Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Опухолевая контаминация аутотрансплантатов гемопоэтических тканей у больных раком молочной железы: прогностические факторы и клиническое значение

На правах рукописи

Прилуцкая Марина Осиповна

ОПУХОЛЕВАЯ КОНТАМИНАЦИЯ АУТОТРАНСПЛАНТАТОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ: ПРОГНОСТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в ГУ Российский Онкологический научный Центр им. H.H. Блохина Российской академии медицинских наук и в лаборатории IMPATH BIS, Лос-Анжелес, Калифорния, США.

Научные руководители:

доктор биологических наук Чимишкян K.JI.

профессор Мосс Т.Д.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ХяПленко В.А.

доктор медицинских наук, профессор Туппцын H.H.

Ведущая организация:

ГУ Московский Онкологический Научно-Исследовательский Институт им. П.А. Герцена МЗ РФ

Защита диссертации состоится «

2005 г. в

<6>

часов на заседании

Диссертационного совета при ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Автореферат разослан « ¿? » [/СССШ/ 2005г.

Учений секретарь Диссертационного совета ГУ РОНЦ РАМН: доктор медицинских наук, профессор

Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность темы исследования

Несмотря на некоторые позитивные сдвиги в ранней диагностике рака молочной железы (РМЖ), абсолютное число больных с запущенными формами заболевания (стадия И1Ь-1У) увеличивается как в России и странах СНГ, так и в большинстве государств Западной и Центральной Европы. Хотя комбинированная химиотерапия пациенток на поздних стадиях РМЖ часто позволяет отсрочить прогрессию заболевания, в конечном итоге у них развиваются рецидивы, приводящие к летальному исходу. В связи с этим, весьма актуальна разработка новых, более эффективных методов лечения больных РМЖ на поздних стадиях заболевания. Одной из разработок в данном направлении является лечение высокими дозами химиопрепаратов (высокодозная химиотерапия, ВХТ). Применение ВХТ для лечения больных РМЖ не дало столь яркого эффекта, как при лечении гемобластозов и некоторых быстрорастущих солидных опухолей человека, в частности, нейробластомы. Однако, в целом ряде работ отмечается действенность ВХТ при лечении больных РМЖ с ограниченным метастатическим поражением и хорошим ответом на индукционную химиотерапию. Кроме того, этот вид лечения иногда проводится даже с адъювантной целью у больных РМЖ, имеющих высокий риск возникновения рецидива.

Угнетение гемопоэза, обусловленное применением высоких доз цитостатиков, можно компенсировать инфузией аутологичных клеток костного мозга (КМ) или стволовых клеток из периферической крови (периферических стволовых клеток, ПСК). Главным препятствием к применению аутотрансплантатов с целью восстановления гемопоэза после ВХТ является их частая контаминация опухолевыми клетками. Реинфузия таких клеток потенциально способна привести к возникновению рецидива заболевания. Чтобы минимизировать этот эффект, костный мозг либо ПСК стараются забирать у пациентки на стадии полной ремиссии, когда доказательства контаминации костного мозга или стволовых клеток из периферической крови отсутствуют. Другим возможным решением этой проблемы является удаление из трансплантатов злокачественных клеток-контаминант без нарушения функции клеток-предшественниц гемопоэза, так называемая «очистка». Для того чтобы выявить опухолевые клетки в гемопоэтических продуктах, а также оценить эффективность очистки аутотрансплантатов, необходимо иметь в распоряжении достаточно чувствительные методы детекции таких опухолевых клеток-контаминант. Таким образом, исследование характера контаминации продуктов КМ и ПСК на разных этапах их подготовки к использованию в качестве аутотрансплантатов имеет большое значение для оптимизации этой процедуры. Эта оптимизация связана с необходимостью эффективного обнаружения опухолевых клеток и их последующего удаления из состава трансплантата Данная процедура направлена на снижение возможного риска возникновения рецидива, обусловленного введением в организм больного в составе трансплантата остаточных

опухолевых клеток.

2. Цель ii задачи исследования

Целью данной работы является исследование факторов, влияющих на опухолевую контаминацию аутотрансплантатов ПСК, а также исследование клинического значения этой контаминации при проведении высокодозной химиотерапии у больных раком молочной железы. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспкримеятяльные задачи:

1). Провести сравнительный анализ частоты и интенсивности контаминации опухолевыми клетками костного мозга и продуктов лейкафереза у больных РМЖ с помощью стандартного иммуноцитохимического анализа.

2). Выявить клинические и терапевтические факторы, способные влиять на контаминацию ПСК раковыми клетками.

3). Оцеиить жизнеспособность «остаточных» опухолевых клеток в составе образцов костного мозга и ПСК с помощью теста на клоногенный рост клеток in vitro.

4). Исследовать, ассоциируется ли фактор контаминации продуктов ПСК с выживаемостью больных РМЖ.

5). Исследовать, повышается ли чувствительность традиционного иммуноцитохимического анализа (ИЦА) благодаря проведению этапа предварительного иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных шариках.

6). Провести сравнительное исследование эффективности очистки С034-позитивных фракций с помощью традиционного ИЦА и ИЦА с обогащением на магнитных шариках (ИЦА-ОММ).

3. Научная новизна работы

Оценка контаминации гемопоэтических трансплантатов опухолевыми клетками как фактора, потенциально влияющего на возникновение рецидивов и выживаемость больных РМЖ, ранее проводилась на выборках небольшого размера (в основном, менее 90 пациенток). Объединить данные этих исследований для совокупного анализа не представляется возможным из-за методологических различий. Кроме того, далеко не все пациентки в процитированных работах адекватно реагировали на проведение ВХТ. В нашей работе эти недостатки были учтены. Впервые проведено крупномасштабное исследование (535 больных РМЖ) возможной корреляции между контаминацией КМ и ПСК опухолевыми клетками и длительностью выживаемости больных на поздних стадиях РМЖ, адекватно реагирующих на проведение ВХТ. Были впервые подробно исследованы клинические и терапевтические факторы, влияющие на частоту контаминации в ПСК. Так, контаминация опухолевыми клетками КМ пациентки с высокой вероятностью позволяет предположить и контаминацию ими продуктов ПСК. Снижение частоты контаминации ПСК раковыми клетками наблюдалось при проведении комбинированной мобилизации и уменьшении количества лейкаферезов.

В данной работе был апробирован новый высокочувствительный метод обнаружения опухолевых клеток - иммуноцитохимический анализ с предварительным этапом иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ). Благодаря

использованию этого метода удалось установить, что частота контаминации трансплантируемого материала гораздо выше, чем считалось ранее. Применение более чувствительного метода детекции остаточных опухолевых клеток для анализа фракций ПСК после селекции на CD34-позитивные клетки позволило определить, что такая селекция является достаточно эффективным методом очистки продуктов лейкафереза от остаточных клеток РМЖ.

4. Няучно-ппактпческая значимость работы

В ходе работы показано, что опухолевая контаминация гемопоэтических тканей, предназначенных для аутотрансплантации у больных РМЖ, является неблагоприятным прогностическим фактором. Кроме того, жизнеспособность опухолевых клеток-контаминант была нами показана в исследовании их клоногенного роста in vitro. В целом, полученные данные свидетельствуют о возможном участии содержащихся в трансплантате опухолевых клеток в возникновении рецидива заболевания. Таким образом, перед проведением трансплантации необходимо осуществить очистку гемопоэтических продуктов от злокачественных клеток-контаминант. Нами также выявлен ряд клинических и терапевтических факторов, которые позволяют спрогнозировать вероятность контаминации ПСК у конкретной пациентки. Благодаря учету некоторых из этих факторов, например, при проведении мобилизации по комбинированной схеме (миелосупрессивная терапия + цитокин), можно снизить вероятность контаминации ПСК еще до процедуры «очистки». Кроме того, благодаря комбинированной мобилизации удается собрать необходимое количество ПСК с помощью меньшего количества процедур лейкафереза. Эти данные позволяют рекомендовать комбинированную схему мобилизации как оптимальную в сравнении с мобилизацией только цитокинами.

Был разработан и апробирован новый высокочувствительный метод детекции остаточных опухолевых клеток, представляющий собой сочетание традиционного иммуноцитохимического анализа (ИЦА) с этапом предварительного иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных шариках. Чувствительность этого усовершенствованного метода в 20 - 50 раз выше традиционного ИЦА. Повышение чувствительности метода детекции остаточных опухолевых клеток в трансплантате может иметь большое значение для оценки эффективности его очистки. Примером могут служить полученные нами данные по оценке уровня контаминации ПСК после проведения позитивной селекции на клетки, экспрессирующие CD34. Благодаря более чувствительному методу детекции остаточных опухолевых клеток можно лучше оптимизировать процедуру очистки трансплантата.

