы от 10, 1, и 0,1 мкг/мл) 3-ое суток, затем заменяли среду на свежую и продолжали культивирование без МП-4 еще 3 суток Суспензии клеток отмывали в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1% фетальной сыворотки Отмытые клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера и во все пробы (кроме контроля) добавляли ФИТЦ-меченые моноклональные антитела (мАТ) в количествах, рекомендованных фирмой-изготовителем Инкубация с мАТ проходила в течение 40 минут на льду Далее суспензии клеток дважды отмывали буфером и проводили анализ флуоресценции окрашенных клеток на лазерном проточном цитофлуориметре EPICS "ELITE" (Coulter Electronics Inc, США) Щамбаева CB, Мазуров ДВ, и dp, 2002]

Определение гемоглобина в клетках линии K-S62 (бензидиновый тест).

Функциональную активность клеток К-562 оценивали в бензидиновом тесте Суспензии клеток К-562 отмывали дважды, затем к осадкам добавляли по 350 мкл деионизованной Н20 (проводили гемолиз), пробы встряхивали на шейкере и сразу же центрифугировали Для измерения испочьзовали надосадочные жидкости, содержащие гемоглобин Реакцию проводили, исходя из следующих количеств реагентов 150

мкл бензидина, 150 мкл Н202 и 150 мкл анализируемого раствора Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре Beckman при длине волны Х.=б10 нм Определение уровня апоптоза в культуре клеток линии HL-60. Клетки линии HL-60 культивировали в 24-х луночном планшете в С02-инкубаторе с пересевом 1 раз за 2 суток Исходная концентрация клеток составляла 2 105/мл Для изучения индуцирующего влияния МП-4 на апоптоз, клетки после пересева инкубировали в течение суток, МП-4 добавляли в фазе экспоненциального роста клеток Оценка количества клеток, вступивших в апоптоз, проводилась цитофлуори-метрическим методом на проточном цитофлуориметре EPICS ELITE (Coulter, США) по общепринятой методике [Telford WG, King LE et al,1994] После окончания инкубации с МП-4, клетки переводили в PM-16/HEPES, на холоду фиксировали в EtOH (70%, 4°С), дважды отмывали в PM-16/HEPES (300 g, 10 мин, 4°С) Затем клетки ре-суспендировали в растворе для окрашивания ДНК (РМ-16, содержащий 20 мкг/мл PI и 1 мг/мл РНКазы) Регистрировали флуоресценцию не менее 1 104 клеток На гистограммах апоптотические клетки дифференцировали от живых по более низкой интенсивности флуоресценции

Определение уровня внутриклеточного [Са2+]1 в клетках линии HL-60. Для измерения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ ([Ca2"],), клетки HL-60 прокрашивали флуоресцентным красителем Для этого 1 мкл Fura-2AM (1 мМ) добавляли к 2 мл суспензии клеток в среде Хенкса (10-12x10б клеток) в кварцевой термоста-тируемой кювете с тефлоновой магнитной мешалкой Суспензию инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С Затем краситель отмывали 2 раза центрифугированием (5 мин при 700 g) Отмытые клетки доводили до концентрации 1х106 клеток на мл Каждая проба содержала 2 мл суспензии клеток Измерение флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Shimadzu RF-1501 340 нм и 380 нм, Хт 505 нм) Уровень [Ca2+]i определяли как описано в работе [Grynkiewicz G, Роете Р, et al, 1985] Fmax и Fmm измеряли при использовании дигитонина (100 мкМ) и EGTA (10 мМ)

Определение активности МАР-киназ в клетках линии HL-60.

Методом иммуноферментного анализа ELISA проводили измерение активности компонентов общей и фосфорилированной формы МАР-киназ - ERK, JNK и р38 В эксперименте использовали клетки линии HL-60, проинкубированные с МП-4 или МП-6 в различных концентрациях в течение 72 часов и контрольные клетки Измерение проводили в соответствии с инструкцией, прилагавшейся к каждому набору ELISA

Определение связывания МП-4 с клетками HL-60.

Цитофлуорычетрический анализ

Клетки отмывали центрифугированием (2 раза при 1000 об/мин 3-5 мин и готовили суспензию клеток 1х106/мл в PBS - буфере (ICN, USA), содержащим 1% ЭТС Образцы (200 000 клеток на образец) инкубировали с ФИТЦ-МП-4 в концентрациях 10'7 - 10"и М в течение 40 мин на холоду (+4°С) После этого надосадочную жидкость отделяли центрифугированием (1000 об/мин 5-7 мин), далее клетки дважды промывали буфером, ресуспендировали и анализировали свечение на проточном цитофлуори-метре EPICS-5 (Coulter Electronics Inc , USA) При изучении конкурентного вытеснения метки, предварительно отмытые от среды клетки линии HL-60 в PBS, содержащие 1% ЭТС, инкубировали с ФИТЦ-МП-4 в концентрации 10 нМ (40 мин, +4°С) Далее образцы инкубировали с немечеными МП-4 или МП-3 в концентрациях от 10 до 100 нМ в течение 40 мин (+4°С) После второй инкубации клетки дважды отмывали центрифугированием (1000 об/мин, 5-7 мин) и анализировали в проточном цитофлуори-метре

Определение способности МП-4 проникать внутрь клетки

1 Методом цитофлуориметрического анализа

Клетки линии HL-60, собранные в количестве 0,5-Ю6 инкубировали с ФИТЦ-МП-4 в течение 40 минут в присутствии различных ингибиторов метаболизма и эндоцито-за, таких как низкая температура, азид натрия, хлорид аммония, нокодазол Непосредственно перед измерением флуоресценции к суспензии клеток добавлялся 5 мкл IM раствора дитионита натрия, для того, чтобы погасить флуоресценцию с поверхности клетки [Drin G, Cottin S, et al, 2003] Флуоресценцию измеряли на проточном цитоф-луориметре EPICS-5 (Coulter Electronics Inc , USA)

