Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение экспрессии и регуляции маркеров активации лимфоцитов человека

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ.И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ю РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

о а?

О—

«СС

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На пуавах рукописи

Веселава Атна Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ И РЕГУЛЯЦИИ МАРКЕРОВ АКТИВАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- МОСКВА 1995 -

/ » / У

/ ( -

Работа выполнена в Российском Государственном медицинском университете.

Научный руководитель:

Чпен-корреслондснт РАЕН, профессор, доктор медицинских наук Кооальчук Л.В.

Научный консультант: Доцонт кафедры иммунологии РГМУ. нандидат медицинских наук Паэлхж A.C.

Официальные оппоненты: академик РАЕН, профессор, доктор медицинских наук Ярилин A.A. доктор медицинских наук Стенина М.А,

Ведущее учреждение - Научно-исслс-дооательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Защита диссертации состоится "____"............. 1995г. в

"...."часов на заседании специализированного совета №10841406 Российского Государственного медицинского университета по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Государственного медицинского университета.

Автореферат разослан "—".............. 1995г. •

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Кузнецова Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

• На современном уровне знаний об иммунной системе целесообразным является- переход от э»4пирических подходов при оценке иммунного статуса (каковыми являлись тесты 1-го и П-го уровней) к более совершенным, так называемым "патогенетическим" принципам, которые позволяют охарактеризовать основные механизмы функционирования иммунной системы как "единого целого" и установить уровень патогенетического дефекта (Коваль-чук Л. В.. Чередеев А.Н., 1990: Петров Р.В.. ПавлюкА.С., 1987). При этом речь идет не столько о создании новых методик, сколько о разработке новых подходов в решении данной проблемы.

В связи с этим предлоаено условно разделить процесс функционирования иммунной системы на следующие компоненты: активация, пролиферация, дифференцировка и регуляция. Первым и основополагающим этапом в развитии иммунного ответа является активация клетки. Этот процесс представляет собой сложную последовательность молекулярных, метаболических, морфологических изменений, которые в конечном итоге приводят к прогрессии активированных лимфоцитов по клеточному циклу (Стенина М. А.. 1990).

Одним из признаков, отличающих стимулированные лимфоциты от покоящихся, является появление на их мембране активацион-ных маркеров (АМ). Это группа молекул различной природы, которые объединены на основании следующих свойств: они синтези-

р/ются de novo в процессе активации клетки, и их экспрессия является необходимым условием для вступления в цикл (Afeltra A. et al.. 1993). ,

Первыми, спустя несколько часов после активация, на поверхности лимфоцитов- экспрессирувтся рецепторы для ИЛ-2 (РИЛ-2), а затем наблюдается аутокринный выброс ИЛ-2. Взаимодействие РИЛ-2 и ИЛ-2 является ключевым событием для реализации активационной программы лимфоцитов и приводит к экспрессии других активационных наркероо (ТФР, HLA-DR). Они хоть и не связывают ИЛ-2, но необходимы для его пролиферативного эффекта (Matour D. et al., 1993).

В настоящее время, в связи с актуальность» данной проблемы. много научных работ посвящено установлению роли АН на лимфоцитах периферической крови в норме и при имунопатологи-ческих состояниях (Corrigan С. et al.. 1991; Flser R. et al., 1991). Сформировалось мнение, что регистрация в циркуляции таких Т-лимфоцитов, получивших название "активированные", свидетельствует об нх участии в патогенезе того или иного заболевания. Однако конкретные характеристики . активированных лимфоцитов, особенно в отношении регуляторных субпопуляций (CD1+. CD8+). остаются малоизученкшми.

Исследование процессов активации и экспрессии АМ на лимфоцитах периферической крови (ПК) было выполнено у больных с впервые выявленным туберкулезом легких, поскольку хорошо известно, что ведущим в патогенезе заболевания является клеточ-но-опосредованный иммунитет (Pleasens W.F., 1989). Туберкулез легких отнесен к группе интерлейкинзависимых иммуиодефйцитоэ и имеет выраженный дефект в иммуноцитокиновой сети с дисба-

лансом регуляторных субпопуляций Г-лимфоцитов, свидетельствующем о феномене преактивации In vivo (Петров Р.В.. Пав-люк A.C., Ковальчук Л.В., 1987). Все это говорит о вкладе Т-лимфоцитов в несостоятельность клеточно-опосредованного иммунного ответа при туберкулезе легких. Поэтому нам представлялось ванным исследовать функциональную активность Т-клеток в отношении экспрессии AM на CD4+ и CD8+ субпопуляциях лимфо-цитрв.

Для более углубленного изучения процессов активации целесообразно исследовать изменения Т-лимфоцитов под действием функциональной нагрузки, а качестве которой может быть использовано воздействие на лимфоциты In vitro митогена или антигена, а также иммуномодулирующих агентов, например, циклос-порина-А (ЦО'-А). Кроме того что Up-К широко используется в клинике как мощный иммунодепрессанг, он является тонким инструментом изучения активационных' процессов иммунокомпетентных клеток in vitro (Baunann G., 1992; Stutz A., 1992). Применение ЦС-А в системе in vitro, на нал взгляд, позволяет смоделировать определенные состояния и на основании этого изучить закономерности активации икмуноцитов.

