Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Клиническое и биологическое значение изменения экспрессии гена KISS1 при метастазировании опухолевых клеток рака молочной железы в головной мозг

На правах рукописи

КАВЕРИНА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

КЛИНИЧЕСКОЕ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА А7ЖИ ПРИ МЕТАСТАЗИРОВАНИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ГОЛОВНОЙ МОЗГ

14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

15 АВГ 2013

Москва - 2013

005532140

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Кадагидзе Заира Григорьевна

Официальные оппоненты: Караулов Александр Викторович

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М.Сеченова Минздрава России

Лактионов Константин Павлович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделением опухолей женской репродуктивной системы ФБГУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН

Ведущее научное учреждение:

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 2013 г. в ^ часов на заседании

диссертационного Совета Д 001.017.01 ФБГУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБГУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

Автореферат разослан Li^o.iJ^—. 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

^^¿^^^[Цишкин Юрий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

Рак молочной железы (РМЖ) на протяжении последних десятилетий занимает лидирующие позиции среди злокачественных новообразований женского населения. Количество заболевших в России составляет 38.2 на ЮО'ООО населения. Пик развития рака приходится на возраст от 50 до 60 лет. Среди данной популяции смертность, вызываемая раком молочной железы, достигает 25-40% от числа заболевших. В общей группе больных с метастатическим поражением головного мозга РМЖ занимает 2-е место, уступая только раку легкого. В то время как при ретроспективном анализе, частота метастазирования в головной мозг при раке молочной железы составляет 10-20%, по данным аутопсии метастазы в головной мозг диагностируют в 30% случаев. Наличие метастазов повышает смертность при раке молочной железы. Так, независимо от возможных методов лечения продолжительность жизни пациентов не превышает 12-24 месяцев. Таким образом, необходимость поиска и внедрения в клиническую практику новых специфичных маркёров ранней диагностики метастазирования при раке молочной железы, очевидна. В настоящее время, помимо онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста, регулирующих формирование первичной опухоли, выделяют новый класс генов, функцией которых является регуляция метастазирования. Изучение данного класса генов расширяет понимание механизмов опухолевой прогрессии, а также имеет практический интерес с точки зрения поиска новых мишеней для терапии онкологических заболеваний. Среди генов-супрессоров метастазирования известны такие гены как KAI, NM23, а также KISS1. Впервые ген-супрессор KISS1 был обнаружен в клетках метастазирующей меланомы в 1996 году. Позднее Miele и Shirasaki с соавт, определили локализацию данного гена в локусе 6ql6.3-q23 хромосомы, и выяснили, что в результате делеций KISS1 гена способность к метастазировашпо клеток меланомы увеличивается. Несмотря на значительное количество накопившихся к настоящему времени экспериментальных данных, касающихся возможной роли этого гена в трансформации и метастазировании опухолевых клеток, механизм его действия до конца неизвестен. Изучение последствий снижения экспрессии гена KISS1 позволит выяснить физиологическую роль продукта данного гена-мишени. Известно, что наряду с генетическими событиями, обуславливающими инактивацию клеточных генов, вследствие изменения последовательности ДНК, важную роль в процессе канцерогенеза играют также эпигенетические явления, не затрагивающие первичную структуру ДНК, но значительно изменяющие экспрессию генов. Одним из таких эпигенетических механизмов является абберантное гиперметилирование специфических последовательностей CpG-островков, расположенных в 5'-регуляторных районах многих генов, которое влечет за собой

подавление экспрессии гена. Практически половина молчащих генов супрессоров и генов репарации инактивируются в результате метилирования промоторного района. Метилирование ДНК является важнейшим механизмом инактивации генов супрессоров самых различных морфологических типах опухолей. Анализ наиболее часто метилируемых генов способствует созданию систем диагностических и прогностических маркеров.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучить особенности экспрессии гена-супрессора ЯЗК57 при метастазировании опухолевых клеток рака молочной железы в головной мозг для определения его прогностической значимости в развитии заболевания.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Исследовать уровень экспрессии гена Ю557 в клетках нормальной ткани, РМЖ, церебральных метастазах (МРМЖ) и определить взаимосвязь с клинико-морфологическими признаками первичной опухоли молочной железы.

2. Подтвердить измененный характер транскрипции гена £/557 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

3. Исследовать статус и частоту метилирования гена К18Б1 в клетках нормальной ткани, РМЖ и церебральных метастазах.

4. Провести анализ изменения пролиферации и миграции клеток рака молочной железы после нокдауна гена АЖХ^.

5. Провести сравнительный анализ уровня .К/Ж?/ в сыворотке больных РМЖ и церебральных метастазах.

6. Изучить прогностическое значение экспрессии гена-супрессора .К/Ж/ в ткани опухоли для продолжительности жизни пациентов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Впервые определена экспрессия кисспептина в церебральных метастазах РМЖ. Изучена взаимосвязь относительного содержания гена ,К/557 в ткани опухоли молочной железы с рецепторным статусом опухоли. Для выявления корреляции между экспрессией белка и уровнем мРНК, проведен сравнительный анализ содержания мРНК гена мишени методом количественного ПЦР. Отмечено соответствие между экспрессией мРНК гена ■К/557 и уровнем белка в клетках первичной опухоли РМЖ и церебральных метастазов.