2 Методом конфокальной микроскопии

Для определения способности МП-4 проникать внутрь клетки использовали метод конфокальной микроскопии Клетки линии HL-60 рассаживали в 96-луночные планшеты по 100000 клеток в 100 мкл на лунку в стандартной среде для культивирования, содержащей 10% ЭТС Далее к клеткам добавляли ФИТЦ-МП-4 в концентрации 1 нМ и инкубировали в С02-инкубаторе при температуре 37°С в атмосфере 5% С02в течение 10, 30 и 40 мин Из клеток инкубированных 10 мин, сразу готовили образцы на стеклах для просмотра в микроскопе Carl Zeiss (Germany) под объективом Plan-Neofluar lOOx/1 3 oil Ph 3 Клетки, инкубированные в течение 30 и 40 мин, перед приготовлением образцов для микроскопии сначала отмывали центрифугированием

(10 мин, 1000 об/мин) Кроме этого, готовили образцы клеток HL-60, которые наблюдали под микроскопом сразу после добавления ФИТЦ-МП-4 (1 мин) Результаты исследований 1. Влияние МП-4 и МП -6 на днфференцировку клеток линии HL-60 Способность МП-4 и МП-6 индуцировать дифференцировку клеток линии HL-60 изучали по нескольким параметрам, характеризующим дифференцировочный процесс по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток, по изменению морфологии клеток, по изменению уровня экспрессии дифференцировочных антигенов, по изменению функциональной активности клеток

1.1. Влияние МП-4 и МП-6 на синтез ДНК в клеточной линии HL-60. Влияние МП-4 и МП-6 на метаболизм клеток линии HL-60 определяли по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток В качестве положительного контроля был взят РМА в стандартной концентрации 10 нг/мл В табл 1 результаты представлены в

Таблица 1 Влияние МП-4 и МП-6 на включение 3Н-тимидина в ДНК клеток линии HL-60

имп/мин, х 10 и в процентах от контроля

Концентрации агентов, добавляемых к клеткам HL-60, мкг/мл Включение [JH] тимидина

имп'мин х 10 3 % от контроля

контроль 6,0 ± 0,9 100

РМА (10 нг/мл) 2,6 ± 0,2** 43

МП-4 10 4,3+0,9 71

МП-4 5 4,2+0,9 70

МП-4 1 2,7+0,4 44

МП-6 50 4,2 ±1,0* 69

МП-6 10 4,6 ±0,2** 76

МП-6 1 6,2 ± 0,7 103

МП-6 0,1 4,5 ± 0,3** 75

*-р<0,05, **-р<0,01

Из таблицы 1 видно, что действие форболового эфира (положительный контроль) приводило к подавлению синтеза ДНК в клетках до 43% от контрольного уровня Оптимальный эффект МП-4 проявился при концентрации пептида 1 мкг/мл При данной концентрации происходило снижение синтеза ДНК до 44% по сравнению с контролем Влияние МП-6 на клетки НЬ-60 в концентрациях от 50 до 0,1 мкг/мл также вызывало снижение уровня синтеза ДНК при дозах пептида 100, 50, 10 и 0,1 мкг/мл наблюдалось подавление до 68, 69, 76 и 75% от контроля соответственно При меньших концентрациях МП-6 от (0,01 до 0,0001 мкг/мл) эффект был недостоверным

1.2. Влияние МП-4 п МП-6 на морфологию клеток линии HL-60.

Для количественного определения зрелых клеток после воздействия МП-4 был использован метод визуальной оценки - подсчета клеток в мазках Морфологический анализ показал (табл 2), что при всех использованных концентрациях МП-4 — 10, 1, и 0,1 мкг/мл наблюдалось увеличение количества моноцитов в 2,6, 2,8 и 2,1 раза соответственно Эти показатели даже превышали эффект действия РМА, использованного в качестве положительного контроля - он увеличивал количество моноцитов всего в 1,5 раза Количество макрофагов при всех использованных концентрациях МП-4 увеличивалось в среднем в 2 - 2,5 раза Следовательно, под влиянием МП-4 в клеточной линии HL-60 появляются зрелые моноциты/макрофаги, т е индуцируется дифферен-цировочный процесс

Промоноциты Моноциты Макрофаги

Контроль 81,0+1,0 16,3+1,5 2,7+0,6

РМА, 10 нг/мл 68,5+8,1* 24,5+3,5** 7,0+1,0*

МП-4, 10 мкг/мл 50,3+8,1** 42,3+6,7** 7,4+1,5**

МП-4, 1 мкг/мл 49,7+1,5*** 45,0+3,6*** 5,3+1,3*

МП-4, 0,1 мкг/мл 57,5+3,8*** 34,8+3,8** 7,7+0,6*

*-р<0,05, ** -р<0,01, ***-р<0,001

Табл 2 Увеличение количества зрелых клеток в меточной линии НЬ-60 под влиянием МП-4

Результаты количественного анализа различных типов клеток в культуре НЬ-60 под влиянием МП-6 представлены в таблице 3 Были исследованы три дозы МП-6 (10, 1 и 0,1 мкг/мл) Наблюдалось увеличение количества моноцитов в 1,5, 1,4 и 1,3 раза по сравнению с контролем, а макрофагов — в 3,1, 2,4 и 2,6 раза соответственно