К наиболее адекватным методам, позволяющим исследовать фенотип интактных клеток и изменения, отражающие процессы активации, относят метод проточной цитофлуориметрии с использованием ионоклональных антител (МонАт). Двухцветовая методика окрашивания с одновременным определением дифференцировочных (CD4, CD8) и функциональных маркеров (CDllb, CD2, CD25, CD71, HLA-DR) позволяет провести не только количественный, ко и качественный анализ на уровне регуляторных субпопуляций лимфо-

цитов, более точно лсн&пизсшать дефект активационной способности Т-лимфоцитов (Вескшапп Е. et al.. 1987; Matour D. et al., 1393), Предлагаемый подход создает такяе предпосылки для разработки методов патогенетически обоснованной иимунокоррек-ции.

Все зьшесказанное спидетелъствует об актуальности проблемы, связанной с изучением экспрессии и регуляции маркеров активации лимфоцитов человека в норме и при иммунопатологии.

Цель исследования.

Целью работы явилось изучение экспрессии и регуляции маркеров активации на CD4* и CD3+- субпопуляциях Т-лныфоцитоз человека методом двухцветовой проточной цитофлуориыетрии в норме и у больных с впервые выявленным туберкулезом легких.

Задачи исследования:

1. Сравнить экспрессию дифференцировочньи и активацион-ных маркеров CD4+-, CD8+ лимфоцитами, стимулированными ФГА в культуре in vitro, у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.

2. Оценить влияние ЦС-А на сублопуляционный состав Т-лимфоцитов (CD4+, CD8*, CD4+CD45RA+. CD8+CD45RVO. стимулированных ФГА в культуре in vitro.

3. Изучить эффект ЦС-А на ФГА-стимулированную экспрессу активационнах маркеров (CD25+-, CD71+. HLA-DR) на CD4+, CDB+ лимфоцитах в культов in vitro у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.

4. Сопоставить степень иыыуносупрессивного влияния ЦС-А с ФГА-стимулированной активаций CD4+, CD8+- субпопуляций лимфоцитов человека в культуре in vitro.

Научная новизна.

С позиций патогенетического подхода изучения иммунного статуса человека разработан новый метод оценки функционального потенциала Т-лимфоцитов до и после активации ФГА, основанный ■ на двухцветовом онраяивании клеток с использованием мо-ноклональных антител и проточной цитофлуориметрии. что позволяет определить содержание активированных лимфоцитов, несущих одновременно маркеры активации (CD25. CD71, HLA-DR) и диффе-ренцировки (CD4, CDS. CD45RA).

У здоровых доноров при культивировании лимфоцитов периферической крови in vitro в присутствии ФГА установлено увеличение относительного количества клеток CD9+ фенотипа при неизменном содеряании CD4+ и CD45RA+ лимфоцитов, что подтверждает преимущественную пролиферацию CD8+ субпопучляцни. Количество активированных (CD25+, CD71+, HLA-DR+) лимфоцитов среди CD4+ и CD8+ клеток прогрессивно увеличивалось в процессе культивирования с ФГА и достигало максимальных значений к 72 часам. Это говорит о схожести активациокньос процессов для CD4+ и CD8+ субпопуляций у здоровых доноров.

Обнаруаеко нарушение активационной и пролиферативной способности регуляторных субпопуляций (CD4*, CD8+) Т-лимфоцитов у больных с впервые выявленным туберкулезом легких зксу-дативного типа течения, оцениваемой по экспрессии AM (CD25, CD71, HLA-DR). Получены данные, свидетельствующие о более вы-рааенном угнетении активациьнной способности CDS-«- субпопуляции у обследованных больных. Это подтверждается также особенностями действия ЦС-А на уровне регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов у больных туберкулезом легких в сравнении со

здоровыми донорами.

Зарегистрировано снижение общего количества поверхностных CD4 молекул на лимфоцитах у здоровых доноров и больных туберкулезом легких под действием ЦС-А. На основании этих данных можно сделать предположение, что установленный эффект ЦС-А на экспрессии CD4 молекулы не зависит от степени активации CD4+ субпопуляции и является универсальным.

При исследовании влияния ЦС-А на экспресси» АЫ (С025, CD71, HLA-DR) CD4+, CD8* лимфоцитами, стимулированными СГА, проведен дифференциальный анализ кле„ток в зависимости от размеров и внутренней структуры, оцениваемых по оптическим характеристикам активированных лимфоцитов. Установлено, что ЦС-А ингибирует экспрессию AM на обеих регуляторных субпопуляциях Т-лимфоцитов. но степень супрессии зависит от уровня ФГА-иидуцированной активации соответствующей субпопуляции. . При атом наиболее информативным оказался анализ лимфоцитов, соответствующих по размерам нестиыулированным клеткам, так как именно изменения среди "малых" лимфоцитов скорее отражают истинную активацию, чем крупные бласты. Применение такого дифференциального подхода позволило точно определить уровень иммунопатологического дефекта в процессе активации Т-лимфоци-' тов у больных туберкулезом легких и супрессивном действии ЦС-А.