Впервые показано, что в сыворотке крови больных с МРМЖ содержится более высокий уровень Я/557 по сравнению с уровнем этого показателя в сыворотке крови пациентов РМЖ. Для изучения функции гена £/55/ был произведен нокдаун гена в клетках рака молочной железы и впоследствии изучена пролиферативная и миграционная активность данных клеток.

Впервые, изучено прогностическое значение экспрессии KISS1 для продолжительности жизни пациентов с метастатическим РМЖ. Проведен анализ частоты метилирования гена в клетках нормальной ткани молочной железы, первичной опухоли и МРМЖ.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ: Полученные данные позволяют установить значимость гена-супрессора KJSS1 в процессе метастазирования опухолевых клеток рака молочной железы в головной мозг. Исследованный маркер может быть использован в практической онкологии для оценки риска метастазирования опухолевых клеток в отдалённые органы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Апробация диссертационной работы состоялась 26 марта 2013г. на совместной научной конференции лаборатории клинической иммунологии опухолей, лаборатории иммунологии гемопоэза, отделении опухолей молочных желез, отделении опухолей женской репродуктивной системы, отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН, лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН.

Материалы работы были представлены на Американском съезде патологоанатомов USCAP (США, 2010 г.), на Американском противораковом конгрессе ACS (США, 2011 г.), на XTV Российском онкологическом конгресссе (Москва, 2010 г.), на XV Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2011 г.).

ПУБЛИКАЦИИ: По материалам работы опубликовано 9 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 280 источников, из которых 20 отечественных и 260 зарубежных авторов. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 таблицами и 17 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящем исследовании использовано 47-образцов церебральных метастазов РМЖ (МРМЖ), 165-тканей-инвазивного протокового рака молочной железы (ИПР) и 46-тканей протоковой карциномы in situ (ПКИС) и 7-образцов метастазов РМЖ в регионарные лимфоузлы. В качестве контроля использовано 127- образцов морфологически нормальной ткани молочной железы, взятых от доноров, не имевших в анамнезе онкологических заболеваний. Всего было проанализировано 392 образца ткани. Все клинические образцы получены в клинике РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина в результате оперативных вмешательств. Описание общей группы больных приведено в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика клинических образцов пациентов.

Характеристики Кол-во образцов МРМЖ(%) 47 Кол-во образцов ИПР (%) 165 Кол-во образцов ПКИС(%) 46

Возраст

Среднее 53.7 (10.9) 51.6(11.80) 52.5 (10.8)

<35 2(5.3%) 9(5.45%) 4(8,8%)

35-55 24(51.1%) 102(61.8%) . 28(60.8%)

>55 21(43.6%) 54(32.7%) 14(30.4%)

Гистологические степени злокачественности

I 39(23.4%) 17(36.9%)

И 20(42.6%) 64(38.6%) 17(36.9%)

III 27(57.4%) 62(38%) 12(26.2%)

Распространенность Опухоли

Т1 50(30.3%) 24(52.2%)

Т2 41(87.2%) 87(52.8%) 17(37%)

ТЗ 4(8.6%) 20(12.1%) 4(8.7%)

Т4 2(4.2%) 8(4.8%) 1(2.1%)

Статус рецепторов эстрадиола (ЕЯ)

Положительный 18(38.3%) 55(43.7%) 26(56.5%)

Отрицательный 26(55.31%) 76(52.4%) 16(34.8%)

Не определен 3(6.4%) 4(3.9%) 4(8,7%)

Статус рецепторов прогестеронов (РЯ)

Положительный 13(27.6%) 77(46.7%) 16(34.8%)

Отрицательный 31(66.0%) 84(50.9%) 27(58.7%)

Не определен 3(6.4%) 4(2.4%) 3(6.5%)

Статус рецепторов НЕЮ

Положительный 17(36.2%) 72(43.6%) 22(47.8%)

Отрицательный 27(57.4%) 82(49.7%) 19(41.3%)

Не определен 3(6.4%) 11(7.4%) 5(10.9%)

Поражение лимфоузлов

N0 83(50.3%) 37(80.4%)

N1 14(29.8%) 65(39.4%) 8(17.4%)

N2 18(38.3%) 10(6.1%) 1(2.2%)

N3 15(31.9%) 7(4.24%)

В данной работе была использована клеточная линия РМЖ: МОА-МВ231ВИ, которая была любезно предоставлена проф. П. Стиг (Национальный Институт Здоровья, Вашингтон, США).

Технология множественно-тканных парафиновых блоков (ТМА)1 использовалась для создания ТМА реципиентного блока, состоящего из 20 образцов ИПР, 20 образцов МРМЖ и 14 образцов нормальной ткани молочной железы. С готового ТМА-блоха и дополнительных 201 блока (состоявших из 74- образцов ИПР, 46- образцов ПКИС и 27-образцов МРМЖ, 7- образцов МЛУ) были сделаны серийные гистологические срезы толщиной 4ц.

Иммуногистохимический анализ осуществляли с использованием проявочной тест-системы DAKO Envision®+kit (Dako Cytomation, США) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Первичные антитела KISS1, были любезно предоставлены разработчиком (проф. Д.Велш, Университет Алабамы, Бирменгем, США, разведение 1:200). Иммуноферментный анализ (ELISA) гена KISS1 в сыворотке крови определялся стандартным способом с использованием наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) Human Human KISSI Quantikine ELISA Kit (Fenix Pharmaceutical, США) на ИФА-анализаторе ANTHOS 2020 (Австрия).

