Автореферат и диссертация по медицине (14.00.26) на тему:Особенности бактериологической диагностики и этиотропной терапии микобактериозов легких

Г г ь и п

г я нон

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДЩИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ШСТИГУТ ФТИЗИ0ПУЛШ0Н0Л0ГИИ

ОТТЕН ТАТЬЯНА ФЕРДИНАВДОША

ОСОБЕННОСТИ БАКТЕРЮЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЭТИОТРОПНОЙ ТЕРАПИИ МИКО БАКТЕРИОЗОВ ЛЕГКИХ

Т4.00.26 - фтизиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург - 1994

- }

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте фтизиопульмонологии ИЗ и МП РФ.

Научные консультанты -

доктор медицинских наук, профессор А.В .Васильев доктор медицинских наук Б.И.Вишневский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, щюфессор В.В.Рыбалко, доктор медицинских наук, профессор Э.А.Степанова, доктор медицинских наук Е Л.Старостенко.

Ведущее учреждение - Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза Российской Академии медицинских наук Шосква).

Защита состоится " "__________ 1994 г. на заседании Специализированного совета ДО 084-36-01 при Санкт-Петербургском НИИ фтизиопульмонологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета

доктор медицинских наук, профессор ЭЛ.Беллендир

Акт^альность_п2облемы

Широкое распространение нетуберкулезных микобактерий (НТМБ) в окружающей среде и тяжесть заболеваний, которые они вызывают у человека, указывает на большую значимость НТМБ как инфекционного агента. В начале 80-х годов ыикобактериоз называли "болезнью будущего" и рассматривали его как новый вид патологии человека, которая распространяется во всех странах мира, как бы вопреки эффективным усилиям, направленным на борьбу с туберкулезом (Зыков М.П. , Ильина Т .Б. , 1978, Jeakina, et.al 1981). Спустя десять лет ви многих странах мира микобактериоз превратился в серьезную реальность настоящего. Заболеваемость микобактерио-зом на 100 ООО населения составляет в Чехословакии 2,3 ( Kubtn, et, al, 1984), в Японии 2,7-2,9 ( Tstikamura, et.al. 1988, Kits, et.al. I991), в США 1,2-1,8 ( O'Brien, 1987, Wolynsky, 1992).

Повсеместно отмечаются изменения в эпидемиологии НТМБ, связанные, вероятно с возросшим числом исследований на НТМБ и улучшением их диагностики, а также нарастанием количества хронических неспецифических заболеваний легких, иммунодефицитных состояний человека и, возможно, изменением экологического окружения НТМБ. Большую опасность представляют НТЭДБ как вторичная инфекция у больных СГОЩом, от 10 до 50$ этих больных страдают микобактери-озом ( '«inter, et.al. 1985, Hawkins, 1986). Трудности диагностики, высокая естественная резистентность НТМБ к антибактериальным препаратам приводит к развитию хронических деструктивных поражений легких или диссеминированным процессам у больных СЩЦом. Заболевание имеет неблагоприятный прогноз, с частыми обострениями, постоянным бактериовыделением и высоким процентом летальных исходов (Воскис-Рункевич М.Н. с соавт., 1990, Ellnar et.al.

I991, Jacobson, 1991).

Реальное совершенствование диагностики и лечения микобакте-риозов требует проведения углубленных клинических наблюдений с тщательными лабораторными исследованиями эволюции инфекционного процесса во всех его проявлениях (Wallace et. ai. 1991).

В иностранной литературе параллельно с увеличением роли НТМБ в патологии человека возрастает число научных публикаций, однако в отечественной практике исследования в области НИ1Б носят единичный характер. Имеющиеся сообщения связаны главным образом с частотой выявления НТМБ в том или ином регионе (Антипо-ва С.И. с соавт., 1984, Макаревич Н.М. с соавт., 1985). Отсутствуют обобщающие работы по видовому составу НТМБ, эндемическому характеру их распространения, не разработаны унифицированные схемы идентификации (Рудой Н.М. с соавт., 1987, Лазовская АД., 1991).

В литературе продолжаются дискуссии о роли НШБ в патологии человека, в том числе об их влиянии на клиническое течение СПЭДа и способности вызывать системные заболевания (Ellner, et* »l. 1991, Griff Ith, •£»■!. 1993). Поэтому изучение ви-

рулентности НИШ, как важнейшего фактора патогенности микробов, является актуальной задачей фтизиобактериологии. В то же время практически отсутствуют работы, в которых проведена сравнительная оценка степени вирулентности НШБ и характера клинического течения микобактериоза.

Диагностические критерии микобактериозов, разработанные Taieaota, et.ai. в 1967 г. не подвергались существенным изменениям до настоящего времени. Однако именно работы клиницистов-исследователей должны оказать действенную помощь в своевременной диагностике микобактериоза, что положительно скажется на ведении и специфическом антибактериальном лечении этих больных ( Debrun-

пев, е».а1. 1992).

Одной из главных проблем микобактериозов являются трудности их лечения. Ввиду высокой природной резистентности НТМБ к существующим антибактериальным препаратам, микобактериозы не поддаются специфической антибактериальной терапии и требуют к себе большого внимания со стороны лечащих врачей (Лозовская М.Э., 1988). Поиск новых методов лечения направлен как на определение эффективности различных антибактериальных препаратов, обычно не применяющихся для -лечения туберкулеза, так и на испытание комбинаций двух-трех и более противотуберкулезных препаратов ( УаЗко, аЬ.а1. 198?, Тзикашига, 1991, 2Ь«пе, 1992).

Все вышеперечисленные проблемы микобактериальной инфекции определяют цели и задачи исследования:

Цель работы:

Разработать систему идентификации нетуберкулезных микобак-терий и новых методов изучения их биологических свойств, необходимых для диагностики микобактериозов, характеристики их распоо-странения и бактериологического обоснования тактики лечения. Задачи_£аботы:

1. Изучить культуральные и биохимические свойства НТМБ и разработать рабочие диагностические таблицы и схемы ускоренной идентификации НТМБ в условиях практических лабораторий противотуберкулезных учреждений.

2. Изучить этиогогию микобактериозов и клинические особенности возникновения заболевания.

3. Провести ретроспективный анализ клинических наблюдений микобактериозов и сопоставить с результатами бактериологических исследований для разработки клинико-бактериологических критериев диагностики данного заболевания.

4. Изучить в эксперименте на животных патогенные свойства НТМБ, возбудителей микобактериозов, и-оценить их роль в возникновении заболеваний.

5. Изучить лекарственную чувствительность отдельных видов НТМБ, выделенных от больных микобактериозом, к различным группам антибактериальных препаратов.

6. Изучить механизм, резистентности НТМБ к антибиотикам пе-нициллинового и цефалоспоринового ряда для бактериологического обоснования применения новых групп антибактериальных препаратов в лечении микобактериозов.

Научнал_новизна

Разработаны рабочие схемы и дифференциально-диагностические таблицы, позволяющие идентифицировать 10 наиболее часто встречающихся видов НТМБ.

Выявлены особенности этиологии и предрасполагающих факторов к заболеванию микобактериозом в различных возрастно-половых группах.

Установлен эндемический характер распространения некоторых видов НТМБ на территории курации СПбШ®.

Доказана возможность постановки диагноза микобактериоза по однократному ввделению НТМБ из патологического материала при условии одновременного появления клинико-рентгено-лабораторных признаков туберкулезоподобного заболевания.

Впервые проведено сопоставление степени вирулентности НТМБ с фазой и клиническим течением микобактериоза. Установлена корреляция между степенью активности клинического процесса в легких и степенью вирулентности НТМБ.

Выявлены особенности антибиограммы различных видов НТМБ. Наряду с высокой природной резистентностью НТМБ к противотуберкулезные препаратам впервые представлены данные о нарастании ле-

- б -

карственной устойчивости НТМБ в процессе антибактериальной терапии.

Показано, что одним из факторов обеспечивающих устойчивость микобактерий к антибиотикам, пенициллинового и цефалоспоринового ряда является продукция фермента беталактамазы.' Экстрацеллюляр-ная и клеточносвязанная беталактамаза характеризуется широким спектром действия и видовой специфичностью.

