Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Особенности дифференцировки лимфоцитов CD4 у больных туберкулезом легких

На правах рукописи

НИКИТИНА Ирина Юрьевна

ОСОБЕННОСТИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЛИМФОЦИТОВ СБ4 У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 1 АВГ 2013

Москва-2013

005532153

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель: доктор медицинских наук ЛЯДОВА Ирина Владимировна Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор ВАСИЛЬЕВА Ирина Анатольевна

Официальные оппоненты:

АТАУЛЛАХАНОВ Равшан Иноятович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунной биотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России;

КРАСНОПРОШИНА Людмила Ивановна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией иммунологических методов исследования Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (Москва)

УГ

Защита диссертации состоится " » ¿'¿¿^йг-f' 2013 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 208.046.02 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габрического» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «_»_

Ученый секретарь диссертационного совета к.м.н.

2013 г.

Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Туберкулез (ТБ) является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний в мире [Хоменко А.Г.,1996; WHO, 2009]. Предупреждение распространения ТБ требует разработки новых эффективных методов диагностики, профилактики и лечения этого заболевания, что невозможно без понимания механизмов формирования протективного противотуберкулезного иммунитета и патогенеза развития заболевания.

Считается, что основную роль в развитии протективного иммунитета при ТБ играют лимфоциты CD4 типа Thl. Одной из основных характеристик лимфоцитов Thl является способность к продукции ИФН-у-цитокина, который вызывает активацию макрофагов и значительно увеличивает их антимикобактериальную активность [Перельман М.И., 2007; Kaufmann S.H., 2001]. Многочисленные исследования, посвященные изучению Т-клеточного иммунитета при инфекции Mycobacterium tuberculosis (Mtb), показали, что дефицит лимфоцитов CD4 типа Thl и (или) недостаточность продукции этими клетками ИФН-у значительно увеличивают восприимчивость к инфекции и приводят к крайне тяжелому течению ТБ [Casanova J.L., Abel L., 2002; Ottenhoff Т.Н. et al., 2002; Ottenhoff Т.Н., Kaufmann S.H., 2012]. Таким образом, эффективность образования и функционирования лимфоцитов CD4 типа Thl в значительной степени определяет исход инфицирования Mtb. В связи с этим, понимание механизмов, обеспечивающих образование лимфоцитов Thl при ТБ, имеет большое значение.

Лимфоциты Thl представляют собой эффекторную популяцию клеток, которая образуется из наивных лимфоцитов CD4 в процессе антиген-зависимой дифференцировки. Начальные этапы дифференцировки происходят в лимфатических узлах (ЛУ), в которых наивные Т-лимфоциты распознают антиген, пролиферируют, приобретают эффекторные функции и фенотип, характерный для эффекторных клеток (CD62L"CCR7"CD44+CD45RO+) [von Andrian U.H., Mackay C.R., 2000]. Образованные в ЛУ эффекторные лимфоциты мигрируют в периферические ткани, в которых дифференцировка продолжается: клетки претерпевают дальнейшие изменения поверхностного фенотипа и функциональной активности [Лядова И.В., 2008; Kaech S.M. et al., 2002; Kunkel EJ. et al., 2002; Roman E. et al., 2002; Kapina M.A. et al., 2007; Appay V. et al., 2008].

Исследования поздних этапов дифференцировки Т-лимфоцитов CD8, проведенные при вирусных инфекциях, показали, что на этих этапах Т-лимфоциты последовательно меняют экспрессию поверхностных маркеров CD28, CD27, CD57 [Papagno L. et al., 2004; Appay V. et al., 2008], переходя от состояния CD28+CD27+CD57" к состоянию CD28"CD27'CD57" и затем - CD28" CD27"CD57+ и постепенно увеличивая свой цитотоксический потенциал [Brenchley J.M. et al., 2003, Papagno L. et al., 2004; Strioga M. et al., 2011]. Процентное содержание указанных субпопуляций эффекторных клеток отражает степень дифференцировки эффекторных лимфоцитов [Appay V., Dunbar P.R. et al., 2002]. Показано, что степень дифференцировки эффекторных

лимфоцитов CD8 зависит от тяжести инфекционного процесса и ее оценка может быть использована для мониторинга за развитием заболевания [Brenchley J.M. et al„ 2003; Strioga M. et al., 2011].

В то время как дифференцировка эффекторных лимфоцитов CD8 при различных вирусных инфекциях изучена достаточно подробно, дифференцировка эффекторных лимфоцитов CD4 при ТБ почти не исследована. Не ясно, какой субпопуляционный состав имеют эффекторные лимфоциты CD4, какой степени достигает дифференцировка лимфоцитов CD4, как степень дифференцировки влияет на функциональные свойства эффекторных клеток. Не исследованным также является вопрос о том, существует ли взаимосвязь между степенью дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4 и активностью ТБ и можно ли использовать анализ степени дифференцировки эффекторных лимфоцитов для оценки активности ТБ и мониторинга за его течением.

Цель настоящей работы - исследование субпопуляционного состава, функциональной активности и особенностей дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4 при туберкулезе легких.

Задачи исследования:

1. Проанализировать экспрессию различных дифференцировочных маркеров на лимфоцитах CD4 у больных туберкулезом. Выявить комбинации маркеров, позволяющие идентифицировать отдельные субпопуляции и определять степень дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4.

2. Охарактеризовать функциональную активность (продукцию ИФН-у, экспрессию маркеров активации CD69 и CD40L) эффекторных лимфоцитов CD4, находящихся на разных стадиях дифференцировки.

3. Сравнить степень дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4 у больных туберкулезом и здоровых людей (на основе экспрессии маркеров CD27, CD28, CD57).

4. Сравнить степень дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4, специфичных к антигенам микобактерий, у больных туберкулезом, здоровых людей, имеющих контакт с больными туберкулезом, и здоровых людей без установленного контакта с больными (на основе экспрессии маркера CD27).

5. Оценить степень дифференцировки общей популяции лимфоцитов CD4 и лимфоцитов CD4, специфичных к антигенам микобактерий, у больных с различными особенностями течения туберкулеза.

6. Исследовать изменения степени дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4, специфичных к антигенам микобактерий, в процессе лечения туберкулеза.

Научная новизна

Показано, что анализ ко-экспрессии маркеров CD27, CD28 и CD57 на поверхности эффекторных лимфоцитов CD4 позволяет идентифицировать отдельные субпопуляции эффекторных лимфоцитов CD4 и определять

отдельные стадии их дифференцировки: СШТСШ%+С05Т, CD2TCШ%+CDST, С027"С028"С057-, С027"СВ28-С057+.

Продемонстрировано, что туберкулез сопровождается накоплением в крови высокодифференцированных эффекторных лимфоцитов СБ4, имеющих фенотип СБ27", и их субпопуляции - СтТСШ%+СВ5Т.

Выявлено снижение протективных свойств и способности к активации эффекторных лимфоцитов СЭ4, находящихся на терминальных стадиях дифференцировки (С027"СВ28"С057-, С027"СВ28-СБ57+).

Показано, что туберкулез сопровождается накоплением в крови МЛ-специфичных лимфоцитов С04, имеющих фенотип СБ27". Определено пороговое значение процентного содержания данной популяции, отличающее больных туберкулезом от лиц с инфицированием МЛ (31.2%, чувствительность - 82%; специфичность - 90%).