Выделение ДНК из клеточного материалла и замороженных срезов тканей производили с помощью протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией. Архивные образцы опухолей, заключенные в парафиновые блоки, предварительно депарафинизировали с помощью ксилола и этанола.

Выделение РНК из клеточного материалла, замороженных срезов тканей и парафиновых образцов производили с использованием кита компании Qiagen (RNeasy* Mini kit, США) по протоколу производителя. Качество выделенной РНК контролировали с помощью анализатора (Agilent Technologies, США).

Для реакции обратной транскрипции использовали кит компании Bio-Rad (¡Script™ с DNA Synthesis Kit, США). Реакция проходила в объеме 20 мкл и включала 1 мкл фермента обратной транскриптазы (¡Script reverse transcriptase, США), 4 мкл 5-кратного раствора реакционной смеси и 15 мкл тотальной РНК.

Бисульфитная модификация ДНК проводилась при помощи набора (EZ DNA

Methylation ™ Kit, Zymo Research, США) по протоколу, оптимизированному для образцов

ДНК, полученных из архивных парафиновых срезов. Позитивный контроль для

бисульфитной реакции был получен от компании ZYMED (#D5011).

1

Бисульфитная 1ЩР представляет собой процесс амплификации бисульфитно-модифицированной ДНК. Праймеры для ПЦР были подобраны к промоторному району гена KISS1, соответсвующие модифицированной бисульфитом матрице (Yamashita S. 2006).

Электрофоретическое разделение ДНК проводили в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия при напряженности электрического поля 15В./см в течение двух часов.

ПЦР в режиме реального времени проводилось на приборе OPTICON 2 Detection System (Bio-Rad, США). Праймеры были подобраны с помощью программы Primer Design и проверены на специфичность. Уровень экспрессии гена KISS1 оценивался путем

вычисления соотношения относительных количеств копий кДНК гена-мишени и контрольного гена (GAPDH).

Нокдаун экспрессии гена KISS1 в клетках рака молочной железы (MDA-231BR) производили с помощью РНК-интерференции, основанной на лентивирусной трансдукции. Рекомбинантные лентивирусы MISSION® shRNA Lentiviral Transduction Particles- 310s1c1h-461s1c1 приобретены у фирмы "Sigma-Aldrich .Co" (США). Трансфекция клеток проводилась согласно протоколу компании производителя. Уровень KISS1 в клетках MDA-231BR был определен методами ОТ-ПЦР и количественной ПЦР через 12 дней после трансдукции лентивирусом, экспрессирующим shPHK против KISS1 либо контрольный shGFP.

Пролиферативную активность оценивали с помощью МТТ-теста. Контрольные (MDA-231BR) и генетически модифицированные клетки (MDA-231BR shKISSl) рака молочной железы окрашивали метилтиазолилдифенил-тетразолиум бромидом (Ml Г) (Roshe, США) по протоколу производителя. Оптическую плотность определяли спектрофотометрически при Х=570 нм с помощью сканирующего ридера Microelisa autoreader MR 580 (Dynatech Product, Germany).

Анализ миграционной активности контрольных (MDA-231BR) и генетически модифицированных клеток (MDA-231BR shKISSl) рака молочной железы производили по принципу метода Бойдена. В качестве хемоаттрактанта использовали ДМЕМ среду; 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС); экспериментальные среды, секретируемые астроцитами (АС) и клетками микроглии (MC). Предварительно, клетки микроглии и астроцитов окрашивали на анти-GFAP (Abeam, США) и анти-CDllb маркеры (BD Bioscience, США). Охарактеризованные клетки микроглии и астроцитов инкубировали с факторами роста в течение 7 дней для получения экпериментальных сред. Заполненную камеру инкубировали в течение 8 часов при температуре 37 ± 0,5 °С при 5 % СОг. Камеру открывали и клетки с верхней стороны мембраны удаляли с помощью Q-наконечника, а клетки, мигрировавшие через мембрану, подсчитывали под оптическим микроскопом Axiovert 200 (Leica, Германия).

Статистический анализ проводили с использованием программы "PRISM" (v 4.0, GraphPad Software, США). Достоверность различий в исследовании оценивали по методу ANOVA (Краскелу-Уолису), непарамегрическим критериям Манна-Уитни и Фишера, тесту хи-квадрат Пирсона в зависимости от характера распределения значенй выборки. Расчет выживаемости проводили методом Каплана-Мейера. Различия считались статистически достоверными при р<0,05 (95% точности).

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Анализ экспрессии белка и мРНК гена в клетках РМЖ и церебральных

матастазов (МРМЖ), определение взаимосвязи с клинико-морфологическими признаками первичной опухоли рака молочной железы

В результате проведенного нами иммуногистохимического исследования срезов ТМА-блока, была выявлена экспрессия в виде гомогенного окрашивания цитоплазмы

опухолевых клеток. Интенсивность реакции и процент антигенположительных клеток варьировал в различных опухолях и иногда в различных участках одной и той же опухоли (Рис. 1). В образцах инвазивного протокового рака молочной железы была обнаружена сильная интенсивность реакции - 3+. Интенсивность окраски в клетках церебральных метастазах варьировала от 0+(отсутствие реакции) до 2+ (умеренная интенсивность окраски).