Таблица 3 Увеличе-

Промоноциты Моноциты Макрофаги

Контроль 81,0+1,0 16,3±1,5 2,7+0,6

РМА, 10 нг/мл 68,5±8,1* 24,5+3,5** 7,0±1,0*

МП-6,10 мкг/мл 67,5+0,7*** 24,0±1,4* 8,5±0,7**

МП-6,1 мкг/мл 71,0±1,4** 22,5±0,7* 6,5±0,7**

МП-6, 0,1 мкг/мл 71,5±3,5* 21,5+2,1* 7,0±1,4*

*-р<0,05, **-р<0,01, ***-р<0,001

ние количества зрелых клеток в клеточной линии НЬ-60 под влиянием МП-6

1.3.Экспрессия днфференцнровочных антигенов на поверхности клеток линии НЬ-60 под влиянием МП-4 и МП-6

В данном исследовании определяли уровни экспрессии клеточных маркеров, свойственных зрелым клеточным формам СБ 14 и СИЗ 8 экспрессируются на моноци-

тах и макрофагах и являются признаком дифференцировки этих клеток \Yalcintepe Ь, Л1ЬепнI, ег ей, 2005]

На рис 1 представлены результаты цитометрического анализа клеток линии НЬ-60 под действием МП-4 Уровень спонтанной дифференцировки в клетках линии НЬ-60 очень невысок процент СБ 14 и СБ38 позитивных клеток в контроле составляет 2,8% и 2,5% соответственно

контроль

РМА

i V тэ™ МП-4 1 ыкг/мл

S J

j

-j

j

1

4

« Г

Рис 1 Увеличение экспрессии СБ 14 и С038 на клетках линии НЬ-60 под действием МП-4

РМА увеличивает экспрессию маркеров CD14 и CD38 в 10 и в 14,5 раз по сравнению с контролем МП-4 в дозе 1 мкг/мл также увеличивает экспрессию антигенов CD 14 и CD38 в 8 и 7 раз соответственно

Изменение экспрессии CD 14 и CD38 на клетках линии HL-60 под влиянием МП-6 показано на рис 2

Рис 2 Увеличение экспрессия CD38 и CD14 на поверхности клеток HL-60 под действием МП-6

1 0,1 0,01

CDU CD"

уровень экспрессии маркеров в % от контроля

Действие МП-6 исследовали в диапазоне концентраций от 10 до 0,01 мкг/мл Было показано, что наиболее выраженным эффектом обладали дозы МП-6 10, 0,1 и 0,01 мкг/мл они увеличивали синтез CD38 до 182, 135 и 123% от контроля соответственно, а экспрессию CD 14 - до 112, 149 и 161%

1.4. Влияние МП-4 на апоптоз клеток линии НЬ-60

МП-4, добавленный к клеткам НЬ-60 в концентрации 1мкг/мл, оптимальной для индукции дифференцировки, значительно увеличивает количество клеток, находящихся в апоптозе (Рис 3)

О 0 0001 0 001 0 01 0 1 1 10

Концентрация МП-4, мкг/мл

Рис 3 Влияние МП-4 на апоптоз клеток линии НЬ-60

Поскольку конечным этапом дифференцировки клеток является апоптоз, то увеличение количества апоптотических клеток в культуре свидетельствует о появлении большего количества зрелых клеток под влиянием МП-4

Таким образом, по различным параметрам показано, что МП-4 и МП-6 являются дифференцировочными факторами для клеток линии НЬ-60 Данные пептиды снижают пролиферацию, увеличивая количество зрелых клеток, несущих маркеры дифференцировки СБ14 и С038, повышают процент морфологически зрелых форм и увеличивают количество апоптотических клеток

2. Влияние МП-4 п МП -6 на дифференцировку клеток линии К-562 Одной из задач исследования было определение дифференцировочной активности МП-4 и МП-6 не только на клетках линии НЬ-60, но и влияние этих пептидов на клетки другой лейкозной линии К-562 При этом использовалась часть методов, применяемых для оценки влияния пептидов на клетки НЬ-60

2.1. Влияние МП-4 и МП-6 па пролиферацию клеточной линии К-562 Пролиферацию клеток линии К-562 под действием МП-4 также определяли по влиянию на синтез ДНК в клетке Так концентрации пептида, 50, 0,1, 0,01 и 0,001 приводили к подавлению синтеза ДЬЖ до, 81, 42, 76 и 72% от исходного уровня соответственно Это действие сопоставимо с эффектом положительного контроля ДМСО (подавление до 67% от исходного уровня), а МП-4 в дозе 0,1 мкг/мл обладал даже более сильным эффектом подавления синтеза ДНК по сравнению с ДМСО (табл 4)

Концентрации агентов, добавляемых к клеткам К-562, мкг/мл Включение [3Н] тимидина

имп/мин х 10"3 % от контроля

- (контроль) 4,4 ± 0,2 100

ДМСО (0,5 %) 2,9 ±0,2*** 67

ДМСО (0,1 %) 3,8 ± 0,3* 88

МП-4 50 3,5 ±0,3** 81

МП-4 10 4,2 ± 0,3 96

МП-4 1 4,4 ± 0,6 101

МП-4 0,1 1,8 ±0,04*** 42

МП-4 0,01 3,3 ±0,3*** 76

Таблица 4 Снижение пролиферации клеток К-562 под влиянием МП-4

*-р<0,05, **-р<0,01, ***-р<0,001

Изменение метаболизма в клетках линии К-562 под влиянием МП-6, также оценивали по включению радиоактивной метки 3Н-тимидина в ДНК клеток Как видно из таблицы 5, МП-6 обладал достоверным подавляющим эффектом на синтез ДНК в широком диапазоне концентраций (от 100 до 0,01 мкг/мл) Эффект всех использованных доз был соизмеримым с действием положительного контроля - ДМСО, который подавлял синтез ДНК до 77% от контрольного уровня так для концентраций 100, 50, 10, 1, 0,1 и 0,01 мкг/мл наблюдалось снижение уровня синтеза ДНК до 82, 69, 71, 79, 73 и