Впервые выявлена ассоциация между накоплением Л//6-специфичных лимфоцитов СБ27" в крови больных туберкулезом и степенью деструкции легочной ткани. Продемонстрировано, что определение процентного содержания М/Ь-специфичных лимфоцитов С027" в крови позволяет оценивать степень деструкции легочной ткани и ее репарацию в процессе лечения туберкулеза: содержание ЛЛб-специфичных лимфоцитов СБ27" выше 47% является признаком высокой степени деструкции легочной ткани (чувствительность - 89%, специфичность - 74%); уменьшение содержания данных клеток в процессе лечения туберкулеза является признаком репарации (заживления) легочной деструкции.

Практическая значимость

Полученные в работе результаты важны для понимания общих закономерностей развития протективного Т-клеточного ответа при туберкулезе, а также для разработки новых подходов к диагностике и мониторингу туберкулеза. В работе получены данные о накоплении в крови больных туберкулезом популяции М/й-спсцифичных лимфоцитов С027", и установлены пороговые значения процентного содержания данной популяции, отличающие больных туберкулезом от лиц с инфицированием МЛ\ больных туберкулезом с высокой степенью деструкции легочной ткани от больных с менее выраженными деструктивными изменениями. Эти результаты могут быть использованы в клинической практике для дифференциальной диагностики активного туберкулеза и инфицирования МЛ, мониторинга за репарацией легочной ткани в процессе лечения туберкулеза.

Положения выносимые на защиту 1. Анализ ко-экспрессии маркеров СБ62Ь, СЭ27, С028, СЭ57 позволяет выявить четыре основные субпопуляции эффекторных лимфоцитов СБ4 при туберкулезе: С0271С028>СЭ57\ С027"С028'С057\ СВ27С028"СВ57-, С027' С028'С057 . Наибольшей способностью отвечать на антигены микобактерий активацией и продукцией ИФН-у обладают субпопуляции СВ27+СБ28+СВ57" и СВ27СБ28+С057\

2. Туберкулез сопровождается накоплением в крови больных МЛ-специфичных лимфоцитов СБ4 с фенотипом СБ27". Определение процентного содержания Мб-специфичных лимфоцитов С04, имеющих фенотип С027", позволяет дифференцировать больных активным туберкулезом от лиц с инфицированием МЛ.

3. У больных туберкулезом накопление Мй-специфичных лимфоцитов СБ4, имеющих фенотип С027", ассоциировано со степенью деструкции легочной ткани. Определение процентного содержания данных клеток позволяет отличить больных с высокой степенью деструкции легочной ткани от больных с менее выраженными деструктивными изменениями и проводить мониторинг за заживлением легочной ткани в процессе лечения.

Внедрение результатов исследования

По материалам диссертационной работы получен патент «Способ оценки эффективности лечения и динамики деструктивных изменений в легочной ткани при туберкулезе легких» (патент на изобретение №2447445; зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 апреля 2012 г). Получено положительное решение о выдаче двух патентов на изобретение: «Способ оценки эффективности лечения туберкулеза легких» (от 07.12.2011, регистрационный номер 2011149566); «Способ оценки активности туберкулезного процесса и степени деструкции легочной ткани» (от 07.12.2011, регистрационный номер 2011149565).

Результаты диссертационного исследования используются в отделе фтизиатрии ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН для оценки активности туберкулеза и мониторинга заболевания; материалы диссертации используются в курсе лекций для ординаторов и аспирантов ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН.

Апробация работы

Апробация работы состоялась на научной конференции отдела иммунологии ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН (протокол №14 от 12 декабря 2012 года). Основные положения диссертации были представлены на Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), Научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 90-летию ЦНИИТ РАМН и Всемирному дню борьбы с туберкулезом (Москва, 2011, 2012 г.г.), X Конференции иммунологов Урала (Тюмень, 2012), III Европейском конгрессе по иммунологии (Глазго, Великобритания, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 8 в рецензируемых изданиях.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 138 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, девяти глав с изложением результатов собственных исследований, заключения и выводов. Список

литературы включает 197 источника, из них 20 отечественных и 177 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 11 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Характеристика больных туберкулезом легких. В исследование были включены 84 больных, поступивших в ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН для лечения по поводу ТБ, в возрасте от 18 до 80 лет. Все больные имели отрицательный результат теста на инфекцию HIV и подтвержденный диагноз ТБ. У 63 пациентов отмечали впервые выявленный ТБ, 21 имели ранее леченый ТБ (рецидив или неудача первоначального курса терапии). Среди 84 больных диагноз инфильтративный ТБ был поставлен 38 пациентам, фиброзно-кавернозный ТБ - 13, кавернозный ТБ - 5, казеозная пневмония - 6, туберкулёма - 10, очаговый ТБ - 6, диссеминированный ТБ - 6 пациентам.

Характеристика здоровых участников исследования. В исследование были включены: здоровые сотрудники ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН (п=21), работающие в контакте с больными ТБ не менее 1 года (7.0 лет [2.5;17.5]) и не имеющие признаков заболевания ТБ («контакты»); здоровые люди (п=15), не имеющие установленного контакта с больными ТБ и клинических проявлений ТБ.

Все исследования были одобрены этическим комитетом ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН и проведены в соответствии с принципами Хельсинской декларации. Исследования проводили за период с 2008 по 2012 г.г.

Анализ субиопуляционного состава и степени дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4. Степень дифференцировки лимфоцитов CD4 оценивали, определяя процентное содержание наивных лимфоцитов, эффекторных лимфоцитов, а также отдельных субпопуляций эффекторных клеток среди всех лимфоцитов CD4. Образцы крови обрабатывали смесью моноклональных антител (мАт), специфичных к маркерам CD4, CD45RO, CD27, CD28, CD57 (BD Biosciences, США) и CD62L (e-Bioscience, США). Популяции идентифицировали методом проточной цитометрии.

Анализ продукции ИФН-у субпопуляциями эффекторных лимфоцитов CD4, находящимися на разных стадиях дифференцировки. Для выявления ИФН-у-продуцирующих клеток образцы крови культивировали in vitro в присутствии сониката Mtb (ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН) и блокатора комплекса Гольджи «GolgiPIug» (BD Biosciences, США). По окончании инкубации клетки обрабатывали мАт, специфичными к поверхностным маркерам CD4, CD62L, CD27, CD28 и CD57 и внутриклеточному ИФН-у (BD Biosciences, США). Популяции ИФН-у-продуцирующих клеток идентифицировали методом проточной цитометрии.

Анализ способности к активации субпопуляций эффекторных лимфоцитов CD4, находящихся на разных стадиях дифференцировки. Для определения способности различных субпопуляций эффекторных лимфоцитов CD4 к активации, определяли содержание в них лимфоцитов, отвечающих на

стимуляцию антигенами Mtb экспрессией молекул CD69 (внутриклеточно) или CD40L (поверхностно). Для выявления лимфоцитов, экспрессирующих CD69, образцы крови культивировали in vitro, как описано выше. После окончания культивирования, клетки обрабатывали мАт, специфичными к поверхностным маркерам CD4, CD62L, CD27, CD28, CD57 и внутриклеточному CD69 (BD Biosciences, США). Для выявления лимфоцитов, экспрессирующих маркер CD40L, инкубацию образцов крови выполняли в присутствии сониката Mtb и мАт анти-С040 (BD Biosciences, США). По окончании инкубации клетки обрабатывали мАт, специфичными к CD4, CD62L, CD27, CD28, CD57 и CD40L (BD Biosciences, США). Популяции лимфоцитов, экспрессирующих CD69 и CD40L, идентифицировали методом проточной цитометрии.