л „- , . А «eSft , . " в , ■ ; : - С ■ . - " ' •. > • -у- ¡¡1 тят шфЩщ

"s ■ ' -• - * • - " ' - i . \ V •

Рисунок 1. Иммуногистохимическая реакция с антителами к KISS1. Ув.40х. А - Отсутствие экспрессии KISS1 клетками церебральных метастазов рака молочной железы. В - Слабая интенсивность реакции. С - Умеренная экспрессия KISS1 клетками церебральных метастазов рака молочной железы. D - Положительный контроль (инвазивный протоковый рак молочной железы);

Для оценки уровня экспрессии гена KISS1 в ТМА-срезах нами было использовано программное обеспечение ACIS. Результаты представлены в виде Brown IOD/ЮцМ2 (Рис. 2А). Используя, тест Краскелла-Уоллиса были обнаружены статистически значимые различия в экспрессии KISS1 среди образцов ИПР, церебральных метастазов РМЖ, нормальной ткани молочной железы и метастазов в регионарные лимфоузлы. Так, экспрессия KISS1 в ткани ИПР (64.67 ± 21.47) достоверно выше, чем в церебральных метастазах РМЖ (3.71 ±0.92, р<0.01) и МЛУ (1.72 ± 0.28, р <0.01). Однако, при сравнении экспрессии KISS1 в нормальной ткани молочной железы и образцах ИПР различие было статистически не достоверным (9.47 ± 2.45, р > 0.05). Для подтверждения результатов ТМА-анализа, мы провели иммуногистохимическое исследование дополнительных 145-образцов ИПР, 46-образцов ПКИС и 27-образцов церебральных метастазов РМЖ. В клетках ИПР сильную (3+) и умеренную интенсивность реакции (2+) наблюдали в 17.2 %

9

(25/145) и 34.5 % (50/145) случаев, отсутствие экспрессии белка наблюдали в 21.4 % исследованных случаев (31/145), слабую интенсивность реакции в -26.9 % (39/145). В клетках ПКИС сильная интенсивность реакции выявлена в 8.7 % (4/46), умеренная реакция в 30.4 % образцов (14/46), слабая окраска в -43.4% (20/46), отсутствие реакции в-17.5 % (8/46). В клетках МЛУ слабая окраска выявлена в -28.6 % (3/7) образцах, отсутствие реакции в- 71.4 % (4/7). В клетках церебральных метастазов рака молочной железы были обнаружены отсутствие реакции и слабая интенсивность окраски .К/Ж/ в -88.9% (24/27), умеренная интенсивность окраски и сильная реакция выявлена в 11.1 % (3/27) образцов. При статистической обработке результатов, с использованием критерия Фишера, показано, что экспрессия белка К1881 в клетках МРМЖ значительно ниже, чем в клетках первичных опухолей РМЖ (р<0.001, Рис. 2).

А

р<0.01

1.0*10 1.0*102-1.0«101-1.0x10° 1.0Х10-'-1.0x10-2-1.0x10

>А

»i» il.

ж Ai

In «f

p<0.01

V?

3? 100% H

ш

о -г 80% -

п

п а. 60% -1

ю

о ь 40% -

£ 20% -

о а. er 0% -

71.7

8.7%

3:; j

17.5

17.2%

Ц.5 ____

21.4

4.2%

70.1

71.4

HT

(n=113)

ПКИС ИПР МРМЖ МЛУ (n=46) (n=145) (n=27) (n=7)

S3X

□ 2X E1X

□ 0X

Рисунок 2. Экспрессия гена KISS1 в первичных опухолях РМЖ (ИПР, ПКИС), нормальной ткани молочной железы (HT), метастазах в головной мозг (МРМЖ) и регионарные лимфоузлы (МЛУ). А - Оценка уровня экспрессии гена KISS1 в ТМА-срезах с использованием программного обеспечения ACIS. Результаты представлены в виде Brown IOD/Юцш2. В - Оценка степени иммуногистохимического окрашивания полуколичественным способом по бальной шкале от 0 до 3 с помощью анализатора изображения «Leica Q550.

На следующем этапе нашей работы мы исследовали зависимость экспрессии гена .К/Ж/ от стадии РМЖ. К ранним стадиям рака молочной железы относятся стадии 1, 2А, 2В, и ЗА. Прогноз для жизни больных РМЖ на ранних стадиях заболевания существенно лучше, чем на поздних. К поздним стадиям рака молочной железы относятся стадии ЗВ, ЗС, и 4 стадия рака молочной железы, при которых обнаруживаются множественные регионарные и отдаленные метастазы, в том числе и церебральные метастазы. Нами обнаружена тенденция к снижению уровня экспрессии К/Ж/ при прогрессировании РМЖ. Так на поздних стадиях РМЖ в 80 % случаев обнаружена слабоположительная реакция на белок К7Ж7 (0+ или 1+), тогда как на ранних стадиях только в 40 % случаев снижена экспрессия гена-супрессора (Таблица 2).

Таблица 2. Зависимость экспрессии гена К/Ж7 от стадии рака молочной железы.

