Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Механизмы дизрегуляции рецептор-опосредованной активации γ-лимфоцитов крови при туберкулезе легких

На правах рукописи

Кошкина Анна Алексеевна

МЕХАНИЗМЫ ДИЗРЕГУЛЯЦИИ РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННОЙ АКТИВАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 ОКТ 2012

Томск-2012

005053510

005053510

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ Новицкий Вячеслав Викторович

доктор медицинских наук,

профессор Уразова Ольга Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории патофизиологии

ФГБУ НИИ фармакологии СО РАМН Агафонов Владимир Иванович

доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, г. Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета

ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России

Потапов Алексей Валерьевич

Защита состоится: «_»

2012 г. в

на заседании диссертационного

Автореферат разослан «_»

2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Петрова И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Положение о том, что в основе туберкулеза легких (TJI) лежит дизрегуляция иммунной системы, стало основой для более детального изучения иммунопатогенеза туберкулезной инфекции и поиска маркерных нарушений со стороны иммунокомпетентных клеток крови [Новицкий В.В. и соавт., 2006; Ивашкин В.Е., 2008]. При этом важную роль отводят межклеточной кооперации, в процессе которой происходит активация наивных Т-клеток с последующей их дифференцировкой в Т-лимфоциты хелперы (Th) типа 1, участвующие в реакциях Т-клеточного иммунного ответа [Свирщевская Е.В. и соавт., 2005; Ивашкин В.Е., 2008; Ярилин A.A., 2010; Schwander S., Dheda К., 2011].

Одной из' главных предпосылок к активному изучению роли Т-клеток в формировании защиты против Mycobacterium tuberculosis является их способность синтезировать цитокины, в частности интерлейкин (IL) 2. Способность IL-2 направлять дифференцировку наивных Т-клеток в ТЫ-лимфоциты, регулировать реакции гиперчувствительности замедленного типа, предотвращать гиперактивацию иммунной системы при смещении баланса Т-хелперных клонов по пути доминирования гуморальных реакций иммунитета играет значительную роль в патогенезе туберкулезной инфекции [Симбирцев A.C., 2004; Зенин В.В. и соавт., 2009; Сологуб Т.В. и соавт., 2009; Ярилин A.A., 2010; Almeida A. et al., 2011; Zuñiga J. et al., 2012].

Дефицит IL-2, часто регистрируемый у больных ТЛ, большинство авторов связывают с развитием вторичной иммунологической недостаточности (ВИН), а среди причин, обусловливающих ее развитие, выделяют уменьшение количества и/или функциональную несостоятельность (гипо- и анергию) Т-клеток [Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2003; Чучалин А.Г., 2004; Новицкий В.В. и соавт., 2005; 2006; Воронкова О.В. и соавт.,-2007; Алешина P.M., 2007; Лусс Л.В., 2007; Маркелова Е.В., 2008; Сепиашвили Р.И., Балмасова И.П., 2008; Хасанова P.P. и соавт., 2008; Корецкая Н.М., 2011; Корецкая Н.М., Большакова И.А., 2011]. Однако вопрос о том, какие механизмы лежат в основе Т-лимфоцитопении и/или анергии Т-клеток при ТЛ остается спорным и требует детального анализа.

Нарушения межклеточной кооперации, опосредующей активацию Т-лимфоцитов в процессе взаимодействия их СОЗ-рецепторов (CD3-TCR) с комплексом «МНС II-пептид» антигенпрезентирующих клеток (АРС) при участии корецептора CD4 и костимулирующих рецепторных молекул (CD28 на Т-лимфоцитах, CD80/CD86 на АРС), могут быть одной из причин Т-клеточного дефицита [Felix N., 2010; Harding С., Boom W„ 2010]. Важная роль при этом отводится процессам костимуляции. Так, взаимодействие С028-молекулы на Т-лимфоцитах и CD80/CD86 на АРС является ключевым импульсом, «разрешающим» активацию Т-клеток и развитие Thl-иммунного ответа. Отсутствие или недостаточность данного сигнала приводят к гибели Т-клеток путем активации программы апоптоза [Wang H. et al., 2005; Briken V., Miller J., 2008].

Помимо этого, некоторые ингибиторные молекулы иммуносупрессорных Т-регуляторных клеток (прежде всего, цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 или CTLA-4) в силу своей высокой авидности к молекулам CD80/CD86 на АРС способны блокировать С028-костимуляторный сигнал в Т-лимфоцитах и, таким образом, подавлять их активацию [Mukherjee S. et al., 2006; Goronzy J., Weyand С., 2008; Ahmed А., 2009].

Известно, что индукция Т-лимфоцитов, опосредованная комплексом «МНС II-пептид-ТСК-костимулирующис молекулы», приводит к запуску основных каскадных путей активации ядерных факторов NF-кВ, АР-1, NFAT, инициирующих транскрипцию гена IL2 и секрецию данного цитокина, активирующего процессы пролиферации и дифференцировки Т-клеток [Скулачев М.В., 2005; Macian F., 2005; Gelinas С., 2006; Абатуров А.Е., 2007; Киселевский М.В., 2008; Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008; Щебляков Д.В. и соавт., 2010; Jung D.H. et al., 2010; Домнинский Д.А., 2011; Yarilina А. et al., 2011; Lee D.,2012],

Между тем, несмотря на значительные успехи в изучении роли основных рецепторных молекул и транскрипционных факторов в регуляции Thl-иммунного ответа, механизмы гипопродукции IL-2, связанные с нарушениями TCR-опосредованной активации Т-лимфоцитов при туберкулезной инфекции, изучены недостаточно, а представленные в научной литературе данные носят фрагментарный и порой противоречивый характер. Учитывая, что рецептор-опосредованная активация Т-лимфоцитов является сложным комплексным процессом, при котором нарушения могут присутствовать в различных его звеньях, исследование в данной области является своевременным и актуальным.

Цель исследования: выявить механизмы и установить особенности нарушений рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов при различных клинико-патогенетических вариантах туберкулеза легких. Задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку базальной и СОЗ/С028-индуцированной секреции IL-2 in vitro у здоровых доноров и больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких.

2. Оценить количество IL-2-синтезирующих лимфоцитов крови, экспрессирующих антигены CD3 (TCR) и CD28, у здоровых доноров и больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом легких.

3. Оценить содержание CTLA-4+ Т-клеток и активных форм внутриклеточных транскрипционных факторов (NF-кВ, NFAT и АР-1) в Т-лимфоцитах крови при СОЗ/СТ)28-индукции in vitro у здоровых доноров и больных туберкулезом легких.

