Автореферат и диссертация по медицине (14.01.16) на тему:Роль молекулярно-генетических методов Genotype в повышении эффективности диагностики туберкулеза с лекарственной устойчивостью микобактерий и микобактериозов

На правах рукописи

Елисеев Платон Иванович

Роль молекулярно-генетических методов Genotype в повышении эффективности диагностики туберкулеза с лекарственной устойчивостью микобактерий и микобактериозов

14.01.16 - фтизиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

^ ТК 2013

Санкт-Петербург 2013

005541815

Работа выполнена на кафедре фтизиопульмонологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Марьяндышев Андрей Олегович - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заведующий кафедрой фтизиопульмонологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Официальные оппоненты:

Васильева Ирина Анатольевна - доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела фтизиатрии Федерального Государственного Бюджетного . Учреждения «Центральный Научно-исследовательский Институт» Российской Академии Медицинских Наук

Журавлев Вячеслав Юрьевич - кандидат медицинских наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории этиологической диагностики отдела лабораторной диагностики Федерального Государственного Бюджетного Учреждения «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущее учреждение: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «17» декабря 2013 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 208.092.01 при ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (191036, Санкт-Петербург, Литовский пр., д. 2/4, тел. (812) 579-25-54).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (191036, Санкт-Петербург, Литовский пр., д. 2/4, тел. (812) 579-25-87).

Автореферат разослан « "/^"Тноября 2013 года

Ученый секретарь совета доктор медицинских наук, профессор Виноградова Татьяна-Ивановна

Актуальность работы и степень ее разработанности. В течение последних лет отмечается неуклонный рост числа ежегодно регистрируемых случаев туберкулеза (ТБ) с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (МЛУ и ШЛУ) (ВОЗ, 2012). В Российской Федерации доля МЛУ ТБ среди впервые выявленных больных составляет 14,4% (Туберкулез в Российской Федерации 2010 г. Аналитический обзор статистических показателей, используемых в Российской федерации, 2011). В Архангельской области данный показатель в 2010 году составил 35,1% (ВОЗ, 2012). На этом фоне все более значимыми становятся вопросы, связанные с уменьшением сроков определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза, ранней госпитализацией больного в специализированное МЛУ/ШЛУ отделение и своевременным началом лечения (ВОЗ, 2010).

Все большую актуальность приобретают вопросы лечения заболеваний, вызываемых микобактериями, не относящимися к туберкулезному комплексу (НТМБ), так называемых «микобактериозов», что в значительной степени связано как с улучшением их диагностики (Макарова М.В., 2011; Дорожкова И.Р., 2012), так и с эпидемией ВИЧ-инфекции (Гунтупова Л.Д., 2011). Зачастую трудности диагностики микобактериозов обусловлены их клиническим сходством с туберкулезом (Гунтупова Л.Д., 2011), а классические бактериологические тесты определения вида микобактерий занимают много времени и не обладают достаточной специфичностью (Макарова М.В., 2007).

В настоящее время в этиологической диагностике туберкулеза и микобактериозов широко используют молекулярно-генетические методы исследования, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция. Эти методы позволяют значительно сократить время диагностики туберкулеза, определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis (МБТ) (Bwanga F., 2009) и вида микобактерии (O'Donnell N.. 2012; Safianowska А., 2010). В работах Ling D.I. (2008) показана высокая специфичность и чувствительность метода Genotype (Hain Lifescience). На основе мета-анализа этих данных

Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала включить в национальные противотуберкулезные программы метод Genotype для диагностики МЛУ ТБ. Имеются сведения об информативности этого метода для выявления лекарственной устойчивости МБТ к отдельным противотуберкулезным препаратам (ПТП) второго ряда и диагностики микобактериозов (Brassier F., 2010). Однако остается неизученным вопрос применения метода Genotype в ежедневной практике противотуберкулезной службы в регионах со значительным распространением лекарственной устойчивости МБТ.

Цель исследования: повышение эффективности диагностики туберкулеза с лекарственной устойчивостью МБТ и микобактериозов на основе применения молекулярно-генетических методов Genotype.

Задачи исследования:

1. Определить достоверность результатов использования метода Genotype MTBDRp/ш1 в диагностике туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью МБТ.

2. Изучить возможность использования метода Genotype MTBDRs/ для определения резистентности МБТ к этамбутолу, офлоксацину, капреомицину и канамицину при диагностике туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью.

3. Исследовать эффективность применения метода Genotype Mycobacterium СМ для верификации случаев заболевания микобактериозами и оценить результаты лечения данной группы заболеваний.

4. Создать алгоритм обследования больного туберкулезом и микобактериозом с использованием молекулярно-генетических методов.

Научная новизна исследования. Впервые доказана эффективность использования метода Genotype MTBDRp/ws в сравнении с результатами метода Bactec MGIT 960 при диагностике МЛУ ТБ в Архангельской области. Впервые доказана высокая специфичность метода Genotype MTBDRj/ при определении лекарственной устойчивости МБТ к офлоксацину и

капреомицину и низкая - при диагностике лекарственной устойчивости к канамицину и этамбутолу. Впервые проведен анализ случаев верификации микобактериозов и результатов их лечения в Архангельской области.