Обоснована целесообразность применения ингибиторов беталактамазы в сочетании с беталактамными антибиотиками для лечения туберкулеза и микобактериозов.

1. Среди НТМБ почти 90% составляют культуры, ввделенные от больных с заболеваниями легких, причем наибольший удельный вес приходится на долю потенциально-патогенных микобактерий с многократным выделением, что является одним из важных диагностических признаков.

2. М. erlum комплекс верифицирован как ведущий возбудитель микобактериоза легких в зоне курации института, однако выделены регионы эндемичные по М. avium (Санкт-Петербург и Ленинградская область), М. kaaaasii (Крайний Север) и М. xeaopi (Северо-Запад РФ).

3. Однократное выделение НШБ является основанием для постановки диагноза микобактериоза в случае одновременного появления

у больного клинико-рентгено-лабораторных признаков, характерных для туберкулезоподобного заболевания.

4. Установлено неблагоприятное прогностическое значение в течение микобактериоза высокой вирулентности НТМБ.

5. Отечественный препарат сульбактам ингибирует микобактери-альную беталактамазу в бактериальной суспензии и фильтрате культуры по всей широте спектра активности и усиливает бактерицидное

действие ампициллина на микобактерии в 8-Ю раз, что делает его доступным для лечения микобактериальных заболеваний.

Практическая_значимость

Предложенные рабочие схемы и, дифференциально-диагностическая таблица позволяет идентифицировать 92% выделенных культур в условиях бактериологических лабораторий противотуберкулезных учреждений и сократить время исследования до 5 дней.

Разработанные клинико-бактериологические критерии диагностики микобактериозов являются важным ориентиром для широкого круга лечащих врачей в вопросе своевременной диагностики микобактери-оза.

Рекомендованы в клинику для лечения микобактериозов наиболее эффективные антибактериальные препнраты и их сочетания - ка-намицин+этамбутол+этионамид, антибиотики группы аминогликозидов (амикацин, гентамицин), сульфаниламидные препараты (бисептол, сульфадиметоксин), сочетание канамицина с эритромицином или дап-соном, а также отечественный препарат сулациллин (сочетание ингибитора беталактамаэы сульбактама с,ампициллином).

Разработанные этапы родовой и видовой идентификации микобак-терий, дифференциальные схемы и диагностическая таблица внедрены в практику бактериологических лабораторий противотуберкулезных учреждений на территории курации института.

Изданы:

- методические рекомендации "Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза" (М., 1992, в соавторстве с В.МДол-жанским, А.Н.Калюк, М.Н.Немсадэе и др.);

- методические рекомендации "Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий" (СПб., 1994).

Подготовлены к печати методические рекомендации "Новые методы диагностики и прогнозирования клинического течения микобак-териоза легких" и "Новый метод лечения туберкулеза и микобакте-риоза легких беталактамными антибиотиками" (Санкт-Петербург, 1994).

Ап£обашя_£аботн

Материалы диссертации доложены на X, XI и ХП съездах фтизиатров (Харьков, 1986; Санкт-Петербург, 1992; Саратов, 1994). На Всесоюзных семинарах фтизиобактериологов (Москва, 1984, Свердловск, 1989; Москва, 1990); на заседании Ленинградского общества фтизиатров (1985), на заседании Ленинградского общества химиотерапевтов (1987), на заседании Санкт-Петербургского научного общества микробиологов и эпидемиологов (1993), на научно-практических конференциях фтизиатров (Санкт-Петербург, 1984; Владивосток, 1986; Дудинка, 1987; Псков, 1988; Архангельск, 1988, Советск, 1989), на совещаниях бактериологов "Школа передового опыта" (Кострома, 1983; Липецк, 1984; Ростов-на-Дону, 1986; Санкт-Петербург, 1987), на семинарах фтизиобактериологов (Москва, 1986, 1988, 1992), На Юбилейной конференции фтизиатров в Ташкенте (1992).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 25 работ.

2^ъем_и_структура_диссе2тации

Материалы диссертации изложены на 14о страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения результатов, практических рекомендаций, выводов, указателя литературы. Содержит 71 таблицу и 9 рисунков. Библиографический указатель включает 357 работ, в том числе 54

- 9 -

отечественных и 303 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и.методы исследования

Для определения роли нетуберкулезных микобактерий в заболевании человека было проведено ретроспективное изучение историй болезни больных микобактериозом - 138 наблюдений, носителей НТМБ - б наблюдений. Больные находились под наблюдением с 1965 по 1993 годы. 71 больной находился на обследовании и лечении в клинике СПбШЭ, остальные лечились в противотуберкулезных стационарах Санкт-Петербурга, Ленинградской области и других городов. Чтобы изучить возможность использования степени вирулентности НТМБ для прогнозирования клинического течения ми-кобактериоза легких было проведено сопоставление степени вирулентности культур с различной степенью активности заболевания у 48 больных. Для определения степени активности процесса мы руководствовались группировкой, разработанной в клинике СП (НИ® М.Э.Лозовской (1988). По степени .клинической активности процесса больные разделялись:

1. Выраженные признаки активности процесса - 13 человек,

2. Умеренные признаки активности процесса - 27 человек.

3. Отсутствие признаков активности процесса - 8 человек.

Нетуберкулезные микобактерии, как объект исследования, поступали в лабораторию из территорий входящих и невходящих в зону курации института, в том числе 1331 культура выделена от больных и 173 культуры - от сельскохозяйственных животных, птиц и окружающей среды. Культуры НТМБ использовались для отработки новых методов идентификации, изучения специфичности и чувствительности различных методов исследования, определения чувствительности к антибактериальным препаратам и определения степени

вирулентности в эксперименте на животных.. Для сравнения бактериологических свойств микобактерий, отдельных методов исследования, лекарственной чувствительности к антибактериальным препаратам и степени вирулентности параллельно с НТМБ проводилось изучение классических микобактерий туберкулеза (МВТ).

Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий проводилась по методике, разработанной Т.Б.Ильиной в СПСНИИ5 (1981), а также на основании собственной схемы идентификации, которая представлена двумя этапами: первичная идентификация - включает определение скорости роста, образование пигмента, способность к росту при различных температурах; окончательная идентификация - определение амидазной и арилсульфатазной активности, гидролиз твина 80, восстановление нитратов. Всего для составления диагностических схем и таблиц было исследовано 37 различных характеристик микроорганизмов.

Хроматографическая идентификация микобактерий, нокардий и родококков проводилась методом тонкослойной хроматографии ( lfordarslca, et.al. 1972), исследовано 83 культуры.

Определение вирулентности НТМБ проводилось по методу внутричерепного заражения морских свинок (Гращенкова О.В., Зыков М.П., 1985) в собственной модификации автора. Определена вирулентность 60 культур НТМБ, в том числе I тест-штамм М. avium TBC-I268, 57 культур комплекса (MAC), М. avium , ввделенннх от больных, М. icansa'sii культура № 1516 и М. fortuitun: № 2961, выделенные от больных. Заражение проводили 0,1 мл микробной суспензии, концентрация 10 мкг/мл. Оценка степени вирулентности НТМБ проводилась по критериям аналогичным критериям для МЕГ, время начала отсчета эксперимента - седьмой день. I. Высокая вирулентность - развитие параличей или гибель живот-

ных - от 7 до 18,9 дня

2. Средняя вирулентность - развитие параличей или гибель животных - от 19 до 23,9 дня

3. Низкая вирулентность - развитие параличей, гибель животных или их забой после 30 дней - от 24 и более дней.

Лекарственная чувствительность НТМБ определялась:

- методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Иенсена,

- диско-диффузным методом ( Ва1сяг1а1о , 1978).

Изучение минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибактериальных препаратов для НТМБ проводилось методом двукратных серийных разведений в синтетической среде Сотона с 10$ лошадиной сывороткой, разработанным в СПСНИ1® (1980).

Изучена активность 59 противомикробных препаратов, в том числе: противотуберкулезные препараты, производные сульфона, препараты группы пенициллинов, цефалоспоринов, тетрациклинов, аминогликозвды, макролвды, сульфаниламидные препараты, производные 8-оксихинолина, нафтиридина, хиноксалина, фторхинолоны.