Практическая знь шмость работы.

Разработан новый подход к оценке иммунного статуса человека. позволяющий одновременно ■ получать количественные и функциональные параметры, отражающие различные этапы активации регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов человека.

Сравнительный анализ экспрессии CD25. CD71, HLA-DR молекул на СШ+ и CD8+ лимфоцитах, под действием ыитогена, позволил определить уровень наруяения активационной способности иммунорегуляторных субпопуляций у больных с впервые зыязленным туберкулезом легких, что создав'; предпосылки для разработки методов патогенетически обоснованной иммунокоррекции.

Выявлены новые иммуномодулируюцие эффекты циклоспорина А на 'экспрессию дифференцировочных и активационных маркеров Т-лимфоцитами человека, главный из которых - снизение общего количества поверхностных CD4 молекул. Это должно быть перспективным при исследовании ВИЧ-инфицибельности.

Разработанный методический подход может быть применен для изучения патологических нарушений в Функционировании иммунной системы и оценки модулирующих эффектов иммунотропных фармакологических препаратов.

Апробация материалов диссрртацкн.

Материалы диссертации доложены и обсуадены_на симпозиуме РАМН "Цитокины при туберкулезе и другой патологии" (Москва, 1993г), на' меядународном симпозиуме "Использование приборов фирмы Becton Dickinson в научной и клинической практике" (Москва, 1993г), на конференции кафэдры иммунологии РГМУ и отдела иммунологии ШЖ (Москва, 1995г).

Публикации.

По результатам выполненных исследований опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на страницах мапино-писного текста, состоит из введения, 4 глав: "Обзор литературы". "Материалы и методы", "Результаты собственных исследований", "Обсуждение результатов" и выводов, иллюстрирована 5 рисунками и 13 таблицами, содержит источников литературы, кз которых отечественных и иностранных.

С0ДЕР5АННЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Исследования выполнены на мононуклеарных классах (ШК). выделенных из периферической венозной крови обследуемых лиц на градиенте плотности фиколп-верографина (d-1,077 г/см3) по методу Воуш в модификации Павлика А. С. и соавторов.

Контрольную группу составили 18 клинически здоровых доноров в возрасте от 19 „о 28 лет. 10 ыувчин и 8 венцин. Группу больных составили лица, страдающие впервые выявленным туберкулезом легких. Всего обследовано 15 больных в возрасте от 23 до 65 лет (9 му»чин и б женщин). Все больные туберкулезом имели преимущественно эксудативный тип изменений в легких (более двух сегментов), с множественными полостями распада и очагами бронхогенного обсеменения.

Иммунофенотилир' чание лимфоцитов проводили, используя мультипараыетрический двухцветовой метод иммунофлуоресцентно-го анализа при окрашивании МонАт серии Leu на протонном цн-тофлуориметре типа FACScan (Becton DlcKinson, США). На поверхности Т-лимфоцитов определяли экспрессию стабильных

/

(CD4+, CD8+). промежуточных (GDICD2, CD45RA) и индуци-бельных молекул или актиоационных маркеров (CD25. CD71, HLA-DR). Регуляторные субпопуляции Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+) идентифицировали с помощью МонАТ, коныогированных с флуорес-цеинизотиоцианатом (ФИТЦ), остальные кластеры дифференцировки оценивали при окрашивании МонАт. коныогированными с фикоэрит-рином (ФЭГ. Процедуру окрашивания проводили по стандартной методике, описанной в Monoclonal Antibody Source Book, Becton Dickinson. 1988 г. Из каждой пробы анализировали по 5000 жизнеспособных клеток, дискриминируемых по интенсивности свечения пропидиум иодида. Цитограмма типичного распределения лимфоцитов при двухцветовом окрашивании приведена на рисунке 1.

,„« 14 . i . 1=ур. р. iy.pi .а'урилрр. i

ПкОО

1Ва"

«О»"!

--.•г»«':*

to1

Г| .

Ill) ' l lllill)

Рис.1. Типичная цитограмма активированных лимфоцитов здорового донора через 72 часа культивирования с ФГА, окрашенных МонАТ к CD4 (FL2 интенсивность флуоресценции клеток, маркированных ФЭ) и С025 (FL1 - интенсивность флуоресценции клеток, маркированных ФИТЦ) кластерам дифференцировки.

I квадрат - клетки "позитивные" по .экспрессии дифференциро-вочного маркера (CD4+CD25-)

II квадрат - клетки, одновременно экспрессирующие маркеры дифференцировки и активации tCD4+CD25+)

III квадрат - клетки "негативные" по экспрессии исследуемых маркеров (CD4-CD25-)

IV квадрат - клетки "позитивнее" по экспрессии активационного маркера (CD4-CD25+)

Количество активированные лимфоцитов в исследуемой су б-популяции Т-кпеток (ft) рассчитывалось по формуле: N-A/(A+B)xl003L где К - % клеток, содержащихся во втором квадрате, а В - % клеток в пераоы квадрате. Помимо определения относительного содержания активированных лимфоцитов в пределах анализируемой субпопуляции (CD4+, CD8+)1, оценивали общее количество поверхностных маркеров в условных единицах-по средней интенсивности свечения флуоресценции (СШ. пропорциональной номеру канала, измеренного в логарифмическом рениме при окрашивании соответствующими МонАт на FÄCScan.