Создан алгоритм бактериологической диагностики микобактериозов и туберкулеза с определением лекарственной чувствительности МБТ на основе использования молекулярно-генетических методов Genotype.

Теоретическая и практическая значимость. Проведено сравнительное исследование эффективности фенотипических и молекулярно-генетических методов выявления и характеристики возбудителей микобактериальных поражений органов дыхания. Продемонстрированы преимущества молекулярно-генетических методов выявления лекарственной чувствительности МБТ по сравнению с фенотипическими методами.

Доказана клинико-диагностическая значимость использования методов Genotype у больных ТБ, в том числе с массивным бактериовыделением, представляющих наибольшую эпидемическую опасность. Показана эффективность метода Genotype MTBDR^/г« для раннего выявления случаев МЛУ ТБ, своевременной госпитализации и начала лечения заболевания. Доказана возможность применения метода Genotype MTBDRj/ для выявления устойчивости МБТ к этамбутолу и ПТП второго ряда с целью коррекции схемы химиотерапии (ХТ) при выявлении дополнительной устойчивости.

Изучены возможности верификации микобактериозов на основании результатов использования метода Genotype Mycobacterium СМ.

Разработан алгоритм этиологической диагностики туберкулеза и микобактериозов на основе комплекса фенотипических и молекулярно-генетических технологий.

Результаты исследования внедрены в лечебно-практических учреждениях Северо-Западного Федерального округа Российской Федерации: ГБУЗ Архангельской области «Архангельский клинический противотуберкулезный диспансер»; ГБУЗ Республики Карелия

«Республиканский противотуберкулезный диспансер»; ГОБУЗ «Мурманский областной противотуберкулезный диспансер»; ГБУЗ Республики Коми «Республиканский противотуберкулезный диспансер», а также в учебном процессе на кафедре фтизиопульмонологии ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет» Минздрава России; кафедре лучевой диагностики, терапии, онкологии, урологии и фтизиатрии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет» Минобрнауки России.

Методология и методы исследования. Диссертационная работа основана на обследовании 612 человек, в том числе 595 больных туберкулезом («новым случаем», «рецидивом») и 17 - микобактериозом. В работе использованы методы: молекулярно-генетические (Genotype) и референтные - фенотипические (посев и постановка теста лекарственной чувствительности (TJI4) в автоматизированной системе Bactec MGIT 960 (с жидкой питательной средой); посев и постановка TJI4 на среде Левенштейна-Йенсена). Методы работы одобрены этической комиссией ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет» Минздрава России.

Положения, выносимые на защиту:

1. Метод Genotype MTBDR/?/iw характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью при выявлении туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью МБТ.

2. Метод Genotype MTBDfts/ делает возможным выявлять устойчивость МБТ к ПТП второго ряда, диагностировать случаи ШЛУ ТБ и проводить коррекцию химиотерапии.

3. Метод Genotype Mycobacterium СМ позволяет верифицировать случаи микобактериозов и назначать этиотропную терапию.

4. Разработанный алгоритм на основе применения молекулярно-генетических методов Genotype обеспечивает повышение эффективности

диагностики туберкулеза с лекарственной устойчивостью МБТ и микобактериозов.

Степень достоверности и апробация результатов. Автором определены цель и задачи работы, дизайн исследования, проведен поиск и анализ литературы, бактериологическое и молекулярно-генетическое обследование пациентов. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 2 в научных журналах и изданиях, которые включены в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций.

Диссертация апробирована на расширенном заседании проблемной комиссии «Гигиена, физиология труда, экология и безопасность в ЧС» ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол №4.2 от 24 сентября 2013 года). Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом» (С.Петербург, 2010, 2011); Российско-Норвежской конференции «Междисциплинарные подходы к социально значимым заболеваниям» (Архангельск, 2011); научно-практической конференции «Нанотехнологии в диагностике лекарственно-устойчивого туберкулеза» (Архангельск, 2011); 42-й и 43-й ежегодной конференции Международного союза борьбы с туберкулезом и заболеваниями легких (Лилль, Франция, 2011; Куала-Лумпур, Малайзия, 2012); научно-практической конференции «Инновационные технологии в организации фтизиатрической и пульмонологической помощи населению» (С.-Петербург, 2011); научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (Москва, 2012); 1 конгрессе Национальной ассоциации фтизиатров

«Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации» (С.-Петербург, 2012), 6-й Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2013), 34-м ежегодном конгрессе Европейской ассоциации микобактериологии (Флоренция, Италия, 2013).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 97 страницах, состоит из введения, 4 глав, включающих обзор литературы, характеристику материалов и методов исследования, результаты исследования и их обсуждение, а также выводов и практических рекомендаций. Список литературы содержит 142 источника, из которых 64 -отечественные и 78 - иностранные. Текст диссертации включает 36 рисунков и 14 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика больных, включенных в исследование.