Определение степени дифференцнровки ЛЛй-специфичных лимфоцитов CD4. Для определения степени дифференцнровки лимфоцитов CD4, специфичных к антигенам Mtb, выявляли лимфоциты CD4, отвечающие на стимуляцию антигенами Mtb продукцией ИФН-у (клетки «ИФН-у+»), Среди этих клеток определяли процентное содержание клеток CD27" (клетки «ИФН-y+CD27"»). Для этого, образцы крови культивировали in vitro (см. выше). В качестве негативного контроля использовали образцы крови, культивированные без добавления стимула. По окончании инкубации все клетки обрабатывали мАт, специфичными к поверхностным маркерам CD4, CD27 и внутриклеточному ИНФ-у. Популяции клеток ИФН-у+ и ИФН-у+СБ27" идентифицировали методом проточной цитометрии.

Абсолютное количество клеток ИФН-у+С027\ содержащееся в 1 мл крови, рассчитывали по формуле:

N H®H-y+CD27- = PCD27- * РиФН-у+ * PCD4+ * Чимф/(100)3, где PcD27- - процентное содержание клеток CD27" среди клеток ИФН-у+; РНФ,,_.Г-процентное содержание клеток ИФН-у+ среди лимфоцитов CD4; PCD4+-процентное содержание лимфоцитов CD4 среди всех лимфоцитов; Ншмф-абсолютное количество лимфоцитов, содержащееся в 1 мл крови, подсчитанное на гематологическом анализаторе Coulter A-Tdiff (Beckman Coulter, США).

Анализ содержания ДЛй-специфичных лимфоцитов CD4 в тканях легкого больных туберкулезом. Для определения содержания Mtb-специфичных лимфоцитов CD4 в фокусе инфекции Mtb в легочной ткани и анализа их степени дифференцнровки, из операционного материала (пораженного участка легочной ткани, хирургически удаленного во время операции) получали суспензии клеток. Клетки культивировали, обрабатывали мАт и определяли содержание в суспензии клеток ИФН-у+СБ27" с помощью проточной цитометрии, как это описано выше для клеток крови.

Проточная цитометрия. Все образцы клеток анализировали на проточном цитофлоуриметре FACSsort (BD Biosciences), используя программное обеспечение CellQuest. Полученные результаты обрабатывали в программе FlowJo (Tree Star).

Метод «QuantiFERON ТВ-Gold in-Tube». Для выявления инфицирования Mtb у здоровых людей и «контактов» использовали тест «QuantiFERON®TB Gold In-Tube» («QFT»). Тест проводили согласно рекомендациям

производителя (Cellestis Ltd, Carnegie, Australia). Результаты анализировали с использованием программного обеспечения «QuantiFERON-TB Gold Analysis Software» (Cellestis Ltd, Carnegie, Australia).

Статистический анализ. Для статистической обработки полученных данных использовали пакеты программ «MS Excel», «SPSS» (версия 18.0), «Prizm 4.0» (GraphPad Software Inc.) и «R» (http://www.r-project.org). Количественные данные представлены в виде медианы с указанием первого и третьего квартиля Me [Q1;Q3]. Для сравнения параметров использовали непараметрический критерий Манна-Уитни и Вилкоксона. Гипотезы рассматривались как статистически достоверные при р<0.05. Пороговые значения, чувствительность и специфичность методов определяли с помощью построения ROC-кривых (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Для выявления корреляционных связей использовали непараметрический тест по Спирмену («SPSS» и «R»). Для выявления множественных связей между несколькими параметрами проводили многопараметрический регрессионный анализ («R»). Выбор «оптимальной» модели линейной регрессии проводили с использованием F-теста и информационного критерия Акаике (AIC, «R») [Bates D.M., 1988; Efron В., 1993; Burnham K.P., 2002]. Для проверки данных, полученных при выборе оптимальной модели линейной регрессии, использовали метод «bootstrapping» [Burnham K.P., 2002].

Результаты исследований

1. Использование маркеров CD45RO, CD62L, CD27, CD28, CD57 для анализа субпопуляционного состава и степени дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4. Основной целью настоящей работы являлся анализ состояния дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4 при ТБ. Известно, что эффекторные лимфоциты образуются из наивных лимфоцитов в процессе антиген-зависимой дифференцировки. Популяция эффекторных лимфоцитов обычно гетерогенна по своему составу и включает в себя субпопуляции, находящиеся на разных стадиях дифференцировки. Исследования, проведенные на моделях вирусных инфекций, показали, что важными маркерами дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD8 являются молекулы CD28, CD27 и CD57: эффекторные лимфоциты CD8 первоначально имеют фенотип CD27+CD28+CD57", а по мере дифференцировки, теряют экспрессию рецепторов CD28 и CD27 и начинают экспрессировать рецепторы CD57 [Аррау V., Zaunders J.J. et al., 2002; Appay V., Rowland-Jones S. L., 2004; Appay V. et al., 2008]. Характер экспрессии данных дифференцировочных маркеров на лимфоцитах CD4, особенности субпопуляционного состава и степень дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4 при ТБ изучены мало. В связи с этим первый этап настоящей работы был посвящен анализу поверхностного фенотипа эффекторных лимфоцитов CD4 и выбору маркеров, позволяющих идентифицировать различные субпопуляции этих клеток при ТБ.

Эффекторные лимфоциты идентифицировали, определяя экспрессию на лимфоцитах CD4 маркеров CD45RO и CD62L; субпопуляционный состав

эффекторных лимфоцитов исследовали, анализируя экспрессию на эффекторных лимфоцитах молекул CD27, CD28, CD57.

В зависимости от экспрессии на лимфоцитах CD4 молекул CD45RO и CD62L у больных ТБ можно было выделить три основные популяции клеток: CD45RO"CD62L+ (наивные), CD45RO+CD62L+ (клетки центральной памяти, Тем), CD45RO+CD62L" (клетки эффекторной памяти/эффекторные лимфоциты, Teff/em). Четвертая популяция - клетки с фенотипом CD45ROCD62L", - была немногочисленной и составляла менее 15% от всех лимфоцитов CD4 (рис. 1 А). По данным литературы, эта популяция представляет собой эффекторные клетки памяти, экспрессирующие маркер CD45RA (Temra). При дальнейшем анализе субпопуляционного состава эффекторных клеток, мы объединили популяции CD45RO+CD62L" и CD45RO"CD62L" и ввели понятие «все эффекторные клетки» (клетки с фенотипом CD62L").

(«ТД»)

Рисунок 1. Характер ко-экпрессии маркеров CD45RO, CD62L, CD27, CD28, CDS7 на поверхности лимфоцитов CD4

А, идентификация эффекторных клеток по экспрессии CD45RO (ось Y) и CD62L (ось X) в популяции лимфоцитов CD4 (п=12); Б, экспрессия молекул CD27 на поверхности всех эффекторных клеток (CD62L") В, экспрессия молекул CD28 (ось Y), CD57 (ось X) на поверхности эффекторных клеток CD27"; Г, экспрессия молекул CD28 (ось Y), CD57 (ось X) на поверхности эффекторных клеток CD27+; Тем - клетки центральной памяти; Teff/em -клетки эффекторной памяти/ эффекторные лимфоциты; Temra - клетки эффекторной памяти, экспрессирующие CD45RA; «ТД» - «терминально-дифференцированные» клетки.