Таблица 5 Снижение пролиферации клеток К-562 под влиянием МП-6

83% от исходного уровня соответственно

Концентрации агентов, добавляемых к клеткам К-562, мкг/мл Включение [■аН] тимидина

имп/мин х 103 % от контроля

- (контроль) 7,5 ± 0,09 100

ДМСО (0,5 %) 5,7 + 0,3* 77

МП-6 100 6,1 ± 0,4* 82

МП-6 50 5,2 ± 0,2** 69

МП-6 10 5,3 ± 0,5* 71

МП-6 1 5,9 ± 0,5* 79

МП-6 0,1 5,5 ± 0,3** 73

МП-6 0,01 6,2 ± 0,2* 83

*-р<0,05, **-р<0,01

Таким образом, МП-4 и МП-6 вызывают снижение синтеза ДНК в клетках линии К-562 до уровня, сопоставимого с таковым известного индуктора дифференци-ровки ДМСО, что свидетельствует о дифференцировочном действии этих двух пептидов и на клетки эритробластного лейкоза

2.2. Экспрессия дифференцнровочных антигенов на поверхности клеток линии К-562 под влиянием МП-4 и МП-6

В данном исследования определяли изменение уровня экспрессии CD44, являющегося маркером зрелых эритроцитов, под влиянием МП-4 и МП-6. [Telen MJ, 1995]

Проведенный нами цитометрический анализ с использованием моноклинальных антител CD-44 (маркер зрелых эритроцитов) показал (рис. 4), что под влиянием МП-4 количество клеток, несущих данный антиген, увеличивается в 2,75 раза по сравнению с контролем. Этот показатель выше, чем под влиянием ДМСО, который увеличивает процент зрелых клеток в данном тесте в 2 раза.

дмсо

i Г '"'У'

1

—tÍT—'¡ЗЗ—*W"Sf

Рис, 4. Изменение экспрессии CD44 на клетках К-562 под действием МП-4

Влияние МП-6 на экспрессию С1)44 на поверхности клеток линии К-562 показано на рис.5. Можно видеть, что МП-6 почти в два раза увеличивает процент клеток, несущих на своей поверхности антиген С044

1 ÜT

Рис 5. Экспрессия CD44 на поверхности клеток К-562 под действием МП-6

50 10 1 0.1

Конце ктрзция МП-6, мкггмл

~гг

2,3, Изменение количества синтезированного клетками К-562 гемоглобина под влиянием МП-4 и МП-6 (бензил и новый тест)

Поскольку клетки линии К-562 являются б ластами и не способны синтезировать гемоглобин, изучалась способность МП-4 и МП-6 влиять на созревание клеток этой линии до зрелых форм по проявлению этими клетками их функциональной активности. Способность синтезировать гемоглобин является признаком не только зрелых, но и функционально активных клеток, поскольку только такие клетки способны доставлять кислород к органам и тканям.

Как видно нз рис.6, под влиянием МП-4 происходит повышение содержания гемоглобина по сравнению с контролем в 1.6 - 1.8 раза. Эта изменения синтеза гемоглобина наблюдались при всех использованных концентрациях МП-4.

ДМСО{0.5%)

№М(0,С1)

МП-» №,1)

контроль

жм (100)

МП-4 (50)

МГ%4(10)

Концентрация МГМ. мкг/ыл-Д имвт илсу лы4окс идШМСО). % '■''■ о5ьенз-

Рис.6 Влияние МП-4 на функциональную активность клеток К-562. Бензи-диновий тест.

J

На круговой диаграмме представлены результаты одного из пяти экспериментов по влиянию МП-6 на синтез гемоглобина клетками К-562. (Рис. 7)

Рис 7. Влияние МП-6 на функциональную активность клеток К-562. Бензидиновый тест

Для высоких доз МП-6 (100; 50; 10 и I мкг/мл) не было обнаружено увеличения синтеза гемоглобина по сравнению с контролем. При этом низкие дозы МП-6 (0,1;

№6(50)

Концентрате МТ-6, мкг/м/у _, ^ Димегигкутъфоксищ (ДМОО). % от^^ { '

МТ-6 (0,1)

0,01, и 0,001 мкг/мл) вызывали достоверно значимое увеличение синтеза гемоглобина, сравнимое с действием БМБО (118% в сравнении с контролем)

Таким образом, МП-6, как и МП-4 является дифференцировочным фактором клеток линии К-562 Под действием этих пептидов происходит снижение пролиферации и дифференцировка клеток линии К-562, повышается процент клеток, несущих маркер дифференцировки СВБ44, увеличивается количество зрелых, функционально активных клеток, способных синтезировать гемоглобин

3. Изучение некоторых механизмов дифференцировочного действия МП-4 на клетках линии НЬ-60. 3.1. Определение параметров связывания МП-4 с клетками НЬ-60

С помощью проточной цитометрии установлено, что ФШЦ-МП-4 связывается с клетками линии НЬ-60 в широком диапазоне концентраций 10"7-10"п М Связывание описывается кривой насыщения, имеющей дозозависимый характер с выходом на плато при 12 нМ