Обследовано 612 пациентов, в том числе 595 больных туберкулезом легких (у 512 заболевание зарегистрировано впервые, у 83 - отмечался «рецидив») и 17 - микобактериозом. Среди 512 больных туберкулезом легких с категорией «новый случай» 252 (49,2%) являлись бактериовыделителями по результатам микроскопии мазка мокроты, 322 (62,9%) - по результатам посева мокроты на питательные среды. Из 83 больных туберкулезом легких с категорией «рецидив» у 45 (54,2%) человек бактериовыделение установлено методом микроскопии, у 61(73,5%) - методом посева. Среди всех пациентов с категориями «новый случай» и «рецидив» зарегистрировано 145 пациентов с МЛУ ТБ. Все пациенты (п = 17) с НТМБ, выявленные с 2010 по 2012 год в Архангельской области, были включены в исследование. Дизайн исследования - проспективное сплошное.

Обследование пациентов включало 4 этапа.

I. Выявление микобактерий осуществлялось методами микроскопии мокроты, посева на питательную среду Левенштейна-Йенсена и

на жидкую питательную среду с применением автоматического анализатора Bactec MGIT 960 с использованием трех образцов.

II. Определение лекарственной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам первого ряда. При положительных результатах микроскопии нативного материала проводили его исследование методом Genotype MTBDR/j/z«, а также осуществляли посев на питательную среду Bactec MGIT 960.

III. Определение лекарственной чувствительности МБТ к этамбутолу и противотуберкулезным препаратам второго ряда. При обнаружении МБТ с МЛУ выполнялось определение устойчивости к ПТП второго ряда методом Genotype MTBDRj/ и абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена (МАК).

IV. Идентификация нетуберкулезных микобактерий проводилась с использованием Genotype Mycobacterium СМ в случае получения отрицательного результата при исследовании культуры методом Genotype MTBDRp/Hi.

Исследования с помощью методов Genotype выполнялись в соответствии с рекомендациями производителя (Hain Lifescience, 2009). Тссты основаны на DNA'STRIP-технологии и позволяют проводить молекулярно-генетическую идентификацию МБТ. Для выявления мутаций и определения лекарственной чувствительности на DNA-стрипы нанесены зонды, соответствующие пробам «дикого типа» (wild types) и «мутантным» пробам. Пробы «дикого типа» охватывают важнейшие участки устойчивости каждого гена (rpoB, katG, и inhA, gyrA, 16S rPHK (rrs) и embB). Отсутствие сигнала хотя бы в одной пробе «дикого типа» указывает на устойчивость тестируемого штамма к соответствующему антибиотику. Genotype Mycobacterium СМ позволяет определить специфичные нуклеотидные последовательности гена 23 S гРНК и идентифицировать микобактерии, в том числе НТМБ. Оценка полученных результатов проводилась с помощью стандартного шаблона.

Статистический анализ. Подготовка баз данных и математические вычисления проводились в табличном редакторе MS Excel. Расчет показателей чувствительности и специфичности методов Genotype, а также 95% доверительных интервалов осуществлен на персональном компьютере с использованием статистических программ Epilnfo и Epitable.

Основные результаты исследования

Результаты определения множественной лекарственной устойчивости МБТ методами Bactec MGIT 960 и Genotype MTBDR/j/ыл

У 211 больных с положительным результатом микроскопии мокроты (183 - с категорией «новый случай» и 28 - с категорией «рецидив») мы оценили возможности метода Genotype MTBDRp/i« для выявления устойчивости МБТ к рифампицину и изониазиду в сравнении с Bactec MGIT 960. Не удалось интерпретировать результаты Genotype MTBDRp/us у 7 (3,3%) больных, у 27 (12,8%) не определены результаты метода Bactec MGIT 960 в связи с отсутствием роста или контаминации, у 4 (1,9%) - выявлены штаммы НТМБ (у двух пациентов - М. avium, и у двух - М. intracellulare).

Поэтому дальнейшему анализу были подвергнуты 173 больных, в том числе 153 - впервые выявленным туберкулезом легких и 20 - рецидивом. У пациентов с впервые выявленным заболеванием при использовании метода Genotype MTBDRp/i« устойчивость к изониазиду выявлена в 70 (45,8%) случаев, к рифампицину - в 57 (37,3%), к обоим препаратам (МЛУ) - в 57 (37,3%), при использовании метода Bactec MGIT 960 соответственно - 73 (47,7%); 55 (35,9%); 55 (35,9%).

Среди больных рецидивом туберкулеза легких устойчивость, определенная методом Genotype MTBDR/j/us, составила: к изониазиду -80,0% (16), к рифампицину - 70,0% (14), к обоим препаратам - 70,0% (14), методом Bactec MGIT 960 соответственно - 80,0% (16); 70,0% (14); 70,0% (14).

Анализ результатов выполненных тестов по определению лекарственной чувствительности МБТ изученными методами показал их сопоставимость к изониазиду - у 170 человек (98,3 %), к рифампицину, а также двум препаратам одновременно (МЛУ) - у 171 (98,8 %). Чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDRp/г« для изониазида, рифампицина и МЛУ представлена в таблице 1.