5. Апробация работы

Диссертационная работа была апробирована 18 февраля 200S г. на совместной научной конференции лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов, лаборатории молекулярной биологии вирусов НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН; отделения реанимации и интенсивной терапии (трансплантации костного мозга и интенсивной химиотерапии), отделения хирургического №8 (опухолей женской репродуктивной системы), отдела клинической иммунологии НИИ Клинической онкологии ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина

РАМН. Основные положения диссертации были представлены сообщениями на 9-ом Международном симпозиуме по трансплантации костного мозга (1999, Хьюстон, Техас, США) и 11-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, Октябрь 2003). По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. 6. Структура и объем паботы

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, раздела результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и библиографии. Материалы диссертации изложены на 103 страницах машинописного текста и включают 14 таблиц, 7 рисунков и 127 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзор литературы

Обзор литературы посвящен феномену опухолевой контаминации аутотрансплантатов гемопоэтических тканей, как важной проблеме при проведении аутотрансплантации и высокодозной химиотерапии у онкологических больных, в том числе у больных раком молочной железы Обсуждаются особенности мобилизации стволовых клеток периферической крови, как процедуры, необходимой для получения достаточного количества таких клеток в составе аутотрансплантата. Описан феномен контаминации аутотрансплантатов гемопоэтических тканей опухолевыми клетками, а современных методов выявления таких «остаточных» опухолевых клеток в составе аутотрансплантата. Проведен сравнительный анализ методов очистки аутотрансплантата от остаточных опухолевых клеток. Материалы и методы

В работе были использованы следующие методы исследования: получение образцов костного мозга и периферических стволовых клеток, получение фракции мононуклеаров, стандартный иммуноцитохимический анализ и иммуноцитохимический анализ с этапом иммунного обогащения на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ), исследование клоногенного роста опухолевых клеток ¡п уйго, методы статистического анализа возможных корреляций между клиническими, терапевтическими и иммуноморфологическими характеристиками исследуемых больных. Результаты и обсуждение

Исследование факторов, влияющих па контаминацию продуктов гемопоэтических стволовых клеток у больных метастатическим ряком молочной железы а). Частота коптяминацнн продуктов ПСК и костного мозга

Контаминация образцов ПСК опухолевыми клетками была исследована у 535 больных РМЖ с IV стадией заболевания. Все эти пациентки получали ВХТ в сочетании с аутотрансплантацией гемопоэтических продуктов без предварительной очистки аутотрансплантата от опухолевых клеток. Образцы ПСК от 110 из 535 проанализированных пациенток (20.6%) содержали клетки РМЖ по результатам стандартного иммуноцнтохимического

анализа (ИЦА). Парные образцы костного мозга от соответствующих пациенток были доступны для 228 из 535 пациенток и собраны за 60 дней до проведения лейкаферезов. Стандартный ИЦА позволил выявить контаминацию костного мозга опухолевыми клетками у 60 из 228 исследованных пациенток (26.3%).

б). Исследование ассоциации между контаминацией костного мозга и контаминацией образцов ПСК

Из 60 пациенток с контаминацией костного мозга у 21 (35%) нашли контаминацию ПСК. В тоже время у пациенток без выявленного поражения КМ контаминация ПСК обнаруживалась в 31 из 168 исследованных случаев (18.4%) (р = 0.01, точный критерий Фишера). Таким образом, наличие опухолевых клеток в костном мозге пациентки ассоциируется с повышенной вероятностью контаминации полученных от нее продуктов ПСК.

в). Исследование влияния схемы мобилизационной терапии на контаминации) образцов ПСК

Данные о характере мобилизационной терапии были получены в отношении 477 из 535 пациенток (Таблица I). В группе пациенток, которым мобилизацию проводили только с помощью цитокина (гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, Г-КСФ, или гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, ГМ-КСФ) контаминация продуктов лейкафереза после мобилизации была выявлена у 49 из 190 пациенток (25.8%). У пациенток, которым мобилизацию проводили по схеме: цитостатик(и) + Г-КСФ, контаминация образцов ПСК была выявлена у 44 из 287 пациенток (15.3%). Можно заключить, что контаминация ПСК более часто наблюдалась у пациенток, которым мобилизацию проводили с помощью только цитокина по сравнению с пациентками, которым мобилизацию проводили по комбинированной схеме (р = 6.4 х !0'J). Этот вывод, однако, требует некоторого уточнения с учетом фактора контаминации КМ.

Таблица I. Частота контаминации ПСК в группах с различным режимом мобилизационной терапии___

Характеристика Нет контаминации Есть

контаминация

Возраст: 45 лет

среднее значение 44 года

диапазон (25-63) (32-61)

Режим мобилизационной терапии

Только цитокин-

Г-КСФ 108 40

ГМ-КСФ 33 9

Химиотерата/цитокчн

один химиопрепарат/Г-КСФ 107 19

несколько химиопрепаратов/Г-КСФ 136 25

Клинический статус на момент забора ПСК

Полный ответ 64 10

Частичный ответ 160 51

Режим ВХТ:

циклофосфамид, тиотепа, новантрон 85 34

циклофосфамид, тиотепа 40 13

циклофосфамид, тиотепа, карбоппатин 118 30

бусульфан, мелфалан, тиотепа 52 14

кармусгин, платинол, циклофосфамид 89 24

Среди 149 пациенток без выявленных метастазов в костном мозге и для которых была известна схема мобилизационной терапии, более высокая частота контаминации ПСК также отмечалась среди тех, которым мобилизацию проводили только цитокином (22 из 63, 35%) по сравнению с группой пациенток с комбинированным режимом мобилизации: химиопрепарат(ы) + Г-КСФ (8 из 86, 9%, р = 0.0001) (Таблица 2). В противоположность группе пациенток без контаминации костного мозга, среди 55 пациенток с выявленными в костном мозге опухолевыми клетками и известным режимом мобилизационной терапии, частота контаминации продуктов лейкаферезов была высокой вне зависимости от использованного мобилизационного режима. Так, при использовании только цитокина контаминация продуктов лейкафереза отмечалась у 9 из 30 пациенток (30%). В группе пациенток, которым проводили мобилизацию по схеме цитокин+химиотерапия контаминация продуктов лейкафереза отмечалась у 11 из 25 пациенток (44%, р = 0.28). Таким образом, у больных РМЖ без выявленных метастатических поражений костного мозга более низкая частота контаминации образцов ПСК опухолевыми клетками отмечается при проведении мобилизации по комбинированной схеме: цитокин + химиотерапия по сравнению с теми пациентками, которым мобилизацию проводили с помощью только цитокина. Для пациенток с выявленными метастазами в костном мозге подобная закономерность не прослеживается.

Таблица 2. Контаминация продуктов лейкафереза у пациенток с известным режимом

мобилизационной терапии.

Контаминация Мобилизационный режим Контаминация Процент Статисти-

продуктов костного продуктов лейкафереза позитивных случаев (+), ческая значимость

мозга есть (+) нет (-) лейкаферез

Нет Только цитокин 22 41 34.9 р = 0.0001,

Цитокин+химиотерапия 8 78 9.3 достоверное

Есть различие

Только цитокин 9 21 30.0 р = 0.28

Цитокин+химиотерапия II 14 44.0 нет различия

У пациенток с мобилизацией только цитокином, в подгруппе «Г-КСФ» контаминация образцов ПСК была обнаружена у 40 из 148 пациенток (27%), в подгруппе «ГМ-КСФ» - у 9 из 42 пациенток (21.4%). Следовательно в описываемой группе не было выявлено различий в интенсивности контаминации продуктов ПСК в зависимости от используемого для мобилизации цитокина (р -0.4). Также не было выявлено различий в отношении контаминации образцов ПСК между подгруппами «один химиопрепарат + Г-КСФ» и «несколько химиопреларатов + Г-КСФ» (19 из 107, 15.0%, против 25 из 161,15.5%).