4. Установить молекулярные механизмы дизрегуляции рецептор-опосредованной

активации Т-лимфоцитов при туберкулезе легких в зависимости от клинической формы заболевания и лекарственной чувствительности возбудителя. Научная новизна исследования. Впервые проведено комплексное исследование молекулярных механизмов дизрегуляции передачи сигнала рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов и дана их сравнительная оценка при различных клинико-патогенетических вариантах туберкулеза легких (TJI). Показано, что гипопродукция IL-2 in vitro (базальная и при индукции антиСОЗ- и антиС028-антителами) при TJI сочетается с уменьшением общего числа CD3- и С028-позитивных лимфоцитов в крови и изменением их субпопуляционного состава вследствие снижения количества CD3+CD28+IL2+, CD3+CD28+IL2" и увеличения содержания CD3+CD28'IL2" клеток на фоне выраженной Т-лимфоцитопении. Продемонстрировано, что у больных TJI имеет место увеличение процентного и абсолютного числа лимфоцитов с иммуносупрессорным фенотипом CD3+CTLA-4+, что, наряду с дефицитом активных форм факторов транскрипции NF-кВ и NFAT2 в Т-клетках, обусловливает нарушение трансдукции сигнала СБЗ/С028-опосредованной активации в Т-лимфоцитах синтеза и секреции IL-2. Установлено, что инфильтративный лекарственно-устойчивый (ЛУ) TJI характеризуется увеличением числа Т-лимфоцитов, содержащих активные формы транскрипционных факторов NFAT1 и АР-1, тогда как при лекарственно-чувствительном (ЛЧ) его варианте количество CD3+NFAT1+ и CD3+AP-1+ остается в пределах нормы. Диссеминированный TJI сопровождается снижением количества данного типа клеток - CD3+NFAT1+ при ЛЧТЛ и CD3+AP-1+ при ЛУТЛ.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные расширяют имеющиеся фундаментальные представления об иммунопатогенезе туберкулезной инфекции, вносят дополнительный вклад в понимание молекулярных механизмов формирования вторичной иммунологической недостаточности и дизрегуляции иммунного ответа в целом при туберкулезе легких. Результаты исследования могут служить основой направленной модуляции иммунного ответа, профилактики и лечения иммунозависимых болезней, а также предпосылкой для разработки новых подходов к патогенетически обоснованной иммунотерапии, направленной на коррекцию нарушений индуктивной фазы иммунного ответа на ранних этапах активации Т-клеток при туберкулезе легких. Положения, выносимые на защиту:

1. У больных инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-резистентным туберкулезом легких угнетение базальной и СОЗ/С028-индуцированной секреции IL-2 in vitro сопряжено с дефицитом общего числа CD3+, CD28+ и IL-2* лимфоцитов и их CD3+CD28+IL2+ и CD3+CD28+IL2" субпопуляций в крови.

2. Дизрегуляция рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов при инфильтративном и диссеминированном туберкулезе легких определяется как в период формирования иммунологического синапса вследствие дефицита

5

поверхностных молекул CD3 (TCR), CD28 и CTLA-4-зависимой супрессии сигнала костимуляции, так и на этапе трансдукции активирующего сигнала в связи с недостаточностью в Т-клетках активных форм транскрипционных факторов NF-кВ и NFAT2, наиболее выраженной при диссеминированном туберкулезе легких с устойчивостью возбудителя к препаратам этиотропной терапии.

3. СОЗ/СП28-индукция Т-клеток in vitro вызывает разнонаправленные изменения активности транскрипционных факторов NFAT1 и АР-1 у больных туберкулезом легких, проявляющиеся ее увеличением при инфильтративном и снижением при диссеминированном туберкулезе легких.

Реализация и апробация материала работы. Основные положения и материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на IX Съезде фтизиатров России (Москва, 2011), XVII и XVIII Межгородских научных конференциях молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011, 2012), Научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти член-корреспондента РАМН, профессора А.К. Стрелиса «Достижения в лечении множественно лекарственно-устойчивого туберкулеза (10-летний опыт)» (Томск, 2012), Итоговой 71-й студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова (Томск, 2012), X Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (Красноярск, 2012), X Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Иркутск, 2012), на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. ИЛ. Мечникова и Р. Коха ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2011 - 2012), на научных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2011 - 2012).

Исследования проведены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках ГК №16.512.11.2046 «Разработка комплекса молекулярно-генетических маркеров дизрегуляции иммунного ответа на Mycobacterium tuberculosis для оптимизации диагностики и коррекции вторичной иммунологической недостаточности при туберкулезе легких», руководитель - профессор О.И. Уразова) и РФФИ (Проект № 11-04-98057-р «Разработка комплекса иммунодиагностических биомаркеров для оптимизации лечения больных туберкулезом легких», руководитель -профессор О.И. Уразова).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 13 таблицами. Библиографический список

включает 287 наименований, из них 148 отечественных и 139 зарубежных источников.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 109 больных (89 мужчин и 20 женщин) с распространенными деструктивными формами впервые выявленного туберкулеза легких (ТЛ) в возрасте 2055 лет. Все пациенты с ТЛ пребывали на стационарном лечении во фтизиотерапевтическом отделении №1 (зав. отд. - А.А. Платоненкова) Томской областной клинической туберкулезной больницы (гл. врач - канд. мед. наук Г.В. Янова). Пациенты поступали в Томскую областную клиническую туберкулезную больницу из муниципальных бюджетных учреждений поликлинической сети (МБЛПУ) г. Томска и Томской области.

Диагноз ТЛ устанавливали на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты, которые были получены на базе биохимической, рентгенологической и бактериологической лабораторий Томской областной туберкулезной больницы (зав. лабораторией - Г.Г. Глотова), а также бактериологической лаборатории Томского областного противотуберкулезного диспансера (зав. лабораторией - В.Е. Павлова).

Клиническую форму заболевания устанавливали на основании данных рентгенологического исследования легких. Из 109 обследованных лиц диагноз инфильтративного ТЛ был выставлен 56 (51,38%) пациентам, диагноз диссеминированного ТЛ - 53 (48,62%) больным. Группы больных с инфильтративным и диссеминированным ТЛ дополнительно были разделены на подгруппы в зависимости от чувствительности М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам (лекарственно-чувствительный (ЛЧТЛ), лекарственно-устойчивый туберкулез легких (ЛУТЛ)).

Критериями исключения пациентов из исследования являлись: возраст больных младше 20 и старше 55 лет, наличие других клиническими форм туберкулезной инфекции, тяжелых сопутствующих заболеваний инфекционного и неинфекционного генеза, отягощенного аллергологического анамнеза, терапия глюкокортикоидами и иммуномодулирующими препаратами.

Группу сравнения составили 50 практически здоровых доноров (группа здоровья II) в возрасте от 20 до 55 лет. Все лица (37 мужчин и 13 женщин), входящие в контрольную группу, прошли медицинский осмотр на базе МБЛПУ Поликлиника №3 (гл. врач - канд. мед. наук А.В. Михленко). Условиями включения в группу сравнения являлись: отсутствие патологических изменений в легких при флюорографическом исследовании, отсутствие в анамнезе легочной патологии, тяжелых аллергических

реакций, хронических инфекционных заболеваний, заболеваемость острыми респираторными вирусными и бактериальными инфекциями не чаще 3-х раз в год, при отсутствии в анамнезе инфекционных заболеваний в течение не менее 3-х месяцев, предшествующих исследованию. Все включенные в исследования добровольцы отрицали наличие в анамнезе аллергических заболеваний, отягощенной наследственности, лекарственной и пищевой аллергии.