Таблица 1

Чувствительность, специфичность и доля совпадений результатов, полученных при использовании методов Genotype MTBDR/j/u.y и Bactec MGIT 960

Исследуемый птп Чувствительность (%) (при 95 % доверительном интервале) Специфичность (%) (при 95 % доверительном интервале) Доля совпадений (%)

Изониазид (Н) 96,6 (ДИ 89,8 -99,1) 100,0 (ДИ 94,6- 100,0) 98,3

Рифампицин (R) 100,0 (ДИ 93,4 - 100,0) 98,1 (ДИ 92,5 - 99,7) 98,8

Н+R (МЛУ) 100,0 (ДИ 92,5 - 99,7) 98,1 (ДИ 92.5 - 99,7) 98,8

Проведенное исследование показало, что у микобактерий, устойчивых к изониазиду, наиболее часто встречались мутации, локализованные в кодоне 315 гена katG (99,0%), включая 7 штаммов, у которых выявлены изменения одновременно в генах katG и inhA. У микобактерий, устойчивых к рифампицину, преобладали мутации в кодоне 531 гена гроВ (88,8%) (таблица 2).

Расхождение в результатах двух методов определено только у 5 (2,9%) пациентов. Так, в трех случаях возбудитель туберкулеза методом Genotype MTBDR^/mj был определен как чувствительный к изониазиду и рифампицину, методом Bactec MGIT 960 - устойчивый к изониазиду при сохраненной чувствительности к рифампицину. В связи с этим проведено тестирование лекарственной чувствительности на среде Левенштейна-Йенсена, которое подтвердило результаты Genotype MTBDR^/i«. В двух других случаях методом Genotype MTBDRp/ws установлена устойчивость

МБТ к изониазиду и рифампицину. Однако по данным, полученным методом Вас1;сс М01Т 960, устойчивость имелась к изониазиду при сохраненной чувствительности к рифампицину. Во втором случае отмечено совпадение с результатами метода Вас1ес МСТТ 960 (устойчивость к изониазиду и чувствительность к рифампицину), в последующем аналогичные данные определены при выполнении культурального теста на среде Левенштейна - Йенсена.

Таблица 2

Анализ мутаций, приводящих к устойчивости к изониазиду и рифампицину

Пробы «дикого типа» / «мутантные» Мутации в генах Число штаммов с мутациями/общее к-во штаммов (абс. значение) Доля выявленных мутаций (%)

katG WT 1/ MUT 1 katG S315T1 78 (86) 90,8

katG WT1 / MUT 1 + /nMWTl/MUTl katG S315T1, inhA C15T 6(86) 7,0

katGWÏÏ / MUT 1 + InhA WT 1 / MUT ЗА katG S315T1, inhA T8C 1(86) 1,1

inhA WT1 / MUT 1 inhA C15T 1(86) 1,1

rpoB WT8/MUT3 rpoB S531L 63(71) 88,8

rpoB WT 7/MUT 2A rpoB H526Y 1(71) 1,4

rpoB WT 7 / MUT 2B rpoB H526D 1(71) 1,4

rpoB WT 3,4 / MUT 1 rpoB D516V 5(71) 7,0

rpoB WT 2 возможная мутация rpoB L511P 1(71) 1,4

Расхождения в результатах, полученных методами Genotype MTBDRp/ws и Bactec MGIT 960, можно объяснить наличием редких мутаций, не определяемых в данной версии теста, а также присутствием как чувствительных, так и устойчивых микобактерий в популяции возбудителя. Согласно данным нашего исследования, присутствие и чувствительных, и устойчивых микобактерий имело место в 5 случаях (2,9%), когда в культуре одновременно выявлены «дикие» и «мутантные» штаммы.

Таким образом, в ходе исследования показана высокая чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDR/j/t«. Результаты методов Genotype MTBDRp/as и Bactec MGIT 960 продемонстрировали высокую долю лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду, особенно в группе пациентов с рецидивом заболевания. Подавляющее большинство лекарственно устойчивых штаммов (88,8 %) характеризовалось мутациями, локализованными в кодонах 531 гена гроВ и 315 гена kalG, что говорит о широком распространении данных штаммов среди больных с МЛУ ТБ в Архангельской области.

Результаты определения ШЛУ методом абсолютных концентраций на среде Левенш гейна-Йенсена и методом Genotype MTBDRs/

Эффективность использования метода Genotype MTBDRs/ с целью диагностики устойчивости МБТ к этамбутолу и ПТП второго ряда изучена у 123 (84,8%) больных МЛУ ТБ, из 145 зарегистрированных в Архангельской области в 2010 году. 22 человека не вошли в анализ проведенного исследования в связи с отсутствием роста МБТ на питательной среде (21 больной) и смертью одного пациента до начала лечения. Проведено сравнение результатов, полученных с применением метода Genotype MTBDRs/ и абсолютных концентраций на среде Левенштейна - Йенсена.