Сульбактам - как ингибитор беталактамазы. Уназин и сулацил-лин - комбинированные препараты, содержащие в соотношении 2:1 ампициллин и сульбактам.

Испытана чувствительность НТМБ к 21 сочетанию различных антибактериальных препаратов.

Автором разработан собственный способ определения микобак-териальной беталактамазы, направлена заявка на изобретение, получено положительное решение. Расширение технических возможностей способа позволяет проводить одновременно определение беталактамазы и ее ингибирование.

Результаты исследований были обработаны методом математической статистики, полученные данные представлены в виде таблиц и графиков.

- 12 -

Полученще_2§з^льтаты_и_их_обс^]щение.

НТМБ выявляются в патологическом материале от больных сравнительно редко. По данным бактериологических лабораторий Санкт-Петербурга и Ленинградской области выделение НТМБ составило от

0.6 до 1,3$ всех вьщеленных культур микобактерий, что соответствует 20-84 культурам в год. Анализ видового состава НТМБ, выделенных от больных за 10 лет, показал, что на первом месте по удельному весу стоят MAG. Уровень "MAC колебался в различные годы от 44,3$ до 65,8$. На втором месте в отдельные годы стояли

М. xenopi (25,6$ - 27,4$), быстрорастущие микобактерии (22,1$ - 19,3$) и сапрофиты (26,4$ - 19,2$). Наименьшая частота встречаемости М. lcana*eil - 1,6$ и М. sorofulaceum - 0,7$. Представленный видовой состав НТМБ во многом аналогичен частоте встречаемости НТМБ в других странах.

Из патологического материала больных на яичных питательных средах были также выделены и идентифицированы группа неклассифицированных микобактерий (18 штаммов) и слабокислотоустойчивые микроорганизмы (81 штамм), которые после идентификации методом тонкослойной хроматографии были отнесены к родственным таксонам: родококков и нокардий.

Увеличение числа заболеваний, вызванных НТМБ, ставит перед бактериологами задачу своевременного их выявления и быстрой идентификации. В результате исследования установлено, что на территории Санкт-Петербурпа и Ленинградской области средний срок идентификации составил 6,4 месяца. Поэтому для приближения диагностических методов в практические лаборатории были разработаны ускоренные способы идентификации, представляющие три этапа исследования:

1. Родовая идентификация микобактерий.

2. Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий.

3. Идентификация микобактерий до вида.

Определение принадлежности культуры к роду микобактерий проводится путем окраски по методу Циль-Нильсена. Дифференциация туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий проводится одновременно с определением лекарственной чувствительности культуры, путем посева исследуемой культуры на среду с добавлением салицилового натрия или пара-нитробензойной кислоты. Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса сводится к определению способности синтезировать никотиновую кислоту (ниацин) и восстанавливать нитраты.

Видовая идентификация НТМБ по степени сложности применяемых методов разделена на первичную и окончательную.

Первичная идентификация основана на морфологических и бактериологических свойствах микобактерий. Наличие или отсутствие пигмента, также как его образование под действием света, является абсолютным признаком всех исследованных видов микобактерий. Исключение составили культуры MAC, у которых в 16% выявлены колонии с желтым пигментом, заметки о появлении желтых штаммов MAC встречаются в литературе. Свойство отдельных видов микобактерий расти при определенном температурном режиме также служит надежной характеристикой вида. За исключением MAC и М. xenopi все микобактерии давали массивный рост при температуре 22° и 28°С. Термофильные М. xenopi росли при 45° и 52°С. Другой характеристикой микобактерий является скорость роста или время, необходимое для образования сформированных колоний. По этому признаку НТМБ разделены на быстро- и медленнорастущие. Определение скорости роста проводится по времени появления колоний субкультуры или по росту на диагностических средах (рис.).

нетч<Гернулезныв

MuHoifaHmepuu

— тиоглиноле£ая среда -f

— среда с нитратом натрия +

— рост $ течение 3 дней +

оирасиа ноло- ~ ниц

рост +

педпеннорястхщие

ФМ. Hansa s Li

\ N 4- /

прц |rt,xenppi| \t1.$o2donae

М. avium

I

с-скотохропогенныЕ ф-сротохромогенные НФ-нефотохромогенные

Рис. Схема пер&ичнои идентисринации нету/ернмезных минв&нтерий

- 15 -

Таким образом, предложенная схема первичной идентификации НШБ основана на сочетании как наиболее простых бактериологических методов, доступных для работы в практических учреждениях, так и на самых специфически» признаках всех испытанных видов микобактерий. По данной схеме идентифицировано 10 из 18 видов НТМБ, выделенных на курируемой территории, что составляет 88,4$ изученных культур. Специфичность первичного этапа идентификации в среднем составила 94,3$ (от 91$ до 100$ по различным признакам).

Окончательная идентификация с применением сложных биохимических исследований проводится в лаборатории института.

Таким образом, в результате изучения бактериологических и биохимических свойств НТМБ предложены:

- три этапа родовой и видовой идентификации микобактерий, которые значительно упрощают работу врача-бактериолога;

- схема дифференциации МБГ и НТМБ;

- схема видовой идентификации 10 наиболее часто встречающихся видов НТМБ, которая проводится без дополнительного применения биохимических тестов;

- дифференциально-диагностическая таблица, которая дает возможность провести идентификацию в условиях бактериологической лаборатории противотуберкулезного диспансера и сократить время исследования до 5 дней. Специфичность представленного набора тестов 94,3$.

Сопоставление культур НТМБ с патологическим материалом от больных показало, что НТМБ выделены главным образом при заболеваниях органов дыхания - 88,6$. В меньшей степени при заболевании мочевьщелительной системы (7,9$), около двух процентов - из операционного и прочего материала. Установлено, что для каждого

патологического материала характерен свой состав выделенных микроорганизмов. Так, из материала при заболеваниях органов дыхания в 73,9% случаев выделялись потенциально-патогенные мико-бактерии, в то же время при болезнях мочеполовой системы в 90,6%-кислотоупорные сапрофиты и родственные микробы, что указывает на возможность загрязнения данного материала. Потенциально-патогенные микобактерии в 100% случаев выделялись из операционного материала (стенка каверны, казеозные массы), что указывало на их безусловное этиологическое значение.

Таким образом, проведенное исследование показало, что половина идентифицированных культур относилась к MAC, причем в 71% случаев они выделялись у больных многократно. Высокий процент выделения MAC от больных с легочной патологией подчеркивает большое значение этих НГМБ в заболевании человека, как у нас в стране так и за рубежом. М. xenopi выделялись главным образом из материала при заболевании легких и стояли на втором месте как возбудители микобактериоза. Быстрорастущие микобактерии выявлялись в большинстве случаев как однократные находки. При оценке значения их ввделения для больного необходимо тщательно дифференцировать возбудителя заболевания от возможности колонизации дыхательных и мочевыделительных путей или случайной контаминации. Кислотоустойчивые сапрофиты, родококки и нокардии выделялись из материала однократно и во всех случаях расценены как загрязнение.

Изучение видового состава НТМБ, выделенных из окружающей среды, сельскохозяйственных животных и их продукции показало, что сапрофитные микобактерии обитали главным образом в почве, торфе и воде. Напротив из лимфатических узлов сельскохозяйственных животных и птиц, давших положительную пробу на туберкулин, выделялись потенциально-патогенные микобактерии. На долю MAC, выделенных из молока и материала от крупного рогатого скота, при-

ходилось около 30% культур, из материала от свиней - 69,6%, от больных кур MAC выделялись в 100% случаев. HTMБ мало патогенны для крупного рогатого скота и свиней и могут вызывать повышение чувствительности к туберкулину. Специфический процесс у птиц вызывается, как правило, MAC.

Следовательно, крупный рогатый скот и свиньи являются носителями НТМБ, которые выделяются в окружающую среду с продуктами животноводства и в экскретах. По-видимому, таким образом осуществляется кругооборот НТМБ между окружающей средой, животными и человеком.

