Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Оптимизация технологии получения жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения

На правах рукописи

Мостовская Елена Викторовна

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКОЙ ФОРМЫ ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ

14.00.36. - аллергология и иммунология 14.00.29. - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в филиале Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения Российской Федерации «Иммунопрепарат», г. Уфа

Научные руководители: кандидат медицинских наук, с.н.с.

Азамат Габдельахатович Исрафилов; доктор биологических наук, с.н.с. Андрей Германович Лютов

Официальные оппоненты:доктор биологических наук, профессор

Леонид Васильевич Козлов доктор медицинских наук, профессор Владимир Александрович Макаров

Ведущая организация - Государственный институт

стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича

Защита состоится «_»_2004 г. в_часов

на заседании диссертационного совета К 208.046.01. ГУ «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского Министерства здравоохранения РФ» по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, с.н.с.

Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ •

Актуальность, проблемы исследования. Среди широкого спектра иммунобиологических препаратов внутривенные иммуноглобулины (ВВИГ) занимают одно из ведущих мест. Рынок нормальных и специфических ВВИГ постоянно расширяется. В России зарегистрирован ряд. отечественных и зарубежных препаратов, различающихся величиной рН, составом стабилизаторов, ионной силой, стабильностью при* хранении, уровнем антител разной специфичности: иммуновенин, габриглобин, имбиоглобулин, сандоглобулин, интраглобин октагам, Ig Vena N I.V. и др.

Согласно рекомендациям- ВОЗ, препараты ВВИГ должны максимально сохранять интактную структуру молекулы, иметь длительный период полувыведения и близкое к естественному распределение субклассов IgG.

К основным показателям качества ВВИГ относится не толоко эффективность их применения, но и безопасность, обусловленная низкой антикомплементарной активностью (АКА), отсутствием или минимальным содержанием агрегатов, димеров и фрагментов, а также нежелательных примесей, таких как IgA, изогемагглютинины. Обсуждается вопрос о безопасности применения препаратов ВВИГ с повышенным содержанием IgE [Quinti I. et at., 1987].

Технология получения-иммуноглобулина для внутривенного введения должна обеспечивать не только соответствие препарата вышеуказанным требованиям, но и стабильность данных показателей при хранении и транспортировке [Анастасиев В В., 2000]. Лиофилизация позволяет продлить срок годности препарата и обеспечивает большую стабильность. Однако время приготовления раствора ВВИГ из лиофилизированной формы препарата может быть достаточно продолжительным. Жидкая форма является более экономичной, удобной для потребителя, однако она требует особого контроля стабильности препарата во время хранения и транспортировки.

Поскольку оценить стабильность качественных характеристик ВВИГ можно только в процессе хранения его в течение установленного срока годности, актуальным является использование при разработке препарата тестов, имитирующих условия хранения и транспортировки. В литературе описаны методы, воспроизводящие хранение препарата в течение двух лет и условия транспортирования {Hirao Y. et al., 1998] Их использование позволяет изучить влияние каждого параметра технологического процесса на стабильность лекарственной формы.

i>OC l«AUUOHAJSfc«Mjj "

Биклвотм I

СПтрС

0% i~J »wrioO

Сохранение параметров иммуноглобулина обеспечивается внесением в препарат определенных стабилизирующих агентов, которые требуют обязательного контроля за их содержанием в готовой лекарственной . форме. Однако, контроль отдельных стабилизирующих веществ затруднителен, в связи с отсутствием доступных специфических методов их определения.

Технологический процесс получения препарата должен обеспечивать максимальную сохранность всех субклассов поскольку антитела к различным видам возбудителей относятся к определенным подклассам что является особенно важным при производстве специфических иммуноглобулинов, например, против цитомегаловируса [Кострова О.М., Алешкин ВА, 1995, Змушко Е.И. ссоавт., 2001].

Для оценки сохранности антител в процессе производства ВВИГ Matejtschuk P. et al. (2002) рекомендуют определять титр антител к возбудителям наиболее распространенных среди населения инфекций, таких как цитомегаловирус, вирус герпеса или гриппа. Кроме того, экспертами ВОЗ рекомендуется оценивать уровень антител к HBsAg, что позволяет обеспечивать определенную вирусологическую безопасность ВВИГ.