В основу методики исследования активации1 лимфоцитов нами был положен'принцип реакции бласттрансфорыации (Matour D. et al., 1993). После выделения мононуклеарные клетки ресуспенди-ровали в среде RPH!-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. 2 ыЫ глутамина и 50 мкг/мл гентамицина. и. культивировали в 24-луночных плоскодонных планшетах (Nunc, Дания)'в термостате npi. 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием COj. В каждой лунке содержалось по 10е клеток в 1,0 ил среды, стимулированных либо ФГА. (конечная, концентрация 5 uxr/мл), либо ФГА вместе с ЦС-А (конечная концентрация 1 мкг/мл)., Через 72 часа культивирования активированные лимфоциты собирались для окрашивания МонАт и анализа на проточном цитофлуориметре.

Одновременно с i /льтнвированием мононуклеаров для оценки экспрессии маркеров активации на FACScan, проводили учет про-лиферативной активности лимфоцитов по включению яН-тимидина традиционным методом бласттрансформации (Павлюк A.C. о.соавторами, 1982), а также, используя подход дифференциального

- и -

анализа стимулированных лимфоцитов в зависимости от размеров и внутренней структуры, оцениваемым по переднему и боковому рассеянию света (ПРС и БРС соответственно).. Для этого на проточном цитофлуориметре устанавливали несколько дискриминационных окон: первое - включавщео все аизнеспособные клетки, второе - содержащее клетки, соответствующие по размеру и структуре выделенным лимфоцитам периферической крови ("малые" лимфоциты), и третье - крупные бластные клетки, появляющиеся о культуре под действием митогена ("большие" лимфоциты).

Статистическая обработка данных проводилась на компьютере типа 1ВМ'РБ ХТ/АТ, с помощью программ Ехе1 3,0 и ЗТАТИШ7. Для каидой серии данных вычисляли среднее арифметическое (М). опибку среднего (т). В таблицах и на графиках результаты представлены в виде М+ш. Для сравнения средних использовали I-критерий Стьюдента.

Результаты собственных исследований.и их обсуждение.

Определение содержания основных регуляторных субпопуляций лимфоцитов у всех обследуемых лиц проводили после выделения !ШК, на градиенте плотности фиколл-верографина при прямом двухцветовом окрашивании соответствующими МонАт на проточном цитофлуориметре. Результаты анализа приведены в таблице 1.

Как видно из полученных результатов, не обнаружено статистически значимых различий в содержании С04+, С08+ лимфоцитов и сопутствующего снижения СМ+/СВЗ*- соотношения у здоровых доноров и больных с впервые выявленным туберкулезом легких. Вместе с тем, процент клеток, экспрессирующих С045ЯА+ маркер, у больных туберкулезом легких был достоверно снижен.

Таблица 1. Относительное содержание регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов среди' МНК у здоровых доноров и больных . туберкулезом легких. •

Кластеры дифферен- цировки Здоровые в Больные туберкулезом легких (Н=15)

CD4+ ' 41.0+0.9s 45.5+2.04

CD 8+ 29.0+0. Э 33.1+2,35

CQ4+/CD8+ 1,5+0.07 1.4+0.12

CD4+CD45RA+ 68. 6+3,58 56,7+3,8*

CD8+CP45RA+ 84.8+2,92 72, 8>3,53*

а - результаты представлены в % как М+ш в обследованной группе * - статистически значимые мекгрупповые различия по t-крнте-рив Стьсдента при Р<0,05

Для оценки функционального состояния CD4+, CDS» лимфоци-тарных субпопуляций определяли экспрессию адгезивных молекул (СОНЬ, CD2) и активационных маркеров (CD25, CD71, DR). Дан- • ные приведены в таблице 2. .

Таблиц? 2. Относительное содержание CDlib+, CD2+, CD25+, DR+ ' клеток среди мононуклэарных CD4+, CD8+ лшафоцитоэ у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.

Кластеры дифференцирован Здоровые WSJ Больные туберкулезом легких (Н=15)

Адгезивные молекулы CD4+CDllb+ CD8+CDllb+ CD4+CD2+ CD8+CD2+ 13.5+2, 52а 44.4+3,54 99,5+0,14 97.8+0,63 10.1+2,2 44,3+4,52 98.5+0,44 94,4+1.71

Маркеры активации CD4+CL~5+ CD8+CD25+ CD4+DR+ CD8+DR+ 3.0+0,6 1,2+0,3 3,6+0,4 5,6+1.0 12,0+1,54« . 3,1+0,77* 11,6+2,64« 28,4+5.02«

а - результаты представлены в % как М+ш в обследованной группе » - статистически значимые межгрупповые различия по ^критерию Стьюдента при Р<0,05

У больных с впервые выявленным туберкулезом легких по сравнению со здоровыми донорами зарегистрирована значительная активация CD4+ и CD8+ субпопуляций лимфоцитов как по экспрессии раннего маркера - CD25. так и по экспрессии позднего маркера активации - HLA-DR молекулы. Относительное содержание клеток, экспрессируэдих CDlib и CD2 маркеры, в обеих обследованных группах было одинаковым.