Проведенный ретроспективный анализ историй болезни больных микобактериозом легких показал, что 90% больных составляли мужчины, большинство из которых были старше 50 лет (64,8%), средний возраст - 53 года. Женщины составляли десятую часть больных, причем среди них преобладали лица моложе 39 лет - 61,5%, средой возраст в этой группе 41 год. Установлено, что 78% больных имели те или иные предпосылки для развития микобактериоза, причем они различались в возрастных и, половых группах. У женщин в возрасте до 50 лет главной причиной, приводившей к заболеванию были ранее перенесенные заболевания бронхо-легочной системы и общесоматические (5 из 7). У мужчин в этом возрасте основным предрасполагающим фактором было наличие профессиональной вредности - 57,6%. Среди лиц старше 50 лет не зависимо от пола главной предрасполагающей причиной возникновения микобактериоза являлись перенесенные хронические заболевания бронхо-легочной системы -66,2%, в том числе у 19 больных неспецифическая легочная патология и у 26 - туберкулез легких.

Анализ случаев микобактериоза показал, что основным возбудителем заболевания являлись MAC - 75,4%, второе место по этиологической значимости занимали М. хеловА (13,1%). Около 5%

заболеваний вызывали М. fortuitum и М. kansaaü и, как единичные случаи, заболевания, вызванные М. chelonei . В то же время при сравнении возбудителей микобактериоза у мужчин и женщин установлено, что М. fortuitum вызывали заболевания значительно чаще у женщин, чем у мужчин (46,2$ против 2,455, р < 0,05). М. xenopi как возбудители заболевания встречались только у мужчин. Повсеместно определяется большое этиологическое значение MAC в заболевании человека, однако высокий процент заболеваний вызванных М. fortuitum. среди женщин и отсутствие у них микобактериозов, вызванных М. xenopi , отмечено впервые.

При изучении возбудителей микобактериоза в различных географических зонах установлено, что по видовому составу возбудители в Санкт-Петербурге и области не имели существенных различий -в обеих зонах более 80$ заболеваний вызывалось MAC, около 10% приходилось на долю М. xenopi , не было заболеваний, вызванных М. icansasü . В остальных зонах отмечалось уменьшение удельного веса MAC и увеличение других видов НТМБ, как возбудителей микобактериоза. Так, на Крайнем Севере выделение MAC, как этиологически значимого агента, было достоверно ниже (р < 0,05), чем в Санкт-Петербурге и области, но несколько чаще встречались М. xenopi , а 22,2$ заболеваний вызвано М. kansaaii

Определение коэффициента корреляции и ассоциации между показателями встречаемости отдельных видов НТМБ в различных географических зонах подтвердило этот вывод. Коэффициент корреляции между выявлением MAC и M.icansasii в Санкт-Петербурге и на Крайнем Севере 1 = 0 ,10 и выражает умеренную тесноту связи; для Ленинградской области и Крайнего Севера £ = 0,47i),II-умеренная теснота связи. Коэффициент ассоциации менаду выявлением MAC и М. xanopi , как возбудителя микобактериоза в Санкт-Пе-

тербурге и на территории Северо-Запада РФ * = 0,42^0,15; для Ленинградской области Ъ '= 0,474э,09, что выражает умеренную ассоциативную связь.

.Таким образом, установлено наличие эндемичес'ких очагов в распространении возбудителей микобактериозов на территории кура-ции СПбНШ®. Санкт-Петербург и Ленинградская область эндемический очаг MAC, территория Северо-Запада - М. xenopi , а на Крайнем Севере достоверно чаще встречаются М. kanoasii

Заболевания микобактериозом в нашей стране носят спорадический характер, что не позволяет составить подробную эпидемиологическую характеристику данной патологии. Однако, в зоне ку-рации определяется несколько населенных пунктов, где выделение НТМБ выше средних показателей. Так, при случайном характере выборки больных микобактериозом легких, 10% всех изученных наблюдений зарегистрировано в центрах горно-добывающей промышленности (гЛорильск, пДебин Магаданской области) и тяжелой металлургии (г.Череповец). Увеличение заболеваемости микобактериозом в индустриальных районах, как следствие ухудшения состояния окружающей среды, отмечается и в иностранной литературе.

При анализе исторйй болезни больных микобактериозом установлено, что цолько 52,2% заболеваний на момент исследования были расценены клинически правильно как больные микобактериозом, остальные проходили с диагнозом различных форм туберкулеза легких. У больных микобактериозом преобладали локальные признаки заболевания: кашель с мокротой, боли в груди, одышка, выслушивались катарральные явления в легких, из общих симптомов у большинства из них наблюдались повышение температуры тела, потливость. Рентгенологические изменения в легких носили полиморфный характер от очаговых до распространенных диссеминированных процессов, в том числе с деструкцией легочной ткани, или фиброзно-кавернозных

форм. Поражения в легких имели одностороннюю локализацию в 57,6$, двустороннюю - в 42,4$.

Микобактериозы, вызванные М. kansasil имели более благоприятное течение (табл.), носили очаговый характер с односторонним поражением. В то же время быстрорастущие микобактерии несколько чаще вызывали деструктивные двусторонние процессы,'2 случая закончились летально. Наиболее тяжелые формы заболевания с неблагоприятным течением и прогнозом отмечены при микобакте-риозе, вызванном MAC. Заболевания протекали по типу инфильтратив-ных и фиброзно-кавернозных форм, характеризовались волнообразным течением с частыми обострениями и выраженными симптомами интоксикации. У 12 (11,2$) из этой группы больных наблюдался летальный исход. 36 больных микобактериозом (25$) подверглись хирургическому вмешательству различного объема. Среди оперированных больных 86$ приходилось на долго микобактериозов, вызванных MAC.

В существующих диагностических 1фитериях главный акцент делается на повторность выделения НТМБ из патологического материала больного. Однако практика показала, что в ряде случаев достаточно однократного выделения НТМБ для постановки диагноза микобактериоза. При анализе повторности выделения культур НТМБ установлено, что у 63,8$ больных микобактерии выделялись пять и более раз, у 31,2$ - от двух до четырех раз, у 5 (3,6$) больных НТМБ выделены только в резецированной ткани легкого и только два больных (1,4$) имели на момент обследования однократное выделение НТМБ. Таким образом, на основании общепринятых критериев диагноз микобактериоза легких подтверждался у 136 больных. Больным с однократным выделением НТМБ диагноз микобактериоза не мог быть поставлен.

Учитывая несовершенство методов выделения НТМБ, низкое качество питательных сред и, возможно, не всегда высокую квалифи-

Распределение больных различными формами микобактериоза легких по виду возбудителя

Патологические процессы Число боль- М. кап еэбИ м. а\ггша М.хепор1 Быстрорастущие микобактерии

в легких ных абс. % абс % абс. % абс. %

Диссеминированный 5 - 4 - „ - I

Очаговый 10 2 20,0 4 40,0 2 20,0 2 20,0

Инфильтративный 35 3 8,6 24 68,6 5 14,2 3 8,6

Туберкулома 6 I - 4 - I -

Кавернозный 5 - - 4 - I -

Фиброзно-кавернозный 74 - - 61 82,4 9 12,2 4 5,4

Цирротический I - - I -

Силикотуберкулез 2 - - 2 -

Всего 138 6 4,3 104 75,4 18 13,1 10 7,2

кацию врача фтизиобактериолога по идентификации микобактерий, были проанализированы истории болезни больных, имевших 2-3 кратное выделение НТМБ. Оказалось, что у 5 больных однократное выделение НТМБ из мокроты и промывных вод бронхов было верифицировано последующим выделением аналогичной, культуры из резецированной легочной ткани, еще у 5 больных повторное выделение культуры НТМБ наблюдалось со значительным интервалом, от I года до трех лет. Детальный анализ историй болезни этих больных показал, что во всех случаях наблюдалась картина микобактериоза легких, но однократное выделение НТМБ не позволяло установить правильный диагноз заболевания. Следовательно, необходимы новые достаточно чет-кив клинические критерии для оценки выделенной культуры.

За основу клинико-бактериологических критериев диагностики микобактериоза взята одновременность появления клинико-рентгено-лабораторных признаков, характерных для туберкулезного процесса, и выделение культуры НТМБ.

