Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Бесцитокиновая мобилизация стволовых гемопоэтических клеток у больных раком молочной железы

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Заболеваемость раком молочной железы (РМЖ) в России, как и в большинстве стран мира, продолжает расти. За период с 1980 по 1999пт==р показатели заболеваемости повысились почти на 70% - с 22,6 до 38,3 на 100£j^; тыс. населения. По данным на 1999 г. абсолютное число заболевших РМЖ в России увеличилось до 44,5 тыс. женщин, составив 19^lo от общего числа злокачественных новообразований. [ 1 ] ^

В последние годы у онкологических больных весьма

111 С rJl ^^ распространенным методом лечения стала высокодозная химиотерапия (ВХТ) с трансплантацией аутологичных периферических стволовых гемопоэтических клеток (ПСГК). Этот метод широко применяется как при онкогематологической патологии (лимфомы), так и при солидных опухолях. По данным ежегодных обобщенных отчетов Европейских трансплантационных центров (1999г.), из числа солидных опухолей высокодозная химиотерапия с аутотрансплантацией периферичкских стволовых гемопоэтических клеток наиболее часто используется при раке молочной железы. [16]

Здесь следует подчеркнуть два важных момента: результативность метода в сравнении с традиционно-применяемыми и причины, которые могут обусловливать в ряде случаев относительную неэффективность высокодозной химиотерапии с трансплантацией аутологичных ПСГК. Под относительной неэффективностью мы в данном случае понимаем отсутствие удлинения периода безрецидивной выживаемости (disease-free survival).

После проведения больным высокодозной химиотерапии с трансплантацией аутологичных ПСГК, без знания причин возникновения рецидивов рака молочной железы, фактически очень сложно оценивать и результативность данного метода лечения, даже в условиях проведения рандомизированных исследований.

Для трансплантации периферических стволовых клеток необходима заготовка цитоконцентрата, содержащего определенное количество CD34+ клеток, что обеспечивает успешное, стойкое и продолжительное восстановление гемопоэза после ВХТ. В норме количество циркулирующих стволовых клеток в периферической крови крайне низкое. Важнейшим этапом для аутотрансплантации ПСГК является их мобилизация. Существует несколько методов мобилизации стволовых гемопоэтических клеток: с использованием химиотерапии в комбинации с колониестимулирующими факторами роста или отдельно, а также с использованием только колониестимулирующих факторов роста. [9]

Как известно, даже в начальной стадии рака молочной железы болезнь не может считаться локальной, и микрометастазы обнаруживаются в костном мозге и периферической крови чувствительными иммуноцитологическими и/или иммуноцитофлуориметрическими методами с использованием специфичных для эпителиальных клеток моноклональных антител (МКА). Одной из причин прогрессирования заболевания (рецидивы, метастазы, развивающиеся у больных раком молочной железы спустя тот или иной период времени после высокодозной химиотерапии) может явиться контаминация опухолевыми клетками аутотрансплантата, который используется для восстановления гемопоэза после ВХТ.

В периферическом русле циркулируют и, возможно, мобилизуются вместе со стволовыми клетками и опухолевые клетки, которые при цитаферезе, без дополнительной очистки попадают в аутотрансплантат. Введение больным собственных живых опухолевых клеток в процессе проведения аутологичной трансплантации стволовых гемопоэтических клеток может являться одной из причин дальнейшего прогрессирования рака молочной железы. Также отмечено, что при применении колониестимулирующих факторов (КСФ) для мобилизации ПСГК, повышается вероятность контаминации опухолевыми клетками цитоконцентрата - мобилизация опухолевых клеток. [77] Подобные механизмы развития метастазов после высокодозной химиотерапии, мобилизации стволовых и опухолевых клеток широко обсуждаются в литературе [10,11] и, следовательно, поиск ответа на вопрос о получении материала для аутотрансплантации CD34+ клеток, без контаминации клетками рака молочной железы, является весьма актуальной для онкологии проблемой. Важное и, возможно, первостепенное значение, имеет решение данного вопроса у больных с распространенными формами рака молочной железы, то есть у тех пациенток, для которых проведение лечения, включающего высокодозную химиотерапию с трансплантацией аутологичных стволовых гемопоэтических клеток, может явиться методом выбора.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Оценка мобилизации периферических стволовых гемопоэтических клеток без применения колониестимулирующих факторов, и оценка уровня контаминации образцов периферической крови клетками рака молочной железы после проведения программных (неоадъювантных) режимов химиотерапии.