г). Исследование влияния количества процедур леПкафереза на частоту контамннацин образцов ПСК

Данные по количеству процедур лейкаферезов были получены для 476 из 535 исследованных больных. Результаты исследования контаминации ПСК в группах пациенток, различающихся по количеству проведенных процедур лейкаферезов, представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Контаминация ПСК, полученных в результате разного числа процедур лейкаферезов

Количество лейкаферезов Контаминация продуктов лейкафереза Процент позитивных случаев

Есть нет

1 8 141 5.3*

2 15 82 15.5Г

3 28 64 30.4"

4 16 36 30.7

<4 29 60 48.3

Г <2, 3. 4 и более 4лейкаферезов (р <0.008) 2Г < 3, 4 и более 4лейкаферезов (р -0 004)

3, 4п и более 4 лейкаферезов (нет статистически значимой разницы)

Пациентки, у которых удалось собрать необходимое для трансплантации количество ПСК в результате одного лейкафереза, характеризовались более низкой частотой контаминации полученного продукта опухолевыми клетками (8 из 149 пациенток, 5.3%), чем больные, у которых необходимо было провести 2 (15 из 97, 15.5%), 3 (28 из 92, 30.4%), 4 (16 из 52, 30.7%) или более (29 из 60, 48.3%) процедур лейкафереза (р £ 0.008). Подобная закономерность прослеживалась и для пациенток, которым провели две процедуры лейкафереза по сравнению с больными, которым провели 3 и большее количество сеансов этой процедуры (р = 0.004). В группе пациенток, которым проводили три процедуры лейкафереза, частота контаминации их продуктов опухолевыми клетками не отличалась значимо от значения этого параметра в группе пациенток, которым проводили 4 и большее количество лейкаферезов.

Повышение частоты контаминации сбора ПСК с увеличением количества процедур лейкафереза может быть следствием большего количества анализируемых проб. Для того, чтобы проверить эту возможность, мы троекратно провели ИЦА образцов лейкафереза 53 из 149 пациенток, у которых эта процедура осуществлялась однократно и сравнили с результатами ИЦА продуктов лейкафереза 58 пациенток, которым проводили 3 процедуры лейкафереза. Пациентки, у которых лейкаферез осуществляли однократно и в случае проведения трех независимых иммуноцитохимических исследований демонстрировали меньшую частоту контаминации по сравнению с теми больными, у которых проводили три лейкафереза (6 из 53 (11.3%) по сравнению с 19 из 58 (32.7%) соответственно; р = 0.007). Частота контаминации сборов ПСК у пациенток, которым проводили три процедуры лейкафереза, после первой из таких процедур была примерно такой же, как у пациенток, которым проводили одну процедуру и осуществляли

иммуноцитохимическое исследование троекратно (15.5% по сравнению с 11.3% соответственно). Таким образом, повышение частоты контаминации сборов ПСК ассоциируется именно с увеличением количества процедур лейкафереза и не зависит от числа проанализированных образцов. Необходимо отметить, что у пациенток с одинаковым количеством проведенных лейкаферезов схема мобилизационной терапии не влияла на частоту контаминации сборов ПСК. Так у пациенток, которым проводили одну процедуру лейкафереза, отмечалась низкая частота контаминации его продуктов вне зависимости от того, была ли проведена мобилизация только цнтокином (2 из 42, 5.8% ) или цитокин использовался в комбинации с химиопрепаратом (3 из 80, 3.8%; р = 0 83). Аналогичное соотношение уровня контаминации ПСК при проведении только цитокиновой и комбинированной мобилизации прослеживалось для пациенток, которым делали две процедуры лейкафереза (цитокин - 25%, комбинированная терапия - 10.6%, р = 0.17), три процедуры (27.2% против 33.3% соответственно, р = 0.75), а также 4 и более процедур (43.3% против 36.5%, р * 0.59).

Данные о дате последнего проведения химиотерапии и количестве проведенных лейкаферезов были известны для 224 из 447 пациенток с определенной схемой мобилизационного режима. При этом у 68 из 224 пациенток мобилизационную терапию проводили только цнтокином и 156 пациенткам мобилизацию проводили по комбинированной схеме. Количество дней с момента проведения последней процедуры химиотерапии до последнего лейкафереза было значительно больше у пациенток, проходивших мобилизацию только цнтокином (медиана - 34 дня, среднее значение - 42.3 дня) по сравнению с теми, кто проходил комбинированную мобилизацию (медиана 11 дней, среднее значение - 12.9 дня) (р < 0.001). Сходным образом, количество процедур лейкафереза было выше у пациенток, получавших мобилизацию только цнтокином (медиана - 3, среднее- 3.31) по сравнению с пациентками, получавшими комбинированную мобилизацию (медиана - 2, среднее - 2.58) (р й 0.001). Таким образом, проведение мобилизации по комбинированной схеме позволяло собрать необходимое количество ПСК за более короткое время и с помощью меньшего количества процедур лейкаферезов. д). Исследование контаминации образцов ПСК в зависимости от типа мобилизации у больных РМЖ с частичной и полной ремиссией

Данные о характере ремиссии на момент проведения лейкафереза были получены для 285 пациен+ок. У 10 из 74 пациенток (13.5%) с полной ремиссией выявлена контаминация продуктов ПСК. В группе пациенток с частичной ремиссией контаминация продуктов ПСК обнаружена у 51 из 211 пациенток (24.2%). Значение этого параметра в последней группе было в 1.8 раза выше, чем в группе больных с полной ремиссией. Это различие хотя и не было статистически значимым, достаточно близко к границе статистической достоверности (р = 0.069 при уровне значимости р < О 05). Такнм образом, можно говорить о тенденции к повышенной частоте контаминации сборов ПСК у больных с частичной ремиссией по сравнению с пациентками на стадии полной ремиссии. У пациенток с полной ремисси'ей частота контаминации сборов ПСК не зависела от типа мобилизационной терапии (мобилизация только цитокином - 5 из 34, 14.7%, комбинированная схема мобилизации - 5 из 40, 12.5%). В тоже время у пациенток с частичной ремиссией при

проведении комбинированной мобилизации отмечалась меньшая частота контаминации сборов ПСК по сравнению аналогичным показателем в группе пациенток с мобилизацией только цитокином (24 из 126, 19.0%, по сравнению с 27 из 85, 31.7%, соответственно р « 0.049). Полученные данные свидетельствуют о том, что комбинированный режим мобилизации ассоциируется со снижением частоты контаминации ПСК у больных РМЖ, находящихся в состоянии частичной ремиссии.

Опухолевая контаминация КМ и ПСК как фактор проглоза выживаемости без прогрессировать болезни и полной выживаемости РМЖ

Пациентки без иммуноцитохимически-детектируемых метастазов в костном мозге имели значительно более высокую выживаемость без прогрессирования болезни (медиана - 458 дней) по сравнению с пациентками, у которых такие метастазы были выявлены (медиана 146 дней, р = 1 х Ю"4). Медиана выживаемости без прогрессирования болезни была выше в группе из 168 пациенток, у которых опухолевые клетки не обнаруживались ни в костном мозге, ни в продуктах ПСК (471 день, р = 7 х !0"5). К сожалению, данные по полной выживаемости для этой группы нациекток не были доступны для анализа.

Данные по выживаемости были доступны для 403 из 447 пациенток с известным режимом мобилизационной терапии. У пациенток без контаминации сборов ПСК выживаемость без прогрессирования болезни и полная выживаемость были определены для 125 пациенток с мобилизацией только цитокином и для 191 пациентки с комбинированной схемой мобилизации. Аналогичные параметры были исследованы у пациенток с контаминацией ПСК, при этом 46 из них проходили мобилизацию только цитокином и 41 - комбинированную мобилизацию. В целом, пациентки без контаминации ПСК характеризовались более длительной выживаемостью без прогрессирования болезни по сравнению с пациентками, у которых контаминация ПСК была выявлена (медиана составляет 401 день против 291 дня соответственно, р = 7 х 10"'). Аналогичное соотношение было показано для названных выше групп пациенток при анализе общей выживаемости (медиана - 1060 дней против 697 дня, р = 9 х 10"').

Сопоставление данных по выживаемости и характеру мобилизационного режима представлено в таблице Таблице 4 Из этих данных видно, что среди пациенток с комбинированной схемой мобилизации более длительная выживаемость без прогрессирования болезни и полная выживаемость отмечается в группе больных без контаминации ПСК (медиана составляет 455 и 1054 дня по сравнению с 243 и 525 днями соответственно, р « 1 х I0'1). В противоположность этому, при мобилизации только цитокином факт контаминации ПСК не ассоциируется с величиной выживаемости без прогрессирования болезни или полной выживаемости. Так, в группе пациенток без контаминации ПСК медиана выживаемости без прогрессирования болезни составляет 352 дня по сравнению с 295 днями в группе пациенток с такой контаминацией, р = 0.3). Медиана полной выживаемости в вышеназванных группах составляет 1060 и 985 дней соответственно, р = 0.34).