Среди 123 пациентов с МЛУ туберкулезом устойчивость к этамбутолу методом Genotype MTBDRs/ выявлена в 71 случае (57,7%), методом абсолютных концентраций - в 99 (80,5%). Причем, у двух пациентов отмечено одновременное присутствие как проб «дикого типа», так и мутаций. В обоих случаях присутствовала мутация M306V гена етЬВ. Совпадение результатов двух методов зарегистрировано у 81 пациента (65,9%). Чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDRs/ для этамбутола составили 64,6% (95% ДИ 54,3 - 73,8) и 70,8% (95% ДИ 48,8 -86,6) соответственно. Мутации в гене етЬВ, обнаруженные в ходе исследования, представлены в таблице 3.

Таблица 3

Мутации в гене етЬВ, обнаруженные в ходе исследования устойчивости к этамбутолу___

Присутствующие мутации (mutation probe) Мутации Количество штаммов

с мутациями /устойчивые (абс. значения) Доля выявленных мутаций (%)

MUT1A M306I 12/71 16,9

MUT1B M306V 54/71 76,1

- M306I 3/71 4,2

MUT IB M306V 2/71 2,8

Устойчивость к канамицину методом Genotype MTBDRs/ выявлена у 9 (7,3%) из 123 пациентов, методом абсолютных концентраций - у 18 (14,6%). Мутации в гене rrs, установленные в ходе исследования, представлены в таблице 4.

Таблица 4

Мутации в гене rrs, обнаруженные в ходе исследования устойчивости к

канамицину и капреомицину

Присутствующие мутации (mutation probe) Мутации Количество штаммов с мутациями /всего (абс. значения)

MUT1 A1401G 6/9

MUT1 A1401G 1/9

- C1402T 1/9

MUT 2 G1484T 1/9

У двух пациентов выявлено одновременное присутствие как «проб дикого типа», так и мутаций. В одном случае присутствовала мутация A1401G гена rrs, в другом - мутация G1484T. Совпадение результатов тестирования двумя методами отмечено у 106 пациентов (86,2%). Чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDRs/ для канамищгаа составила 27,8% (95% ДИ 10,7 - 53,6) и 96,2% (95% ДИ 90,0 -98,8) соответственно.

Из 123 обследованных пациентов устойчивость к капреомицину методом Genotype MTBDRs/ определена у 9 (7,3%), методом абсолютных

концентраций - у 13 (10,6%) (таблица 4). Полученные результаты исгильзования двух методов были сопоставимы у 115 пациентов (93,5%). Чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDRs/ для капреомищша составила 53,8% (95% ДИ 26,1 - 79,6) и 98,2% (95% ДИ 92,9 -99,7) соответственно.

Результаты определения устойчивости к офлоксацину 2 методами оказались схожими - у 7 (5,7%) пациентов из 123 обследованных. При этом, у одного пациента отмечено присутствие как проб «дикого типа», так и мутации. Мутации в гене gyrA представлены в таблице 5.

Таблица 5

Мутации в гене gyrA, обнаруженные в ходе исследования устойчивости к офлоксацину_

Присутствующие мутации (mutation probe) Мутации Количество штаммов с мутациями/вссго (абс. значения)

MUT1 A90V 2/7

MUT2 S91P 1/7

MUT3C D94G 3/7

митзс D940 1/7

Совпадение результатов двух методов установлено у 117 пациентов (95,1%). Чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDRs/ для офлоксацина составила 57,1% (95% ДИ 20,2 - 88,2) и 97,4% (95% 92,1 - 99,3) соответственно.

Таким образом, при сравнении результатов использования метода Genotype MTBDRs/ и МАК на среде Левенштейна - Йенсена специфичность оказалась высокой при определении устойчивости к офлоксацину и инъекционным препаратам, но несколько ниже - при определении устойчивости к этамбутолу. Эти результаты позволяют с высокой достоверностью регистрировать лекарственную устойчивость при выявлении мутации в соответствующих генах. Показатель чувствительности варьировал

от 27% до 64%, что в случаях отсутствия мутаций не позволяет полагаться только на результаты метода Genotype MTBDRs/ и требует использования дополнительных методов ТЛЧ для диагностики лекарственной устойчивости к препаратам второго ряда, в том числе ШЛУ.

Диагностика и лечение микобактериозов

В нашем исследовании мы проанализировали случаи выявления НТМБ на территории Архангельской области. Для идентификации был использован метод Genotype Mycobacterium СМ, позволяющий определять наиболее распространенные виды микобактерий.

С 2010 по 2012 годы в Архангельской области нетуберкулезные микобактерии были обнаружены у 17 пациентов с подозрением на туберкулез, из них женщин - 6 (35,3%) и мужчин - 11 (64,7%). В 2010 году выявлено 7(41,2%) случаев, в 2011 и 2012 годах - по 5 (29,4%). Средний возраст больных составил 58,4 ± 12,91 лет. На момент выявления НТМБ два пациента находились в пенитенциарной системе Архангельской области. В подавляющем большинстве случаев выявлены штаммы М. avium complex : М. avium - у 8 (47,1%) больных, и М. intracellular - у 4 (23,5%). Данные по каждому случаю выявления НТМБ на территории Архангельской области представлены в таблице 6.