* Таким образом, на основании исследования лимфоцитов периферической крови у больных с впервые выявленным туберкулезом легких установлено снижение содержания клеток CD4+CD45RA.+,. CD8+CD45RA* фенотипа с одновременным повышением количества CD4+, CD8+ лимфоцитов, экспрессирущих CD25, HLA-DR маркеры. В то ае время уровень экспрессии этих маркеров, оцениваемый по СИФ, соответствовал значениям здоровых доноров. По нашему мнению изменение в содержании CD45RA+ лимфоцитов и активированных (CD25+. HLA-DR-»-) клеток у больных с впервые выявленным туберкулезом легких отражает перераспределение лимфоцитарных субпопуляций в связи с выходом в циркуляцию недавно активированных антигеном клеток-памяти (CD45R0+).

Для изучения Функциональной активности регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов выделенные МНК культивировали In vitro с поликлональным митогеном ФГА в течение 72 часов. По истечении срока культивирования определяли относительное содержание клеток CD4+, CD3+, CD4+CD45RA+-, CD0+CD45RA+ фенотипа. Было установлено, что под действием ФГА у здоровых доноров наблюдается прирост клеток CD8+ фенотипа до 56.6+5.76% и соответствующее снижение CD4+/CD8+ соотношения до 0,83+0,18, ' в то

время как содержание CD4+. CD4+CD45RA+, CDS+CD45RA+ оставалось неизменным как у гдорооых доноров, так и у больных туберкулезом. В отличие от доноров, у больных туберкулезом легких нэ установлено изменения количества CD8+ клеток и CD4+/CD8+ соотношения, что согласуется с.данными о снижении функциональной активности CD8+ субпопуляции при данной патологии.

Изучение эффекта ЦС-А на ФГА-индуцированную активацию Т-лимфоцитов показало (рисунок 2). что ЦС-А ингибировал прирост клеток CD8+ фенотипа у здоровых доноров до 40,8+3,24%, не влияя при этом на относительное содержание других регуля-торных субпопуляций. У больных туберкулезом легких ЦС-А не изменял содержание ни одной из анализируемых (004*, CD8+, CD4+CD45RA+. CD8+CD45RA+) субпопуляций и их количество соответствовало таковым показателям у здоровых, доноров (рису-. нок 3).

На основании представленных данных моано сделать вывод о том. что ЦС-А к 3-им суткам культивирования не влияет на относительное содержание клеток CD4+, CD4+CD45RA+, CD8+CD45RA+ фенотипа у здоровых доноров и больных туберкулезом легких. Установлено, что результат действия ЦС-А на относительное ко-' личество CD8+ лимфоцитов зависит от ФГА-индуцированной пролиферации CD8+ клеток и не проявляется у больных туберкулезом легких е связи с нарушением пролиферативной активности этой субпопуляции.

рисунок 2. Изменение относительного содержания рвгулятоиных сУШТопуляциЙ Т-лимфоцитов (CD4+. CQ8*. CD4+CD45RA+. CD3+CD45RA*-) у здоровых доноров, при культивировании tn vitro.

чтксаттиг ¡■rnimvm-ir i, CD4* COO* C04.CD45flAt CD8.CD45RA*

Рисунок 3. Изменение относительного содержания регуляторних субпопуляций Т-лимфоцитов (CD**. CD8+, CD4+CD45RA«-. CD8+CD45RA+) у больных тубзркулезом легких при культивировании In vitro.

------—Г- - ——Ж(ша' Г

COU CD8« <ЧМ«СГ ГЪ « СОЗ<аМ5ПА*

Наряду с изучением влияния ЦС-А на относительное содер-асание регуляторных субпопуляций, оценивали его эффект на общее количество поверхностных маркеров Т-лимфоцитов, стимулированных ФГА in vitro (таблица 3).

Таблица 3. Эффект ЦС-А на среднюю интенсивность флуоресценции поверхностных наркеров Т-лимфоцитов (СР4, CD8, CD45RA), стимулированных ФГА в культуре in vitro, у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.

Кластеры дифферен- Здоровые доноры (Н=18) Больше т^бе|жулозо11

цирован ФГА ФГА+ЦС-А ФГА ФГА+ЦС-А

CD4+ 507+12,Ва 414+15,5« 503+27,1 412+19,4*

CD8+ . 598+18,? 562+14,8 571+34,2 508+33.5

CD4+CQ45RA+ 439+20,6 414+23,5 411+8,8 409+9,1

CD8+CD45RA+ 445+13,2 435+25,2 441+7.2 432+14,5

а - результаты представлены в виде М+п. где М - средняя интенсивность флуоресценции в условных единицах, измеренная в логарифмическом режиме при окрашивании соответствующими МонАт на FACScan

« - статистически значимые внутгригрупповые различия по t-критерик Стыодента при Р<0,05