055 ООО-

ка=1,з нм

•

^ „ г г-"-

РИС 8 Связывание ФИТЦ-МП-4 с клетками НЬ-60

[ФИТЦ-МП-4], нм

Анализ взаимодействия ФИТЦ-МП-4 с клетками НЬ-60 в координатах Лаинуи-вера-Берка позволил рассчитать константу диссоциации, равную 1 3 нМ (рис 8) , что характерно для рецепторов высокой аффиности

Для оценки специфичности связывания МП-4 с клетками линии НЬ-60 были проведены эксперименты по вытеснению ФИГЦ-МП-4 избыточным количеством немеченого МП-4 и миелопептидами с другими аминокислотными последовательностями - МП-3 (Ьеи-Уа1-Суз-Туг-Рго-С1п) или МП-б (УаЬАэр-Рго-Рго) (рис 9)

Рис 9 Анализ специфичности связывания ФИТЦ-МП-4 с клетками НЬ-60

Как видно из рисунка 9, введение избытка немеченого МП-4 в инкубационную смесь приводит к дозозависимому снижению интенсивности флуоресценции, тек вытеснению ФИТЦ-МП-4 с сайтов связывания на клетках-мишенях (рис 9 кривая 1) В то же время, введение избытка немеченых пептидов с другой аминокислотной последовательностью, МП-3 или МП-6, не приводит к такому результату (рис 9, кривые 2 и 3) Насыщение и обратимый характер связывания при избытке немеченого пептида той же аминокислотной последовательности и отсутствие вытеснения другими немечеными пептидами позволяют утверждать, что ФИТЦ -МП-4 специфически связывается с поверхностными рецепторами клеток миелобластного лейкоза НЬ-60 Факт того, что МП-6 не вытеснят ФИТЦ-МП-4, говорит о том, что МП-4 и МП-6 имеют различные сайты связывания на клеточной поверхности и, вероятно, различные пути дифферен-цировочного действия

3.2 Проникновение МП-4 внутрь клеток линии НЬ-60 С помощью конфокальной микроскопии было показано, что ФИТЦ-МП-4 не только специфически связывается с поверхностью клеток НЬ-60, но и проникает в цитоплазму этих клеток Установлено проникновение пептида внутрь клетки и его локализация вокруг клеточного ядра (Рис 10)

Клетки НЬ-60 просматривали в микроскопе через различные промежутки времени после добавления к ним ФИТЦ-МП-4 и фотографировали Было показано, что через 1 мин после инкубации клеток НЬ-60 с ФИТЦ-МП-4 меченый пептид проникает в межклеточное пространство (рис 10, а), а уже через 10 мин (рис 10, б) практически полностью находится на поверхности клеток Через 30 мин после начала инкубации ФИТЦ-МП-4 обнаруживается в цитоплазме (рис 10, в), а через 40 мин (рис 10, г) меченый пептид локализуется вокруг клеточного ядра

196

394 МП-4. нМ 59

Рис.10 Проникновение ФИТЦ-МП-4 внутрь клетки. Стрелками показано положение пептида через 1,10, 30,40 мин.

3.3. Исследование характера проникновения МП-4 внутрь клеток HL-60

Проникновение ФИТЦ-меченого МП-4 исследовали также с помощью проточной цитофлуориметрии. [Drin G, Cottin S, et al„ 2003} В наших экспериментах уровень флуоресценции клеток, инкубировавшихся с ФИГЦ-МП-4 при 37°С в присутствии азида натрия, вызывающего истощение АТФ, хлорида аммония, нейтрализующего кислый pH лизосом, нокодазола, ннгибнрующего полимеризацию микротрубочек, не отличался от флуоресценции клеток, инкубировавшихся при 37°С при погашенной флуоресценции с поверхности. (Рис 11) Инкубация клеток с меченым пептидом при 4°С блокировала проникновение пептида внутрь клетки и, следовательно, приводила к уменьшению флуоресценции по сравнению с клетками, инкубировавшимися при Э7°С

Эти данные свидетельствуют о том, что проникновение меченого пептида внутрь клетки носит энергонезависимый характер, не зависящий от температуры и не связанный с эндоцитозом.

3.4. Участие ионов Са2+ в реализации днфференцировочной активности МП-4

Важную роль в регуляции процесса дифференцировки играет изменение внутриклеточной концентрации свободных ИОНОВ кальция [Саг+];. \SanteHa ¿, Егсо1апо Е, г(

Рис. 11. Исследование

о

102

FL 1 LOG

характера проникновения ФИТЦ-МП-4 в клетки линии НЬ-60. Цифрами показано действие I - 4аС, 2 - 37°С, 3 4- 37'С*, 5 - ноко-дазол*. 6- ЫаЫ3*,*-при ту-

шении флуоресценции с поверхности

al, 2005]0собенно важно контролировать изменение базального уровня [Са2+], при длительном действии некоторых агентов, индуцирующих дифференцировку клеток В связи с этим, необходимо было изучить Са2+ ответы недифференцированных промие-лоцитов линии HL-60 на стандартные агенты и сравнить их с ответами клеток HL-60, подвергнутых воздействию миелопептида МП-4 3 41 Са2+ ответы в недифференцированных клетках HL-60

На рис 12 показано влияние последовательных добавок стандартного активатора фагоцитов - fMLP к клеточной суспензии В концентрациях 1-3 мкМ этот агент не влиял на недифференцированные HL-60 клетки В то же время, увеличение концентрации fMLP до 10 мкМ вызывало достоверный Са2+ ответ Последующая обработка этих клеток высокими концентрациями fMLP приводила к монотонному увеличению [Са2+], Добавление к клеткам необратимого ингибитора Са2+-АТРазы эндоплазмати-ческого ретикулума (SERCA) - тапсигаргина (500 нМ) сопровождалось характерным высоко амплитудным ростом [Ca2+]i , который обусловлен двумя взаимосвязанными процессами выходом ионов Са2+ из внутриклеточного депо и транспортом Са2+ по кальциевым SOC каналам, регулируемым содержанием Са2+ в депо (SOC - store operated channels) Эти данные позволяют предположить, что в плазматических мембранах недифференцированных HL-60 клеток либо содержится незначительное количество рецепторов для fMLP, либо сродство этих рецепторов для данного агента невелико