Лечение микобактериозов проводилось в соответствии с международными и российскими рекомендациями: для микобактериоза М. avium — REClr (2 эффективных курса, 1 - продолжает лечение), KmREClr (1 -эффективный курс), HREZClr (умер от микобактериоза на фоне ВИЧ-инфекции), MfxClrPtoKm (прерванное лечение); М. intracellularе - REClr в 3-х случаях и KmZRMfxPtoPasCs/ZRMfxPtoPasCs в 1 случае (все эффективные курсы); М. gordonae - REClr (диагноз снят); М. fortuitum - AmClrLfx (эффективный курс); М. chelonae - ZPtoPasGfxAmClr (прерванное лечение).

Таким образом, эффективность химиотерапии отмечена у 9 из 13 пациентов. Неэффективное лечение зарегистрировано у 4 пациентов: в одном

случае пациент с ВИЧ-инфекцией умер от микобактериоза, два пациента прервали лечение, у одного диагноз был снят.

Таблица 6

Характеристика микобактериозов, выявленных в Архангельской области в 2010-2012 гг.

№ Пол Вид микобактерии Год выявления НТМБ Количество клинических образцов, из которых были выделены НТМБ Возраст на момент выявления НТМБ

1 м М. avium 2010 5 66

2 м M.intracellulare 2010 4 65

3 м М. avium 2010 1 48

4 м М. intracellulare 2010 1 73

5 ПС* м М. avium 2010 1 46

6 м М. intracellulare 2010 3 62

7 ж М. avium 2010 1 65

8 м М. avium 2011 1 61

9 м M.gordonae 2011 4 48

10 ПС* м М. fortuitum 2011 2 57

11 ж М. avium 2011 3 50

12 ж М. fortuitum 2011 1 54

13 ж М. intracellulare 2012 3 73

14 ж М. avium 2012 1 73

15 м М. avium 2012 2 47

16 м M.gordonae 2012 1 78

17 ж M. chelonae 2012 2 26

♦Примечание: ПС - пациент на момент обнаружения НТМБ находился в пенитенциарной системе

В заключение можно сказать, что дифференцировать микобактериоз и туберкулез, основываясь только на клинико-рентгенологической картине, а также на результатах лабораторных исследований по обнаружению кислотоустойчивых микроорганизмов без идентификации вида микобактерии, практически невозможно. Более того, без проведения идентификации вида микобактерий возможна гипердиагностика в случае контаминации материала сапрофитными микобактериями. Применение метода Genotype Mycobacterium СМ позволило своевременно верифицировать микобактериозы на территории Архангельской области и назначить

адекватное лечение. Эффективность химиотерапии отмечена в 69,2% случаев, при этом основной причиной неэффективного лечения явилось прерывание его самими пациентами.

Данные исследования позволили внедрить молекулярно - генетические методы Genotype в алгоритм выявления МБТ, определения их лекарственной чувствительности, а также диагностики микобактериозов на территории Архангельской области. В частности, до начала лечения больной ТБ сдает два образца мокроты для проведения микроскопии, а также выполнения посева на плотную и жидкую питательные среды. При получении положительного результата микроскопии в одной из проб данный образец исследуется методом Genotype MTBDRp/ws для подтверждения присутствия МБТ, а также для определения лекарственной чувствительности к изониазиду и рифампицину. При отрицательном результате микроскопии для исследования методом Genotype MTBDRp/us используется первая выделенная на питательных средах культура (рис. 1).

Обрota да Микроскопия получевиой культуры

шф И

Посев на плотную питательнуюсреду

Обриец мокроты „Ж

пиигшт!........it

Микроскопия полученной культуры

Посев ва Bactec MGIT

ГШЩЛШ'Г

Проведение методов Genotype

ОС Am Cm Ofx Е

Постановка ТЛЧ в системе Bactec MGIT

Рисунок 1. Алгоритм обследования больного туберкулезом для выявления МЛиЬегсиЬзгз и определения чувствительности к ПТП.

При наличии в образце МБТ и чувствительности к обоим препаратам для лечения назначаются препараты первого ряда. При выявлении

устойчивости к рифампицину или обоим препаратам регистрируется случай МЛУ ТБ, при определении устойчивости только к изониазиду - случай ТБ, устойчивого к изониазиду, назначаются соответствующие схемы ХТ и выполняется исследование методом Genotype MTBDRs7 для выявления чувствительности к этамбутолу, фторхинолонам и инъекционным ПТП. При определении устойчивости принимается решение о коррекции ХТ. У всех больных МЛУ ТБ обязательно проводится определение лекарственной чувствительности к ПТП второго ряда методом Bactec MGIT 960.

При отрицательных результатах использования метода Genotype MTBDRjp/г«, выполняется исследование методом Genotype Mycobacterium СМ с целью определения вида микобактерий, регистрации случая микобактерпоза и назначения соответствующего лечения.

Разработанный алгоритм позволяет в короткие сроки выявить больных с лекарственно устойчивым ТБ, в том числе МЛУ и ШЛУ ТБ, а также своевременно диагностировать у больного микобактериоз.