Анализ экспрессии молекулы CD27 на поверхности лимфоцитов CD4 показал, что наивные лимфоциты имели фенотип CD27+, а эффекторные клетки состояли из двух популяций, - CD27+ и CD27" (рис. 1 Б). Данные литературы свидетельствуют о том, что популяция эффекторных клеток CD27" является более зрелой и образуется из эффекторов CD27+ [Kapina М.А. et al., 2007]. В

связи с этим, в настоящей работе для обозначения эффекторных лимфоцитов CD27+ и CD27" мы использовали термины «ранние» и «поздние» эффекторы, соответственно.

Анализ экспрессии на эффекторных лимфоцитах CD4 рецептора CD28 (ко-стимуляторный рецептор, экспрессия которого снижается на поздних стадиях дифференцировки) и маркера CD57 (маркер терминальной дифференцировки клеток, экспрессия которого появляется на поздних стадиях дифференцировки) показал, что популяция эффекторов CD27+ была гомогенна: более 95% клеток экспрессировали на своей поверхности рецептор CD28 и не экспрессировали молекулы CD57 (рис. 1 Г). Напротив, популяция CD27" была гетерогенна и включала в себя три субпопуляции эффекторных клеток: CD27"CD28+CD57" (здесь и далее для краткости обозначаемая как «CD28+»), CD27"CD28"CD57" («CD28-») и CD27"CD28"CD57+ («CD57+», рис. 1 В). В литературе, потеря экспрессии на Т-лимфоцитах рецептора CD28 считается признаком клеточного старения, а появление экспрессии молекул CD57 — маркером терминальной стадии клеточной дифференцировки [Brenchley J.M. et al., 2003; Vallejo A.N., 2005]. Учитывая это, для обозначения выявленных нами субпопуляций эффекторных лимфоцитов CD27" («поздних» эффекторов) мы использовали следующие термины: для субпопуляции CD28+ - «зрелые» эффекторы (дополнительное обоснование термина приводится ниже), CD28" «стареющие», CD57+ - «терминально-дифференцированные» эффекторы.

В целом, анализ ко-экспрессии маркеров CD62L, CD27, CD28, CD57 позволил выделить две популяции эффекторов CD62L"CD27+ (CD27+, «ранние») и CD62L"CD27" (CD27", «поздние»), а среди «поздних» эффекторов субпопуляции CD27CD28+CD57" (CD28+, «зрелые»), CD27CD28CD57" (CD28", «стареющие»), CD27"CD28"CD57+ (CD57+, «терминально-

дифференцированные»). Сопоставление полученных результатов с данными литературы позволяет заключить, что выявленные субпопуляции представляют собой последовательные стадии дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4 (рис. 2).

2. Способность к продукции ИФН-у и антнген-индуцированной активации субпопуляций эффекторных лимфоцитов CD4, находящихся на разных стадиях дифференцировки. При ТБ основным цитокином, продуцируемым эффекторными Т-лимфоцитами и обеспечивающим протективный ответ, считается ИФН-у. В связи с этим, мы исследовали способность эффекторных лимфоцитов CD4, находящихся на разных стадиях дифференцировки, к продукции данного цитокина.

Образцы крови получали от больных ТБ, стимулировали антигенами Mtb и определяли содержание ИФН-у-продуцирующих клеток в популяции наивных лимфоцитов и отдельных субпопуляциях эффекторных клеток.

Проведенный анализ показал, что основными продуцентами ИФН-у были эффекторные лимфоциты CD27+ и CD27" (рис. 3 А). При этом популяция эффекторов CD27" содержала достоверно больше ИФН-у-продуцирующих клеток, чем популяция эффекторов CD27+ (1.4% [0.5;2.9] и 0.4% [0.2;0.6], соответственно, р<0.001). Среди эффекторных лимфоцитов CD27" основной

субпопуляцией, отвечающей на стимуляцию антигенами Mtb продукцией ИФН-у, являлась субпопуляция CD28. а субпопуляции CD28" и CD57+ содержали достоверно меньший процент ИФН-у-продуцирующих клеток (1.05% [0.37;2.37], 0.14% [0.05;0.19] и 0.02% [0.01;0.15], соответственно, р<0.005). Эти результаты согласуются с данными, опубликованными группой исследователей под руководством F. Kern, которые также отмечали низкую способность к продукции ИФН-у у лимфоцитов CD28" [Streitz M.et al., 2007].

CD62L

(наивные лимфоциты)

CD62L"

(эффекторные лимфоциты)

Лг

CD2f («ранние»)

CD27* CD281 CD57'

/"-

CD28" («зрелые»)

CD27"

(«поздние» эффекторы) _^

N

CD28'

(«стар

CD27" CD28* CD57'

CD57+ («ТД»)

CD27' CD27"

CD28" CD28" CD57" CD57

Рисунок 2. Схема изменения поверхностного фенотипа лимфоцитов CD4 по мере

дифференцировкп

Жирным шрифтом выделены обозначения различных популяций лимфоцитов CD4, принятые в настоящей работе (CD62L+ - «наивные»; CD62L" - эффекторные; CD27+ -«ранние»; CD27" - «поздние»; CD28+ - «зрелые»; CD28" - «стареющие»; CD57+ -«терминально-дифференцированные»);

Нижним подчеркиванием обозначены изменение экспрессии маркеров на поверхности эффекторных лимфоцитов CD4 по мере их дифференцировкп.

Полученные данные о низкой способности эффекторов С 028" и С 057 к продукции ИФН-у поставили вопрос о способности этих клеток отвечать на антигенную стимуляцию. Для ответа на этот вопрос исследовали способность различных субпопуляций эффекторных лимфоцитов С04 к активации в ответ на стимуляцию антигенами МЛ. Об активации лимфоцитов судили по повышению экспрессии маркеров активации С069 (внутри клетки) и С040Ь (на поверхности клетки).

Клетки, экспрессирующие маркеры активации С069 и СБ40Ь, практически отсутствовали в популяции наивных лимфоцитов, но обнаруживались в популяциях эффекторных клеток - как СП27+, так и С027". Среди эффекторов С027", активированные клетки (С069+ и С0401Г) обнаруживались почти исключительно в субпопуляции С028+ (рис. 3 Б).

Эти данные свидетельствовали о том, что эффекторы С028+ представляют собой функционально наиболее зрелую и «реактивную» субпопуляцию

эффекторных лимфоцитов СБ4, в связи с чем для их обозначения в работе использовали термин «зрелые» эффекторы.

„=0.0005 п=0М1

n-o.rns р=0.001

»-0.052

1 ,'0.6

*г

cd62l*cd27*cmr cd28*cd28'cd57+

„•>0.03 /1=0.01 11=0.03 ¡1=0.03

0=0. Об

11=0.09

' i 1...

cd62i/cd27* cd27

cd28*cd28"cds7*

л-ftm 11=0.03 i>=o.o.i »-o.m 0=0.03

11=0.06

¡1=0.15

v 4.... ^ T7

cd62l*ci>27* cd27" ci>28*cms* cd57*

Рисунок 3. Функциональные свойства различных популяций лимфоцитов CD4

А, Процент ИФН-у-продуцирующих клеток среди различных популяций лимфоцитов C.D4 (п=12);

Б, Экспрессия молекул CD69 (слева) и CD40L (справа) на различных популяциях лимфоцитов CD4 (п=6);

Слева от прерывистой черты показаны популяции наивных клеток, эффекторов CD27+ и CD27", справа от черты субпопуляции эффекторов CD27". Популяции лимфоцитов CD4 обозначены в соответствии с рис. 2. Сравнительный анализ проводили с помощью непараметрического критерия Вилкоксона, результат считали достоверным при р<0.05.