Как видно из представленных данных, ЦС-А вызывал снижение общегр количества поверхностных CD4 молекул в обеих группах обследованных пациентов в равной степени. Не установлено влияния ЦС-А на экспрессию других днфференцировочных маркеров (CD8, CL45RA) у здоровых доноров и больных туберкулезом легких. Для детального изучения эффекта ЦС-А на экспрессию CD4 молекул был проведен дифференциальный анализ в зависимости от размеров стимулированных лимфоцитов, оцениваемых по оптическим характеристикам на проточном цитофлуориметре. Было обнаружено, что ЦС-А снижал общее количество поверхностных CD4" молекул у здоровых доноров и больных туберкулезом легких как

среди лимфоцитов, сравнимых по размерам с покоящимися МНК, так и среди крупных бластов. Полученные данные прямо указывают. что влияние ЦС-А на экспрессии CD4 молекул не зависит от степени и стадии активации клеток, экспрессирущих данный кластер дифференцировки.

Известно, что многие иммунотропные препараты приводят к модуляции поверхностных рецепторов и маркеров лимфоцитов. Наличие такой способности было исследовано нами в отноаении действия ЦС-А на экспрессию адгезивных молекул (Cnilb, CD2).

Таблица 4. Влияние ЦС-А на относительное содержание CD4+, CD8+ лимфоцитов, экспрессирущих CDUb, CD2 молекулы, при стимуляции ФГА в культуре In vitro у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.

Кластеры дифференцировки Здоровые доноры <«=18) Польиыо туберкулезом

ФГА ФГА*ЦС-А ФГА' ФГА+ЦС-А

CD4+CD11Ь+ CD8+CD11Ь+ CD4+CD2+ CD8+CD2+- 22. 6+7, 74a 39, 6+2, 73 98, 9+0, 48 95, 5+2. 33 19.4+2,37 39.9+9,13 98,3+0,41 97.4+2,33 20, 6+4, 18 13, 8+5,2» 98, 9+0,29 92, 3+3,11 18,0+5,34 16. 6+4, 73* 98,7+0,41 96, 6±1.05

а - результаты представлены в % как М+га в обследованной группе * - статистически значимые межгрупповые различия по t-крите-рию Стьюдента при Р<0,05

Полученные результаты (таблица 4) свидетельствуют, что ЦС-А не оказывает влияния на относительное количество CD4+, CD8+ клеток, зкспрессируюци/ С011!з, CD2 молекулы у здоровых доноров и болььых туберкулезом легких. Более того, эффект ЦС-А не зависит от ФГА-индуцированного изменения анализируемых субпопуляций. Например, у больных туберкулезом легких под действием ФГА в сравнении-со здоровыми донорами количество CD8+CDllb+ было значительно снижено (39.6+2.73Ж и 13.8+5,2% -

соответственно) и не изменялось при добавлении ЦС-А. Эти данные еще раз подтверждают предположение о дефектности CD8+ субпопуляции лимфоцитов у больных туберкулезом легких.

Для изучения закономерностей экспрессии раньих (CD25. CD71) и поздних (HLÀ-DR) маркеров активации МНК культивировали In vitro в присутствии ФГА и ЦС-А (72 часа). Результаты анализа экспрессии AM на CD4*, CD8+ лимфоцитах у обследованных лиц представлены на рисунках 4, 5, 6.

В соответствии с ранее полученными нами данными (Павлик A.C. с соавторами 1993) обнаружено нарушение экспрессии AM в культуре ФГА-стиыулированных лимфоцитов у болыых туберкулезом по йледуючим параметрам: снижение относительного со-дераания CD8+CD25+, CD44JD71+,. 'CD8*CD71*r- CD4+DR+, CD8+DR+ клеток. На основании этого моино заключить, что у больных с зксудативной формой туберкулеза легких имеется выраженный дефект активации на уровне обеих регулярных субполуляций (CD4+, CD8+) Т-лимфоцитов. Однако, изменения в активации CD8+ лимфоцитов при этом носят более глубокий характер, поскольку проявляются по всем исследуемым параметрам.

Как и следовало ожидать, эффект ЦС-А на экспрессию AM у больных туберкулезом легких отличался от такового у здоровых доноров. В первую очередь это касается воздействия ЦС-А на экспрессию CD25 на CD4+. CD8+ лимфоцитах. По сравнения со здоровыми донорами у больных туберкулезом не установлено ин-гибирующего действия ЦС-А на CD25 маркер на CD4+ и CD8+ лимфоцитах (рисунок 4).

Рисунок 4. Экспрессия CD25 маркера на CD4+. CD8> лимфоцитах у здоровых доноров и больных туиеркуяезом легких при культиви-

ровании In vitro

C04»C025* С04»С025* С04*С025* С03»С025*

Рисунок 5. Экспрессия CD71 маркера на CD4+, CD8* лимфоцитах у здоровых доноров и сольных туберкулезом легких при культивировании In vitro.