В большинстве наблюдений (70,1%) заболевание легких выявлено при очередном профилактическом обследовании или диспансерном наблюдении, у остальных пациентов (29,9$) патологические изменения в легких диагностированы при обращении за медицинской помощью. Для определения одновременности выделения культуры НТМБ с клиническими проявлениями заболевания были сопоставлены дата забора диагностического материала на посев и дата обращения к врачу или флюорографического обследования. В результате такого сопоставления было установлено, что уже в первые два месяца после начала заболевания в материале 64,3% больных были выделены НТМБ, при профилактическом обследовании - у 60,4$. Следовательно, более 60$ больных имели одновременное выделение культуры НТМБ и появление клинико-рентгенологических признаков заболевания уже в первые два месяца от начала заболевания, что может служить достоверным

критерием для постановки диагноза микобактериоза. У 22,5% больных дата выделения культуры НТМБ и появления клинической симптоматики активного легочного процесса укладывалась в период от 3 до 6 месяцев. Анализ 21 наблюдения, с несовпадающей датой выделения культуры и появления клинических признаков заболевания, показал, что по клиническим диагнозам все они были расценены как больные микобактериозом и несовпадение даты может быть связано, как с документальными погрешностями, так и с поздним бактериологическим обследованием больных.

Наряду с больными микобактериозом иэучона группа больных, у которых выделение НТМБ не сопровождалось развитием заболевания. Все больные (6 человек) имели в анамнезе перенесенный туберкулез легких и выделение культуры НТМБ происходило при очередном диспансерном наблюдении, но ни у одного из них в этот период не выявлено клинических или рентгенологических признаков активности процесса. В этом случае выделение НТМБ было диагностировано как носите льство.

Проведенные кпинико-бактериологические сопоставления показали, что существенным отличием между заболеванием микобактериозом и носительством НТМБ является не столько повторность выделения МБ, сколько наличие выраженных клинических проявлений активности патологического процесса в легких. На основании разработанных диагностических критериев диагноз микобактериоза ретроспективно был поставлен двум больным с однократным выделением MAC. Оба больных выделили культуру НТМБ в первый месяц появления у них клинических признаков заболевания и спеиифических изменений на рентгенограмме.

Установлены факты длительных интервалов между повторным выделением культуры НТМБ из мокроты или резецированной ткани (10 больных), что связано как с лабораторными трудностями выделения

НТМБ, так и с организационными недостатками в бактериологическом обследовании больных. В этих случаях также знание критериев одновременности выделения культуры и появления активных патологических изменений в легких способствовало бы своевременной диагностике микобактериоза по первому выделению культуры НТМБ.

Таким образом, разработанные критерии диагностики позволяют на основании появления выраженной клинико-рентгено-лабораторной симптоматики, совпадающей с датой выделения НТТ^Ь из патологического материала ставить диагноз микобактериоза легких впервые выявленным больным по однократному (первичному) выделению культуры. Аналогичное сопоставление даты активизации процесса в легких и даты выявления культуры может иметь место и у больных-хроников в период обострения на фоне интенсивной противотуберкулезной терапии. Диагноз микобактериоза в таком случае ставится по однократному выделению культуры НТМБ.

Определение степени вирулентности НТМБ проводилось методом внутричерепного заражения морских свинок, критерием оценки патогенных свойств микробов служил нейропаралитический симптомокомп-лекс (развитие параличей задних конечностей). Для определения степени вирулентности НТМБ была отработана плотность микробной взвеси 10 мкг/мл, вызывающая патологический процесс в организме животных, протекающий с явлениями нейропаралитической симптоматики. Определение вирулентности культур М. атг±ии , выделенных от больных микобактериозом показало, что больше половины культур (56,1%) имели низкую вирулентность для морских свинок, которая характеризовалась отсутствием выраженных патологических изменений в организме. Даже при развитии парезов и параличей гибель животных наступала крайне редко (8,3%). Большинство животных сохраняли активное движение и к концу эксперимента' показывали прибавку в весе (5,1%). Средняя степень вирулентности определялась

у 22,8% культур. При заражении животных культурой средней вирулентности у 21% отмечалось развитие параличей задних конечностей, у 42,1% - парезы. Гибель животных в этой группе происходила в 39,5% случаев, потеря веса составила 14,6%. Высокая степень вирулентности определялась у 21,1% культур. Для них характерен высокий процент развития параличей (36,7%) и гибели жиеотных (56,7%). При сравнении степени вирулентности НТМБ и МВТ установлено, что даже 10 кратное увеличение дозы заражения животных не позволило им достигнуть вирулентности МВТ. Высокая степень вирулентности встречалась у 53,4% культур МЕГ против 21,1% у культур MAC.

Сопоставление степени активности клинического процесса со степенью вирулентности показало, что при отсутствии признаков активности процесса у больных микобактериозом подавляющее число культур (87,5%), характеризовались низкой степенью вирулентности. В то же время у больных с выраженными признаками активности процесса низковирулентные культуры выделялись только в 46,1% случаев и достоверно реже, чем в группе больных с отсутствием признаков активности (р< 0,05). При выраженных признаках активности процесса 30,8% культур проявляла высокую вирулентность для морских свинок. Коэффициент корреляции между степенью вирулентности культур MAC и степенью выраженности признаков активности процесса t = 0,415),08, что выражает умеренную тесноту связи этих показателей.

Следовательно, можно сделать вывод, что определение степени вирулентности НТМБ служит прогностическим показателем в клинике микобактериоза. Если культуры с низкой вирулентностью встречаются достаточно часто при любой степени активности процесса и не могут быть надежным прогностическим показателем активности процесса, то обнаружение высоковирулентных культур свидетельствует о выражен-

ных признаках активности. В этом случае у больного наблюдаются выраженные симптомы интоксикации, локальные признаки обострения процесса, по данным лабораторных исследований - увеличенное СОЭ, сдвиг в лейкограмме. При рентгенологическом обследовании, как правило, определяются перифокальные воспалительные изменения вокруг очагов и каверн, появление свежей инфильтрации, распада и обсеменения. Аналогичные результаты были получены при сопоставлении степени вирулентности культуры с продолжительностью и частотой бактериовыделения, Прекращение бактериовыделения в течение первого года заболевания происходило главным образом у больных с низкой вирулентностью культур (73,1%), при длительности выделения НТМБ более трех лет - 58,3$ культур имели высокую и среднюю вирулентность. По-видимому, быстрое прекращение бактериовыделения может происходить как в результате естественного самоисцеления организма, так и врззультате эффективного терапевтического и хирургического лечения. Напротив, высоко- и средневирулентные культуры характеризуют длительнотекущие прогрессирующие процессы. При сопоставлении с частотой выделения культуры установлено, что при многократном вьщелении НТМБ 62,4$ культур имели высокую и среднюю степень вирулентности. В случае выделения единичных культур -65,3$ относились к низковирулентным. По-видимому, культуры с низкой вирулентностью скорее элиминируются из организма, не вызывая патологического процесса.

При изучении степени вирулентности культур MAC, ввделенных у впервые выявленных больных и больных с хроническим деструктивным процессом в легких отмечено, что высоко- и средневирулентные культуры выделялись главным образом у больных с хронически текущим деструктивным микобактериозом (53,4$), в то время как у впервые выявленных больных 63,6$ культур имели низкую степень вирулентности. Коэффициент ассоциации между частотой встречаемости

культур с различной степенью вирулентности и продолжительностью заболевания микобактериозом равен Ъ = о.ззЗэ ,09, что указывает на умеренную тесноту связи этих показателей.

Следовательно, можно сделать вывод, что определение степени вирулентности культуры MAC, выделенной от больного, имеет прогностическое значение в определении хронического течения патологического процесса в легких и раскрывает возможный механизм патогенеза микобактериоза. Так, толчком к возникновению специфического процесса в организме является инфицирование человека культурой низкой вирулентности, а за поддержание хронического процесса с волнообразным или рецидивирующим характером ответственны высоко- и средневирулентные культуры.