Таблица 4. Сопоставление данных по выживаемости и ха эактеру мобилизационного режима

Тип мобилизационной Терапии Характер контаминации ПСК Количество пациенток Медиана выживаемости без прогрессирования болезни (дни) Медиана полной выживаемости (Дни)

Комбинированная (цитокин+химио-препарат) Нет Есть 191 41 455 243 1054 525

Только цитокин Нет Есть 125 46 352 295 1060 985

Характер ответа на химиотерапию коррелирует с частотой контаминации продуктов ПСК, а также длительностью выживаемости без прогрессирования болезни и полной выживаемости. Для пациенток в состоянии полной ремиссии и контаминацией ПСК медиана выживаемости без прогрессирования болезни составляет 418 дней, а у пациенток без опухолевых клеток в сборах ПСК - 512 дней (р = 0.61). Таким образом, пациентки в состоянии полной ремиссии (в результате проведенной химиотерапии) на момент забора ПСК вне зависимости от контаминации сборов ПСК характеризуются примерно одинаковыми показателями выживаемости без прогрессирования болезни. К сожалению, при проведении исследования не было возможности оценить полную выживаемость в группе пациенток в состоянии полной ремиссии.

В отличие от пациенток с полной ремиссией, для пациенток с частичной ремиссией на момент забора ПСК выживаемость без прогрессирования болезни была выше в подгруппе без контаминации этих продуктов (медиана - 444 дня для пациенток без контаминации ПСК и 243 дня - для пациенток с контаминацией, р = 0.001). Для пациенток с частичной ремиссией удалось также оценить полную выживаемость. Полная выживаемость коррелировала с выживаемостью без прогрессирования болезни и была выше у пациенток без контаминации сборов ПСК (медиана -979 дней) по сравнению с пациентками, у которых в этих сборах были найдены опухолевые клетки (медиана - 594 дня) (р = 0.001).

У пациенток с контаминацией ПСК из обеих рассматриваемых групп (с полной и частичной ремиссией на момент проведения лейкафереза) выживаемость без прогрессирования болезни была выше у пациенток с полной ремиссией (медиана -418 дней) по сравнению с пациентками, у которых отмечалась частичная ремиссия (медиана - 243 дня) (р = 0.01).

Мультивариантный анализ взаимозависимости факторов прогноза

С помощью регрессионного анализа мы провели исследование значимости факторов, позволяющих оценить вероятность контаминации ПСК, а также факторов, ассоциирующихся с прогнозом выживаемости у исследованных больных РМЖ. При совместном исследовании нескольких факторов: контаминации КМ, количества лейкаферезов, частичной или полной ремиссии на момент трансплантации и типа мобилизационного режима было установлено, что единственным независимым фактором, позволяющим прогнозировать контаминацию ПСК,

является контаминация КМ (р = 0.03). При одновременной оценке приведенной выше панели факторов для количества лейкаферезов уровень ошибки положительной корреляции составил 0 07, для характера ремиссии на момент трансплантации значение этого параметра было 0.2 и характера мобилизационного режима - 0.08 (для достоверного заключения уровень ошибки должен быть меньше 0.05).

Контаминация сборов ПСК у пациенток с обнаруженными с помощью ИЦА опухолевыми клетками в костном мозге была в 2.43 раза выше, чем в группе пациенток с отрицательными результатами ИЦА костного мозга. Исключение из анализируемой панели факторов контаминации КМ приводит к тому, что количество лейкаферезов становится статистически достоверным фактором прогноза (р < 0.001) и не зависит от клинического статуса ( р = 0.17) и мобилизационного режима (р = 0 54). При проведении этого анализа было показано, что значение функции вероятности контаминации сборов ПСК повышалось с каждой дополнительной процедурой лейкафереза на 2.13 единицы.

В группах пациенток, сформированных на основании типа мобилизационного режима и количества проведенных лейкаферезов такие характеристики как возраст, количество курсов химиотерапии до проведения ВХТ, число и сайг метастазов и статус эстрогенового рецептора распределялись примерно одинаково (Таблица 5).

Таблица 5. Анализ факторов прогноза

Фактор прогноза Характер мобилизационной терапии Комбинированная / Только цитокин Количество лейкаферезов 1 / 2 / 3 и более

Возраст, медиана 45 лет / 44 года 45 / 45 / 45 ле*

Перед терапией Нет Один режим ¿2 режимов 65% / 61% 32% / 35% 3% / 4% 65%/ 59%/ 60% 30%/ 40%/ 31% 5%/ 1%/ 7%

Сайт метастатического поражения: только костный мозг только кости другой сайт печень ¿2 сайтов 18% / 20% 21% / 21% 4% / 8% 18% / 14% 39% / 37% 23%/ 14% / 17% 21%/ 22% / 21% 6%/ 3% / 7% 14%/ 21% / 15% 36%/ 40% / 39%

Статус эстрогенового рецептора: экспрессия есть экспрессии нет 68% / 68% 32% / 32% 70%/ 69%/ 66% 30%/ 30%/ 33%

Нами было проведено исследование значимости факторов прогноза выживаемости без

прогрессирования болезни и полной выживаемости. Панель анализируемых факторов включала: клиническую стадию, контаминацию КМ, контаминацию ПСК, мобилизационный режим и количество процедур лейкафереза. В результате проведенного регрессионного анализа нами не

были выявлены независимые факторы прогноза выживаемости без прогрессирования болезни и полной выживаемости.

Исследование клоногенного роста опухолевых клеток-контамннант

С целью исследования ростового потенциала опухолевых клеток, содержащихся в гемопоэтических продуктах больных РМЖ, 31 образец костного мозга и 27 образцов ПСК от 31 пациентки были исследованы в тесте на клоногенный рост опухолевых клеток in vitro. (Для 4 пациенток не представлялось возможным исследовать образцы ПСК). Клоногенная эффективность выращивания клеток составляла от 0.4 до 14% со средним значением в 4%. Клоногенный опухолевый рост был обнаружен как в свежесобранных, так и в размороженных после хранения в жидком азоте образцах.

Иммунофлуоресцентмое окрашивание опухолевых клеток с моноклональными антителами к цитокератину SB-3 позволило выявить интенсивно-светящиеся колонии клеток в позитивных образцах. Позитивное окрашивание этими антителами полностью коррелировало с данными фазово-контрастной микроскопии: окрашивание не- наблюдалось ни в одном отрицательном случае роста опухолевых колоний поданным микроскопии. В трех случаях позитивной окраски на SB-3, когда колонии опухолевых клеток морфологически не выявлялись под микроскопом, они были обработаны антителами к поверхностному маркеру моноцитов и гранулоцитов CDU. Ни в одном из этих трех случаев антитела к CD11 не проявили SB-3-познтивные колонии опухолевых клеток.

Таблица 6. Сопоставление результатов ИЦА и клоногенного анализа опухолевого роста

Источник стволовых клеток Результат иммуноцитохи-мического анализа Результат клоногенного анализа опухолевого роста

Костный мозг Есть контаминация 21 Рост есть 17 Роста нет 4

Нет контаминации 10 Рост есть 2 Роста нет 8

ПСК Есть контаминация 5 Рост есть 4 Роста нет 1

Нет контаминации 22 Рост есть 0 Роста нет 22

Как а образцах костного мозга, так и в образцах ПСК результаты выявления опухолевых клеток с помощью иммуноцитохимического анализа коррелируют с данными по клоногенному росту опухолевых клеток In vitro (Р <0.0001).

Клоногенный рост опухолевых клеток in vitro был выявлен в 21 из 26 иммуноцитохимически-позитивных образцов КМ и ПСК (Таблица 6). Одновременно с этим рост колоний не был обнаружен в 30 из 32 иммуноцитохимически-негативных случаев (Таблица б). В 17 из 21 иммуноцитохимически-позитивных образцов костного мозга был показан клоногенный рост опухолевых клеток, тогда как из 10 иммуноцитохимически-негативных случаев такой рост был показан лишь в двух образцах (р ■ 2 х 10°', точный критерий Фишера). Сходным образом, в 4 из 5 образцов ПСК, содержащих иммуноцитохимически-детектируемые опухолевые клетки, был

показан рост опухолевых колоний в клоногенном тесте in vitro, тогда как ни одного случая такого роста не было отмечено в 22 иммуноцитохимически-негативных образцах ПСК (р = 2.8 х 10"4). Таким образом, результаты ИЦА по контаминации исследованных образцов опухолевыми клетками, коррелируют с результатами теста на клоиогенный рост опухолевых клеток in vitro (р < 0.0001). Из приведенных данных видно, что остаточные опухолевые клетки в составе аутотрансплантата гемопоэтической ткани жизнеспособны и при введении в организм больного потенциально могут участвовать в возникновении рецидива заболевания. Характеристика нового метода детекции опухолевых клеток в образцах ПСК: пммуноцитохнмического анализа с этапом иммунного обогащения на магнитных микросферях

В этом разделе охарактеризован новый, высокочувствительный метод детекции резидуальных клеток рака молочной железы. Схема проведения анализа приведена на рисунке I.