Материалом для иммунологического исследования служила периферическая венозная кровь, стабилизированная гепарином (25 Ед/мл). Взятие крови проводили утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл. Исследование проводились однократно, до начала специфической противотуберкулезной химиотерапии.

Подсчет общего количества лейкоцитов и их отдельных морфологических форм (лимфоциты, моноциты) осуществляли на гематологическом анализаторе МЕК-6400 (Nihon Kohden, Япония).

Мононуклеарные лейкоциты выделяли из периферической крови методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3) [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Лимфоциты отделяли от моноцитов, основываясь на способности последних к адгезии на стекле и пластике [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].

Концентрацию жизнеспособных клеток в суспензии определяли с использованием 0,5% раствора трипанового синего [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992].

Специфическую индукцию лимфоцитов осуществляли путем добавления индукторов пролиферативного ответа (моноклональные антитела (МКАТ) к CD3- и С028-молекулам) и блокатора внутриклеточного транспорта (моненсин) в дозах 1, 4, и 5 мкг/мл соответственно. Время индукции в зависимости от исследуемого параметра составляло: 40 мин (транскрипционные факторы), 10 ч (рецепторные молекулы CD3, CD28 и внутриклеточный IL-2) и 48 ч (рецепторная молекула CTLA-4 и IL-2 in vitro).

Определение рецепторных молекул (CD3, CD28, CTLA-4), внутриклеточных транскрипционных факторов (NF-кВ, АР-1, NFAT1, NFAT2) и IL-2 в лимфоцитах крови выполняли методом проточной лазерной двухцветной цитометрии с помощью МКАТ, меченных флуоресцентными метками (PerCP, FITC, РЕ).

Для оценки базальной и СОЗ/СП28-индуцированной секреции IL-2 in vitro (по содержанию интерлейкина в супернатантах культуральных суспензий мононуклеарных лейкоцитов) использовали метод твердофазного иммуноферментного «сэндвичевого» анализа (ELISA).

Обработку полученных результатов проводили на основе общепринятых статистических методов с помощью пакета прикладных программ Statistica for Windows (2000, версия 6.0) фирмы «Statsoft Inc.». Проверка нормальности распределения выборочных данных осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Вилка. При сравнении анализируемых выборок проверяли гипотезу о равенстве их генеральных дисперсий с помощью критерия Фишера. В случае нормального распределения признака в исследуемых выборках и равенстве их генеральных дисперсий проверку

гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента, при различных дисперсиях - с помощью критерия Аспина-Уэлча. Для оценки статистической значимости различий между независимыми выборками с ненормальным распределением и равными дисперсиями использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, при различных дисперсиях - критерий Уолда-Вольфовита. С целью установления взаимосвязей между изучаемыми количественными показателями вычисляли коэффициент корреляции Пирсона (при нормальном распределении) и Спирмена (при ненормальном распределении). При уровне значимости р<0,05 различие двух сравниваемых величин считали достоверным [Бронштейн И.Н., Семендяев К.А., 1986; Флейс Дж„ 1989; Боровиков В.В., 2001].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В отечественной и зарубежной литературе представлено много работ, посвященных изучению иммунного статуса и эффективности иммунного ответа у больных туберкулезом легких (ТЛ) [Кноринг Б.Е. и соавт., 1999; Хонина Н.А. и соавт., 2000; Ulmer A.J. et al., 2000; Черешнев В.А., 2001; Dantzer R., 2001; Комогорова Б.Э., 2005; Краснов В.А. и соавт., 2005; Воронкова О.В. и соавт., 2007; Новицкий В.В. и соавт., 2008; Шовкун Л.А, 2008; Лядова И.В., Гергерт В.Я., 2009; Хасанова P.P. и соавт., 2009; Шилько Т.А., 2009; Колосова А.Е. и соавт., 2010; Чурина Е.Г. и соавт., 2010; 2011]. Это связано, прежде всего, с тем, что состояние факторов иммунологической защиты является решающим при инфицировании, а также определяет характер течения патологического процесса и исход заболевания при развитии туберкулезной инфекции.

В настоящее время среди причин, лежащих в основе развития ТЛ, особое значение отводится комплексу этиологических и патогенетических факторов, обусловливающих нарушение иммунного ответа на М. tuberculosis и формирование вторичной иммунологической недостаточности (ВИН), сопровождающей данное заболевание. Наличие ВИН существенно влияет как на течение туберкулезного процесса, так и на качество этиотропной терапии; ее характерной особенностью является дисбаланс в цитокиновой сети, проявляющийся, как правило, гипопродукцией цитокинов, ответственных за «поляризацию» дифференцировки наивных (нулевых) Т-лимфоцитов-хелперов (Th) в Thl-клетки и развитие иммунного Thl-ответа [Чучалин А.Г., 2004]. Наиболее отчетливо с характером течения туберкулезной инфекции связаны изменения секреции интерлейкина (IL) 2, являющегося основным аутокринным фактором роста и активации Т-лимфоцитов и обладающего способностью направлять дифференцировку наивных Т-клеток по Thl-пути. Гипопродукция IL-2, часто регистрируемая при ТЛ, в настоящее время считается основным критерием ВИН и рассматривается среди основных факторов неэффективности иммунного ответа на М. tuberculosis [Сахно Л.В. и соавт., 2004; Лусс Л.В., 2007; Ивашкин В.Т., 2008].

Известно, что основными клетками-продуцентами IL-2 являются активированные

Thl-лимфоциты, на долю которых приходится до 90-95% секретируемого в ходе иммунных реакций IL-2. В этой связи причины дефицита IL-2 напрямую зависят от активации Т-клеток [Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008].

Причины снижения активности Thl могут лежать в нарушении взаимодействия между Т-лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками (АРС) [Ивашкин В.Т., 2008; Griffiths G.M., Tsun А., 2011]. Известно, что межклеточная сигнализация в иммунной системе осуществляется путем как непосредственного контактного взаимодействия клеток, в котором участвуют их поверхностные молекулы, так и посредством цитокинов [Dustin M.L., 2010; Alarcón В. et al., 2011]. При этом основным механизмом индукции секреции IL-2 принято считать передачу импульсов посредством Т-клеточного рецептора (CD3-TCR) [Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008]. Показано, что для активации наивных Т-клеток по Thl-пути необходимо соединение CD3-TCR лимфоцита с комплексом «МНС И+пептид» АРС при участии корецептора CD4 и молекул костимуляции CD28 (на Т-клетках) и CD80/CD86 (на АРС) [Ивашкин В.Т., 2008; Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008; Yokosuka T., Saito Т., 2010]. При этом активация костимулирующей молекулы CD28 является обязательным условием для запуска клеточно-опосредованного иммунного ответа. Отсутствие или недостаточная стимуляция через CD28 приводит к активации программы апоптоза и гибели Т-лимфоцита [Ивашкин В.Т., 2008; Gerdes N.. Zirlik А., 2011; Lichtman А.Н., 2012].