Данная закономерность не отмечалась в клинике микобактериоза и находится в противоречии с аналогичными исследованиями в практике фтизиатрии, где установлено, что культуры МВТ, выделенные от больных с длительнотекущими туберкулезными поражениями, как правило, характеризуются сниженной вирулентностью для лабораторных животных. Известно, что именно высоковирулентные мико-бактерии способны к персистированию и размножению в макрофагах человека, что служит резервуаром инфекции. Не исключено, что длительное пассирование в организме человека, может приводить к повышению вирулентности НТМБ. Подтверждением этому наблюдению служит экспериментальная работа Orowle (1986), который обнаружил преобладание вирулентных культур в популяциях, прошедших пассирование через культивированные макрофаги.

Лечение больных микобактериозом проводится в противотуберкулезных стационарах и строится на использовании специфических антибактериальных препаратов. Поэтому первоначально было проведено определение эффективности противотуберкулезных препаратов (ПТП) как отдельных, так в различных комбинациях, а также изуче-

но развитие лекарственной устойчивости НТМБ в процессе антибактериальной терапии. Установлено, что НТМБ проявляли различную чувствительность к ПТП. Так, естественная устойчивость М. xenopi отмечалась только к этамбутолу и рифампицину (16,6% и 25,0% соответственно). Устойчивость к стрептомицину в дозе 5 мкг/мл определялась у 16,6% культур. Высокие же дозы стрептомищна, изо-ниазида и этионамида полностью подавляли рост культур М.xenopi что дает широкий выбор ПТП для лечения микобактериоза, вызванного М. xanopi

Чувствительность М. fortuitum к стрептомицину, изониа-зиду, рифампицину, этионамиду и циклосерину не превышала 10%, и только к этамбутолу и канамицину было чувствительно 35,8 и 56,6% соответственно. MAC были в 93,6% устойчивы к рифампицину, в 83,9% - к изониазиду. Наиболее активными против MAC были этам-бутол - 50,0% и канамицин - 41,9%. При сочетанном применении ка-намицина в различных дозах с этамбутолом и этионамидом подавлялся рост 95,8-100,0% культур. Замена в этих комбинациях канамици-на на изониаэид снижала их активность до 85,4% - 89,6% (р £ 0,05). Следовательно, главную роль в комплексной терапии микобактериозов, вызванных MAC, играет канамицин, в сочетании с этамбутолом, этионамидом и даже изониазидом.

Изучение лекарственной чувствительности культур от больных, длительно леченных ГГГП, показало, что также как и у МБГ у НТМБ происходит нарастание устойчивости. Отмечено достоверное увеличение числа устойчивых кул.ьтур MAC к стрептомицину (36,8% против 73,7%), изониазиду (57,8% против 81,8%) и этамбутолу (30,0% против 61,0%). Наибольшая чувствительность сохранялась к зтионами-ду (34,7%) и этамбутолу (39,0%), что необходимо.учитывать в клинике при лечении йэльньгх микобактериоэом. При-исследовании ле-

карственной устойчивости M.xenop.1 отмечено увеличение резистентности не только к этамбутолу (16,6% против 33,3%) и рифам-"ицину (25,0% против 75,0%, р 0,05), но и развитие устойчивости к ранее эффективным препаратам изониазиду и этионамиду. Однако, и в этом случае М. xenopi не обладали такой высокой степенью полирезистентности как MAC, что оставляет возможность для длительного применения ПТП.

Таким образом, проведенное исследование показало высокую естественную резистентность НТМБ к ПТП. 85% культур MAC, полученных от больных до начала лечения обладали устойчивостью к 3 и более препаратам. М. xenopi значительно были более чувствительны к ПТП и характеризовались монореэистентностью в 41,6%. В работе прослежено нарастание лекарственной устойчивости НТМБ к ПТП в процессе антибактериальной терапии. В отличие от культур МБГ и частично М. xenopJ. , у которых нарастание лекарственной устойчивости происходит за счет перехода культур из категории чувствительных в категорию резистентных; для MAC нарастание устойчивости характеризовалось переходом из состояния моно- и ди-резистентности к полирезистентности, так как даже среди первичных культур отсутствуют полностью чувствительные штаммы. Второй особенностью развития резистентности MAC является более длительный период, необходимый для формирования устойчивых популяций.

Изучение лекарственной чувствительности НТМБ к антибиотикам и химиопрепаратам широкого спектра действия показало, что они проявляли различную активность против испытанных видов микобакте-рий.

Так, антибиотики группы аминогликозидов были достаточно эффективны против М. fortuitum. и в меньшей степени против MAC. Минимальная концентрация, подавляющая рост 50% культур М. for_ tuitum составляла для амикацина - 0,78 мкг-мл, для гентамици-

-ЗОна - 3,12 мкг/мл, для канамицина - 1,56 мкг/мл. Для MAC минимальная подавляющая концентрация (МПК) равнялась 6,25; 6,25; и 3,12 мкг/мл (соответственно).

Изучение макролидов, в связи с их высокой эффективностью против внутриклеточных паразитов, показало, что эритромицин проявляет угнетающее действие на MAC в дозе 12,5 мкг/мл. Сочетан-ное испытание эритромицина (12,5 мкг/мл) с канамицином (30 мкг/мл) значительно усиливало антибактериальное действие последнего, подавлялся рост 62,1% исследованных культур. Не зависимо от дозы эритромицина только 18,2% культур М. fortuities были к нему чувствительны. Следовательно, комбинацию эритромицина с канамицином рекомендуется использовать в клинике для лечения микобактериозов, вызванных MAC.

Испытанные сульфаниламидные препараты проявляли активное противомикробное действие на оба вида НТМБ. Наиболее активно действовали бисептол и сульфадиметоксин, которые подавляли рост НТМБ в наименьших концентрациях. Бисептол в дозе 50 мкг/мл подавлял рост 71,9% культур MAC и все культуры М. fortultun Сульфадиметоксин в дозе 100.мкг/мл подавлял рост 50% испытанных культур.

Антибиотики класса фторхинолонов угнетают активность бактериальной гиразы и проявляют активность внутри фагоцитов (ципро-бай). Минимальная подавляющая концентрация ципробая для М. icansasii , М. fortuitum и М. smegmatis составила

0,39 мкг/мл, для MAC - 3,1 мкг/мл. Таривид был также активен против НТМБ, однако рост MAC подавлялся только при концентрации препарата 25 мкг/мл. Следовательно, препараты класса фторхинолонов можно использовать при лечении микобактериозов, но против МАС-инфекции они менее'эффективны.

Производные сульфона показали низкую активность против

НТМБ. При самостоятельном применении диафенилсульфон в дозе 50 мкг/мл подавлял только 20,0$ культур MAC, в то же время в сочетании с канамицином он проявлял выраженное потенцирующее действие, повышая активность последнего до 86,0$.

Для изучения сочетанного действия различных антибактериальных агентов были отобраны препараты, показавшие наибольшую активность при самостоятельном применении. Установлено, что соче-танное применение антимикробных препаратов значительно повышает их бактериостатическую активность. Полное или почти полное подавление роста MAC наблюдалось при комбинации аминогликозидов с сульфаниламидами (от 88,8$ до 100$). Следует отметить, что увеличение дозы бисептола и амикацина во всех сочетаниях усиливало подавляющий эффект комбинации, кроме того, активность кана-мицина (50 мкг/мл) при сочетанном применении оказалась равной активности амикацина в той же дозе. Препарат группы цефалоспори-нов, как при раздельном применении, так и в сочетании с амино-гликозидами, дал самые низкие результаты, что объясняется устойчивостью MAC к беталактамным антибиотикам.

Для определения активности антибиотиков широкого спектра дейс.твия против М. fortultum был использован метод диффузии в агаре, как наиболее простой и широко применяющийся в лабораторной практике для работы с неспецифической микрофлорой. Установлено, что наибольшую активность против М. fortultum. проявляли антибиотики группы аминогликозидов. К гентамицину и канамицину умеренную и высокую чувствительность проявляли почти все испытанные культуры (96,1$ и 98,1$), средний диаметр зоны задержки роста микобактерий составил 28,8 мм и 28,7 мм. Мономицин несколько уступал им по действию, подавляя рост 76,5$ культур. В то же время беталактамные антибиотики в 100$ случаев не оказывали

- 32 -

влияния на рост M. fortuitum . Тетрациклин, ристомицин и эритромицин эффективно действовали на 35-15$ испытанных штаммов и в некоторых случаях могут применяться для лечения больных. В каждом отдельном случае микобактериоза, вызванного M. fortuit и::. , следует определять антибиограмму данного возбудителя, используя набор стандартных дисков и агаризованнуга среду Сото на.