CD4+C071* CD4+C071 + CD3+CD71* C0S+C071*

□ ЫН(С»ФГА

Ш МНК*ФГА*ЦС-А, здороиыо доноры

I У!НК*ФГА*ЦС-А, больные ту6ер!сулээом лепя«

Вместе с тем. у здоровых доноров и больных туберкулезом ЦС-А снижал экспрессию CD71 и HLA-DR на CD4+. CD8+ лимфоцитах (рисунок 5 и 6). однако степень ингибироэания CD71 на CD8+ лимфоцитах у больных туберкулезом была значительно меньве. По всей видимости это связано со снижением исходной ОГА-стимули-роваиной экспрессии AM на CD8+ субпопуляции, особенно - С071 маркера.

Рисунок 6. Экспрессия HLA-DR маркера на CD4+. CD8+ лимфоцитах У здоровых доноров и больных туберкулезом легких ири культивировании In vitro.

О МНК+ФГА В МНК»ФГА»ЦС-А. Ш МНК»ФГА*ЦСА больмыа

здоровые доноры туберкулезом легких

Результаты анализа по'экспрессии AM на CD4+ и CD3+ лимфоцитах, стимулированных в культуре In vitro, в зависимости от оптических характеристик (ПРС и БРС) представлены в таблице б.

Таблица 5. Зффект ЦС-А на относительное содержание активированных (CD25+. CD71+, HLA-DR+) CD4+» CD8+ лимфоцитов, стимулированных ФГА в культуре in vitro, в зависимости от ПРС и БРС у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.

Кластеры дифферен- цировки Здоровые доноры (Н=18) Больные тцбв^кулезом

ФГА ФГА+ЦС-А ФГА ФГА+ЦС-А

Лимфоциты. соответствующие по размерам покоящимся МНК

CD4+CD25+ CD8+CD25+' 74,94 0,8а 44,3+9,1 49,2+1,7» 21,4+3,1« 63,0+5,1 31,1+4. 7м 67.7+2, е 35,2+3,7

CD4+CD71+ CD8+CD71+ 34.6+7,0 28,2+2,4 7,6+4,5« 3,5+0,9« 18,9+4,8" 16, 6+3,1" 11,6+3,7 , 11,6+3,0

CD4+DR+ CD8+DR+ 48,9+8,2 26,4+4,3 22,7+3,1« 16.7+3,1« 26, 3+5, 0м 15,1+3. 5м 17,1+4,9 10,8+3,4

МНК, соответствующие по размерам крупным бластам

CD4+CD25+ CD8+CD25+ 95,3+2.0 93,9+3,1 90,3+5,9 80,3+7,9 96, 1+1,3 91,0+2, 6 95,8+1,2 85,2+6, 6

CD4+CD71+ CD8+CD71+ 87,3+5,7 85,9+2, 5 49,1+8,0« 37,7+6,1« 81,5+5,0 77, 9+6.1 44,4+8,6* 59,4+3,2«

CD4+DR+ CD8+DR+ 69,3+5,4 00,8+5,7 60,9+3,2 56,0+1.4 58, 4+7, 6 67, 3+4.0 40, 7+7,1 47, 4+9,9

а - результаты представлены в % как И+га в обследованной группе

* - статистически значимые внутригруппоеые различия по Ь-критерию Стьюдента при Р<0,05

~ - статистически значимые исагрупповые различия по ^критерию Стьнденга При ?<0,05

Полученные результаты свидетельствуют, ,что принципиальное отличие в действии ЦС-А на лимфоциты у здоровых доноров и больных туберкулезом легких локализуется на уровне "малых" бластов. У здоровых доноров ЦС-А резко снижал количество гк-

тивированных (С025+, С071+, 0й+) клеток СР4+, И>8+ фенотипа, в то время как у больных туберкулезом оно оставалось без изменения. Среди крупных бластных клеток содержание активированных С04+. С08+ лимфоцитов и ингибирующий эффект ЦС-А на С04+С071+ и Сй8+С071+ был одинаковым у пациентов обеих обследованных групп. Таким образом, использованный подход дифференциального анализа ФГА-стимулированных лимфоцитов в зависимости от размеров и внутренней структуры позволяет более точно установить уровень нарушений в активации С04+ и С08+ лимфоцитов и особенности действия ЦС-А.

Оценка общего количества поверхностных АМ (С025, С071, Ой) на С04+." С08+ лимфоцитах по СИФ под влиянием ЦС-А показала, что у здоровых донорЬв и больных туберкулезом легких ЦС-А приводил к значительному снижению СИФ для С025 молекулы и на С04+, и на С08+ субпопуляции, не влияя при этом на СИФ для СБ71 и Н1,А-0й молекул. Деталь, ¿¡й анализ установил, что данный эффект' ЦС-А реализуется как на уровне лимфоцитов, соответствующих по размерам покоящимся МНК. так и на уровне крупных бластов. .Таким образом, полученные нами данные согласуются с результатами тех исследователей, которые установили, что ЦС-/ Иэ только ингибирует ИЛ-2 секрецию, но и влияет на формирование функционального РИЛ-2 (РохиеП В. М. е1 а1., 1990). Пс всей видимости, это действие ЦС-А не зависит от с;:пени активации иммунокомпетентных клеток, так как проявляется на обею регуляторных субпопуляциях лимфоцитов (С04+. СБ8+) и в обей) обследованных группах пациентов. На основании того факта, чтс ЦС-А не влиял на относительное , количество С025+клеток ) больных туберкулезом легких можно предположить,. что ЦС-А дол-

/

вен быть Сопеэ эффективен о предотвращении первичного ответа на антиген, чей э ингибировании ук> залученной ишунной реакции как о случае анализа лиифоцитов больных туберкулеза легких.