По существующим представлениям, иммунный ответ на М. tuberculosis подавляется в связи с активацией Т-регуляторных лимфоцитов (Treg), оказывающих супрессорное влияние на процессы лимфопролиферации и опосредующих Т-клеточную анергию [Ярилин A.A., 2010; Зурочка A.B., 2011; Симбирцев A.C., 2011; Чурина Е.Г. и соавт., 2010; 2011; Sakaguchi S., 2011]. При этом большое значение придается присутствию на поверхности Treg-лимфоцитов ингибитора костимуляции - молекулы CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4), поскольку именно с этой молекулой связывают реализацию их иммуносупрессорной функции [Сахно JI.B., 2004; Ярилин A.A., 2010]. Среди основных эффектов супрессии выделяют способность CTLA-4, обладающей высокой авидностью к молекулам CD80/CD86 на АРС, предотвращать их костимулирующее действие через С028-молекулу и, таким образом, подавлять активацию Thl-клеток [Казимирский А.Н., 2006].

Исходя из этого, нами была предпринята попытка оценить секрецию IL-2 при специфической индукции лимфоцитов, имитирующей взаимодействия между антигенпрезентирующими клетками и Т-лимфоцитами in vitro, и выявить возможные нарушения процессов межклеточной кооперации на уровне Т-клеточного рецептора и молекул костимуляции.

Анализ цитокинсекреторной активности показал, что у больных TJI отмечается гипосекреция IL-2 лимфоцитами крови как в спонтанных условиях (базальная), так и при CD3/CD28-HHflyKiom клеток, наиболее выраженная при ЛУТЛ (базальная при

диссеминированной его форме, индуцированная - при инфильтративной) (таблица 1). При этом было отмечено снижение относительного и абсолютного числа CD3-, CD28- и IL-2-позитивных лимфоцитов у больных как ЛЧТЛ, так и ЛУТЛ относительно соответствующих показателей у здоровых доноров, наиболее выраженное в группе пациентов с диссеминированным ЛУТЛ. Кроме того, у больных ТЛ было зарегистрировано изменение субпопуляционного состава Т-лимфоцитов, которое проявлялось снижением числа CD3+CD28+IL-2+, CD3+CD28+IL-2" и увеличением содержания CD3+CD28TL-2~ лимфоцитов, а также повышением количества иммуносупрессорных CTLA-4+ Т-клеток на фоне выраженной Т-лимфоцитопении. Наиболее значительные их изменения обнаруживались у пациентов с лекарственно-устойчивым вариантом туберкулезной инфекции (рисунок 1, 2).

Таблица 1

Секреция IL-2 лимфоцитами крови in vitro у здоровых доноров и больных туберкулезом легких, Me (Q1-Q3)

Группы обследованных лиц Базальная секреция, пг/мл СОЗ/СО28-индуцир0 ванная секреция, пг/мл

Здоровые доноры 12,81 (11,26-15,57) 35,88 (32.39-44,15) р4<0,001

Больные инфильтративным туберкулезом легких ЛЧТЛ 8,73 (6,46-13,42) р,<0,05 13,45 (10,62-18,09) p^O.OOl; р4<0,01

ЛУТЛ 6,24(4,58-9,13) р,<0,001; р,<0,01 8,80 (7,80-12,51) p^O.OOl; p^O.OOl; р4<0,01

Больные диссеминированным туберкулезом легких ЛЧТЛ 7,62 (7,00-8,94) р, <0,001;р, <0,05 23,74 (20,62-27,88) p^O.OOl; р2<0,01; р4<0,001

ЛУТЛ 3,56(3,13-4,77) p^O.OOl; р2<0,01; р,<0.001 12,56(11,59-16,68) p^O.OOl; р2<0,01; р,<0,001;р4<0,001

Примечание. ЛЧТЛ - лекарственно-чувствительный туберкулез легких; ЛУТЛ — лекарственно-устойчивый туберкулез легких; р, - по сравнению с показателями у здоровых доноров; рг - по сравнению с показателями у больных с ЛЧТЛ (внутри каждой клинической формы); рз - по сравнению с показателями у больных с инфильтративным ТЛ; р4 - по сравнению с показателями базальной секреции (без использования индукторов).

Угнетение 1Ь-2-секреторной активности Т-лимфоцитов, установленное в настоящем исследовании, во многом определяется снижением количества данной субпопуляции клеток. Уменьшение общего числа СОЗ-позитивных лимфоцитов может быть связано как с непосредственной гибелью клеток в очаге воспаления в легких, что приводит к ускоренной миграции Т-клеток из периферической крови [Сахно Л.В., 2004], так и, как уже указывалось выше, с запуском программы их апоптоза [Ивашкин

11

В.Т., 2008].

Pl.P3 Pl P1.P3 Pi:

ДЛУТЛ 6,9 j 13,1 78,8 1."

Р1.Р2 Pl Pi

длчтл 10,6 1 1S.3 ! 69,2 1

Р1.Р3 Pi, Рз Р1.Р3 Pij

И ЛУТЛ 6,5 1 9.5 I 80,2 3,2

Pl Pi Pl

И ЛЧТЛ 15,1 20,0 62,5

зд 18,9 25,5 1 51,8 6.1

1 1 i 1

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

0CD3-CD2S-IL2- GCD3+CD2S+IL2- DCD3-CD2S-IL2- ■ CD3-CD28-IL2-

Рисунок 1. Субпопуляционный состав Т-лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров и больных туберкулезом легких

Примечание. ЗД - здоровые доноры; И ЛЧТЛ - инфильтративный лекарственно-чувствительный туберкулез легких; И ЛУТЛ - инфильтративный лекарственно-устойчивый туберкулез легких; Д ЛЧТЛ - диссеминированный лекарственно-чувствительный туберкулез легких; Д ЛУТЛ - диссеминированный лекарственно-устойчивый туберкулез легких.

В качестве ключевых факторов активации апоптоза при действии на макроорганизм инфекционных агентов в настоящее время рассматриваются нерепарируемые повреждения и рецептор-зависимая селекция клеток. Так, было показано, что Т-клеточный дефицит при туберкулезе может быть обусловлен индуцированной возбудителем дезорганизацией хромосомного аппарата лимфоцитов и систем, обеспечивающих генетический гомеостаз макроорганизма. При этом угнетение индекса стимуляции ДНК-репарации в лимфоцитах крови при туберкулезе связывают с инфекционно-токсическим их повреждением, которое может быть одной из причин запуска Fas-индуцированного апоптоза и снижения численности данной популяции клеток [Ивашкин В.Т.. 2008; Шилько Т.А., 2009; Уразова О.И., 2010; Чурина Е.Г. и соавт., 2011].