Для повышения эффективности химиотерапии туберкулеза и микобактериоза делаются попытки применения беталактамных антибиотиков, основанием для этого послужило открытие новых соединений с выраженной способностью инактивировать беталактамазы различной природы.

С помощью разработанного автором способа определения мико-бактериального фермента и способа его ингибирования проведено изучение механизма устойчивости микобактерий к пенициллинаы и цефалоспоринам и возможности использования этих антибиотиков во фтизиатрической практике. Установлено, что все испытанные виды микобактерий, за исключением MAC, проявили способность инактивировать пенициллин, что свидетельствует о наличии у них фермента беталактамазы. Наибольшая активность фермента проявлялась у быстрорастущих микобактерий (M. phlei э M.smegaafcLs и M. chelonfii ), уже после б часов инкубации 91,6$ культур полностью гидролизовали пенициллин. Достаточно высокая активность наблюдалась у М. ъ-x/is и M. tuberculosis - 73,3$ и 53,7$ (соответственно). При 6 часовой экспозиции только 42$ культур M. fortuitum инактивировали пенициллин, среди M. kanaasii ни один штамм не проявил активности фермента. После 24 часового контакта с антибиотиком полный или частичный гидролиз пенициллина наблюдался у 90 - 100$ испытанных культур всех видов мико-

бактерий, за исключением MAC. Неспособность MAC инактивировать пенициллин при высокой МПК пенициллина позволяет предположить другой механизм устойчивости данного вида НТМБ к беталактамным антибиотикам.

Изучение субстратной специфичности фермента показало, что микобактериальная беталактамаза имеет широкий спектр действия, который включает антибиотики пенициллинового и цефалоспоринового ряда. Кроме того каждый вид микобактерий имеет характерную только для этого вида специфичность фермента. Так, беталактамаза быстрорастущих микобактерий (М. ohelonei , М. smegmatie и М. phlel ) имеет самый широкий спектр действия и способна ги-дролизовать пенициллины и цефалоспорины, как неустойчивые, так и устойчивые к беталактамазе, в том числе такие высокоактивные препараты как кефзол и цефамезин. Другой вид быстрорастущих микобактерий-- M.fortuitum , показал меньшую широту спектра фермента. Почти все культуры М. fortuitum гидролизуют пенициллин, ампициллин, кефзол и цефамезин, но не способны инактивировать устойчивый к беталактамазе оксациллин. Фермент М. kansasii имеет ограниченный спектр действия, гидролизуя только пенициллин. Беталактамаза микобактерий туберкулезного комплекса обладает достаточно широким спектром действия, частично гидролизуя кефзол и цефамезин.

Проведенное исследование позволяет считать, что в жидкой питательной среде определяется экстрацеллюлярная беталактамаза, однако известно, что микобактериальная беталактамаза находится в клеточносвязанном состоянии, то есть ее определение возможно при разрушении клетки. Естественный процесс разрушения клетки происходит при старении культуры. Поэтому было проведено сравнительное определение беталактамазы в бактериальной суспензии и

фильтрате культур микобактерий туберкулезного комплекса различного возраста. Исследование показало, что по мере старения культуры активность фермента в фильтрате возрасла до 100%, в то же время уровень фермента в суспензии культуры снизился до 50%. Следовательно, в фильтрат культуры выходит клеточноевязанный фермент, освободившийся в результате аутолиза клеток. Исследование бактериальной суспензии и фильтрата 11-12 недельных культур MAC и М. xenopi позволило выявить следы клеточносвязанного фермента. Сравнение спектра действия беталактамазы в бактериальной суспензии и в фильтрате показало, что клеточносвязанньгй фермент имел такой же спектр действия, как и экстрацеллюлярный, но выявлялся у значительно большего числа культур.

Таким образом, микобактериальная беталактамаза продуцируется различными видами микобактерий в виде клеточносвязанного и экст-рацеллюлярного фермента. Следовательно, чтобы оказать антибактериальное действие на возбудителя необходимо нейтрализовать действие фермента. Определение ингибирующего действия сульбактама (производство НИИ антибиотиков, Москва) показало, что сульбактам способен подавлять микобактериальную беталактамазу по всей широте спектра действия фермента.

Следующим этапом работы было определение антибактериальной активности комбинации сульбактама с антибиотиками группы пенициллина. -Туберкулостатическая активность пенициллина и ампициллина против микобактерий была достаточно низкой, МПК для М. tutcrou-loelo , М. boris и MAC равнялась ТОО и более мкг/мл, рост М. fortuitum не подавлялся концентрацией 800 мкг/мл. Испытание комбинации сульбактама с пенициллином и ампициллином показало, что сульбактам усиливает антибактериальное действие антибиотиков. МПК всех испытанных штаммов снизилась в 8-10 раз и соста-

вила у некоторых штаммов микобактерий туберкулезного комплекса 12,5 и 6,5 мкг/мл, у M.fortuitua - 100 мкг/мл.

Появление новых фармакологических средств - сулациллин, уназин - представляющих со£ой сочетание ампициллина и сульбакта-ма, дало возможность проверить эффективность их действия на ми-кобактерии. Установлено, что оба препарата имели одинаково высокое воздействие на испытанные виды микобактерий. Эффективность сулациллина и уназина составила 3,12 мкг/мл для М. ЧапзазИ и 12,5 мкг/мл для МВТ. Комбинированные препараты несколько усиливали действие ампициллина на MAC, но концентрация антибиотика оставалась высокой (более 50 мкг/мл). Следовательно, уназин и сулациллин можно применять для лечения микобактериальных заболеваний, вызванных МТБ и М. kansasii , при МАС-инфекции они мало эффективны.

Таким образом, проведенное исследование всесторонне охватывает проблему микобактериозов легких и является логическим обобщением и продолжением традиционной для СПеНИИФ работы с нетуберкулезными микобактериями. Наряду с бактериологическим изучением выявления и идентификации микобактерий, разработаны вопросы этиологии микобактериозов легких, факторов, предшествующих заболеванию, эндемической очаговости возбудителя и клинико-бактериоло-х)

гических критериев. Определено прогностическое значение высокой вирулентности НТМБ в клинике микобактериозов и патогенезе заболевания, бактериологически обоснованы важнейшие направления этиотропной терапии микобактериозов.

х)

диагностики.

выводы

1. Предложенная рабочая схема первичной идентификации и диагностическая таблица нетуберкулезных микобактерий ускоряет идентификацию 10 наиболее часто встречающихся видов нетуберкулезных микобактерий до 5 дней. Специфичность представленного набора тестов составляет 94,3%.

2. В зоне курации СПйШ® идентифипировано 18 видов нетуберкулезных микобактерий, характеризующихся различной частотой обнаружения и клинической значимостью. На первом месте по удель-но'му весу стоит MAC, уровень которого по годам колебался от 44,3% до 65,8%. На втором месте находятся М. xenopi (от 6,4% до 27,4%), быстрорастущие микобактерии (от 8,3% до 22,1%) и сапрофитные микроорганизмы.

3. В регионе наблюдения установлено 5 этиологически значимых видов нетуберкулезных микобактерий. Основным возбудителем микобактериозов является MAC, который вызывает 75,4% заболеваний. Однако установлена эндемическая очаговость в распространении возбудителей микобактериозов, с преобладанием в Санкт-Петербурге и Ленинградской области - MAC (83,8-85%), на Крайнем Севере - М. kaasasii (22,2%), на Северо-Западе РФ - М. xenopi (20,7%).

4. При однократном (первичном) выделении нетуберкулезных микобактерий у больного решающее значение для постановки диагноза микобактериоза принадлежит наличию клинико-рентгено-лаборатор-ных признаков, характерных для туберкулезоподобного поражения,

в период бактериологического обследования.