Таким образом, при ТБ лимфоциты, обладающие способностью к активации и продукции ИФН-у в ответ на стимуляцию антигенами Mtb, присутствовали в популяции «ранних» эффекторов CD27+, в большем количестве — в субпопуляции «зрелых» эффекторов CD28+ и значительно в меньшем - в популяциях «стареющих» и «терминально-дифференцированных» эффекторов (C.D28" и CD57+).

3. Анализ субпопуляциоиного состава эффекторных лимфоцитов CD4 у больных туберкулезом и здоровых людей (на основе экспрессии маркеров CD27, CD28, CD57).

Поскольку любой инфекционный процесс сопровождается образованием эффекторных лимфоцитов и их дальнейшей дифференцировкой, мы поставили вопрос о том, какой степени достигает дифференцировка лимфоцитов CD4 у больных ТБ и различается ли субпопуляционный состав эффекторных лимфоцитов CD4 у больных ТБ и здоровых людей. Для ответа на поставленный вопрос у больных ТБ и здоровых людей определяли процентное содержание наивных лимфоцитов, эффекторных лимфоцитов и различных субпопуляций эффекторных клеток.

Процентное содержание наивных и эффекторных лимфоцитов у больных ТБ и здоровых людей достоверно не отличалось (хотя наблюдалась тенденция к

более низкому содержанию наивных лимфоцитов и более высокому содержанию эффекторных лимфоцитов у больных ТБ, р=0.09 и р=0.1, соответственно, рис.4 А, Б).

Среди эффекторных лимфоцитов, у больных ТБ отмечалось более высокое содержание эффекторов С027" (12.9% [9.5;23.9] у больных и 8.4% [5.7;14.9] у здоровых, р<0.05, рис. 4 В). Анализ содержания субпопуляций эффекторов СБ27" показал, что у больных ТБ по сравнению со здоровыми людьми, было выше содержание клеток С028+ (8.7% [6.5;12.3] и 6.3% [4.1;8.8], соответственно, р<0.05, рис. 4 Г), для субпопуляций С028" и СБ57+ достоверных различий между больными ТБ и здоровыми людьми выявлено не было, хотя у некоторых больных ТБ отмечали существенное (в 3-5 раз по сравнению с группой здоровых людей) увеличение содержания этих клеток.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что в крови больных ТБ происходит накопление эффекторных лимфоцитов СБ27" и их субпопуляции -эффекторов СБ28+, т.е. у больных ТБ популяция эффекторных лимфоцитов СБ4 была представлена клетками более дифференцированными, чем у здоровых людей.

наивные CD62I/

эффекторы CD62L"

здоровые больные Т Б

здоровые больные Т Н

В эффекторы СР27" Г эффек-горы СР2Г Д эффекторы CD28" Е эффекторы CD57*

х "Ют гт:- it 50п-:- .. . ...........

здоровые больные ТБ

здоровые больные ТБ

здоровые больные ТБ

здоровые больные ТБ

Рисунок 4. Процентное содержание популяций лимфоцитов CD4 у больных туберкулезом и здоровых людей

Показано процентное содержание (медиана, 25% и 75% квартиль) следующих популяций у больных ТБ (п=42) и здоровых людей (п=15):

А, наивные лимфоциты (CD62L+); Б, эффекторные лимфоциты (CD62L"); В, эффекторные лимфоциты CD27"; Г, эффекторные лимфоциты CD28+; Д, эффекторные лимфоциты CD28"; Е, эффекторные лимфоциты CD57+;

Сравнительный анализ проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, результат считали достоверным при р<0.05.

Мы проанализировали, имеется ли взаимосвязь между процентным и абсолютным содержанием у больных ТБ отдельных субпопуляций эффекторных лимфоцитов CD4 и особенностями течения заболевания. Была выявлена прямая корреляция между процентом эффекторных лимфоцитов CD27" и тяжестью (активностью) ТБ, оцениваемой по степени деструкции легочной ткани (rho=0.41, р=0.007), а также количеству в мокроте Mtb

(rho=0.49; p<0.007). Кроме того, была отмечена ассоциация между высоким содержанием в крови эффекторов CD57+ и тяжелым клиническим течением ТБ (р<0.05). Корреляционный анализ не выявил достоверных связей между абсолютным содержанием отдельных субпопуляций эффекторных лимфоцитов CD4 и особенностями течения заболевания.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что более тяжелое течение ТБ сопровождается не недостаточностью образования эффекторных лимфоцитов, а напротив, более высокой степенью их дифференцировки.

4. Степень дифференцировки М/б-специфичных лимфоцитов CD4 у больных туберкулезом, «контактов» и здоровых людей (на основе экспрессии маркера CD27). В предыдущем разделе были приведены данные по субпопуляционному составу и степени дифференцировки всех лимфоцитов CD4. В следующей части работы мы поставили задачу оценить степень дифференцировки лимфоцитов CD4, специфичных к антигенам Mtb. Для идентификации ЛЛА-специфичных клеток использовали часто применяемый подход - выявление с помощью проточной цитометрии клеток, отвечающих на стимуляцию антигенами Mtb, продукцией ИФН-у («Mfè-специфичные» лимфоциты или клетки «ИФН-у+», рис. 5 А). Сравнительный анализ процентного содержания клеток ИФН-у+ показал, что у больных ТБ содержание данных клеток было достоверно выше, чем у здоровых людей. Однако различий между содержанием клеток ИФН-у+ у больных ТБ и «контактов» выявлено не было (р=0.7). Это согласуется с данными других исследований, в которых сообщается о невозможности дифференцировать активный ТБ и инфицирование Mtb с помощью широко используемых методов IGRAs, основанных на определении концентрации ИФН-у+ в плазме крови (Ling D. I. et al., 2011; Pinto L. M. et al., 2012).

Оценку степени дифференцировки клеток «ИФН-у+» проводили по экспрессии CD27, т.е., определяя процентное содержание среди них эффекторов CD27" (клетки «ИФН-у+С027~», рис. 5 Б). Оценку степени дифференцировки клеток ИФН-у+ по другим маркерам (CD28, CD57) не проводили, поскольку, как показано выше, такие клетки не отвечают на стимуляцию антигенами Mtb продукцией ИФН-у.

Было обнаружено, что у больных ТБ процентное содержание клеток ИФН-y+CD27" было существенно выше (47.3% [33.2;63.6]), чем у здоровых людей (33.2% [16.8;39.5], р<0.0005, рис. 5 В) и «контактов» (21.8% [18.0;28.5], pO.OOOl, рис. 5 В).

Поскольку больные ТБ и «контакты» отличались по процентному содержанию клеток ИФН-у+С027", а дифференциальная диагностика активного ТБ и инфицирования Mtb является важной и пока не решенной задачей, мы проанализировали возможность дифференцировки больных ТБ и всех здоровых участников, в том числе и «контактов», по содержанию клеток ИФН-у'CD27".

По данным ROC-анализа пороговое значение процентного содержания клеток ИФН-у'СD27" в крови, равное 31.2%, отличало больных ТБ от «контактов» с чувствительностью 82% и специфичностью 90%, а пороговое значение, равное 35.1%, отличало больных от всех здоровых участников

(здоровых людей и «контактов») с чувствительностью 74% и специфичностью 83% (рис. 5 Г). Эти результаты хорошо согласуются с результатами исследований Sreitz М. и соавт [Streitz М. et al., 2007], которые показали более высокое содержание Mró-специфичных лимфоцитов CD27" у больных ТБ по сравнению с «контактами» и возможность проведения дифференциальной диагностики активного ТБ и инфицирования Mtb по содержанию данных клеток.