Немалая роль в регуляции клеточной гибели принадлежит также фактору некроза опухолей (TNF) а, являющемуся ключевым регулятором иммунного ответа [Биктасова А.К., 2010; Ярилин A.A., 2010]. В условиях туберкулезной инфекции TNF-a-опосредованная гибель иммунокомпетентных клеток может иметь доминирующее значение в развитии Т-клеточного дефицита в виду индуцированной М. tuberculosis гиперсекреции данного цитокина [Воронкова О.В., 2007; Серебрякова В.А., 2011].

68.03% 6,07%

со о -

<41 о -

■ Щи- А

о 0

1С 1 102 103 1С CTLA4 - РЕ

! 42,29% 24,09%

'о -

# В

о о - т

40.66% 14.87% Б

Ф

47.55% 15.73% ш г

--1—.......ГГ—'—.......I.—'—.......

8 Si

! 44,16% 20,96% % д

: р

10' 102 103 10" 10° СШ Pert P FIJ-Helghl

Ж

| (i,(17 % |

f V 1 Ml '

102

CTLA4-PE

10

FL2-Heigbt

Рисунок 2. Количество СОЗ-позитивных клеток, экспрессирующих CTLA-4, в условиях действия индукторов (антиСОЗ, антиС028 антитела) in vitro у здоровых доноров и больных туберкулезом легких (по данным проточной цитофлуориметрии)

Примечание. Данные представлены на примере наиболее показательных индивидуальных гистограмм распределения лимфоцитов крови по параметрам флуоресценции при окраске антителами к CD3 (РегСР) и CTLA-4 (РЕ) у здорового донора (А) и пациентов с инфильтративным лекарственно-чувствительным (Б) и лекарственно-устойчивым (В) туберкулезом легких, диссеминированным лекарственно-чувствительным (Г) и лекарственно-устойчивым (Д) туберкулезом легких; Е, Ж - изотипический контроль флуоресценции.

Известно, что CD4+ Т-лимфоциты являются более чувствительными к активации апоптоза за счет высокой экспрессии ими рецепторов FasR и TNFR1 и подавления активности антиапоптотических генов семейства bcl-2 [Пичугин A.B., Апт A.C., 2005; Ивашкин В.Т., 2008; Тюлькова Т.Е. и соавт., 2008; Ярилин A.A., 2010].

Кроме того, в индуктивной фазе иммунного ответа путем апоптоза удаляются Т-лимфоциты, не получившие адекватного костимуляторного сигнала при взаимодействии антигенспецифического рецептора с презентируемым антигеном. Активация процесса апоптоза в данном случае зависит от NFAT1-индуцированной экспрессии апоптотического фактора FasL в ответ на неадекватный антигенный стимул, определяющий гибель Т-клетки [Сибиряк C.B. и соавт., 2006; Gwack Y. et al., 2007]. В пользу данного предположения может свидетельствовать зарегистрированное в настоящем исследовании снижение относительного числа С028-позитивных Т-лимфоцитов у больных TJT, максимально выраженное при ЛУТЛ (рисунок 1).

Однако следует отметить, что гипопродукция IL-2, а также снижение числа CD3+CD28+IL-2+ лимфоцитов у больных ТЛ могут быть обусловлены анергией Т-клеток. Выявленное у больных ТЛ увеличение содержания CD28~IL2~ и CTLA-4+ Т-клеток на фоне выраженной Т-лимфоцитопении и гипосекреции 1L-2, вероятно, связано с увеличением количества и функциональной активности Т-регуляторных клеток, способных супрессировать процессы лимфопролиферации, вызывая развитие гипо- и анергии Т-лимфоцитов [Чурина Е.Г. и соавт., 2010; 2011].

Таким образом, у больных ТЛ отмечается существенное снижение числа Т-лимфоцитов, гипосекреция IL-2 при С03/С028-индукции и изменение процентного соотношения субпопуляций СОЗ-позитивных клеток, проявляющееся снижением IL-2-синтезирующих (IL-2+) Т-клеток, увеличением числа CD28- и IL-2-негативных лимфоцитов, а также CD3+CTLA-4+ клеток. Выявленные изменения носят в большей степени однонаправленный характер и максимально выражены у пациентов с лекарственно-резистентным вариантом туберкулезной инфекции. Учитывая, что передача активационного сигнала в процессе межклеточной кооперации, опосредованная Т-клеточным рецептором и костимуляцией через CD28, является одним из ключевых моментов формирования противотуберкулезного иммунитета, выявленные изменения в Т-лимфоцитах при ТЛ могут свидетельствовать о неспособности Т-клеток эффективно отвечать на антигенный стимул, что приводит к выраженной гипосекреции IL-2.

Как уже отмечалось ранее, активация CD3-TCR лимфоцита при участии корецептора CD4 и костимулирующей молекулы CD28 на Т-клетках приводит к запуску механизмов сигнальной трансдукции, конечным итогом которых (применительно к Thl-ответу) является секреция 1L-2 и экспрессия его поверхностного рецептора [Bromley S.K. et al., 2001; Пименов A.A. и соавт., 2003; Ярилин A.A., 2003; Wang H. et al., 2005; Ивашкин В.Е., 2008]. Активация CD3-TCR/CD28 приводит к запуску цепочки тирозиновых киназ Fyn, Lck, ZAP70, вызывающих расщепление

фосфатидилинозитолдифосфата с образованием диацилглицерола и инозитолтрифосфата. Последний высвобождает из внутриклеточных депо Са2+, необходимый для активации кальциневрина, который, в свою очередь, дефосфорилирует цитоплазматическую форму ядерного фактора транскрипции NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells), способствуя, тем самым, его транслокации в ядро. Диацилглицерол активирует протеинкиназу С и белок Ras. Последний способствует фосфорилированию протеинкиназы Raf, запускающей сигнальный каскад митоген-активированных белков (МАРК и МАРКК (Мек)). Активная протеинкиназа С при помощи Carma-1 (caspase-recruitmcnt-doinain-containing membrane-associated guanylate kinase 1) связывается с фосфорилированным белком Bcl-10. Протеин Вс1-10 взаимодействует с каспазоподобной протеазой MALT-1, которая в последующем активирует комплекс 1кВ-киназ (IKK). Следствием является фосфорилирование ингибитора кВ (1кВ) по двум близкорасположенным остаткам серина (32 и 36), что служит сигналом для убиквитинации и последующей деградации молекулы 1кВ в 26S-протеосомах с освобождением из связи с ингибитором фактора транскрипции NF-kB. Параллельно этому в каскаде МАР-киназ активируются ядерная форма транскрипционного фактора (ТФ) NFAT (NFATn). Совместное действие ядерных факторов NFATc, NFATn, объединенных в полноценный транскрипционный фактор NFATc/n, и NF-kB включает в ядре «ранние гены» клеточной пролиферации Fos и Jun й промотор АР-1, который (взаимодействуя с NFAT) активирует транскрипцию генов IL-2 (JL2) и его рецептора (CD25) [Kintzel P.E., Calis К.А., 1991; Chang С.Р. et al., 2004; Hayden M.S., Ghosh S., 2004; Monaco С. et al., 2004; Marian F., 2005; Абатуров A.E., 2006; 2007; Gilmore T.D., 2006; Ивашкин B.E., 2008; Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008; Hayden M.S., Ghosh S., 2008; Зенин B.B. и соавт., 2009].