Инкубация с МКАТ

2х отмывка несвязавшихся МКАТ

Инкубация с магнитными шариками, связанными вторичными АТ

Отделение шариков в магнитном поле

Удаление несвязавшихся клеток

Сбор клеток РМЖ, связанных с шариками

Фиксация, иммунное окрашивание.

Рисунок I. Схема проведения ИЦА-ОММ.

Повышение чувствительности традиционного ИЦА достигается благодаря проведению предварительного обогащения пула опухолевых клеток в исследуемом образце. Такое обогащение возможно благодаря применению специфических моноклональных антител к клеткам РМЖ, иммобилизованных на магнитных микросферах. Мы сравнили чувствительность данного метода с традиционным иммуно-цитохимическим анализом (ИЦА) у больных 11-111 стадии РМЖ с высоким риском прогрессии заболевания, а также у пациентов с IV стадией РМЖ. а). Отработка и характеристика метода ИЦА с обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ)

Стандартный ИЦА и ИЦА с обогащением на магнитных микросферах были проведены в б повторах. Моделью для отработки метода служили клетки линии рака молочной железы САМА-1, добавленные в различных концентрациях к образцам мононуклеарных клеток крови от доноров без онкопатологии. Образцы, содержащие по 2 - 3 х 10' мононуклеарных клеток крови, были проанализированы с помощью стандартного ИЦА (рис. 2а). Образцы с количеством клеток 1x10* и 2 х 10' были проанализированы с помощью ИЦА с обогащением (рис. 26 и 2в соответственно).

10*

10 О

А >iv Лу

/Ép

J?

J

'Я' f=asBi

уУ

б/'

10« и*' 1сн ta1 io*

Б

''Л /у'''

y'

О/ >>" г sO.987

уб

'''

10" 10»

в

У y¡

у У y'

y-

/ / г*0Явв

D '

Рисунок 2. Отработка метода ИЦА -ОМШ. Клетки САМА-1 в различных концентрациях добавлялись к мононуклеврным клеткам крови здоровых доноров (6 повторов каждая концентрация). А - стандартный ИЦА. Оси координат отражают отношение количества клеток САМА-1 к количеству мононуклеаров, поскольку в экспериментах с высоким и низким количеством САМА-1 было обнаружено разное количество мононуклеаров. Б -ИЦА-ОММ (I х 10* мононуклеаров), В -ИЦА-ОММ (2 х 10* мононуклеаров). Оси на рисунах Б и В отражают абсолютное количество клеток САМА-1. Сплошная линия показывает функцию линейного выравнивания наименьших квадратов. Пунктирные линии показывают границы 95% доверительного интервала.

lo" 1С

Ожидаемое количество клеток РМЖ

Отличная линейность стандартной прямой для всей панели анализируемых образцов была получена как для стандартного ИЦА (г = 0.981), так и для ИЦА с обогащением (для I х 10' клеток г - 0.987; для 2 х I о' г - 0.999).

Нижний предел возможности обнаружения клеток РМЖ среди 1 х 10* клеток составил одну клетку РМЖ на 2 х 10' моноцитов. В тоже время среди 2x10* клеток этот предел составил одну клетку РМЖ на 5 х 10' моноцитов. Таким образом, чувствительность ИЦА-ОММ возрастает в 20 - 50 раз по сравнению с стандартным ИЦА.

Обнаружение опухолевых клеток, в ИЦА с обогащением как оценивается наклоном стандартной кривой, выраженной в процентах, составило 58.7% (95% доверительный интервал, 54.5 - 62.8%) и 68.1% (95% доверительный интервал, 66 8 - 69.4%) для определения среди I х 10* и 2 х Ю' моноцитов соответственно.

Коэффициент вариации ИЦА с обогащением, как показали усредненные данные по всем экспериментам с добавлением к кроветворным клеткам различного количества клеток линии РМЖ САМА-1, был 21.9% и 16.8% при анализе 1 х 10* и 2 х Ю' моноцитов соответственно (Таблица 10). При нижнем пределе детекции коэффициенты вариации составили 22.1 и 40.5 % соответственно.

Специфичность ИЦА с обогащением была определена с помощью образцов периферических стволовых клеток от 18 доноров без онкопатологии. Ни в одном из этих образцов не были обнаружены клетки с характерным для РМЖ окрашиванием согласно критериям ИЦА. С целью осуществления негативного контроля специфичности использованных антител, для обработки препаратов больных РМЖ вместо описанных выше моноклональных антител в серии экспериментов в сходной концентрации использовалась нормальная мышиная сыворотка. Ни в одном случае также не были обнаружены признаки позитивного окрашивания, характерного для клеток РМЖ.

Использование моноклональных антител 9184, 9187 и 9189 в одной серии экспериментов и моноклональных антител TFS2 и SB-3 в другой серии экспериментов в четырех повторах с одними и теми же образцами дало сходные результаты.

б). Исследование эффективности очистки сборов ПСК от остаточных клеток рака молочной железы в результате позитивной селекции клеток ня экспрессию CD34

Позитивная селекция на экспрессию CD34 позволяет существенно уменьшить количество остаточных опухолевых клеток в предназначенных для аутотрансплантации ПСК. При этом возникает вопрос: насколько эффективно удалось очистить трансплантат от опухолевых клеток? Чтобы оценить эффективность очистки, необходимо использовать как можно более чувствительные методы детекции остаточных клеток РМЖ. В данном разделе работы нами проведено сравнение эффективности используемых для этого методов: стандартного иммуноцитохимического анализа (ИЦА) и нового, более чувствительного метода -

иммуноцитохимического анализа с иммунным обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ), описанного ранее. Схема метода дана на рисунке 3.

Образец ПСК

Исследовались продукты ПСК от 36 больных РМЖII - IV стадий заболевания (35 женщин и 1 мужчина). Степень очистки и содержание С034-позитивных клеток в продуктах лейкаферезов, осуществленных с помощью полностью автоматизированной иммунологической селекции на магнитных микросферах, составляли 97.5% и 38.1% соответственно. Стандартные кривые анализа для ИЦА-ОММ и стандартного ИЦА были построены на основании контрольных экспериментов с клеточной линией рака молочной железы САМА-1, как это было описано в предыдущем разделе.

в). Определение коптамнняции продуктов лейкафереза клетками РМЖ с помощью стандартного ИЦА

Как показали результаты стандартного ИЦА с обогащением, 8 из 35 (один образец не удалось проанализировать) продуктов лейкафереза (23%) до селекции на С034 содержали клетки РМЖ.

Таблица 7 Исследование контаминации С034- и СИ34+ фракций по результатам стандартного

ИЦА и ИЦА-ОММ

Стандартный ИЦА ИЦА-ОММ

CD34- CD34+ CD34- CD34+

Есть контамиНация Нет контаминации Есть контаминация Нет контаминации Есть контаминация Нет контамиНации Есть контаминация Нет контаминации

7и 29 0IJ 36 25' 10 I7J 18

19% 81% 0% 100% 71% 29% 49% 51%

По результатам стандартного ИЦА контаминация Сй34-позитивных фракций отсутствует, тогда как С034-негативные фракции 7 пациенток содержат клетки РМЖ(р = 5.7 х Iff'). 1 Уровень контаминации С034-негативных фракций по результатам ИЦА-ОММ сугцественно выше по сравнению с результатами стандартного ИЦА (р "1.3 х 1& ). 'По результатам ИЦА-ОММ 49% СD34-позитивных фракций содержат опухолевые клетки, тогда как стандартный ИЦА не позволил выявить контаминацию С034-позитивной фракции ни у одной пациентки (р = 4.3 х Iff').