ГГ'о2+1

Рис 12 Изменение Са2+ ответа в недифференцированных клетках HL-60 под влиянием стандартных агентов Цифрами показано последовательное добавление 1-5 - 10 мкМ fMLP, 6 -500 нМ тапсигаргина, 7 - 0,5 мкМ миконазола, 8-0,1 мкМ иономиципа

3 4 2 Са2+ ответы в клетках НЬ-60, инкубированных с МП-4

На рис 13 представлены результаты экспериментов, поставленных по аналогичной схеме на НЬ-60 клетках, подвергшихся воздействию МП-4 в течение 72 часов Необходимо особо отметить, что Са2+ ответ на fMLP наблюдался уже при концентрации 0,5 мкМ и был выраженным при конечных концентрациях от 1-7 мкМ

нМ 6

[Ca ], нМ

300

100

Рис 13 Изменение Са2+ ответа в клетках HL-60, инкубированных с МП-4 (10 мкг/мл) в течение 72 часов под влиянием стандартных агентов

Цифрами показано последовательное добавление 1 - 1мкМ fMLP, 2-2 мкМ fMLP, 3-4 мкМ fMLP, 4- 500 нМ талсигаргина, 5,6 - 0,5 мкМ миконазола, 7,8 - 0,1 мкМ иономицина

На основании этих результатов можно заключить, что МП-4 выступает в качестве эффективного дифференцировочного фактора, который приводит к резкому усилению Са2+ ответа на существенно более низкие концентрации 1МЬР

3 4 3 Изменение базального уровня [Са2'], под влиянием МП-4 Многие дифференцировочные агенты увеличивают такой жизненно важный показатель клеток, как базальный уровень [Са2+]ь что вызывает серьезные побочные эффекты при использовании их в клинике В связи с этим особое внимание было уделено изменению базального уровня [Са2+], под действием МП-4 Обработка недифференцированных НЬ-60 клеток МП-4 (10-80 мкг/мл) не изменяла базальный уровень [Са2+], Аналогичные результаты были получены на НЬ-60 клетках, прединкубированных с МП-4 (10 мкг/мл) (Рис 14)

[Са2+]ц нМ

350

250

200

□ Недифференцированные клетки

И Клетки, инкубированные с МП-4 в течение 72 часов

Рис 14 Влияние прединкубации с МП-4 на базальный уровень [Са2*], и Са2+ ответы в клетках НЬ-60

1 - базальный уровень[Са2*], в контрольных клетках, 2 - базальный уровень [Са2^], в клетках, прединкубированных с МП-4 (10 мкг/мл) в течение 72 часов.З-базальный уровень [Са2+], в контрольных клетках при добавлении МП-4 (10-80 мкг/мл), 4-Са3+ ответ в контрольных клетках под действием 50 мкМ £МЬР, 5-Са2+ ответ в клетках, прединкубированных с МП-4 под действием 7мкМ 1МЬР

Таким образом, было показано, что в клетках HL-60, инкубированных в течение длительного времени с МП-4, базальный уровень [Са2+], оставался практически неизменным, что выгодно отличает МП-4 от других дифференцировочных агентов, таких как витамин D3.

3.5. Измерение активности компонентов системы МАР-киназ в клетка* линии HL-60 под влиянием МП-4 и МП-б

Для раскрытия некоторых механизмов дифференцировочного действия МП-4 и МП-6 исследовали влияние этих пептидов на активацию/ингибирование компонентов одной из важных систем внутриклеточной сигнализации - МАР-киназ, С помощью имм у в о ферментного анализа ELISA установлено, что МП-4 и МП-6 вызывают изменение функционального состояния различных компонентов системы МАР-киназ в клетках линии HL-60.

3.5.1, Изменение активности компонентов системы МАР-киназ под влиянием МП-4.

На рис.15 показано, что МП-4 вызывает ингибирование ЕКК.-киназы как в общей, так и в фосфорилированной форме на 49% и 33,6% соответственно. При этом наблюдается активация общей и ингибирование фосфорилированной формы JNK-киназы на 20,2% и 11,9% соответственно, и ингибирование общей формы р38-киназы на 28,8%.

3.5.2. Изменение активности компонентов системы МАР-киназ под действием МП-6 МП-6 вызывает активацию фосфорилированной формы белка ЕЯК на 26,1% и акгивацию как общей, так и фосфорилированной формы ЖК на 55,7 % и 42,8%, Как и МП-4, МП-6 вызывает ингибирование уровня общей формы р38-киказы на 12,7%. (Рис Л 6)

30

Рис.15. Изменение активности компоненты системы МАР-киназ под влиянием МП-4 ] мкг/мл. Показано 1)икгибирование общей и фосфорилированной форм ЕКК-киназы; 2) ингибирование фосфорилированной формы ШК-киназы; 3) ингибирование общей формы р38-киназы.

-60 -1—

Рис. 16. Изменение активности компоненты системы МАР-киназ под влиянием МП-6 ) мхг/мл. Показано 1)ивтибиррвание общей и активация фосфорилированной форм ЕЕ1К-кнназы; 2) активация общей и фосфорилированной формы ШК -киназы; 3) ингибирование общей формы рЗ 8-киназы.