5. Установлено неблагоприятное прогностическое значение высокой вирулентности нетуберкулезных микобактерий, коррелирующее с выраженной активностью клинических признаков заболевания, ча-

стым и длительным бактериовыделением.

6. Ассоциативная связь между степенью вирулентности нетуберкулезных микобактерий и длительностью патологического процесса в легких, раскрывает механизм патогенеза микобактериоза, когда заражение человека происходит культурой с низкой вирулентностью, а развитие деструктивного процесса обусловлено высоковирулентной культурой.

7. Нетуберкулезные микобактерии обладают различной степенью естественной резистентности к противотуберкулезным препаратам., М. хеаор! в 41,6$ характеризуются монорезистентностью, в то время как культуры MAC в 85$, а М. fortuitum в 90$ проявляют полирезистентность. Наряду с высокой исходной устойчивостью нетуберкулезных микобактерий к противотуберкулезным препаратам установлено ее нарастание в результате длительных курсов антибактериальной терапии.

8. Разработан новый способ определения микобактериальной беталактамазы и ингибирования фермента.,Простота и доступность способа позволяют рекомендовать его для работы в практических убеждениях здравоохранения.

9. Установлено наличие внутриклеточной и экстрацеллюлярной микобактериальной беталактамазы, которая обладает широким спектром действия и видовой специфичностью. Фермент быстрорастущих микобактерий гидролизует все испытанные антибиотики группы пени-циллинов и цефалоспоринов, микобактерии туберкулезного комплекса - не гидролизуют антибиотики, устойчивые к беталактамазе, у М.avium и М. xenopi выявлена незначительная активность клеточносвязанного фермента.

10. Применение комбинированных препаратов, содержащих ингибиторы микобактериальной беталактамазы (сулациллин, уназин),

усиливает антибактериальное действие беталактамных антибиотиков и делает их доступными для лечения тебуркулеза и микобактериозов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Проблемы бактериологической диагностики микобактериозов легких // Современные проблемы туберкулеза и неспецифических заболеваний органов дыхания: Сборниктрудов. - Вильнюс, 1984. -С.245-248 (в соавторстве с Т.Б.Ильиной, Б.И.Вишневским).

2. Микобактериозы с клиническим течением по типу неспецифических пневмоний // Организация противотуберкулезной и пульмонологической помощи населению Молдавской ССР: Тезисы докладов.

- Кишинев, 1984. - С.131-132 (в соавторстве с Л.П.Божковой, Д.И.Войтовой, Т.Б.Ильиной и др.).

3. Результаты проверки работы бактериологических лабораторий по идентификации микобактерий // Пробл.туб. - 1985. - № I.-С.60-64 (в соавторстве с Т.Б.Ильиной, Б.И.Вишневским).

4. Совершенствование микробиологической диагностики микобактериозов - заболеваний человека, вызванных нетуберкулезными микобактериями // Совершенствование и стандартизация бактериологических исследований при туберкулезе: Сборник трудов. - Фрунзе, 1985. - С.79-84 (в соавторстве с Т.Б.Ильиной).

5. Диагностика заболеваний, вызванных нетуберкулезными ми-кобактериями // Всесоюзный съезд фтизиатров, Ю-й. - Киев, 1986.

- С.85 (в соавторстве с Н.М.Макаревич, Н.М.Рудой, Р.А.Лотоцкой и др.).

6. Дифференциация МДиЬегси1о»1з и М. Ъо»1я с помощью салицилатного теста и редукции нитратов // Пробл.туб. - № I. -С.57-60 (в соавторстве с Т.Б.Ильиной, Э.С.ШаппЪ, Б.Я.Циммером).

- 39 -

7. Бактериологическая диагностика туберкулеза и микобакте-риоза // Современные вопросы дифференциальной диагностики и теоретических исследований при туберкулезе: Сборник трудов Центрального НИИ туберкулеза. - М., 1987. - С.82-88 (в соавторстве с Н .М .Макаревич, Р.А.Лотоцкой).

8. Чувствительность некоторых нетуберкулезных микобактерий к антибиотикам и химиопрепаратам широкого спектра действия // Проблемы и перспективы развития бактериологии во фтизиатрии: Сборник трудов. - М., 1988. - С.87-91.

9. Химиотерапия микобактериозов в эксперименте // Пробл. туб. - 1988. - № 9. - С.47-52 (в соавторстве с А.Е.Александровой, М.Э.Лозовской, Б.М.Ариэлем).

10. Совершенствование методов лечения микобактериозов в связи с лекарственной устойчивостью нетуберкулезных микобактерий. // Актуальные вопросы лабораторной диагностики туберкулеза в эксперименте и клинике: Сборник трудов Центрального НИИ туберкулеза. - М., 1989. - С.39-44 (в соавторстве с М.Э.Лозовской).

11. Экспериментально-теоретические обоснования к использованию беталактамных антибиотиков в этиотропной терапии туберкулеза // Актуальные вопросы лечения больных туберкулезом на современном этапе: Тезисы докладов. - Якутск, 1990. - С.45-46 (в соавторстве с Т.И.Виноградовой, Р.А.Щеголевой, Б.И.Вишневским).

12. Определение активности антибиотиков широкого спектра действия против М.Гогйи1Л«а методом диффузии в агаре // Пробл.туб. - 1990. - С.54-57.

13. К вопросу о тактике ведения больных микобактериозом легких // Пробл.туб. - 1991. - № 4. - С.13-15 (в соавторстве с

А .В.Васильевым).

14. Особенности диагностики и клинического течения микобак-

териоэа легких // Диагностика и дифференциальная диагностика туберкулеза легких и внелегочных локализаций: Сборник трудов. -СтПетербург, 1991. - С.85-88 (в соавторстве с М.Э.Лозовской).

15. Совершенствование диагностик« микобактериоза и бактериологическое обоснование его лечения // Съезд врачей-фтизиатров, 11-й: Тезисы докладов. - СЛетербург, 1992. - С.245.

16. Микобактериозы у больных с хроническими неспецифическими заболеваниями легких // Пробл.туб. - 1992. + № 7-8. - С.38-40 (в соавторстве с Д.И.Войтовой).

17. Бактериологическое обоснование лечения заболеваний легких, вызванных нетуберкулезными микобактериями // Вопросы борьбы с туберкулезом и неспецифическими заболеваниями легких в Узбекистане: Сборник трудов. - Ташкент, 1992. - С.244-247.

18. Этиология и клиника микобактериозов легких // 4-ый съезд фтизиатров Казахстана: Тезисы докладов. - Алма-Ата, 1992,-С.166-172 (в соавторстве с М.Э.Лозовской).

19. Видовая характеристика нетуберкулезных микобактерий за 10 лет // Социально-эпидемиологические проблемы туберкулеза в территориях Крайнего Севера: Тезисы докладов. - Якутск, 1992. -С.89 (в соавторстве с Т.Б.Тльиной).

20. Этиология и клиника микобактериоза легких // 4-ый национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сборник резюме. -М., 1994. - С.198.

21. Характеристика нетуберкулезных микобактерий - потенциальных возбудителей заболеваний человека // Пробл.туб. - 1994.* 3. - С.56-59.

22. Опыт кооперативного исследования эпидемиологического значения региональных особенностей возбудителя туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий // Туберкулез как объект научных

исследований: Труды СМШ®. - СПб., 1994. - Том I. - С.54-58 (в соавторстве с О.В.Брпхачевой, Б.И.Вишневским).

23. Повышение эффективности культуральной диагностики туберкулеза внелегочной локализации // Туберкулез как объект научных исследований: Труды СПеШШ. - СПб., 1994. - Том 2. -С.71-75 (в соавторстве с Б.И.Вишневским, М.ВрПлатоновой).

24. Развитие лекарственной устойчивости нетуберкулезных микобактерий к противотуберкулезным препаратам // Туберкулез как объект научных исследований: Труды СПгЛИИФ. - СПб., 1994. -

Том 2. - С.64-71.

25. Клинико-бактериологические критерии диагностики мико-бактериоза легких // Съезд врачей-фтизиатров, 12-ый: Сборник резюме. - Саратов, 1994. - С.241.