Согласно требованиям Европейской Фармакопеи, технология получения ВВИГ должна содержать одну или несколько специальных стадий вирусной инактивации. Другой проблемой, существующей при производстве иммуноглобулина для внутривенного введения, является пирогенность отдельных серий препарата. Поэтому перед разработчиками возникает задача выбора способов инактивации вирусов и устранения присутствующего в препарате пирогена, не оказывающих негативного влияния на качественные характеристики готового препарата.

Таким образом, разработка технологии получения стабильной жидкой формы отечественного нативного препарата ВВИГ, максимально удовлетворяющего требованиям Европейской Фармакопеи, остается актуальной. Использование тестов на ускоренное старение и перемешивание позволяет проанализировать влияние каждого параметра производства препарата на его стабильность. На основании вышеизложенного была сформулирована цель и определены задачи настоящего исследования.

Цель исследования. Оптимизировать технологический процесс производства иммуноглобулина для внутривенного введения для получения жидкой формы нативного препарата и провести его сравнительный анализ с отечественными и зарубежными образцами.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать технологическую схему производства внутривенного иммуноглобулина для получения стабильной жидкой лекарственной формы, приготовить экспериментально-производственные серии препарата и представить необходимую нормативно-техническую документацию в Департамент здравоохранения МЗ РФ.

2. Определить оптимальную величину рН и содержание хлорида натрия раствора иммуноглобулина, обеспечивающие стабильность показателя антикомплементарной активности, молекулярных параметров и • титров антител препарата во время хранения.

3. Подобрать стабилизатор • физико-химических параметров иммуноглобулина и разработать метод качественного и количественного контроля содержания выбранного стабилизатора в готовой лекарственной форме.

4. Провести сравнительный анализ полученного внутривенного иммуноглобулина и ряда отечественных и зарубежных препаратов по основным качественным показателям: антикомплементарной активности и молекулярным параметрам.

5. Оценить содержание нежелательных примесей - IgA, IgE и гемагглютининов в препаратах внутривенных иммуноглобулинов.

6. Изучить распределение субклассов IgG и уровень антител к возбудителям бактериальных и вирусных инфекций в различных препаратах иммуноглобулина для внутривенного введения.

Научная новизна. Разработана технологическая схема производства стабильной жидкой формы препарата нативного иммуноглобулина для внутривенного введения иммуновенин-М.

Предложен оригинальный метод определения мальтозы в препаратах внутривенного иммуноглобулина, сочетающий неспецифическую количественную реакцию на редуцирующие вещества с хроматографическим разделением Сахаров.

Установлено, что падение титра антител к цитомегаловирусу после ускоренного старения корреляционно связано с возрастанием агрегации в препарате.

Выявлена корреляционная связь между уровнем титров анти-цитомегаловирусных антител и содержанием димеров в препаратах внутривенного иммуноглобулина.

Найдена корреляция между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.

Показана зависимость между величиной титра антител к тиреоглобулину и уровнем антител к цитомегаловирусу и вирусу герпеса 8-го типа.

Практическая значимость работы. Адаптированные методы определения изогемагглютининов, антител к HBs-антигену и оригинальный способ качественной идентификации и количественного определения мальтозы используются с 1.10.02 г. в цехе препаратов крови и ОБТК Уфимского филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» для стандартизации иммуноглобулина и внесены в нормативно-техническую документацию на препарат иммуновенин-М.

Проведен комплексный сравнительный анализ ряда отечественных и зарубежных препаратов внутривенных иммуноглобулинов, зарегистрированных в России, показавший преимущества того или иного препарата по содержанию гемагглютининов, содержанию антител к различным возбудителям и распределению субклассов Показано, что препарат иммуно-венин-М соответствует требованиям Европейской Фармакопеи.

Внедрение результатов исследования в практику.

Стабильная жидкая форма препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, получившего название «Иммуновенин-М», прошла контроль отдела биологического и технологического контроля, его экспериментально-производственный выпуск с 09.2002 г. начат цехом препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе.

Нормативно-техническая документация на препарат иммуновенин-М направлена для утверждения в Департамент здравоохранения РФ.