Таким образом, процесс дифференцировал клеток под действием МП-4 приводит к ингибированию фосфорилированных форм ЕЯК-, ЖК - киназ, вызывает снижение уровня общего белка р38, что свидетельствует о влиянии пептида на данные внутриклеточные гт>ти, С другой стороны, МП-6 вызывая активацию ЕЯК- и ЖК-киназы, приводит к ингибированию уровня общего белка р38. Этот факт подтверждает различные пути дифференцировочного действия этих пептидов, поскольку они имеют различные сайты связывания на клетках линии НЬ-60,

Выводы:

1. МП-4 и МП-6 являются факторами клеточной дифференцировки. Они индуцируют терминальную дифференцировку лейкозных клеточных линий НЬ-бО и К-562, что показано по различным показателям; снижению пролиферации, появлению морфологически зрелых клеток, экспрессии дифференцировочных антигенов на клеточной поверхности, проявлению функциональной активности клеток.

2. МП-4 специфически связывается е клетками линии Н1,-60 (КсЗ = 1,3 нМ). Затем пептид проникает внутрь клетки и локализуется вокруг клеточного ядра,

3. Проникновение пептида внутрь клетки является энергонезависимым, тепмера-турозависимым процессом, не связанным с эндоцитозом.

4. Дифференцировка клеток линии НЬ-бО под влиянием МП-4 сопровождается увеличением амплитуды Са2+ ответов, при этом МП-4 практически не влияет на базальный уровень свободных ионов Са2+ в клетке, что выгодно отличает его от ряда других дифференцировочных агентов и указывает на возможность его применения в клинике.

ео

45

,4(1

№

£ 1? 15

8 6 0

-1Ь

-30

-45

ю|Ь!врк рПоарИо 1о»а1рЬоврЬо ь шк ч^мк

иЩа

5. МП-4 вызывает ингибирование JNK-киназы и ERK-киназы, а также подавляет активность общей формы белка р38, что свидетельствует о влиянии пептида на данные внутриклеточные пути

6 МП-6 не вытесняет ФИТЦ-МП-4 из мест специфического связывания на поверхности клеток HL-60 Ингибируя активность общей формы р38, МП-6, в отличие от МП-4, вызывает активацию как ERK, так и JNK-киназы Эти данные указывают на различие в механизмах дифференцировочного действия МП-4 и МП-6

Практические рекомендации

Результаты диссертации целесообразно использовать для создания новых лекарственных средств, вызывающих дифференцировку опухолевых клеток и направленно действующих на определенные компоненты сигнального каскада в опухолевой клетке

Список работ, опубликованных по теме дисссртацип

1 Кирилина Е А, Хайдуков С В , Калюжная М В , Попова С С , Суворов Н И , Михайлова А А //Миелопептиды, влияющие на дифференцировку лейкозных клеток // РААКИ, 5-й Конгресс, Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии, тезисы докладов, 12-14 ноября 2002, т 2, с 227

2 Кирилина Е А, Гурьянов С А, Суворов Н И, Попова С С , Хайдуков С В , Михайлова А А //Дифференцировка клеток миелобластного (HL-60) и эритробла-стного (К-562) лейкозов под влиянием миелопептида-4 и миелопептида-6 // Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, 2003, Москва, тезисы стендовых сообщений, с 73

3 Suvorov NI, Popova S S , Holodenko IV, Gur'yanov S A, Efremov M A Specific binding of myelopeptide-4 with the cells of the HL-60 human leukemia cell line International Journal on Imtrmnorehabihtation, may 2004, V 6, № 2, 236

4 Суворов H И, Попова С С , Холоденко И В , Гурьянов С А , Ефремов М А Специфическое связывание миелопептида МП-4 с клетками лейкозной линии HL-60 Тезисы VII чтений, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова, Москва, 2004, с 38

5 Суворов H И , Попова С С , Холоденко И В , Гурьянов С А, Ефремов M А Специфическое связывание миелопептида МП-4 с клетками лейкозной линии HL-60 Аллергология и иммунология, 2004, том 5, № 1, с 104

6 Кирилина Е А , Суворов H И, Попова С С , и др Индукция дифференцировки в лейкозных клеточных линиях под влиянием миелопептида-4, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2005, том 140 №11, с 565-570

7 Асташкин Е И, Суворов H И , Михайлова А А , Грачев С В , Изменение Са2+ ответа на формилпептид в клетках миелолейкоза HL-60 при индукции их дифференцировки миелопептидом МП-4, ДАН, 2006, т 408, №3, с 418-421

8 Suvorov N, Astashkin Е, Mikhailova А, Са2+ and МАРК signaling m HL-60 cells during differentiation by myelopeptide MP-4, 15th protein kinase meeting «Spatial and Temporal Regulation of Signalling», 2006, Oslo, p 61

9 Гурьянов С A, Кирилина E A, Хайдуков С В , Суворов H И, Молотковская И M, Михайлова А А Специфическое связывание и проникновение внутрь клетки-мишени флуоресцентно меченного миелопептида-4, обладающего диф-ференцировочной активностью Биоорганическая химия 2006, т 32, № 6, с 1-5

Подписано в печать 12 04 2007 г Исполнено 13 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ №300 Тираж 100 зкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Актуальность проблемы

Известно, что нарушение процессов пролиферации и дифференциров-ки клеток в костном мозге приводит к развитию тяжелых, а часто и неизлечимых заболеваний. К таким заболеваниям относятся различные типы лейкозов, в частности острые нелимфобластные (OJT или OHJIJI) и хронические (XJI). Это объясняет важность проблемы поиска новых дифференцировоч-ных факторов, особенно эндогенной природы, которые могли бы быть использованы в комплексной противолейкозной терапии.