Таким образом, ключевыми звеньями в механизмах трансдукции сигнала стимуляции секреции основного Thl-ассоциированного цитокина - IL-2, является активация ТФ NF-кВ, АР-1 и NFAT. С этих позиций было проанализировано количество СОЗ-позитивных лимфоцитов, содержащих активные формы указанных ТФ в условиях С03/С028-индукции клеток in vitro.

Как показали результаты проведенного исследования, у больных ТЛ отмечается снижение относительного и абсолютного числа CD3+NF-kB+ лимфоцитов относительно показателей у здоровых доноров, наиболее выраженное при диссеминированной форме ЛУТЛ. При этом количество CD3+AP-1+ лимфоцитов у больных ЛЧТЛ оставалось в пределах нормы, повышалось у больных инфильтративным ЛУТЛ и снижалось при диссеминированной его форме (рисунок 3).

Низкая активность NF-kB и АР-1 при ТЛ, вероятно, связана с недостаточностью активационного сигнала, обусловленной снижением экспрессии молекулы костимуляции CD28, а также увеличением супрессорного влияния CTLA-4-молекулы, согласно выявленному у пациентов с ТЛ повышению численности экспрессирующих ее Т-клеток.

40

ЭО

. 20 10 О

12345 123 45

Рисунок 3. Относительное содержание NF-кВ- и АР-1-позитивных Т-клеток в культуре лимфоцитов в условиях действия индукторов (антиСЭЗ-, антиС028-антитела) in vitro у здоровых доноров и больных туберкулезом легких

Примечание. Здесь и на рисунке 4: 1 - здоровые доноры; 2 - больные инфильтративным лекарственно-чувствительным туберкулезом легких; 3 - больные инфильтративным лекарственно-устойчивым туберкулезом легких; 4 - больные диссеминированным лекарственно-чувствительным туберкулезом легких; 5 - больные диссеминированным лекарственно-устойчивым туберкулезом легких.

Среди вариантов инактивации сигнальных каскадов, опосредованных CTLA-4, рассматривают негативное его влияние на активность 1кВ-киназ, в результате которого нарушаются процессы фосфорилирования 1кВ и освобождения активного гетеродимера NF-кВ [Olsson С. et al., 1999; Dias S.R., Rudd C.E., 2001; Абатуров А.Е., 2006; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006; Mukheijee S. et al., 2006; Маянский А.Н. и соавт., 2007; Абатуров А.Е., 2008; Goronzy J., Weyand С., 2008; Ahmed А., 2009]. Зарегистрированный в настоящем исследовании дефицит С028-позитивных Т-лимфоцитов на фоне увеличения числа CTLA-4+ Т-клеток, вероятно, может являться причиной низкой активности NF-кВ и снижения численности субпопуляции NF-kB+ Т-клеток.

Известно, что ТФ NF-кВ и АР-1 являются редокс-чувствительными и отвечают за изменение окислительно-восстановительного баланса клетки, индикатором которого служит соотношение про- и антиоксидантов. Активация процессов свободнорадикального окисления служит своего рода индуктором ТФ NF-кВ и АР-1. С другой стороны, антиоксиданты (каталаза, супероксиддисмутаза (СОД), глутатион), являются ингибиторами транскрипционной активности. В исследованиях показано, что активность NF-кВ резко блокируется в присутствии ацетилцистеина, глутатиона, СОД [Долинная Н.Г. и соавт., 2008]. Вместе с тем, установлено, что у больных TJI отмечаются высокие значения активности СОД в лимфоцитах крови независимо от

клинической формы заболевания при JI4TJI, а также у пациентов с диссеминированным ЛУТЛ [Есимова И.Е., 2007; Шилько Т.А., 2009]. Вероятно, этим фактом можно объяснить выявленное нами низкое содержание NF-kB+ и АР-1+ Т-лимфоцитов у пациентов с диссеминированной формой ЛУТЛ.

Не исключено, что снижение числа NF-кВ-позитивных Т-лимфоцитов может быть обусловлено угнетением синтеза субъединиц ТФ, связанным с нарушениями процессов биосинтеза белка при ТЛ [Ing R. et al., 2000; Poddar M.K. et al, 2000; Перельман М.И., 2007].

Высокий уровень CD3+AP-1+ лимфоцитов, выявленный у больных инфильтративным ЛУТЛ, на фоне снижения числа CD3+NF-kB+ клеток, по всей видимости, свидетельствует о реализации альтернативных путей активации «ранних генов» клеточной пролиферации Fos и Jun и промотора АР-1, не связанных с NF-kB (рисунок 3).

Кроме того, была показана ингибирующая роль глюкокортикостероидов (ГКС) на активность ТФ NF-kB, АР-1, NFAT [Абатуров А.Е., 2008]. ГКС, проникая в цитоплазму клетки, взаимодействуют с гормонсвязывающим доменом С-конца изоформы а глюкокортикостероидного рецептора (GR), локализованного в цитоплазме и представляющего собой мультикомплекс. ГКС-активированный GR оказывает ингибирующее влияние на МАРК-, МАРКК- и 1кВ-киназы, активирует синтез белков 1кВ, взаимодействует с субъединицами р50 и р65 NF-кВ (и, вероятно, c-Jun АР-1), подавляя их транскрипционную активность [Абатуров А.Е., 2008]. Высокие концентрации ГКС могут вносить определенный вклад в формирование дефицита NF-kB- и АР-1-позитивных Т-клеток при ТЛ.

Как уже отмечалось, еще одним важным ТФ, оказывающим влияние на промотор гена 1L2 и синтез одноименного цитокина, является NFAT. Для зрелых Т-лимфоцитов характерно присутствие двух цитоплазматических форм NFAT - NFAT1, NFAT2. Блокада экспрессии NFAT в Т-лимфоцитах сопровождается снижением активности IL-2-промотора и угнетением синтеза цитокина [Pongracz J.E., Stockley R.A., 2006; Felix N.J. et al., 2010; Walsh N.P. et al., 2011; Poirier N. et al., 2011; Zelante T., 2012]. Считается, что промотор гена 112 низко селективен в отношении ТФ NFAT, однако существует мнение, что NFAT2 является наиболее эффективным активатором транскрипции гена 112. Блокада гена NFAT2 сопровождается снижением пролиферативного ответа Т-лимфоцитов, в то время как отмена экспрессии NFAT1, напротив, приводит к усилению спонтанной и антиген-стимулированной Т- и В-клеточной пролиферации с повышением доли активированных клеток в обеих популяциях [Arguni Е. et al., 2006; Абатуров, А.Е., 2007; Oh-hora M., Rao A 2009- Kang H., 2010].