Основываясь на полученных результатах, в дальнейших исследованиях мы использовали порог 35.1% как верхнюю границу нормы.

А Б В Г

CD4

62.5%

24 -10 <¡0 80 100

tOO'/o - CUf [шф|[<]|Г1К П.%

ИФН-у С 1)27

Рисунок 5. Оценка степени дифференцировки М/й-специфичных лимфоцитов CD4 по экспрессии молекул CD27 у больных туберкулезом, «контактов» и здоровых людей

Принцип идентификация АЛб-специфичных клеток ИФН-у+ (А) и их субпопуляции CD27" (клеток ИФН-у+С027", Б) методом проточной цитометрии; В. процентное содержание клеток H®H-y+CD27" у больных (п=50), «контактов» (п=21) и здоровых людей (п=15); Г, ROC-анализ определения порогового значения процентного содержания клеток t№H-y+CD27", отличающего больных ТБ от всех здоровых участников; AUC (area under curve) - площадь под характеристической кривой операционной характеристики;

Сравнительный анализ проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, результат считали достоверным при р<0.05.

5. Особенности степени дифференцировки М/й-специфичных лимфоцитов CD4 у больных с различным течением туберкулезного процесса. При анализе содержания клеток M4>H-y+CD27~ у больных ТБ было обнаружено, что их процентное содержание существенно варьирует (от 12 до 95%, рис. 5 В). Было предположено, что такая вариабельность может быть связана с особенностями течения ТБ. Для проверки этого предположения, мы проанализировали наличие ассоциации между содержанием в крови клеток ИФН-у+С027" и различными характеристиками ТБ (представлены в таблице 1).

Корреляционный анализ по Спирмену показал, что наиболее значимыми коррелятами высокого содержания в крови клеток ИФН-у+CD27~ являлись: степень деструкции легочной ткани (rho=0.65, р=2.7х10"7), клиническая тяжесть заболевания (rho=0.63, р=7.7х10"7), наличие и выраженность патологических изменений в OAK (rho=0.49, р-ЗхКГ4). Достоверная (но существенно более низкая) корреляция была выявлена между содержанием клеток ИФН-у+С027" и: а) количеством в мокроте Mtb (rho=0.41, р=0.003); б) распространенностью ТБ в легких (rho=0.42, р=0.003).

Поскольку корреляционный анализ выявил несколько факторов, ассоциированных с накоплением в крови больных ТБ клеток ИФП-у"С027~,

важно было определить, какие из выявленных факторов были наиболее значимыми.

Таблица 1

Основные характеристики туберкулеза, включенные в анализ

Характеристики ТБ Пояснения

Длительность ТБ Впервые выявленный ТБ; Ранее леченый ТБ

Количество п .мок-рогсИ//А отсутствие МгЬ в мокроте; 10-99 КУМ в 100 н/зр (или 1-20 КОЕ в 1мл образна); 1-10 КУМ в п/эр; >10 КУМвп/зр

Лекарственная устойчивость М/Ь Отсутствие лекарственной устойчивости (Б); Монорезистентность (РЯ); Множественная лекарственная устойчивость (МОЯ); Широкая лекарственная устойчивость (ХГЖ)

Распространенность ТБ 1-3 сегмента в разных долях легкого; > 4 сегментов в разных долях пли 1 -2 доли; 3 доли в разных легких; Целое легкое или оба легких

Степень деструкции легочной ткани Отсутствие ПР; Одпа небольшая ПР (<2см); Несколько небольших или одна крупная ПР (>2см); Множественные ПР (>2см)

Наличие и выраженность патологических изменений в ОДК (повышение СОЭ, лейкоцитоз, лимфопенпя, налочкоядернын сдвиг влево) Отсутствие патологических изменений в ОАК; Изменение одного показателя; Изменение двух показателен; Изменение трех и более показателен

Клиническая тяжесть (повышение 1, симптомы интоксикации) Отсутствие симптомов и (|10ГМ Два симптома и Несколько симптомов к Цо^; Несколько симптомов и

Примечание. КУМ — кислотоустойчивые микобактерии; КОЕ — колониеобразующая единица; OAK - общий анализ крови; СОЭ - скорость оседания эритроцитов; t - температура тела; S - sensitivity to drug; DR - drug resistant; MDR - multiple drug resistant; XDR -extensively drug resistant; ПР - полость распада.

Множественный регрессионный анализ показал, что основными коррелятами высокого содержания в крови клеток HcDH-y+CD27" были: высокая степень деструкции легочной ткани и клиническая тяжесть ТБ (р=0.006 и р=0.02, соответственно). Дополнительный анализ, проведенный с использованием методов выбора «оптимальной» модели линейной регрессии (F-теста и критерия AIC) подтвердил, что степень деструкции легочной ткани и клиническая тяжесть заболевания представляли минимальный набор факторов, наилучшим образом объясняющий высокое процентное содержание в крови клеток ИФН-у+СБ27". Аналогичные результаты были получены и при использовании метода «bootstrapping»: степень деструкции легочной ткани и клиническая тяжесть ТБ объясняли высокое содержание клеток PM>H-y+CD27" в

13% и 15% случаев, соответственно, что является достаточно высоким показателем.

6. Оценка деструктивных изменений в легочной ткани путем определения степени дифференцировки ЛМ-спеиифичных лимфоцитов

CD4. Проведенный нами анализ показал, что одним из двух основных коррелятов накопления в крови клеток ИФН-у4СБ27" являлась степень деструкции легочной ткани. В связи с этим был поставлен вопрос о том, можно ли использовать определение процентного содержания клеток ИФН-у'CD27" в крови больных ТБ для оценки степени деструкции в легких.

ROC-анализ показал, что определяя процентное содержание клеток ИФН-y+CD27" можно разграничить больных с высокой степенью деструкции легочной ткани от больных с менее выраженными деструктивными изменениями: порог, равный 47%, разграничивал таких больных с чувствительностью 89% и специфичностью 74% (AUC=0.89, р<0.0001, рис. 6 А).

А Б

^ IDO

| 80

е 60 г

| 40 % 20 г 0

Рисунок 6. Анализ ROC-крнвой и процентное содержание клеток ИФП-у+СГ>27' у больных туберкулезом с различной степенью деструкции легочной ткани

А, ROC-кривая процентного содержания клеток H<T>II-y'CD27', построенная для разграничения больных ТБ с высокой степенью деструкции легочной ткани от больных с менее выраженным! деструктивными изменениями; Б, «валидаццонный» анализ: степень деструкции легочной ткани, оцененная с помощью результатов КТ (ранги), у больных с низким (<47%) и высоким (>47%) процентным содержанием клеток ИФН-у'С1)27" (п=14).

Таким образом, по нашим данным, процентное содержание клеток ИФН-y+CD27" выше 35.1 % позволяло отличать больных ТБ от всех здоровых участников (см. выше, рис. 5 Г), а содержание клеток ИФН-у+CD27" выше 47% -больных ТБ с высокой степенью деструкции легочной ткани от больных с менее выраженными деструктивными изменениями.

Для проверки полученных результатов был проведен дополнительный («валидационный») анализ. В исследование были включены 14 больных ТБ, у которых определяли процентное содержание в крови клеток ИФН-у+СБ27" и, сравнивая полученные результаты с пороговыми значениями 35.1% и 47%, делали заключение об активности ТБ и выраженности деструктивных изменений в легочной ткани. Сделанное заключение сравнивали с результатами лучевых методов исследования легких (КТ и/или рентгенограмма грудной клетки). Результаты представлены на рисунке 6 Б. Чувствительность выявления активного ТБ составила 71%; чувствительность и специфичность выявления

100% - специфичность"/« H<i>irVCD27'kjiciki1, %

высокой степени деструкции легочной ткани составили 71% и 100%, соответственно.