в а в о л и

1. Стимуляция цононуклеарных клоток периферической крови здоровых доноров ФГА d культуре in vitro приводит к прогрессивному увеличении содержания CD4+ и CD8+ лимфоцитов, зкспресси-рущих CD25, CD71, HLA-DR молекулы, а также приросту относительного количества клеток CDS* Фенотипа до 56+5,76%, что свидетельствует о преимущественной пролиферации данной субпо-пуляцкн.

2. У больных с впервые выявленный туберкулезом легких установлен дефект активационной способности CD4+ и CD8+ субпопуляций лшфоцитсо. стимулированных ФГА, проявляющийся в сния9-кш1 относительного количества клеток., экспрессируюцих CD25, CD71, HLA-DR маркеры активации. Зти нарушение более выражены для CD3+ субпопуляции лимфоцитов.

3. Под влиянием циклоспорина А зарегистрировано сниаениа общего количества поверхностных CD4 молекул на иононуклеарных клетках, стимулированных ФГА In vitro. Этот эффект циклоспорина А но зависит от степени шстявации лимфоцитов и проявляется у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.

4. Циклоспорин А сникает ФГА-стииулирозанную экспрессию акти-вацконных паркеров (CD25, CD71, HLA-DR) in vitro на CD1+ и CD8+ регуляторных субпопуляциях лимфоцитов и ингибнрует прирост клеток CD8+ фенотипа у здоровых доноров.

5. Циклоспорин А блокирует накопление In vitro активированных CD4+ и CD6+ лимфоцитов, экспрессируюцих CD71, -HLA-DR маркеры, п зависимости от степени ФГА-стимулированной активации CD4*. CD8+ субпопуляций лимфоцитов у больных туберкулезом легких, в. Определение уровня экспрессии активационных маркеров на лимфоцитах, стимулированных In vitro1, а также влияния на этот процесс иммуномодулируощих препаратов может быть использовано в качестве одного из критериев оценки иммунного статуса человека с позиций патогенетического подхода.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ КО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1) Фенотип интактных и' активированных 1л vitro митогеном Т-лимфоцитов. Исследование субпопуляций Т-клеток здоровых доноров. - Иммунология, 1993, N3, стр. 21-24, - Павлпк А. С., Беда М. Б.. Зеселова A.B.. Миал B.D.. ТолстовВ.В, , Ковальчук

n.ß.

2) Фенотип интактных и активированных In vitro митогеном Т-лимфоцитов. Исследование субпопуляций Т-клеток у больных туберкулезом легких. - Иммунология. 1993. N6, стр. 49-52. -Павлок А. С., Беда И. В., Веселова А. В., Мишин В. D.. Катаргин Н. А., Ковальчук Л. В.

3) Динамика экспрессии комплекса маркеров активации на CD4+. CD8+ лимфоцитах периферической крови человека при поликло-нальной стимуляции In vitro. .- БЭБИМ, 1994, ИИ, стр. 483-485. - Ковальчук Л. В., Беда М. В., Веселова А. В., Дементьева Е. Г., Мишин В.»., Червинская Т.А., Ильина Н.И.

4) Сравнительное изучение экспрессии маркеров активации на субпопуляциях Т-лимфоцитов при различных формах бронхиальной астмы. - Терапевтический архив, . 1995, N3, стр. 26-29 - Беда И.В., Паслюк A.C.. Вэселова А.В., Демонтьева Е. Г.. Соловьев С. С., Барт Б. Я., Ковальчук Л. В.

6) The activation of lyapliocyte subsets in nonaierglc asthma Abatr. of XIV World Congress of Asthaology. Israel, Jerusa-1 in, 1993 - Kovalchuk L.V.. Pavlyuk A.S., BedaM.V.. Veselova A.V.

6) The expression of activated markers on lmaunoregulatlng T-subsets lh different imunopathologles - Annual Veetlng of the European Academy of Allergology and Clinical Iiminology, Rotterdan. Netherlands, 1993 - Kovalchuk L.V., Pavlyuk A.S., Beda U.V.. Veselova A.V.

7) The assessment of the expression of activation markers by hunan ' CD4+, CD3+ lynphocytes as the method of ImmunomanHöring - First International Congress of ImmunoreliaMlltatlon, Dagoray3, Russia, 1994 - Pavlyuk A. S.. BedaM.V., Veselova A.V.. Dementyeva E.G.

8) Assessment of activation markers expression by CD4+. CD8+ huaan lymphocytes In vitro - 12-th European Immunology Meeting, Barcelona. Spain, 1994 - Kcvalchuk L.V., Pavlyuk A.S., Beda U.V., Veselova A.V.