Измерение количества Т-лимфоцитов, содержащих активную форму NFAT2, позволило установить снижение (ниже нормы) процентного и абсолютного числа CD3+NFAT2+ клеток у больных ЛЧТЛ и ЛУТЛ (рисунок 4). Исключение составили

пациенты с инфильтративным ЛУТЛ, у которых численность данной субпопуляции Т-лимфоцитов не отличалась от нормальных величин и была значимо выше аналогичных показателей в других обследуемых группах (рисунок 4). В то же время, количественный анализ Т-клеток, содержащих активную форму №АТ1, позволил зарегистрировать существенное увеличение относительного и абсолютного числа СОЗ+НРАТ1+ лимфоцитов у больных инфильтративным ЛУТЛ и низкие показатели численности СВЗ+№;АТ1+ клеток при диссеминированном ЛЧТЛ. При остальных формах ТЛ количество СОЗ+№АТ1+ лимфоцитов оставалось в пределах нормы (рисунок 4).

CD3+NFAT1+

X

1

Т

X I

37

CD3*NFAT2+

-Median I 125%-75% i Min-Ma*

1

Рисунок 4. Относительное содержание NFAT1- и NFAT2-no3iroiBHUx Т-клеток в культуре лимфоцитов в условиях действия индукторов (антиСОЗ-, антиСБ28-антитела) in vitro у здоровых доноров и больных туберкулезом легких

Установленные нарушения могут быть связаны с недостатком активной формы КТАТ2 в цитозоле клеток в результате снижения ее синтеза, сопряженного с дефицитом биосинтеза белка, характерного для ТЛ [1п§ Я. й а1., 2000; Ро(1с1аг М.К. е1 а1., 2000; Перельман, М.И., 2007]. Снижение числа №АТ2-позитивных Т-лимфоцитов может быть обусловлено активацией СОД в клетках, оказывающей негативное влияние на активность №АТ2. Косвенно, в пользу данного предположения свидетельствует установленный в более ранних работах высокий уровень активности СОД при инфильтративном и диссеминированном ЛЧТЛ и диссеминированной форме ЛУТЛ [Есимова И.Е., 2007; Шилько Т.А., 2009]. Именно при этих формах ТЛ определялось снижение числа СОЗ+ОТАТ2+ клеток в настоящем исследовании. При этом инфильтративный ЛУТЛ, по данным Т. А. Шилько [2009], характеризуется нормальными показателями активности СОД. В настоящем исследовании численность №АТ2-позитивных Т-лимфоцитов при данной форме ТЛ оставалась в пределах нормы.

Кроме того, нельзя исключить и влияние высоких доз ГКС, регистрируемых при

TJT, на снижение количества NFAT2+ Т-клеток [Абатуров А.Е., 2008].

Уменьшение содержания NFAT1-позитивных Т-лимфоцитов у пациентов с диссеминированным JI4TJ1, вероятно, связано с теми же причинами, что и снижение числа CD3+NFAT2+ клеток.

Выявленное в работе повышенное содержание NFATl-позитивных Т-лимфоцитов при инфильтративном ЛУТЛ может свидетельствовать об усилении активности данного ТФ. Так, было показано, что при инфильтративной форме ЛУТЛ лимфоциты характеризуются наиболее высоким содержанием фосфатидилинозитола в мембране клеток и высоким уровнем внутриклеточного Са2+. Кроме того, как уже было отмечено, при данной форме ТЛ регистрируются нормальные показатели активности ферментов антиоксидантной защиты [Есимова И.Е., 2007; Шилько Т.А., 2009]. Известно, что фосфатидилинозитол является предшественником вторичных мессенджеров - диацилглицерола и инозитолтрифосфата. Инозитолтрифосфат регулирует Са2+-зависимую активацию кальциневрина, который, в свою очередь, является прямым активатором NFAT [Chang С. et al., 2004; Hayden М., Ghosh S„ 2004; Monaco С. et al., 2004; Macian F„ 2005; Gilmore T.D., 2006; Ивашкин B.E., 2008; Hayden M„ Ghosh S., 2008; Зенин B.B. и соавт., 2009]. В данной ситуации вероятным механизмом активации NFAT1 и, соответственно, регистрируемого увеличения числа CD3+NFAT1+ клеток, может являться повышенная активность кальциневрина. При этом можно предположить, что преимущественная в данной ситуации активация NFAT1, а не NFAT2, связана с низким содержанием последнего в цитозоле клеток.

Особое внимание обращало на себя соотношение NFAT 1 /NFAT2-no3HTHBHbix Т-лимфоцитов при туберкулезной инфекции. Так, например, известно, что NFATl-белок участвует в негативном контроле пролиферации Т-лимфоцитов за счет инициации экспрессии FasL [Gomez-Sintes R. et al., 2010; Alvarez S. et al., 2011]. Увеличение числа Т-лимфоцитов, содержащих активную форму NFAT1, у больных инфильтративным ЛУТЛ в сочетании с нормальным количеством NFAT2+ клеток, вероятно, оказывает негативное влияние на количество CD3+ лимфоцитов, что, возможно, вносит вклад в снижение численности СОЗ-субпопуляции клеток при данной форме ТЛ и снижение их IL-2-секреторной функции.

Кроме того, показана способность NFAT2 и NFAT1 (в комплексе друг с другом) существенно усиливать транскрипцию гена 1L4 на начальных этапах активации, взаимодействуя с пурин-богатыми последовательностями промотора, с последующим №АТ2-ингибированием на поздней фазе транскрипции гена IL4 [Zddor Е., 2008; Zhang Y. et al. 2009; Lee S.H. et al., 2009; Lohoff M. et al., 2010; Saito R. et al., 2011]. Снижение количества CD3+NFAT2+ лимфоцитов у больных ТЛ при нормальном или увеличенном содержании CD3+NFATT клеток позволяет предположить дезинтеграцию в работе изучаемых ТФ, приводящую, по всей видимости, к нарушению ингибирования поздней фазы транскрипции гена IL4, увеличению IL4-продуцирующей активности Т-клеток и переключению их активации с Thl- на ТЪ2-иммунный ответ. Это также может вносить

определенный вклад в гипопродукцию IL-2.

Таким образом, полученные нами данные позволяют заключить, что при TJI нарушение взаимодействия АРС и Т-лимфоцитов, приводящее к низкой IL-2-секреторной активности, гипо- и анергии Т-клеток, является комплексным, многоуровневым и обусловливается как влиянием супрессорных механизмов (в том числе посредством CTLA-4), так и дефицитом СТ)28-костимуляции и нарушением процессов сигнальной трансдукции в лимфоцитах крови вследствие снижения числа Т-клеток, содержащих активные формы внутриклеточных транскрипционных факторов (NF-кВ, NFAT2, АР-1) (рисунок 5). Это, несомненно, расширяет имеющиеся фундаментальные представления о патогенезе туберкулезной инфекции и, возможно, послужит основой модуляции иммунного ответа, профилактики и лечения иммунозависимых болезней.

ВЫВОДЫ

1. При инфильтративном и диссеминированном лекарственно-чувствительном и лекарственно-устойчивом туберкулезе легких гипосекреция in vitro IL-2 (фактора роста и активации Т-клеток), характеризующая состояние гипоэргии Т-клеточного звена иммунитета, определяется дефицитом общего числа CD3+, CD28+, IL-2+ лимфоцитов и их CD3+CD28+IL2+ CD3+CD28TL2~ субпопуляций на фоне повышения количества CD3+CD28~IL2~ Т-лимфоцитов в крови.