Этот показатель имел почти сходное значение при анализе С034-негативных фракций от этих же пациентов (7 из 36, 19%) (Таблица 7). Отсутствие значительной разницы по содержанию клеток РМЖ между продуктами лейкафереза до позитивной селекции на CD34 и С034-негативной фракцией после лейкафереза соответствует теоретическому ожиданию, поскольку считается, что продукты ПСК до селекции и С034-негативные фракции сходны в отношении контаминации клетками РМЖ. В тоже время ни в одном из 36 образцов С034-позитивных фракций не были обнаружены клетки РМЖ (0 из 36, 0%). Таким образом, С034-позитивные фракции статистически значимо отличались по значению исследуемого параметра от продуктов лейкафереза до селекции на CD34 (р = 2.2 х 10"' ) и от С034-негативных фракций (р = 5.7 х I0'5)

г). Определение контаминации продуктов лейкафереза клетками РМЖ с помощью ИЦА-ОММ

Использование ИЦА с обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ) позволило выявить контаминацию в 25 из 35 С034-негативных фракций (71%), что существенно выше значения данного параметра при использовании стандартного ИЦА (19%, р = 1.3 х 10'5) (Таблица 13). Очевидно, что частота обнаружения контаминации С034-негативных фракций повышается за счет более высокой чувствительности ИЦА-ОММ по сравнению с стандартным ИЦА. Была также зафиксирована контаминация 17 из 35 (49%) С034-позитивных фракций, хотя по результатам

стандартного ИЦА ни один образец С034-позитивных фракций не содержал опухолевых клеток (0%, р = 4.3 х I0"7). Таким образом, С034-позитивиые фракции также могут содержать опухолевые клетки, которые выявляются только с помощью более чувствительного метода анализа - ИЦА-ОММ. Тем не менее, и по результатам ИЦА-ОММ частота контаминации С034-позитивных фракций была несколько ниже, чем С034-негативных (49% по сравнению с 71%). У 8 из 34 (24%) больных клетки РМЖ выявлялись с помощью ИЦА-ОММ в С034-негативных фракциях и не выявлялись в С034-позитивных. Не было ни одной пациентки, у которой раковые клетки обнаруживались бы в СГ)34-по1итивной фракции и не обнаруживались бы в С034-негативной фракции. Не выявлено ассоциации между количеством отобранных С034-позитивных клеток и фактом обнаружения в этой фракции раковых клеток (р « 0.33).

Количество клеток РМЖ, выявленных с помощью ИЦА-ОММ в С034-позитивных фракциях было значительно ниже, чем в продуктах лейкаферезов от тех же больных до процедуры обогащения. В среднем количество раковых клеток в коитаминированных С034-позитивных фракциях составляло 22 единицы (от б до 73 клеток). В тоже время в продуктах лейкафереза перед обогащением среднее количество клеток РМЖ в контаминированном образце составляло 3297 единицы (от 10 до 98400 клеток). Среднее значение коэффициента очистки продуктов лейкафереза (log) от клеток РМЖ в результате проведения отбора на С034-позитивные клетки составляло 2.2 (от 1.7 до 4.0) (Рисунок 4).

Нижний предел детекции

Уменьшение медианы логарифма 2 2 (диапазон 1.7 - 40)

После

С034+ селекция

Рисунок 4. Общее количество клеток РМЖ до и после позитивной селекции иа С034.

Таким образом, хотя использование более чувствительного ИЦА-ОММ позволяет обнаружить контаминацию значительного количества С034-позитивных фракций, количество опухолевых клеток в аутотрансплантатах благодаря позитивной селекции на С034 значительно снижается. Более того, по результатам ИЦА-ОММ, у 8 из 34 пациенток (24%) С034-позитивные фракции не содержали опухолевых клеток, тогда как их С034-негативные фракции содержали такие клетки. Иными словами, удалось добиться полной очистки аутотрансплантата в пределах чувствительности ИЦА-ОММ. Эти данные свидетельствуют об эффективности применения позитивной селекции на экспрессию С034, как метода очистки аутотрансплантата от остаточных клеток РМЖ.

д). Количество опухолевых клеток в продуктах лейкафереза до селекции на СШ4 как фактор прогноза коитамииации С034-позитивных фракций

Контаминация клетками РМЖ продуктов лейкафереза была обнаружена с помощью ИЦА-ОМШ у 8 из 13 (62%) больных со второй стадией РМЖ, у 9 из 13 (69%) с III стадией заболевания у 7 из 8 (88%) - с IV стадией РМЖ. При этом не выявлена значительная разница в количестве раковых клеток между образцами больных с И-Ш стадиями заболевания и образцами больных с IV стадией. Во фракциях С034-позитивных клеток вероятность обнаружения опухолевых клеток также не ассоциировалась со стадией заболевания.

Общее количество клеток РМЖ, обнаруженных после единичного лейкафереза, было ретроспективно подразделено на несколько уровней: низкий (менее 1000), средний (1000-5000) и высокий (более 5000). Затем с помощью логистического регрессионного анализа удалось показать зависимость между уровнем контаминации продуктов лейкафереза до селекции на СР34 и вероятностью ее обнаружения в СР34-позитивной фракции клеток (р = 0.037, ОИ. = 1.3; С1 = 95%, 0.06 - 2.89). С целью выявления более подробных деталей зависимости между количеством клеток РМЖ в продуктах лейкафереза и вероятностью контаминации С034-позитивной фракции после обогащения, был проведено исследование кривой логистической регрессии. Такой подход позволил определить количественный показатель вероятности того, что С034-позитивная фракция содержит, либо не содержит остаточные раковые клетки. Как показано на рисунке 5, угол наклона кривой регрессионного анализа составлял 0.868 (С1 = 95%, 0.711-1.000).

I о

08

ё

% 0.6 л

I

» 0.4 о

в ?

0.2 0.0

Рисунок 5. Характеристическая кривая, отображающая соотношение чувствительности и специфичности прогноза обнаружения клеток РМЖ в отобранных С034-позитивных фракциях. Прогноз построен на основании общего количества опухолевых клеток присутствовавших в образце до селекции.

Значение этого показателя подтверждает прогностическую значимость количества клеток РМЖ в продуктах лейкафереза до селекции на С034, позволяющего спрогнозировать вероятность контаминации С034-позитивной фракции. Если общее количество раковых клеток в продукте лейкафереза было больше или равно 2.2 х 103, СР34 -позитивная фракция с высокой вероятностью будет содержать детектируемые раковые клетки. Если этот показатель будет менее 2.2 х 105 клеток РМЖ, раковые клетки в С034-позитивной фракции не будут выявлены. Чувствительность и специфичность предсказания контаминации С034-позитивиой фракции составили 76.5% и 87.5% соответственно. Таким образом, количество опухолевых клеток в продуктах лейкафереза до селекции на С034 является фактором, который можно использовать для оценки вероятности контаминации СШ4-позитивной фракции.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Специфичность

Выводы

1. В результате сравнительного иммуноцитохимического анализа клеток 535 больных РМЖII - IV стадии обнаружена контаминации костного мозга в 26% случаев и ПСК - в 20.6% случаев, при этом установлена положительная корреляция между выявлением раковых клеток в костном мозге и образцах ПСК обследованных больных.

2. По результатам теста на клоногенный рост in vitro остаточные опухолевые клетки в составе аутотрансплантата жизнеспособны и потенциально могут участвовать в возникновении рецидива заболевания.

3. Вне зависимости от использованных цитокинов (Г-КСФ или ГМ-КСФ) и схем мобилизации (только цитокины или комбинированная схема) не отмечено изменения интенсивности контаминации продуктов цитафереза опухолевыми клетками за исключением больных, находящихся в состоянии частичной ремиссии, у которых мобилизация по комбинированной схеме позволяет снизить частоту контаминации продуктов лейкафереза. При этом комбинированная схема мобилизации позволяет снизить количество цитаферезов.

4. Отсутствие контаминации образцов ПСК ассоциируется с увеличением выживаемости без прогрессирования болезни и полной выживаемости только для пациенток, проходивших мобилизацию по комбинированной схеме.

5. Больные в состоянии полной ремиссии на момент проведения лейкафереза имеют одинаковые показатели выживаемости без прогрессирования болезни вне зависимости от статуса контаминации ПСК в отличие от пациенток в состоянии частичной ремиссии, у которых выживаемость без прогрессирования болезни и полная выживаемость выше при отсутствии опухолевых клеток в образцах ПСК.

6. Использование ИЦА-ОММ позволило выявить гораздо более высокую частоту контаминации продуктов ПСК (71%), чем удавалось установить ранее с помощью менее чувствительных методов (обычно менее 25%), а также обнаружить контаминацию примерно половины исследованных СВ34-позитивных фракций, которая не была определена с помощью стандартного ИЦА.