7. Степень дифференцировки М/6-специфичных лимфоцитов СБ4 в ткани легкого больных туберкулезом. Ранее И.В. Лядовой и соавт. [Ьуас1оуа 1.У. е1: а1., 2004; Карта М.А. е1 а1., 2007] было показано, что у мышей образование эффекторных лимфоцитов С027' из более ранних эффекторов СБ27+ может происходить в легочной ткани, в которой вновь образованные эффекторы СИ2Т преимущественно и накапливаются. Мы предположили, что вариабельность процентного содержания клеток ИФН-у+СВ27' в крови больных ТБ может отражать их различное содержание в легочной ткани. Для проверки данной гипотезы был проведен сравнительный анализ процентного содержания клеток ИФП-у+С027" в легочной ткани и крови больных, оперированных по поводу ТБ.

У всех пациентов процентное содержание клеток ИФН-у+С027" в легочной ткани было высоким (>76% от лимфоцитов ИФН-у+). Напротив, в крови содержание клеток ИФН-у+С027" варьировало. Корреляционный анализ показал отсутствие связи между процентным содержанием клеток ИФН-у+С027"в крови и легочной ткани (гИо= - 0.11, р=0.8). Процентное содержание клеток ИФН-у+СЭ27" в легких не было связано ни с одной из характеристик ТБ. Напротив, процентное содержание клеток ИФН-учСЭ27~ в крови восьми исследованных больных было ассоциировано со степенью деструкции легочной ткани (п=8, гЬо=0.88, р<0.01). Эти данные, во-первых, еще раз подтвердили наши результаты, полученные на большей выборке больных (п=50), об ассоциации между накоплением клеток ИФН-у+СБ27" в крови и степенью деструкции легочной ткани. Во-вторых, полученные данные показали, что в крови процент эффекторов С1)27" среди М/6-епеиифичных клеток варьирует не зависимо от содержания этих клеток в легочной ткани.

8. Изменение степени дифференцировки ЛЛ6-специфичных лимфоцитов СЭ4 у больных туберкулезом в процессе лечения. В связи с нашими данными об ассоциации между процентным содержанием в крови больных ТБ клеток ИФН-у^С027", степенью деструкции легочной ткани и клинической тяжестью заболевания, мы исследовали, изменяется ли содержание клеток ИФН-у+СБ27" в процессе лечения ТБ.

Определение содержания клеток ИФН-у+СБ27" у больных ТБ проводили в начале лечения и через 2 месяца интенсивной терапии. В исследование были включены больные с изначально высоким процентным содержанием клеток ИФН-у+СБ27" (выше 35.1%). В зависимости от характера изменений содержания клеток ИФН-у+СБ27' в процессе лечения, пациентов разделили на три группы: группа со стабильно высоким содержанием клеток ИФН-у+СВ27" (п=13); группа с уменьшением содержания клеток ИФН-у+С027" (п=6); группа с нормализацией содержания клеток ИФН-у'С'027~ (п=3, рис. 7 А). В каждой группе проанализировали динамику деструкции легочной ткани, клинических проявлений заболевания, количества в мокроте МЛ.

В ходе лечения у больных из первой группы процентное содержание клеток ИФН-у+СБ27" существенно не изменялось и сохранялось выше 47%. К

концу 2 месяца лечения на рентгенограмме (и/или КТ) у 10 из 13 больных (77%) сохранялись выраженные деструктивные изменения легочной ткани (рис. 7 Б). При этом у 4 из 10 пациентов высокая степень деструкции легочной ткани сохранялась и к концу 4 месяца лечения. А

□

Заживление деструктивных изменений в легких

Время лечения (месяцы)

Уменьшение деструктивных изменений в легких

Сохранение деструктивных изменений в легких

Рисунок 7. Изменение процентного содержания клеток М'1>11-/4 027 в крови и динамика деструктивных изменений в легких у больных туберкулезом в процессе

лечения

А, Деление больных ТБ (п=22) на группы в зависимости от изменения процентного содержания клеток ИФН-у+СБ27" в процессе лечения; Б. Динамика деструктивных изменений в легких у больных каждой группы

Порот 47% - порог, разграничивающий больных с высокой степенью деструкции в легких и больных с менее выраженными деструктивными изменениями; порог 35.1% - порог, разграничивающий больных ТБ от всех здоровых участников.

Во второй группе больных ТБ в ходе лечения наблюдали значительное уменьшение процентного содержания клеток ИФН-у+С027" (однако оно оставалось выше принятой верхней границы нормы - 35.1%). На рентгенограмме (и/или КТ) у 3 из 6 больных (50%) наблюдали уменьшение деструкции легочной ткани к концу 2 месяца лечения (рис. 7 Б), у всех 6 больных - к концу 4 месяца.

У третьей группы больных ТБ к концу 2 месяца лечения происходила полная нормализация процентного содержания клеток ИФН-у+СБ27" (значения становились менее 35.1%). На рентгенограмме (и/или КТ) у всех 3 больных к концу 2 месяца лечения было отмечено полное восстановление/заживление деструктивных изменений легочной ткани (рис. 7 Б).

Таким образом, сохранение высокого процентного содержания клеток ИФН-у+СВ27" в ходе лечения было связано с сохранением деструктивных

изменений в легочной ткани, уменьшение или нормализация содержания данных клеток было связано с уменьшением или полным восстановлением/заживлением участков деструкции. В целом, отмечалась достоверная корреляция между снижением процентного содержания клеток ИФН-у+СБ27" в крови и восстановлением/заживлением поврежденной легочной ткани (гЬо=0.54, р<0.01).

Зависимостей между изменениями процента клеток ИФН-у+С027" и количеством в мокроте МЛ или клинической тяжестью ТБ выявлено не было (гЬо=0.23, р=0.31 и гЬо=0.22, р=0.31, соответственно).

В целом, проведенный анализ степени дифференцировки МЛ-специфичных эффекторных лимфоцитов показал, что: 1) высокое содержание клеток ИФН-у+С027" отличает больных ТБ от людей с инфицированием МЛ; 2) у больных ТБ накопление клеток ИФН-у+С027" в крови ассоциировано со степенью деструкции легочной ткани; 3) уменьшение содержания в крови клеток ИФН-у+С027~ в процессе интенсивной терапии является показателем восстановления/заживления поврежденной ткани легких.

ВЫВОДЫ

1. Анализ экспрессии молекул СЭ27 на лимфоцитах С04 у больных ТБ позволяет выделить две популяции эффекторов: СБ27+ («ранние») и СБ27" («поздние»). Популяция поздних эффекторов С 027" включает три субпопуляции: С027"С028ТС057" («зрелые», «С028+»), С027"С028"С057~ («стареющие», «С028"») и С027"С028"СБ57+ («терминально-дифференцированные», «С057+»).

2. Основными популяциями, отвечающими на микобактериальные антигены активацией (экспрессией маркеров С069 и СБ40Ь) и продукцией ИФН-у, являются популяция эффекторных лимфоцитов СБ27+ и субпопуляция поздних эффекторов С028\ Субпопуляции поздних эффекторов СБ28" и С057+ обладают низкой способностью к антиген-индуцированной активации и продукции ИФН-у.

3. У больных ТБ по сравнению со здоровыми людьми отмечается увеличение процентного содержания в крови популяции поздних эффекторов С027" и их субпопуляции С028 , что свидетельствует о более высокой степени дифференцировки лимфоцитов СЭ4.