2. Снижение секреции IL-2 и количества IL-2+ и CD28+ Т-лимфоцитов в условиях рецептор-опосредованной индукции in vitro у больных туберкулезом легких ассоциировано с повышением абсолютного и относительного числа клеток, экспрессирующих цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA-4) с иммуносупрессорной активностью.

3. Изменения рецептор-экспрессирующей и IL-2-продуцирующей активности Т-клеток у больных туберкулезом легких (TJI) варьируют в зависимости от клинической формы заболевания с большей выраженностью дефицита CD3+, CD28+, IL-2+ лимфоцитов в крови и базальной секреции IL-2 при диссеминированном лекарственно-устойчивом TJI (ЛУТЛ), а гипосекреции IL-2 при СТ>3/С028-индукции in vitro - при инфильтративном ЛУТЛ.

•4. Дизрегуляция трансдукции сигнала рецептор-опосредованной активации Т-лимфоцитов при индукции антиСЦЗ- и антиС028-антителами in vitro у больных инфильтративным и диссеминированным туберкулезом легких определяется дефицитом в клетках активных форм транскрипционных факторов NF-кВ и NFAT2, наиболее выраженным при диссеминированном туберкулезе легких с устойчивостью возбудителя к препаратам этиотропной терапии.

Mycobacterium tuberculosis

Рисунок 5. Механизмы нарушений активации Т-лимфоцитов крови при туберкулезе легких по данным литературы и результатам собственных исследований (выделено серым)

5. Инфильтративный лекарственно-устойчивый туберкулез легких (ЛУТЛ) сопровождается увеличением числа Т-лимфоцитов, содержащих активные формы транскрипционных факторов NFAT1 и АР-1, в то время как диссеминированный туберкулез легких сопровождается снижением количества клеток с иммунофенотипами CD3+NFAT1+ (при лекарственно-чувствительном его варианте) иСОЗ+АР-1+(при ЛУТЛ).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Писаренко, М.С. Роль полиморфизма гена IL-12В в цитокинзависимой активации Т-хелперов 1 типа у больных инфильтративным туберкулезом легких [Текст] / М.С. Писаренко, A.A. Кошкина // Актуальные проблемы патофизиологии: материалы XVII Межгородской конференции молодых ученых. - СПб., 2011. - С. 126-127.

2. Клинико-иммунологическая характеристика Beijing-туберкулеза в Томской области [Текст]: материалы IX Съезда фтизиатров России / О.В. Воронкова, P.P. Хасанова, О.И. Уразова, З.К. Хаитова, И.Е. Есимова, A.A. Кошкина II Туберкулез и болезни легких, 2011. - №4. - С. 96.

3. Цитокинпродуцирующая активность мононуклеарных лейкоцитов крови при туберкулезе легких с множественной лекарственной устойчивостью [Текст]: материалы IX Съезда фтизиатров России / P.P. Хасанова, О.В. Воронкова, О.И. Уразова, З.К. Хаитова, И.Е. Есимова, A.A. Кошкина II Туберкулез и болезни легких. -2011,-№5.-С. 209-210.

4. Продукция интерлейкина-2 лимфоцитами периферической крови у больных туберкулезом легких в условиях CD3/CD28 индукции in vitro [Текст] / A.A. Кошкина, М.С. Писаренко, И.Е. Есимова // Актуальные проблемы патофизиологии: материалы XVIII Межгородской конференции молодых ученых. - СПб., 2012. - С. 74-76.

5. Писаренко, М.С. Т-клеточные механизмы нарушений индуктивной фазы иммунного ответа при туберкулезе легких [Текст] / М.С. Писаренко, A.A. Кошкина II Материалы Всероссийской 71-й итоговой студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова / СибГМУ; под ред. В.В. Новицкого, Н.В. Рязанцевой. - Томск, 2012. -С. 57-58.

6. Причины дизрегуляции иммунного ответа при туберкулезе легких: влияние М. tuberculosis на течение иммунитета [Текст] / И.Е. Есимова, В.В. Новицкий, О.И. Уразова, P.P. Хасанова, A.A. Кошкина, Чурина Е.Г. // Бюллетень сибирской медицины. - 2012. -№3. - С. 79-86.

7. Кошкина, A.A. Субпопуляционный состав СОЗ+-лимфоцитов крови и особенности СОЗ/СП)28-индуцировашюй секреции интерлейкина 2 у больных туберкулезом легких [Текст] / A.A. Кошкина, М.С. Писаренко, И.Е. Есимова // Актуальные

вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири: материалы X Научно-практической конференции молодых ученых. - Красноярск, 2012. - С. 26-30.

8. Особенности СЭЗ/С028-индуцированной секреции интерлейкина 2 и субпопуляционный состав Т-лимфоцитов крови у больных туберкулезом легких [Текст] / A.A. Кошкина, В.В. Новицкий, О.И. Уразова, И.Е. Есимова, P.P. Хасанова// Бюллетень Восточно-сибирского научного центра СО РАМН. - 2012. -№3, ч.2. -С. 92-95.

9. Кошкина, A.A. Механизмы дизрегуляции рецепторопосредованной сигнальной трансдукции в Т-лимфоцитах крови при туберкулезе легких [Текст] / A.A. Кошкина //Фундаментальные исследования.-2012,-№8, ч.1. - С. 91-95.

10. Причины дизрегуляции иммунного ответа при туберкулезе легких: роль нарушений исходного состояния иммунологической реактивности организма [Текст] / И.Е. Есимова, В.В. Новицкий, О.И. Уразова, P.P. Хасанова, A.A. Кошкина, Е.Г. Чурина // Бюллетень сибирской медицины. - 2012..- №4. - С. 93-98.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДТЛ - диссеминированный туберкулез легких

ИТЛ - инфильтративный туберкулез легких

ЛУТЛ - лекарственно-устойчивый туберкулез легких

ЛЧТЛ - лекарственно-чувствительный туберкулез легких

ТЛ - туберкулез легких

ТФ - транскрипционный фактор

АР-1 - Activator Protein 1 - активирующий протеин 1

АРС - Antigen-presentation Cell - антигенпрезентирующая клетка

CTLA-4 - Cytotoxic T-lymphocyte Antigen 4 - цитотоксический Т-лимфоцитарный

антиген 4

IL - Interleukin - интерлейкин

NFAT - Nuclear Factor of Activated T Cells - ядерный фактор активированных T-клеток

NF-кВ - Nuclear Factor kB - ядерный транскрипционный фактор кВ

TCR - T-Cell Receptor - Т-клеточный рецептор

Th - T-helper - Т-хелпер

Treg - Т-регуляторный лимфоцит

Подписано в печать 24.09.2012г. Усл. печ. листов 0,75. Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной печати СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ№217 Тираж 100 экземпляров.