7. Позитивная селекция на экспрессию CD34 позволила в среднем на два порядка уменьшить количество опухолевых клеток в продуктах ПСК. По результатам ИЦА-ОММ у 24% пациенток удалось добиться полной очистки. Более точное определение частоты и интенсивности контаминации аутотрансплантатов с помощью ИЦА-ОММ является показанием к проведению дополнительной очистки.

8. Количество опухолевых клеток в продуктах лейкафереза до селекции на CD34 является фактором, который можно использовать для оценки вероятности контаминации С034-позитивной фракции. При значении данного параметра, равном 2200 и более клеток, С034-позитивная фракция с высокой вероятностью будет контаминирована клетками РМЖ.

7. Список работ, опубликованных по теме диссертапии

1. Pecora AL, Lazarus НМ, Cooper В, Kennedy MJ, Umiel Т, Meagher R, Herzig R, Copelan Б, Prilutskava M. Glassco J, Kahn DG, Moss TJ. Breast cancer contamination in peripheral blood stem cell (PBSC) collections association with bone marrow disease and type of mobilization. Blood, V. 90: Supp. 1,99a, 1997.

2. Kalin DG, Prilutskava M. Cooper B, Kennedy MJ, Meagher R, Pecora AL, Preti RA, Moreb J, Wingard J, Rosenfeld C, Herzig R, Glassco JE, Umiel T, Copelan E, Lazarus HM, Moss TJ. The relationship between the incidence of tumor contamination and number of phercsis for stage IV breast cancer. Blood V. 90, Supp. 1, 565a, 1997.

3. Prilutskava M. Moss TJ, Umiel T, Burgess J, Brockmayer C, Mills BJ. Enhanced immunocytochemical (ICC) detection of tumor cells in peripheral blood stem cell (PBSC) products from breast cancer (BrCa) patients. Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research, V. 7, p. 299, 1998.

4. Umiel T, Prilutskava M. Nguyen NH, Moss TJ, Burgess J, Griffith M, Mills BJ. Detection of breast cancer (BrCa) cells in patient peripheral blood stem cell (PBSC) and CD34 selected products using immunocytochemical (ICC) and tumor enrichment procedures. Blood, V. 92 Supp 1,446a, 1998.

5. Moss TJ, Lazarus HM, Weaver CH, Buckner CD, Noga SJ, Preti RA, Copelan E, Penza S, Cooper BW, Meagher RC, Herzig RH, Kahn DG, Prilutskava M. Rosenfeld C, and Pecora AL. The clinical significance of breast cancer cells in marrow and stem cell products taken from stage IV patients. In: Dicke K, Keating A. Autologous Marrow Transplantation: Proceedings of the Ninth International Symposium. Houston: University of Texas M.D. Anderson Hospital and Tumor Institute at Houston. 265-273, 1999.

6. Umiel T, Joyce R, Prilutskava M. Vatanparast R, Moss TJ. Tumor enriched immuoncytochemical (ICC) assay for the detection of breast cancer (BrCa) cells in patient peripheral blood stem cell (PBSC) products. Blood, V. 94, Supp 1, 143a, 1999.

7 Umiel T, Prilutskava M. Nguyen NH, Moss TJ, Schaeffer A, Burgess J, Griffin M, Mills B. Breast tumor contamination of peripheral blood stem cell harvests: increased sensitivity of detection using immunomagnetic enrichment. Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research, V.9, pp.895-904,2000.

8 Burgess J, Mills B, Griffith M, Mansour V, Weaver CH, Schwartzberg LS, Snyder EL, Krausw DS, Yanovich S, Prilutskava M. Umiel T, Moss TJ. Breast tumor contamination of PBSC harvests: tumor depletion by positive selection of CD34+ cells. Cytotherapy, V.3, pp. 285-294,2001.

9. Pecora AL, Lazarus HM, Jennis AA, Preti RA, Goldberg SL, Rowley SD, Cantwell S, Cooper BW, Copelan EA, Herzig RH, Meagher R, Kennedy MJ, Akard LR, Jansen J, Ross A, Prilutskava M. Glassco J, Kahn D, Moss TJ. Breast cancer cell contamination of blood stem cell products in patients with metastatic breast cancer: predictors and clinical relevance. Biology of Blood and Marrow Transplantation, V. 8(10), pp. 536-543, 2002.

10. Прилункая Марина Иосифовна. Мосс Томас Д. Оценка эффективности очистки периферических стволовых клеток от контаминации опухолевыми клетками у больных раком молочной железы. Материалы 11-ой Международной Научной Конференция «СПИД, рак и родственные проблемы», Санкт-Петербург, Октябрь 2003, стр. 72.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. Н И. Бяохмна РАМН Подписано а печать 05.03.05 Заказ № 153 Тираж 100эю

4

«

РНБ Русский фонд

2007-4 4486

Угнетение гемопоэза, обусловленное применением высоких доз цитостатиков, можно компенсировать инфузией аллогенных либо аутологичных клеток костного мозга (КМ) или стволовых клеток из периферической крови (периферических стволовых клеток, ПСК). Трансплантация аутологичных гемопоэтических клеток имеет несколько потенциальных преимуществ по сравнению с аллогенной трансплантацией: нет необходимости в наличии гистосовместимого донора, отсутствует риск развития реакции «трансплантат против хозяина». Таким образом, использование аутотрансплантатов более безопасно. Главным препятствием к применению аутотрансплантатов с целью восстановления гемопоэза после ВХТ является их частая контаминация опухолевыми клетками. Реинфузия таких клеток потенциально способна привести к возникновению рецидива заболевания. Чтобы минимизировать этот эффект, костный мозг либо ПСК стараются забирать у пациентки на стадии полной ремиссии, когда доказательства контаминации костного мозга или стволовых клеток из периферической крови отсутствуют. Другим возможным решением этой проблемы является удаление из трансплантатов злокачественных клеток-контаминант без нарушения функции клеток-предшественниц гемопоэза, так называемая «очистка». Для того чтобы выявить опухолевые клетки в гемопоэтических продуктах, а также оценить эффективность очистки аутотрансплантатов, необходимо иметь в распоряжении достаточно чувствительные методы детекции таких опухолевых клеток-контаминант. В настоящее время существует несколько методов выявления остаточных опухолевых клеток, у каждого из которых есть свои преимущества и недостатки (более подробно это будет описано в литературном обзоре). Необходимо подчеркнуть, однако, что целесообразность применения того или иного метода обнаружения остаточных опухолевых клеток напрямую связана с клиническими, морфологическими и молекулярно-генетическими особенностями конкретного новообразования и требует проведения тщательных исследований.

Другой важной проблемой, связанной с проведением аутотрансплантации гемопоэтических тканей онкобольных, является выбор источника аутотрансплантата: либо костный мозг, либо стволовые клетки из периферической крови (периферические стволовые клетки, ПСК). Если в начале 90-х годов прошлого века преимущество отдавалось аутотрансплантации костного мозга (КМ), то к концу 90-х годов в подавляющем большинстве случаев стали использовать только ПСК. Это обусловлено целым рядом преимуществ, которые имеют ПСК как источник стволовых клеток по сравнению с КМ. (Эти преимущества будут описаны в главе «Обзор литературы»). Однако, концентрация ПСК в периферической крови чрезвычайно низка. Существенно увеличить количество и качество ПСК в продуктах лейкафереза удалось благодаря введению в практику мобилизационной терапии. В настоящее время используют две принципиальные схемы мобилизации ПСК: или комбинацию миелосупрессивной химиотерапии с воздействием факторов роста гемопоэтических клеток, или мобилизацию только с помощью факторов роста. При этом ассоциация между применением той или иной схемы мобилизации и контаминацией продуктов ПСК исследована недостаточно.

Таким образом, исследование характера контаминации продуктов КМ и ПСК на разных этапах их подготовки к использованию в качестве аутотрансплантатов имеет большое значение для оптимизации этой процедуры. Эта оптимизация связана с необходимостью эффективного обнаружения опухолевых клеток и их последующего удаления из состава трансплантата. Данная процедура направлена на снижение возможного риска возникновения рецидива, обусловленного введением в организм больного в составе трансплантата остаточных опухолевых клеток.

Цель работы: исследование факторов, влияющих на опухолевую контаминацию аутотрансплантатов ПСК, а также клиническое значение этой контаминации при проведении высокодозной химиотерапии у больных раком молочной железы.

Были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ частоты и интенсивности контаминации опухолевыми клетками костного мозга и продуктов лейкафереза у больных РМЖ с помощью стандартного иммуноцитохимического анализа.

2. Выявить клинические и терапевтические факторы, способные влиять на контаминацию ПСК раковыми клетками.