Экспрессия KiSSl Ранняя стадия Поздняя стадия р value

0+ или 1+ 40% (104/258) 80% (206/258) р<0.01

2+ или 3+ 60% (155/258) 20% (52/58) р<0.05

В дальнейшем была проанализирована зависимость уровня экспрессии Ш/ от рецепторного статуса опухоли (рис. 3). Выявлена достоверная положительная корреляция содержания Ш/ с уровнем РЯ (тест Спирмена= 0.28, р=0.01). При анализе зависимости К/Ж/ от показателей НЕЯ2/пеи и ЕЯ статистически достоверной корреляции не выявлено.

f=0 11 р=0.35 /=0.15j3=0.19 ' (=0.28^0.01

31 31 31

Рисунок 3. Анализ зависимости экспрессии гена KISS1 от рецепторного статуса рака молочной железы. А - Зависимость экспрессии KISS1 от уровня экспрессии HER2/neu. В -Зависимость экспрессии KISS] от уровня экспрессии рецептора ER. С - Прямая корреляционная зависимость экспрессии KISS J от уровня рецептора PR.

В настоящей работе проведен сравнительный анализ содержания мРНК гена КЕВ! методом ОТ-ПЦР в клетках церебральных метастазов и первичной опухоли РМЖ. В работе тотальная РНК была выделена из 102 архивных парафиновых срезов и 10 замороженных образцов: 5 образцов опухолевой ткани молочной железы и 5-МРМЖ. Для получения достоверных результатов при исследовании экспрессии генов крайне важно оценивать качество и количество выделенной РНК (Рис. 4).

5

5-3

К

'

5-2-irt

8. 11 С

2 О л

|-2

со -3 <2

ИПР

ИПР

R!N 1-1.9

ТО

МРМЖ

RIN 2-3

МРМЖ

5. 3

ее § 2

I 0

М -1

Е

5 -2

V) -3

S2 х

5—6.8

яВЕ

ИПР

МРМЖ

Рисунок 4. Анализ экспрессии мРНК гена KISS1 в клетках церебральных метастазов РМЖ (МРМЖ) и первичной опухоли РМЖ. Результаты представлены с помощью логорифмической шкалы с основанием 10. Статистический критерий Манна-Уитни использовался для сравнения различий между группами с RIN 1-1.9, RIN 2-3 и RIN 5-6.8 (pO.OOl, р<0.001 и р=0.0079, Рисунок 4А, В, С).

Автоматически рассчитывался интегральный уровень целостности РНК (RNA Integrity Number, RIN). Значения RIN варьировали от 1.1 до 3.7 (среднее значение = 2.2) для РНК, выделенной из парафиновых срезов тканей. Качество РНК выделенной из замороженных срезов было более высоким, значения RIN варьировали от 5.1 до 6.8 (среднее значение=6.2). Несмотря на низкое качество РНК, выделенной из парафиновых срезов тканей, результаты ПЦР в режиме реального времени показали, что уровень экспрессии гена KISSJ в клетках церебральных метастазов статистически достоверно ниже, чем в

клетках рака молочной железы (Рис. 4А (RIN 1-1.9, р<0.001), Рис. 4В (RIN 2-3, р<0.001)). В замороженных срезах тканей нам также удалось обнаружить достоверное снижение уровня экспрессии KISS1 в церебральных метастазах (Рис. 4С (RIN 5-6.8, р=0.0079)). При сравнении результатов иммуногистохимического анализа и ПЦР в режиме реального времени, нами отмечено соответствие между экспрессией мРНК гена KISS1 и уровнем белка в клетках первичной опухоли РМЖ и церебральных метастазов.

Анализ метилирования CpG-островков промотора гена KISS1 в клинических образцах РМЖ, МРМЖ и морфологически нормальной ткани молочной железы

Идентификация новых потенциальных генов-супрессоров, метилированных при РМЖ, может расширить панель молекулярно-диагностических маркеров злокачественных опухолей. Наиболее эффективными маркерами ранней диагностики является гиперметилирование промоторов некоторых генов супрессоров опухолевого роста. Следующей задачей нашего исследования являлось определение статуса метилирования CpG-островков гена KISS1 в церебральных метастазах, первичной опухоли РМЖ и морфологически нормальной ткани молочной железы. На первом этапе была выделена ДНК из парафиновых срезов тканей: 44 образцов РМЖ, 44 образцов МРМЖ и 5 образцов нормальной ткани молочной железы. Затем, полученную ДНК денатурировали, обрабатывали бисульфитом натрия и гидроксидом натрия, при этом происходит превращение остатков цитозина в урацил, тогда как метилированные остатки цитозина такому превращению не подвергаются. После бисульфитной конверсии, ДНК была амплифицирована в реакции ПЦР. Праймеры для ПЦР были подобраны к промоторному району гена KISS1, соответствующему модифицированной бисульфитом матрице. На Рис. 5 приведена фотография агарозного геля после разделения продуктов бисульфитной-ПЦР, где А- положительный контроль с универсальной метилированной ДНК (ZYMED, США), В-образцы рака молочной железы (7) и С- образцы церебральных метастазов (10). Из Рисунка 5А видно, что в положительном контроле в реакции бисульфитной-ПЦР образуется фрагмент длиной 150 пар оснований, нижний порог чувствительности метода определяется при внесении 0.02нг. ДНК, а верхний порог-2нг. ДНК. На следующем этапе исследования мы вносили в каждую лунку геля по 0.2 нг. ДНК, полученную в реакции бисульфитной-ПЦР из образцов РМЖ и МРМЖ. Из Рисунка 5В видно что, в 3-х образцах РМЖ (дор.2, 4, 5) - промотор гена KISS1 гиперметилирован, в одном образце (дор.7)-гипометилирован, и один образец (дор.1)-частично метилирован, отсутствие фрагментов -свидетельство нарушения баланса метилированных и неметилированных аллелей. Затем мы определили метилирование промотора гена KISS] в образцах МРМЖ (Рисунок 5 С).