OJT встречаются в разных странах с частотой от 2 до 4 на 100 ООО населения в год. У детей лейкозы являются наиболее частым злокачественным новообразованием (38-40%), они обуславливают высокую летальность, уступая первое место среди причин смертности у детей старше 2 лет лишь травмам. Частота лейкозов у детей составляет 3.2-4.4 на 100 000. Чаще болеют дети в возрасте 2-5 лет. У взрослых на долю OHJIJI приходится 80% среди всех острых лейкозов. Заболеваемость OHJ1J1 увеличивается с возрастом, достигая частоты 10-15 на 100 000 в год в популяции старше 65 лет. OJIJI составляют лишь 20% среди всех острых лейкозов взрослых. Мужчины и женщины заболевают с равной частотой. [Liesner RJ, Goldstone АН., 1997, EsteyE, Dohner Н. 2006]

В настоящий момент основой терапии всех OHJIJI, кроме варианта МЗ (острый промиелоцитарный лейкоз), является сочетание различных методов химиотерапии.

Наряду с химиотерапией, приводящей к гибели опухолевых бластов, получает развитие терапия, вызывающая дифференцировку незрелых опухолевых клеток. Однако следует отметить, что таких препаратов в настоящее время сравнительно мало. Так, терапия острого промиелоцитарного лейкоза основана на применении производных витамина A (ATRA) и AS2O3, вызывающих созревание лейкозных клеток. Ведутся активные исследования других соединений, потенциально способных к их использованию в клинике -это производные витамина D, Е, сАМР, препараты на основе цитокинов и др. Однако, применение дифференцировочной терапии и противоопухолевых препаратов часто сопровождается развитием побочных реакций. В связи с этим возрастает потребность в препаратах, применение которых в комплексной терапии лейкозов останавливая рост .опухолевых клеток и вызывая их дифференцировку, в тоже время оказывало бы минимальный побочный эффект.

В начале 1970-х годов группой российских иммунологов под руководством Р.В. Петрова впервые были обнаружены иммунорегуляторные пептиды костного мозга - миелопептиды (МП) (Petrov R.V., Mikhailova А.А., 1972). МП синтезируются клетками костного мозга человека и млекопитающих без какой-либо стимуляции антигенами или митогенами. Они лишены видовой специфичности и, таким образом, могут быть использованы для иммунокоррекции при различных заболеваниях человека. В настоящее время структурно охарактеризованы и синтезированы шесть МП, каждый из которых обладает собственной иммунокорригирующей активностью. Многочисленные экспериментальные данные по биологическим свойствам МП показывают, что функциональная активность этого класса эндогенных регуляторов направлена на поддержание иммунного гомеостаза организма. При возникновении сдвигов в иммунной системе определенный МП взаимодействует с соответствующей клеткой-мишенью и индуцирует цепь реакций, приводящих к исправлению возникших нарушений.

Показано, что МП-4 и МП-6 обладают дифференцировочной активностью в отношении клеток линий миелобластного и эритробластного лейкозов HL-60 и К-562. МП-4 и МП-6 увеличивают уровень экспрессии диффе-ренцировочных антигенов CD 14, CD38 и CD44, снижают уровень пролиферации властных клеток, вызывают характерные морфологические изменения. В связи с этим представляется возможным использование МГТ-4 и МП-6 в комплексной терапии острых лейкозов.

2. Цели и задачи

Целью данной работы является изучение дифференцировочных свойств и анализ возможных механизмов действия миелопептидов МП-4 и МП-6 на лейкозных клеточных линиях HL-60 и К-562.

В рамках данной работы решались следующие задачи

1. Изучить дифференцировочные свойства миелопептидов МП-4 и МП-6 на модели лейкозных клеточных линий HL-60 и К-562 по различным показателям дифференцировочного процесса;

2. Исследовать характер связывания МП-4 с клетками линии HL-60 и оценить возможность его проникновения внутрь клетки;

3. Определить влияние МП-4 на активацию/ингибирование компонентов системы MAP - киназ в клетках линии HL-60;

4. Изучить роль ионов Са2+ в индукции дифференцировки клеток HL-60 под влиянием МП-4.

Обзор Литературы

выводы

1. МП-4 и МП-6 являются факторами клеточной дифференцировки. Они индуцируют терминальную дифференцировку лейкозных клеточных линий HL-60 и К-562, что показано по различным показателям: снижению пролиферации, появлению морфологически зрелых клеток, экспрессии дифференцировочных антигенов на клеточной поверхности, проявлению функциональной активности клеток.

2. МП-4 специфически связывается с клетками линии HL-60 (Kd = 1,3 нМ). Затем пептид проникает внутрь клетки и локализуется вокруг клеточного ядра.

3. Проникновение пептида внутрь клетки является энергонезависимым процессом, который зависит от температуры, и, по-видимому, не связан с эндоцитозом.

4. Дифференцировка клеток линии HL-60 под влиянием МП-4 сопровождается увеличением амплитуды Са ответов, при этом МП-4 практически не влияет на базальный уровень свободных ионов Са в клетке, что выгодно отличает его от ряда других дифференцировочных агентов и указывает на перспективность его применения в клинике.

5. МП-4 вызывает ингибирование компонентов системы МАР-киназ JNK и ERK, а также подавляет активность общей формы белка р38, что свидетельствует о влиянии пептида на данные внутриклеточные пути.

6. МП-6 не вытесняет ФИТЦ-МП-4 из мест специфического связывания на поверхности клеток HL-60. В отличие от МП-4, МП-6 вызывает активацию как ERK, так и JNK-киназы, что указывает на различие в механизмах дифференцировочного действия МП-4 и МП-6.