3. Оценить жизнеспособность «остаточных» опухолевых клеток в составе образцов костного мозга и ПСК с помощью теста на клоногенный рост клеток in vitro.

4. Исследовать, ассоциируется ли фактор контаминации продуктов ПСК с выживаемостью больных РМЖ.

5. Исследовать, повышается ли чувствительность традиционного иммуноцитохимического анализа (ИЦА) благодаря проведению этапа предварительного иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах.

6. Провести сравнительное исследование эффективности очистки С034-позитивных фракций с помощью традиционного ИЦА и ИЦА с обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ).

Научная новизна работы

Оценка контаминации гемопоэтических трансплантатов опухолевыми клетками как фактора, потенциально влияющего на возникновение рецидивов и выживаемость больных РМЖ, ранее проводилась на выборках небольшого размера (в основном, менее 90 пациенток). Объединить данные этих исследований для совокупного анализа не представляется возможным из-за методологических различий [Weather с соавт., Cooper с соавт., Stadtmauer с соавт.]. Кроме того, далеко не все пациентки в процитированных работах адекватно реагировали на проведение ВХТ. В нашей работе эти недостатки были учтены. Впервые проведено крупномасштабное исследование (535 больных РМЖ) возможной корреляции между контаминацией КМ и ПСК опухолевыми клетками и длительностью выживаемости больных на поздних стадиях РМЖ, адекватно реагирующих на проведение ВХТ. Было установлено, что пациентки с контаминацией КМ характеризуются менее длительной выживаемостью без прогрессирования болезни, чем пациентки без нее. Контаминация ПСК является фактором, ассоциирующимся с снижением выживаемости только у пациенток, проходивших мобилизацию по комбинированной схеме и находящихся в состоянии частичной (но не полной) ремиссии на момент проведения лейкафереза. Были впервые подробно исследованы клинические и терапевтические факторы, влияющие на частоту контаминации в ПСК. Так, контаминация опухолевыми клетками КМ пациентки с высокой вероятностью позволяет предположить и контаминацию ими продуктов ПСК. Снижение частоты контаминации ПСК раковыми клетками наблюдалось при проведении комбинированной мобилизации и уменьшении количества лейкаферезов.

В данной работе был апробирован новый высокочувствительный метод обнаружения опухолевых клеток — иммуноцитохимический анализ с предварительным этапом иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах. Благодаря использованию этого метода удалось установить, что частота контаминации трансплантируемого материала гораздо выше, чем считалось ранее. Применение более чувствительного метода детекции остаточных опухолевых клеток для анализа фракций ПСК после селекции на СОЭ4-позитивные клетки позволило определить, что такая селекция является достаточно эффективным методом очистки продуктов лейкафереза от остаточных клеток РМЖ.

Научно-практическая значимость

В ходе работы показано, что опухолевая контаминация гемопоэтических тканей, предназначенных для аутотрансплантации у больных РМЖ, является неблагоприятным прогностическим фактором. Кроме того, жизнеспособность опухолевых клетокконтаминант была нами показана в исследовании их клоногенного роста in vitro. В целом, полученные данные свидетельствуют о возможном участии содержащихся в трансплантате опухолевых клеток в возникновении рецидива заболевания. Таким образом, перед проведением трансплантации необходимо осуществить очистку гемопоэтических продуктов от злокачественных клеток-контаминант. Нами также выявлен ряд клинических и терапевтических факторов, которые позволяют спрогнозировать вероятность контаминации ПСК у конкретной пациентки. Благодаря учету некоторых из этих факторов, например, при проведении мобилизации, можно снизить вероятность контаминации ПСК еще до процедуры «очистки». Так, у больных без метастазов в КМ проведение мобилизации по комбинированной схеме позволяет снизить частоту контаминации ПСК опухолевыми клетками. Кроме того, благодаря комбинированной мобилизации удается собрать необходимое количество ПСК с помощью меньшего количества процедур лейкафереза. Эти данные позволяют рекомендовать комбинированную схему мобилизации как оптимальную в сравнении с мобилизацией только цитокинами.

Был разработан и апробирован новый высокочувствительный метод детекции остаточных опухолевых клеток, представляющий собой сочетание традиционного иммуноцитохимического анализа (ИЦА) с этапом предварительного иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах. Чувствительность этого усовершенствованного метода в 20 - 50 раз выше традиционного ИЦА. Применение нового метода позволило установить, что уровень контаминации образцов гематопоэтической ткани у больных РМЖ гораздо выше, чем это считалось ранее: если стандартный ИЦА позволяет выявить контаминацию ПСК у 7% больных РМЖ на II - IV стадиях заболевания, то новый метод - у 86% пациенток. Повышение чувствительности метода детекции остаточных опухолевых клеток в трансплантате может иметь большое значение для оценки эффективности его очистки. Примером могут служить полученные нами данные по оценке уровня контаминации ПСК после проведения позитивной селекции на клетки, экспрессирующие CD34. Если стандартный ИЦА не позволил выявить опухолевые клетки ни в одном из 36 образцов С034-позитивных фракций, то в ИЦА-ОММ опухолевые клетки обнаружены в 49% С034-позитивных фракций. Одновременно с этим у В пациенток (24%) при анализе с помощью ИЦА-ОММ опухолевые клетки были обнаружены только в С034-негативных фракциях, и не обнаруживались в С034-позитивных фракциях, то есть у этих пациенток благодаря позитивной селекции на CD34 удалось полностью очистить трансплантаты в пределах чувствительности ИЦА-ОМШ. Таким образом, благодаря более чувствительному методу детекции остаточных опухолевых клеток можно лучше оптимизировать процедуру очистки трансплантата. Другим возможным приложением высокочувствительного метода обнаружения опухолевых клеток может являться мониторинг за ходом лечения пациенток. Возникновение рецидива, по-видимому, должно сопровождаться повышением количества опухолевых клеток в периферической крови, и, вероятно, может быть зафиксировано с помощью этого метода. Возможность применения ИЦА-ОММ для мониторинга за возникновением рецидива РМЖ необходимо исследовать дополнительно.

ВЫВОДЫ

1. В результате сравнительного иммуноцитохимического анализа клеток 535 больных РМЖ II - IV стадии обнаружена контаминация костного мозга в 26% случаев и ПСК - в 20.6% случаев, при этом установлена положительная корреляция между выявлением раковых клеток в костном мозге и образцах ПСК обследованных больных.

2. По результатам теста на клоногенный рост in vitro остаточные опухолевые клетки в составе аутотрансплантата жизнеспособны и потенциально могут участвовать в возникновении рецидива заболевания.

3. Вне зависимости от использованных цитокинов (Г-КСФ или ГМ-КСФ) и схем мобилизации (только цитокины или комбинированная схема) не отмечено изменения интенсивности контаминации продуктов цитафереза опухолевыми клетками за исключением больных, находящихся в состоянии частичной ремиссии, у которых мобилизация по комбинированной схеме позволяет снизить частоту контаминации продуктов лейкафереза. При этом комбинированная схема мобилизации позволяет снизить количество цитаферезов.

4. Отсутствие контаминации образцов ПСК ассоциируется с увеличением выживаемости без прогрессирования болезни и полной выживаемости только для пациенток, проходивших мобилизацию по комбинированной схеме.

5. Больные в состоянии полной ремиссии на момент проведения лейкафереза имеют одинаковые показатели выживаемости без прогрессирования ^болезни вне зависимости от статуса контаминации ПСК в отличие от пациенток в состоянии частичной ремиссии, у которых выживаемость без прогрессирования болезни и полная выживаемость выше при отсутствии опухолевых клеток в образцах ПСК.

6. Использование ИЦА-ОММ позволило выявить гораздо более высокую частоту контаминации продуктов ПСК (71%), чем удавалось установить ранее с помощью менее чувствительных методов (обычно менее 25%), а также обнаружить контаминацию примерно половины исследованных С034-позитивных фракций, которая не была определена с помощью стандартного ИЦА.

7. Позитивная селекция на экспрессию CD34 позволила в среднем на два порядка уменьшить количество опухолевых клеток в продуктах ПСК. По результатам ИЦА-ОММ у 24% пациенток удалось добиться полной очистки. Более точное определение частоты и интенсивности контаминации аутотрансплантатов с помощью ИЦА-ОММ является показанием к проведению дополнительной очистки.

8. Количество опухолевых клеток в продуктах лейкафереза до селекции на CD34 является фактором, который можно использовать для оценки вероятности контаминации CD34-позитивной фракции. При значении данного параметра, равном 2200 и более клеток, С034-позитивная фракция с высокой вероятностью будет контаминирована клетками РМЖ.