Из Рис. 5С видно, что промотор гиперметилирован в 7 из 10 образцов (дор. 2, 3, 4, 6, 7, 9, 10), гипометилирование промотора в МРМЖ не выявлено. В дальнейшем, при изучении дополнительного количества образцов, нами обнаружен достаточно высокий уровень метилирования промотора гена К1851 в образцах РМЖ - 18 случаев из 44 (41%) и достоверно высокий в образцах церебральных метастазов РМЖ - 40 случаев из 44 (90. 9%), р < 0.01 (Рис. 6). В нормальной ткани молочной железы не выявлено метилирования промотора гена .ЮЖ/. Полученные результаты подтверждают значимую роль метилирования промотора гена -£/557 в процессе его инактивации.

Положительный контроль

5. ^

200п.н. —]

"1

100 п,н,

л X N О 1 о 3

о о. с в-

ы ^ 1

5: 5 3

№

150 п. н.

150П.Н.

праймер р 150П.Н.

3

12 3 43 678 9 10

__ _ 77^4 ||Г

МетнлнрОЕанне

праймер

—г?

Неметнлировамие

Рисунок 5. Анализ метилирования промоторной области гена .£/557 в клетках церебральных метастазов РМЖ. А-Определение чувствительности, бисульфитной-ПЦР на контрольных образцах (образец с универсальной метилированной ДНК (гУМЕО, США) - маркер молекулярного веса, положительный контроль (ДНК 2нг, ДНК 0.2нг, ДНК 0.02нг, ДНК 0.002нг) и отрицательный контроль; Оценка метилирования гена .¿0557 в тканях рака молочной железы (В, 7 образцов) и церебральных метастазах (С, 10 образцов).

Р<0.01

РМЖ МРМЖ

Рисунок 6. Сравнение частоты метилирования гена опухолевой супрессии KJSS1 в клетках церебральных метастазов и первичной опухоли РМЖ. Степень метилирования гена KISS1 определяли методом бисульфитной-ПЦР. Для анализа распределения изучаемых признаков использовали критерий согласия Колмагорова-Смирнова, р value< 0.01.

Анализ пролиферативной и миграционной активности клеток рака молочной железы после нокдауна гена-супрессора KISS1 РНК-интерференция-это процесс подавления экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК при помощи малых молекул РНК. В представленной работе мы использовали РНК-интерференцию с помощью лентивирусных конструкций, экспрессирующих короткие шпилечные РНК (shPHK) против KISS1. Для подтверждения специфичности нокдауна посредством shPHK, был проанализирован уровень мРНК гена KISSJ в контрольных клетках рака молочной железы экспрессирующих shPHK (MDA-231BR shOFP) и клеток MDA-231BR, трансдуцируемых shPHK против KISSI (MDA-231BR shKISSl). Результаты ОТ-ПЦР в реальном времени показали, что трансфекция клеток shPHK против KISS1 приводит к значительному (более 50%) снижению уровня мРНК гена-супрессора в клетках MDA-231BR (Рис. 7).

На следующем этапе исследования мы решили изучить, влияет ли нокдаун гена KISSI на пролиферативную активность клеток рака молочной железы. Зависимость скорости пролиферации контрольных клеток (MDA-231BR, MDA-231BR shGFP) и генетически модифицированных клеток (MDA-231BR shKISSl) рака молочной железы определяли с помощью колориметрического МТТ-теста. Оценку результатов МТТ-теста осуществляли с помощью вычисления коэффициента пролиферации (КП) по формуле: КП=ОПопыт/ ОПконтроль, где ОПопыт - это оптическая плотность экстракта красителя, поглощенного опухолевыми клетками в ходе МТТ-теста, ОПконтроль - это оптическая плотность

красителя, содержащегося после МТТ-теста в лунках с культуральной средой без клеток. В клетках со сниженной экспрессией гена К1£№1 (Ж)А-231В11 бЫСКЭ!) коэффициент пролиферации был значительно выше, чем в контрольных клетках (Рис. 8).

MDA-231BR ShGFP MDA-231SR SMK1SS1

Рисунок 7. Ингибирование экспрессии мРНК KISS1 в клетках MDA-231BR трансдуцированных shPHK против KISS1 в сравнении с контрольными клетками MDA-231BR shGFP (* р <0.01). Уровень KISS] был определен методом количественной ПЦР через 72 часа трансдукции лентивирусом, экспрессирующим shPHK против KISS1.

1.5 ,

1.0 .

o.s J

I-SMDA-231BR

р——; MDA-231BR shGFP в MDA-231BR shKISSI

День 1

День 2

Рисунок 8. Изменение коэффициента пролиферации (КП) клеток РМЖ в 1 -ий и 2-ой день после нокдауна гена ЮЖ/.