ВЫВОДЫ

1. Genotype MTBDR/7/г« является информативным методом для определения мутаций, ассоциированных с множественной лекарственной устойчивостью МБТ. Чувствительность и специфичность теста составила к изониазиду соответственно 96,6% и 100%, рифампицину - 100% и 98,1%, для МБТ с МЛУ-100% и 98,1%.

2. Genotype MTBDRs/ обладает высокой специфичностью при выявлении устойчивости М. tuberculosis к этамбутолу и ПТП второго ряда. Чувствительность и специфичность метода составила: для этамбутола -64,6% и 70,8%, для канамицина - 27,8% и 96,2%, для капреомицина - 53,8% и 98,2%, для офлоксацина - 57,1% и 97,4% соответственно.

3. При обнаружении мутаций результаты метода Genotype MTBDRs/ свидетельствуют об устойчивости МБТ к препарату и позволяют своевременно выявить туберкулез с устойчивостью возбудителя к

этамбутолу и ПТП второго ряда. Отсутствие мутаций требует использования дополнительных методов определения лекарственной чувствительности.

4. Доказана эффективность применения метода Genotype Mycobacterium СМ при верификации случаев заболевания микобактериозами на территории Архангельской области. Среди обнаруженных нетуберкулезных микобактерий преобладали М. avium (47,1 %) и М. intracellulare (23,5%).

5. Разработанный алгоритм обследования больного ТБ на основе молекулярно-генетических методов позволяет с высокой точностью диагностировать случаи МЛУ и ШЛУ ТБ, выявлять НТМБ и проводить верификацию микобактериозов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Метод Genotype MTBDRp/i« можно использовать в качестве метода скрининга у больных ТБ с массивным бактериовыделением для определения лекарственной чувствительности МВТ к изониазиду и рифампицину.

2. Метод Genotype MTBDRp/w необходимо использовать как основной метод при диагностике МЛУ ТБ, а также у пациентов с устойчивостью к изониазиду при сохраненной чувствительности к рифампицину.

3. Рекомендуется использовать метод Genotype MTBDRs/ для диагностики ШЛУ ТБ в комплексе с фенотипическими культуральными методами определения лекарственной чувствительности М. tuberculosis к этамбутолу и противотуберкулезным препаратам второго ряда.

4. Метод Genotype Mycobacterium СМ целесообразно применять для идентификации вида микобактерии при обнаружении кислото-устойчивых микроорганизмов в клиническом материале, выделенной культуре микобактерий и при отрицательных результатах использования метода Genotype MTBDRpft«.

5. Разработанный алгоритм рекомендуется применять с целью диагностики туберкулеза с лекарственной устойчивостью МВТ, в том числе МЛУ/ШЛУ и микобактериозов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Елисеев, П. И. Сравнительная характеристика методов Genotype MTBDRplus и абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена при определении лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза / П. И. Елисеев, И. В. Тарасова, Г. П. Горина, Д. В. Перхин, А. О. Марьяндышев // Материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом». - СПб., 2010. - С. 112.

2. Mann, G. Beyond accuracy: creating a comprehensive evidence base for tuberculosis diagnostic tools / G. Mann, S. B. Squire, K. Bissel, P. Eliseev , E. Du Toit, A. Hesseling, M. Nicol, A. Detjen, A. Kritski // The International Journal of tuberculosis and lung disease. - 2010. - Vol. 14, № 12. - P. 1518 - 1525.

3. Елисеев, П. И. Сравнение методов Genotype MTBDRsl и абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена при определении лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза к этамбутолу, офлоксацину, канамицину и капреомицину / П. И. Елисеев, Д. В. Перхин, А. О. Марьяндышев // Материалы Всерос. науч.-практ. конф. «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом». - СПб., 2011.-С. 439.

4. Елисеев, П. И. Результаты применения методов GenoType MTBDRplus и ВАСТЕС MGIT для определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза / П. И. Елисеев, Д. В. Перхин, Г. П. Горина, А. О. Марьяндышев // Материалы Всерос. науч.-практ. конф. «Инновационные технологии в организации фтизиатрической и пульмонологической помощи населению». - СПб., 2011. - С. 89.

5. Елисеев, П. И. Результаты применения методов GenoType MTBDRplus и ВАСТЕС MGIT для определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза / П. И. Елисеев, Е. И. Никишова, Г. П. Горина, А. О. Марьяндышев // Туберкулез и болезни легких. - 2012. - № 6. - С. 31 - 34.

6. Nikishova, Е. Pulmonary tuberculosis treatment based on drug susceptibility test results in Arkhangelsk region / E. Nikishova, P. Eliseev, D. Perkhin, G. Balantsev, A. Maryandyshev // Abstract book of 43 World conference on lung health of the international union against tuberculosis and lung disease. - Kuala Lumpur, Malaysia, 2012. - S. 311.