ЗАДАЧИ:

1. Показать возможность мобилизации периферических стволовых гемопоэтических клеток после программных режимов химиотерапии без применения колониестимулирующих факторов.

2. Определить наиболее оптимальное время сбора периферических стволовых гемопоэтических клеток, опираясь на количественное определение CD34+ клеток в периферической крови и динамику подъема уровня лейкоцитов после химиотерапии.

3. Исследовать динамику содержания опухолевых клеток в периферической крови больных распространенными формами рака молочной железы после неоадъювантной химиотерапии.

4. Определить оптимальные сроки сбора периферических стволовых гемопоэтических клеток с точки зрения контаминации лейкоконцентрата клетками опухоли.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Использование стандартных, программных режимов химиотерапии в качестве мобилизации периферических стволовых гемопоэтических клеток, без применения колониестимулирующих факторов, расширяет возможность проведения ВХТ с аутотрансплантацией у больных распространенными формами рака молочной железы. Соотношение степени контаминации периферической крови опухолевыми клетками и мобилизационного эффекта стандартных режимов химиотерапии, позволило определить оптимальные сроки сбора периферических стволовых гемопоэтических клеток - при максимальной концентрации стволовых клеток и минимальном содержании опухолевых клеток в циркуляции после химиотерапии. Оценка субпопуляций CD34+ клеток позволила выявить качественный состав периферических стволовых гемопоэтических клеток с точки зрения мобилизации в периферическую кровь наиболее ранних клеток предшественниц гемопоэза.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

В результате проведения работы установлена мобилизационная эффективность стандартных химиотерапевтических режимов без применения КСФ. Тем самым стандартное лечение может быть использовано как один из этапов ВХТ, в данном случае этап мобилизации стволовых клеток. Мобилизация стволовых клеток без применения КСФ ощутимо снизила себестоимость в целом дорогостоящего процесса ВХТ. Оценена динамика периферических стволовых гемопоэтических клеток, лейкоцитов и опухолевых клеток в периферической крови после проведения химиотерапии, что позволило определить оптимальное время сбора материала аутологичной трансплантации для поддержки кроветворения после высокодозной химиотерапии у больных распространенными формами рака молочной железы.

ВЫВОДЫ

1. Спокойное состояние кроветворения у больных раком молочной железы характеризуется широким диапазоном концентраций CD34+ клеток (0-5 на мкл периферической крови, медиана - 0,9). У 83% больных в периферическом русле присутствует не более 2 CD34+ кл/мкл периферической крови.

2. Средний процент CD34+ клеток среди лимфоцитов в спокойном состоянии кроветворения составляет 0.12%±0.05% (медиана - 0,03%). Средний процент CD34+ клеток среди лейкоцитов - 0.025±0.013% (медиана -0,004%)

3. Воздействие химиотерапевтических режимов (схема CAF и ее модификации) способно мобилизовывать CD34+ клетки в периферическую кровь без дополнительного введения ростовых кроветворных факторов.

4. Мобилизация ПСГК определяется по повышению уровней CD34+ клеток в периферическом русле: более 0.3% CD34+ лейкоцитов и 10 и более СБ34+клеток на мкл периферической крови.

5. Достаточные для трансплантации уровни ПСГК отмечаются у 16 больных раком молочной железы после однодневного введения химиотерапии по схеме CAF.

6. Высокие уровни CD34+ клеток могут сохраняться в течение нескольких дней (3-4 дня), что позволяет провести последовательные цитаферезы, сборы ПСГК и набрать материал для полноценной поддержки кроветворения на фоне высокодозной химиотерапии.

7. Пик уровней ПСГК приходится на 12 - 14 дни (включительно) от момента введения химиопрепаратов и совпадает с началом восстановления числа лейкоцитов крови (выход из надира).

8. На фоне введения химиопрепаратов по схеме CAF у больных раком молочной железы отмечена циркуляция в периферическом русле незначительного количества опухолевых клеток (KL-1+клеток, менее 10/млн лейкоцитов). Минимальное количество опухолевых или их отсутствие наблюдается в период с 12 по 14 дни после химиотерапии по схеме FAC. 9. Сроки с 12 по 14 день характеризуются минимальным количеством метатастатических опухолевых клеток или их отсутствием, что позволяет считать данный период оптимальным для сбора материала аутологичной трансплантации для поддержки кроветворения у больных раком молочной железы после стимуляции кроветворения химиотерапевтическими препаратами без дополнительного применения ростовых факторов.