Миграционная активность опухолевых клеток является одним из признаков трансформированного фенотипа, так как опухолевые клетки способны мигрировать и проникать сквозь ткани, что, в конечном счете, определяет метастатические осложнения раковых заболеваний. Известно, что церебральные метастазы имеют гематогенное происхождение, а интерстициальный отдел головного мозга контролируется астроцитами и их плотный контакт вокруг сосудов мозга, как признается в настоящее время, является главной структурой ГЭБ. Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) является одним из главных иммуноцитохимических маркеров астроцитов. В качестве маркера астроцитов он широко применяется в диагностических целях и в экспериментальных работах при исследовании функций нервной системы в норме и при патологии. Для выявления клеток микроглии широко применяется маркер CD11B. В настоящей работе для характеристики клеток микроглии и астроцитов использовался иммунофлюоресцентный метод. Экспрессия белка GFAP выявлялась в виде гомогенного окрашивания цитоплазмы и мембраны астроцитов. Клетки микроглии экспрессировали на своей поверхности гликопротеин CD11В (Рис. 9).

Микроглня Астроциты

DÂPI, CD11B DAPi, GFAP

Рисунок 9. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток микроглии и астроцитов.

В дальнейшем эти клетки использовались для получения экспериментальных условий. В данном исследовании контрольные (МВА-231В11 вЬОРР) и генетически модифицированные клетки рака молочной железы (МБА-231ВК бЫЖЗ!) тестировали на способность осуществлять миграцию через поры мембран камер Бойдена. Как видно на Рис. 10, миграционная способность контрольных и генетически модифицированных клеток рака молочной железы отличается друг от друга в зависимости от того какой тип хемоаттрактанта был использован. Так, в среде ДМЕМ контрольные и генетически

модифицированные клетки не мигрировали через поры мембраны. При использовании в качестве хемоатграктанта 10% эмбриональной телячей сыворотки (10% ЭТС), миграция генетически модифицированных клеток была значительно ниже, чем контрольных клеток (14 относительно 330, pO.OOOl). При использовании в качестве хемоаттрактанта среды, секретируемой клетками микроглии (МС), миграционная активность генетически модифицированных клеток бьша также значительно меньше, чем контрольных клеток (117 относительно 170, р<0.001). В том же случае когда в качестве хемоаттрактанта использовали среду, секретируемую астроцитами, миграция генетически модифицированных клеток бьша значительно выше, чем контрольных клеток (50.14 относительно 23.22, р<0.05). Таким образом, полученные данные подтверждают, что нокдаун экспрессии гена KISS1 в клетках РМЖ (MDA-231BR) влияет на их миграционную способность в экспериментах in vitro.

О

Ё ц

о

ш

&

0) X s Q о

400

300

200

100

MDA-231BR shGFP MDA-231BRshKISS1

ДМЕМ 10%ЭТС МС AC

Рисунок 10. Анализ миграционной способности контрольных и генетически модифицированных клеток рака молочной железы при использовании различных хемоаттрактантов. В качестве хемоаттрактанта использовали экспериментальные среды; ДМЕМ, 10 % эмбриональную телячью сыворотку (10 % ЭТС), среды, секретируемые клетками микроглии (МС) и астроцитами (АС).

Клиническое значение экспрессии белка К1$$1 для прогрессии рака молочной железы

Далее мы исследовали уровень Я7Ж>7 в сыворотке больных РМЖ и МРМЖ с помощью иммуноферментного анализа. Данный метод позволяет проводить точную количественную оценку содержания исследуемого белка в биологических пробах. Достаточно информативным показателем в оценке прогноза заболевания считается определение уровня онкомаркеров и молекулярно-биологических факторов в сыворотке крови онкологических больных. Например, показано, что повышенный уровень УЕОБ-С в крови пациентов с немелкоклеточным раком легкого, меланомой кожи, папиллярной карциномой щитовидной железы, карциномой поджелудочной железы или раком пищевода коррелирует с наличием метастазов в лимфатических узлах. Исследователями выявлено высокое содержание антител к гену-супрессору р53 в сыворотке крови больных раком молочной железы, карциномой легкого и раком яичников. Однако содержание большинства генов-супрессоров в сыворотке больных раком молочной железы не изучено.

В нашем исследовании был обнаружен более высокий уровень .ИЖ/ (6.2±1.25 мюг/мл) в сыворотке крови больных РМЖ по сравнению с уровнем этого показателя в крови пациентов с МРМЖ (1,2±1.25 мкг/мл, соответственно, р<0.05, Рис. И). Учитывая важное значение ранней диагностики для своевременного лечения онкологических заболеваний, стоит обратить внимание на высокие значения К1851 в сыворотке крови у больных РМЖ на начальной стадии опухолевого процесса и значительное снижение уровня гена при наличии отдаленных метастазов.

12.5 10.01

! 7.5-

I 5.0 2.5

о.о-

а да

'дА-

РМЖ

МРМЖ

Рисунок 11. Анализ уровня ЮЖ/ в сыворотке больных РМЖ и МРМЖ.