Модифицированный метод определения изогемагглютининов и адаптированный способ анализа анти-HBs антител для препаратов внутривенных иммуноглобулинов внесены в проект фармакопейной статьи предприятия на препарат иммуновенин-М.

Предложенный оригинальный метод определения содержания мальтозы включен в проект фармакопейной статьи предприятия на препарат иммуновенин-М, а также в фармакопейные статьи предприятия на препарат габриглобин-^ производства ЗАО «Иммуно-Гем», Челябинской областной станции переливания крови и Свердловской областной станции переливания крови.

Предложен метод расчета результатов реакции связывания комплемента при определении антикомплементарной активности иммуноглобулинов с использованием стандартных компьютерных

программ Excel и Statistika (StatSoft Inc., USA), который используется в цехе препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе и в лаборатории иммуноглобулинов ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизирована технологическая схема производства иммуноглобулина для внутривенного введения, позволяющая получать

• стабильную жидкую форму нативного препарата, который характеризуется:

- величиной рН 5,5;

- содержанием натрия хлорида менее 0,2 %;

- стабилизатором- мальтозой в концентрации 10 %. Технологическая схема производства включает:

- инкубацию полуфабриката иммуноглобулина с мальтозой при температуре 30 °С (для получения нормального внутривенного иммуноглобулина) или при температуре 37 °С (для производства специфического антицитомегаловирусного иммуноглобулина для внутривенного введения);

- стадии инактивации вирусов и депйрогенизации, не ухудшающие свойства препарата.

2. Сравнительный анализ отечественных и зарубежных препаратов продемонстрировал соответствие разработанного иммуноглобулина требованиям Европейской Фармакопеи. Иммуно-венин-М отличается высоким' содержанием мономерного иммуноглобулина G, низким уровнем IgA и гемагглютининов.

3. Обнаружена корреляция между содержанием антител к вирусам краснухи, Элштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и - Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (Москва, 2003) и научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).

Апробация проведена на заседании Ученого совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (научного отдела) филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе 10.12.2003 г. (протокол № 11) и на заседании секции Ученого совета «Медицинская биотехнология» ГУ «МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского МЗ РФ» 16.03.2004 г. (протокол № 2).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 137 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 36 отечественных и 147 иностранных работ. Текст иллюстрирован 20 таблицами и 19 рисунками.

Раздел исследований по получению экспериментально-производственных серий препарата иммуновенин-М выполнен в цехе препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе совместно с начальником цеха препаратов крови к.м н. Г. Б. Кудашевой и микробиологом И. А." Корниловой.

Раздел работы, посвященный исследованию титров антител к различным возбудителям в препаратах внутривенных иммуноглобулинов выполнен совместно с сотрудником цеха препаратов крови к б.н. В. В. Хабибуллиной.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения 64 экспериментальных и 6 производственных серий препарата внутривенного иммуноглобулина было использовано 600 л фильтрата «Б», образующегося при фракционировании ' плазмы спиртовым методом Кона.

В работе использованы ультрафильтрационное оборудование производства ГУП «Иммунопрепарат», фильтры УСФ ПО «Прогресс» (г. Кириши), мембраны «Ultipor» фирмы «Pall» (ФРГ), хроматографическое оборудование фирмы LKB (Швеция), спектрофотометр «Dynatech Mr 5000» (Швеция).

Были исследованы 25 серий препаратов внутривенных иммуноглобулинов: «Габриглобин» (Ивановская ОСПК - 3 серии); «Иммуновенин» (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммуно-препарат», Уфа - 5 серий); «Имбиоглобулин» (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «ИмБио», Нижний Новгород - 1 серия); «Ig Vena N.I.V.» («Farma-Biagini», Италия - 2 серии); «Октагам» («Окта-фарма», Швейцария - 4 серии); «Сандоглобулин» («Новартис», Швейцария - 1 серия); «Интраглобин» («Биотест Фарма», Германия -6 серий); «Цитотект» («Биотест Фарма», Германия - 1 серия).