4 «

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящее время у больных с распространенными формами рака молочной железы, с ожидаемым негативным прогнозом после стандартного лечения, все чаще обсуждается возможность использования высокодозной химиотерапии с аутологичной трансплантацией ПСГК или КМ. Рандомизированные исследования не подтвердили достоверной клинической значимости использования высокодозной химиотерапии при раке молочной железы различных стадий. Возобновление болезни у больных, получивших ВХТ также как и у больных в группе сравнения (не получавших ВХТ) заключалось в возникновении отдаленных гематогенных метастазов (кости, печень, легкие, гловной мозг). Если предполагать в качестве основного назначения ВХТ, эрадикацию всех опухолевых элементов в организме больного, в том числе и метастатических клеток, существующих на момент операции, то подобные результаты представляются трудно объяснимыми.

Вместе с тем существует и другая причина прогрессирования рака молочной железы после ВХТ. Дело в том, что в ходе представленных рандомизированных исследований в процессе трансплантации ПСГК больным после проведения ВХТ, не учитывается факт возможной контаминации трансплантируемого материала опухолевыми клетками. Соответственно, очистка трансплантируемого лейкоконцентрата от опухолевых клеток не проводилась. Этот факт, как одна из возможных причин прогрессирования, никак нельзя сбрасывать со счетов, так как даже у больных начальными стадиями рака молочной железы (ГИа), в большом проценте случаев (до 25%), циркулирующие опухолевые клетки обнаруживаются в периферической крови и/или костном мозге. Более того, целым рядом работ доказано, что примерно у 25% больных, у которых опухолевые клетки отсутствуют в периферической крови, их появление становится возможным после мобилизации ПСГК с использованием КСФ. Таким образом, можно предположить, что у значительной части больных раком молочной железы (до 50%, точные данные не известны), которые подверглись ВХТ с аутотрансплантацией ПСГК, в процессе этого лечебного мероприятия и проведения заместительной/восстановительной терапии стволовыми клетками, вводились также и опухолевые клетки. Вероятность того, что именно эти клетки явились источником возобновления болезни, крайне велика.

В последнее время ПСГК вытесняет КМ как источник гематологической поддержки для трансплантации после высокодозной химиотерапии. В результате трансплантации мобилизованных ПСГК пациентам с аплазией костного мозга восстановление гемопоэза наступает более быстро, чем при трансплантации костного мозга. Также процедура сбора ПСГК в отличие от сбора КМ не столь травматична, не требует общей анестезии и длительного пребывания пациента в стационаре, следовательно, уменьшая затраты.

Циркуляция стволовых клеток в периферической крови в норме (то есть при спокойном состоянии гемопоэза) незначительна.

Мобилизация ПСГК в периферическую кровь значительно улучшила эффективность их сбора, хотя механизмы, вовлеченные в процесс мобилизации, до конца не ясны. [84]

Чувствительными иммунологическими методами, в 60% - 80% аспиратов костного мозга и в 10% — 80% цитоконцентратов периферических стволовых гемопоэтических клеток обнаруживаются опухолевые клетки у больных IV стадией рака молочной железы. Микрометастазы, присутствующие в аспиратах костного мозга и цитоконцентратах ПСГК больных раком молочной железы могут повышать риск возникновения рецидива или дальнейшей генерализации процесса.

Возможно, контаминация цитоконцентрата ПСГК опухолевыми клетками, напрямую способствует возникновению рецидивов и дальнейшей диссеминации процесса у больных раком молочной железы после высокодозной химиотерапии. [80]

В своем исследовании Pedrazzoli с соавт. описали случай, когда у больной раком молочной железы выявлено дальнейшее распространение процесса вскоре после высокодозной химиотерапии. В материале для аутотрансплантации данной пациентки обнаруживались опухолевые клетки. [81]

В исследовании Sharp с соавт. в течение 10 — 28 месяцев наблюдения лишь одна больная осталась в живых, из 6-ти, которым трансплантирован материал, содержащий опухолевые клетки, тогда как из 8-и больных, получивших свободные от клеток рака молочной железы трансплантаты, выжило 7. [82]

ПСГК могут быть собраны в фазе восстановления гемопоэза после миелосупрессивной химиотерапии, после назначения колоние-стимулирующих факторов или после химиотерапии + КСФ.