Для определения прогностического значения экспрессии KISS1 с увеличением продолжительности жизни пациентов метастатическим РМЖ нами проведен однофакторный анализ. Экспрессия KISS1 в церебральных метастазах РМЖ была связана с увеличением продолжительности жизни больных (р=0.0096). Пациенты были разделены на две группы в зависимости от интенсивности иммуногистохимической реакции в образцах тканей метастатического РМЖ: KISS1+ группа с уровнем окраски от 1+ до 3+ и KISS1-группа с отсутствием окраски в исследуемых, образцах. Так, у KISS J + больных продолжительность жизни больных составляла 42.4± 4.6 месяцев (95% CI 32.4-52.5). У KISSI- больных продолжительность жизни больных составляла 27.0± 5.0 месяцев (95% CI, 15.5-38.5). График зависимости продолжительности жизни больных от экспрессии KISS1 представлен на Рис. 12.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

KISS1--KISS1 +

р=0.0096

1 к N=8

N=10

—г-

0 25 50 75

Месяцы после операции (мастэктомии)

■ I »

100 125 150

Рисунок 12. Продолжительность жизни больных метастатическим раком молочной железы в зависимости от экспрессии

выводы

1. Полученные данные свидетельствуют о достоверном снижении уровня экспрессии белка и мРНК гена-супрессора KISS1 в клетках церебральных метастазов по отношению к первичной опухоли рака молочной железы (РМЖ).

2. Выявлена положительная корреляция экспрессии гена KISSJ с положительным прогестероновым статусом опухоли с клинической стадией рака.

3. В сыворотке крови больных первичным РМЖ обнаружен более высокий уровень белка KISS1 (б.2±1.25 мкг/мл) по сравнению с уровнем этого показателя в крови пациентов с церебральными метастазами (1,2±1.25 мкг/мл, соответственно, р<0,05).

4. С помощью однофакторного анализа показана связь экспрессии гена KISS1 с увеличением продолжительности жизни больных.

5. Наибольшая частота абберантного метилирования промоторного региона гена KISS1 была обнаружена в клетках церебральных метастазов (90.9%) в сравнении с образцами первичной опухоли РМЖ (41%).

6. Методом РНК-интерференции проведен нокдаун гена-супрессора в клетках РМЖ (MDA-231BR). Специфичность метода оценена по снижению уровня мРНК и белка изучаемого гена.

7. Показано, что нокдаун гена KISS J в клетках РМЖ (MDA-231BR) влияет на их миграционную способность в экспериментах in vitro.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Каверина Н.В. Ретроспективный анаши экспрессии Е-кадхерина в клетках рака молочной железы, рака легких и метастазах головного мозга вызываемых ими / Каверина Н.В., Уласов И.В., Лесняк М., Барышников А.Ю., Кадагидзе З.Г. // XIII Российский онкологический конгресс. Материалы конгресса. Москва.-2009.-17-19 ноября.-С.393.

2. Kaverina N.V. Expression profile of matrix metalloproteinases.in primary and metastatic breast cancer / Tretiakova M., Kaverina N.V., Pytel, P., Kadagidze Z.G., Baryshnikov A.Y., Ulasov I.V., Lesniak M. // Laboratory Investigation.- Feb.2010.- V.90 (1S).-P.75A.

3. Kaverina N. Inhibition of autophagy has impact on viral replication / Ulasov I, Ahmed A, Thaci B, Kaverina N, Lesniak M. // American Society of Gene Therapy. Washington.- May 2010,- P.322.

4. Каверина H.B. Влияние метилирования промотора K3SS1 на подавление экспрессии гена в клетках рака молочной железы и метастазов в головном мозге / Каверина Н.В., Уласов И.В., Фаворская И.А., Зборовская И.Б., Барышников А.Ю., Кадагидзе З.Г. // Вестник РОНЦ имени Н.Н. Блохина РАМН.- 2011.- № 4.- С. 17-23.

5. Kaverina N. In situ В cell-mediated immune responses and tubulointerstitial inflammation in human lupus nephritis/ Chang A., Henderson S.G., Brandt D., Liu N., Guttikonda R., Hseih C., Kaverina N., Utset Т.О., Meehan S.M., Quigg R.J., Meffre E., Clark M.R. // J Immunol.- 2011.- V.3, №186.-P. 1849-60.

6. Kaverina N. Clinical significance of KISS1 protein expression for brain invasion and metastasis / Ulasov I.V., Kaverina N., Thaci В., Pytel P., Sattar H., Cao D., Hurst D.R., Welch D.R., Olopade O.I., Kadagidze Z.G., Lesniak M.S. // American Association for Cancer Research.Orlando.- 2011.-P.1439.

7. Kaverina N.V. Clinical significance of KISS 1 protein expression for brain invasion and metastasis / Ulasov IV, Kaverina N.V., Pytel P., Thaci В., Liu F., Hurst D.R., Welch D.R., Sattar H.A., Olopade O.I., Baryshnikov A.Y., Kadagidze Z.G., Lesniak M.S. // Cancer ACS.-2012.- V.8,№118.-P. 2096-105.

8. Kaverina N. Inhibition of MMP14 potentiates antiglioma effect of TMZ and ionizing radiation / Ulasov I.V., Auffinger В., Thaci В., Pytel P., Kaverina N., Liu F., Ahmed A., Lesniak M. // American Association for Cancer Research.Chicago.- 2012,- P.880.

9. Kaverina N. The differential expression of micro-RNA-200 superfamily in primary breast cancer and brain metastasis / McDemott R, Ulasov I, Kaverina N, Gabikian P, Lesniak M. //Neuro-Oncology.- 2012,- V.14 (Supp.l), № 6.- P. 2-3.

Подписано в печать 16.07.13. Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеШСору». Тираж 100 экз. Заказ № 441. Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24