4. Процентное содержание М/6-специфичных лимфоцитов С04, выявляемых по продукции ИФН-у в ответ на стимуляцию микобактериальными антигенами, у больных ТБ и «контактов» увеличено по сравнению со здоровыми людьми. Достоверных различий в содержании Мгб-специфичных лимфоцитов С04 между больными ТБ и «контактами» не выявлено.

5. Больные ТБ отличаются от «контактов» более высоким содержанием эффекторных лимфоцитов С027" среди М/6-специфичных лимфоцитов С04 в крови, т.е. более высокой степенью дифференцировки М$-специфичных лимфоцитов С04. Определение процентного содержания эффекторов С027" среди АЛй-спецкфичных лимфоцитов С04 позволяет оценить активность ТБ: содержание клеток выше 35.1% разграничивает больных ТБ от всех здоровых

участников (здоровых людей и «контактов», р<0.0001, чувствительность 74%, специфичность 83%).

6. У больных ТБ отмечается прямая корреляция между процентным содержанием эффекторных лимфоцитов CD27" среди M/6-специфичных лимфоцитов CD4 в крови и степенью деструкции в легких (pO.OOOl). Содержание указанных клеток выше 47% является признаком выраженных деструктивных изменений в легких (чувствительность 89%, специфичность 74%).

7. Изменение процентного содержания лимфоцитов CD27" среди популяции Mtó-специфичных лимфоцитов CD4 в процессе проведения противотуберкулезной терапии позволяет судить о репарации легочной ткани и оценивать эффективность проводимой терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Учитывая уровень распространенности туберкулеза в России и высокий риск инфицирования Mtb, при обследовании пациентов с подозрением на ТБ рекомендуется проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и инфицирования Mtb с помощью определения процентного содержания высокодифференцированных Мй-специфичных лимфоцитов CD4 (клеток H<DH-y+CD27~) в крови (в сочетании с другими методами выявления инфекции Mtb). При правильном диагностическом подходе повышается вероятность точного и своевременного выявления заболевания.

Определение процентного содержания высокодифференцированных Mtb-специфичных лимфоцитов CD4 у больных ТБ в начале и в процессе лечения может быть использовано в качестве дополнительного метода мониторинга за эффективностью лечения.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оценка степени дифференцировки и функциональной активности эффекторных лимфоцитов CD4 у больных туберкулезом легких / Н.С. Шмитова, И.Ю. Конакова (И.Ю. Никитина), H.A. Кондратюк, И.А. Васильева, И.В. Лядова // Научные труды к 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки, проф. М.М. Авербаха. - 2010, М. - С.43.

2. Activation of CD4+T cell differentiation towards CD27", CD28and CD57+ effectors in tuberculosis / I. V. Lyadova, I. Y. Konakova fl.Y. Nikitina), N. S. Shmitova, I. A. Vasilyeva // The Journal of International Immunology: abstracts of 14th International Congress of Immunology. - 2010, Kobe. - PP-061-58.

3. Дифференцировка эффекторных T-лимфоцитов при хронической бактериальной инфекции: маркеры, механизмы и информативность оценки в клинической практике / И.В. Лядова, Н.С. Шмитова, И.Ю. Никитина, И.А. Васильева, H.A. Кондратюк // Медицинская Иммунология. -2011. - Т. 13. - №4-5. - С. 397.

4. Степень дифференцировки T-лимфоцитов CD4 у больных туберкулезом легких / И.Ю. Никитина, Н.С. Шмитова, H.A. Кондратюк,

И.А. Васильева, И.В. Лядова // Медицинская Иммунология. - 2011. - Т. 13. -№ 4-5. - С. 402.

5. Иммунологический метод определения активности туберкулеза легких и выраженности деструктивных изменений в легочной ткани // И.Ю. Никитина.

H.А. Кондратюк, В.В. Ганусов, Р.Б. Амансахедов, И.А. Васильева, И.В. Лядова // Актуальные вопросы борьбы с туберкулезом: материалы юбилейной сессии, посвященной 90-летию ЦНИИТ РАМН. - 2011, М. - С. 135.

6. Использование «интерфероновых тестов» для диагностики и оценки активности туберкулеза легких / И.Ю. Никитина. Н.А. Кондратюк, И.А. Васильева, И.В. Лядова // Актуальные вопросы борьбы с туберкулезом: материалы юбилейной сессии, посвященной 90-летию ЦНИИТ РАМН. - 2011, М. С. 137.

7. Степень дифференцировки Т- лимфоцитов CD4 как новый показатель состояния Т-клеточного иммунитета у больных туберкулезом легких / И.Ю. Никитина // Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей: материалы научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 90-летию ЦНИИТ РАМН и Всемирному дню борьбы с туберкулезом. — 2011, М. - С. 62.

8. Severe tuberculosis induces high degree of CD4 T cell differentiation /

I.V. Lyadova, I.Y. Nikitina, I.A. Vasilyeva, V.V. Ganusov // The Journal of Immunology: meeting abstracts. - 2012, Boston. - P. 25.

9. Исследование возможности применения метода «QuantiFERON-TB Gold In-Tube» для диагностики туберкулеза легких / И.Ю. Никитина // Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей: материалы научно-практической конференция молодых ученых, посвященной Всемирному Дню Борьбы с туберкулезом. — 2012, М. — С. 81.

10. Информативность определения спонтанной и специфической продукции цитокинов для оценки активности туберкулезного процесса / Е.В. Васильева, В.Н. Вербов, И.Ю. Никитина, Н.Е. Любимова, Н.А. Арсентьева, А.В. Семенов, Арег А. Тотолян // Вестник уральской медицинской академической науки. — 2012. - № 4 (41). - С. 99.

11. Исследование степени дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD4 при туберкулезе легких / И.Ю. Никитина, Н.А. Кондратюк, И.А. Васильева, И.В. Лядова // Вестник уральской медицинской академической наукн. — 2012. - № 4 (41). - С. 140-141.

12. Mfé-specific CD27low CD4 Т cells as markers of lung tissue destruction during pulmonary tuberculosis in humans / I.Y. Nikitina, N.A. Kondratuk, G.A. Kosmiadi, R.B. Amansahedov, I.A. Vasilyeva, V.V. Ganusov, I.V. Lyadova // PLoS ONE. - 2012. - Vol.7 (8). - e43733 (13 стр.).

13. The degree of CD4 T cell differentiation as marker of tuberculosis severity and progression / I.Y. Nikitina, E.N. Tsiganov, I.A. Vasilyeva, I.V. Lyadova // The Journal of Immunology: abstracts of the European Congress of Immunology. - Glasgow, 2012. - P. 600.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИФН-у - интерферон - гамма KT — компьютерная томография ЛУ - лимфатический узел мАт — моноклональные антител ТБ — туберкулез AIC — критерий Акаике AUC - area under curve CD - cluster of differentiation HIV - вирус иммунодефицита человека IGRAs - IFN-y assays («интерферонновые» методы) Mtb - Mycobacterium tuberculosis ROC — receiver operator characteristic QFT - «QuantiFERON®TB Gold In-Tube»

Подписано в печать 11 апреля 2013 г. Формат 60x90/16, объём 1,0 п.л. Тираж 100 экз., заказ N2 11041325

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912У772801001 Адрес: 105066, г. Москва, Лефортовский пер., дом 8, корпус 2. Тел. 728-97-17, +7(499)261-78-22. http://www.onlinecopy.ru