Развитие метода высокодозной химиотерапии при раке молочной железы прошло ряд этапов. Первоначально, одним из подходов, явилась собственно высокодозная химиотерапия, с которой начиналось лечение. Впоследствии, ВХТ предшествовала так называемая индукционная химиотерапия, направленная на уменьшение массы первичной опухоли, которая, по сути, соответствует неоадьювантной химиотерапии. Ранее индукционная химиотерапия применялась в монорежиме, однако показано, что комбинация нескольких химиотерапевтических агентов более эффективна. На сегодняшний день для мобилизации ПСГК наиболее часто используется химиотерапия с последующим назначением колониестимулирующих факторов.

В процессе мобилизации ПСГК с использованием КСФ, опухолевые клетки также могут попадать в периферическое русло, а затем и в продукт цитафереза — материал для аутотрансплантации [77], что в свою очередь может привести, как отмечено выше, к рецидиву и дальнейшему распространению болезни.

Все вышесказаноое натолкнуло нас на мысль об использовании стандартных неоадьювантных режимов химиотерапии, применяемых при распространенных формах рака молочной железы (следует отметить, что данные больные являются потенциальными кандидатами на ВХТ) для мобилизации ПСГК, причем без применения колониестимулирующих факторов. Возможность мобилизации ПСГК без КСФ обсуждался в литературе и ранее.

В нашем исследовании мы оценили мобилизационную эффективность стандартных неоадьювантных режимов химиотерапии.

ПСГК могут быть собраны в процессе стандартного неоадьювантного лечения - больные получают адекватную противоопухолевую терапию без использования цитокинов, соответственно уменьшается риск мобилизации опухолевых клеток, не требуются затраты на дорогостоящие колониестимулирующие факторы.

Так же, как показали наши исследования, при химиотерапевтической мобилизации происходит выброс наиболее ранних клеток-предшественниц гемопоэза (истинных стволовых клеток), способных восстанавливать все ростки кроветворения. Можно сказать, что в ряде случаев, при относительно невысоком количестве стволовых клеток, их качественный состав указывает на возможность полноценного восстановления гемопоэза.

Феномен выброса наиболее ранних стволовых клеток под влиянием химиотерапевтической мобилизации, в сравнении с миелоидно-коммитированными стволовыми клетками, полученными после назначения колониестимулирующих факторов, возможно, объясняется тем, что рецептроы КСФ экспрессируются на достаточно поздних этапах гемопоэтической дифференцировки и отсутствуют в истинных стволовых клетках. Здесь же, затрагивая вопрос о качественном составе трансплантационного материала и, в общем, о стволовых клетках, следует отметить, что материал, получаемый при лейкаферезе, представляет собой коктейль, состоящий из стволовых клеток находящихся на разных стадиях дифференцировки и развития.

В нашем исследовании показано, что пик выброса ПСГК приходится на 12-14 дни после проведения химиотерапии и выражается в проценте CD34+ лейкоцитов и абсолютном количестве CD34+ клеток на мкл периферической крови. Средний процент CD34+ лейкоцитов составил 0,303±0,03, а абсолютное количество CD34+ клеток составило 8,19±1,98 на мкл периферической крови. При сравнении с данными литературы и опытом трансплантаций в РОНЦ, данные показатели могут быть достаточны для проведения адекватного сбора ПСГК для последующей трансплантации. Следует отметить, что мобилизирующий эффект может сохраняться в течение нескольких дней, что позволяет провести последовательные сборы ПСГК. Также отмечено, что мобилизирующий эффект присутствует и после проведения повторных курсов химиотерапии, хотя степень его выраженности сравнительно невелика.

При исследовании опухолевых клеток, в ряде случаев, нами выявлено их присутствие в периферической крови спустя 8-12 дней после проведения химиотерапии, однако признаков мобилизации опухолевых клеток, не было: их количество не нарастало, напротив, снижалось, они не появлялись у тех больных, у которых первоначально (до химиотерапии) их не было. Важно отметить тенденцию к уменьшению количества опухолевых клеток в периферической крови по мере возрастания срока от проведения химиотерапии, а также после проведения последующих курсов. Данная ситуация возможно свидетельствует об эффективности проводимой химиотерапии.

В качестве заключения можно сказать, что использование стандартных режимов неоадьювантной химиотерапии при распространенных формах рака молочной железы обеспечивает адекватный противоопухолевый эффект, позволяет мобилизовать необходимое количество стволовых клеток для подготовки трансплантационного материала, без дополнительных затрат на содержание пациента в клинике и медикаменты для него, а также уменьшает риск опухолевой контаминации цитоконцентрата и возникновения рецидива заболевания.