7. Eliseev, P. Evaluation of the impact of line probe assay on time to treatment initiation for smear-positive multidrug-resistant tuberculosis cases in the Arkhangelsk region of Russia / P. Eliseev, G. Balantsev, E. Nikishova, P. Phillips, R. Dacombe, E. Gospodarevskaya, A. Maryandyshev, S. Squire // Abstact book of 43 World conference on lung health of the international union against tuberculosis and lung disease. - Kuala Lumpur, Malaysia, 2012. - S. 421.

8. Елисеев, П. И. Влияние метода MTBDRplus на сроки начала лечения больных с МЛУ туберкулезом и экономическую эффективность системы здравоохранения в Архангельской области / П. И. Елисеев, Г. А. Баланцев, Е. И. Никишова, П. Филлипс, Р. Дэйкомб, Е. В. Господаревская,

А. О. Марьяндышев, С. Б. Сквайер II Материалы 1-го Конгресса ассоциации «Национальная ассоциация фтизиатров». - СПб., 2012. - С. 181.

9. Баланцев, Г.А. Технология количественно-качественной оценки новых методов диагностики туберкулеза / Г. А. Баланцев, П. И. Елисеев, Е. Н. Богданова, Е. И. Никишова, А. О. Марьяндышев // Материалы 1-го Конгресса ассоциации «Национальная ассоциация фтизиатров». - СПб., 2012. - С. 218.

10. Никишова, Е. И. Результаты лечения больных туберкулезом легких в Архангельской области в соответствии с тестами лекарственной чувствительности МБТ / Е. И. Никишова, П. И. Елисеев, Д. В. Перхин, Г. А. Баланцев, А. О. Марьяндышев // Материалы 1-го Конгресса ассоциации «Национальная ассоциация фтизиатров». - СПб., 2012. - С. 120.

11. Елисеев, П. И. Результаты применения методов Genotype для определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза к препаратам первого и второго рада в Архангельской области / П. И. Елисеев, Е. И. Никишова, И. В. Тарасова, Г. П. Горина // Материалы науч.-практ. конф. молодых ученых с междунар. участием, посвящ. всемирному дню борьбы с туберкулезом, «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей». - М„ 2012. - С. 37.

12. Eliseev, P. I. Epidemiological analyses of tuberculosis in Arkhangelsk, Russia and implementation of a rapid assay for detection of resistance in this high burden setting / P. I. Eliseev, A. O. Maryandyshev, E. I. Nikishova, I. V. Tarasova, G. P. Gorina, E. Chryssanthou, M. Malin Ridell, L. Larsson // International Journal of Mycobacteriology. - 2013. - Vol. 2, № 2. - P. 103 -108.

13. Eliseev, P. I. Epidemiological analyses of tuberculosis in Arkhangelsk, Russia and implementation of a rapid assay for detection of resistance in this high burden setting / P. I. Eliseev, A. O. Maryandyshev, E. I. Nikishova, I. V. Tarasova, G. P. Gorina, E. Chryssanthou, M. Ridell, L. Larsson // Scientific Program including Abstracts of Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology. - Florence, Italy, 2013. -P. 70.

14. Чернокова, E. Ф. Выявление и лечение микобактериозов с применением метода Genotype Mycobacterium СМ в Архангельской области / Е. Ф. Чернокова, П. И. Елисеев, Е. И. Никишова, И. В. Тарасова, А. О. Марьяндышев // Бюллетень Северного Государственного Медицинского Университета - Архангельск, 2013. -№ 1. - С. 80.

15. Елисеев, П. И. Результаты применения метода GenoType MTBDRsl для определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза к этамбутолу, офлоксаципу, каиамицину и капреомицииу в Архангельской области / П. И. Елисеев, И. В. Тарасова, Е. И. Никишова, А. О. Марьяндышев // Туберкулез и болезни легких. - 2013. - № 1. - С. 32 - 36.

Список сокращений

Am - амикацин

Clr - кларитромицин

Cm - капреомицин

Cs - циклосерин

Н - изониазид

Е - этамбутол

Km - канамицин

Lfx - левофлоксацин

MAC - Mycobacterium avium complex

Mix - моксифлоксацин

Pas - Пара-аминосалициловая кислота (ПАСК) Pto - протионамид R - рифампицин Z - пиразинамид

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ГБУЗ АО АКПТД - Государственное бюджетное учреждение

здравоохранения Архангельской области «Архангельский клинический

противотуберкулезный диспансер»

ДИ - 95% доверительный интервал

МАК - метод абсолютных концентраций определения лекарственной

чувствительности на среде Левенштейна-Йенсена

МБТ - микобактерия (ии) туберкулеза

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

НТМБ - нетуберкулезные микобактерии

ТЛЧ - тест лекарственной чувствительности

ПТП - противотуберкулезные препараты

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РФ - Российская Федерация

ТБ - туберкулез

ХТ - химиотерапия

ШЛУ - широкая лекарственная устойчивость

Подписано в печать 11 ноября 2013 г. Формат 60x90/16 Объём 0,83 усл. п. л. Печать ризографическая. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 225 Отпечатано в типографии ООО «Фирма «Стикс» 196128, Санкт-Петербург, ул. Кузнецовская, 19