Антикомплементарную активность (АКА) определяли в реакции связывания комплемента, согласно МУК 3.3.2.1063-01. Для постановки реакции использовано 2,5 л крови барана, 550 доз сухого комплемента и 30 мл гемолитической сыворотки.

Определение молекулярных параметров проводили методом гель-фильтрации.

В работе были использованы диагностические иммуно-ферментные тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск и ЗАО «Алкор Био», г. Санкт-Петербург.

Содержание анти-А и анти-В иммунных изогемагглютининов определяли модифицированным методом непрямой гемагглюти-нации; IgA и распределение субклассов IgG - методом радиальной' иммунодиффузии по Манчини.

Для определения содержания мальтозы в препаратах использовали количественный метод с реактивом Фелинга и хроматографическое разделение на бумаге.

Определение пирогенности проводили согласно МУК 4.1/4.2.588-96, с. 52, используя внутривенное введение иммуноглобулина в дозе 10,0 мл на 1 кг массы кролика. В работе использовали 24 кролика породы Шиншилла.

Исследование стабильности препарата проводили в испытательных тестах на перемешивание и ускоренное старение, являющихся аналогами условий транспортирования и хранения препарата в течение 2 лет, которые в дальнейшем' обозначались как «искусственное старение» препарата.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ «Excel 4.0» и «Statistica 5.7».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка технологии получения жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения

Для решения поставленных задач был произведен подбор оптимальных параметров технологического процесса получения внутривенного иммуноглобулина. Первым этапом исследования стал выбор значения рН препарата. С этой целью были приготовлены экспериментальные серии с различной величиной рН: 4,0; 5,0; 5,5; 6,2; 7,0.

Анализ молекулярных параметров экспериментальных образцов показал, что среди свежеприготовленных препаратов агрегаты отсутствовали, содержание димеров было менее 5 %, а мономеров - более 95 % в сериях с величиной рН 4,0; 5,0 и 5,5. Однако, после искусственного старения оптимальным оказался препарат с величиной рН 5,5, поскольку, после воспроизведения условий транспортировки в нем было отмечено минимальное содержание агрегатов и фрагментов, а после ускоренного старения -максимальное содержание мономерной фракции, по сравнению с другими исследуемыми образцами.

По способности спонтанно активировать систему комплемента все свежеприготовленные экспериментальные серии ВВИГ соответствовали требованиям Европейской Фармакопеи, при этом наиболее низкой АКА обладали препараты с величиной рН 4,0 и 5,5.

Молекулярные параметры и АКА являются показателями безопасности ВВИГ, а величина титров специфических антител и их стабильность являются показателями его эффективности. В препаратах ВВИГ нормируется содержание антител к альфастафило-лизину (не менее 2 МЕ/мл), что является показателем эффективности препарата против бактериальных возбудителей. В качестве тестовых антител для анализа противовирусной активности нами были выбраны антитела к цитомегаловирусу (ЦМВ), так как они являются одними из наиболее распространенных среди доноров плазмы, и их титр не связан с вакцинацией, в отличие от противокоревых антител.

Поэтому все приготовленные экспериментальные образцы ВВИГ были проанализированы на сохранность титров антител к цитомегаловирусу. Обнаружено, что наибольшей стабильностью титров антител к ЦМВ обладал препарат с величиной рН 5,5. После ускоренного старения снижение титра антител в нем составило всего 11,0 %, при падении его уровня на 63,15 % при рН 5,0; на 38,42 % - при рН 6,2; на 42,12 % - при рН 7,0. В препарате со значением рН 4,0, наоборот, наблюдалось значительное возрастание титра анти-ЦМВ антител после искусственного старения. Возможно, подобное повышение титра можно объяснить конформа-ционными изменениями структуры молекулы иммуноглобулина при кислом рН.

Таким образом, сравнение препаратов с различным значением рН выявило преимущества ВВИГ, формулированного при величине рН 5,5, как непосредственно после изготовления, так и после искусственного старения.

Другим фактором, влияющим на свойства ВВИГ, является концентрация хлорида натрия в препаратах. Содержание NaCI существенно сказывается на свойствах и переносимости ВВИГ [Stiller S. etal., 2001].

На втором этапе исследования для определения оптимальной концентрации NaCI были приготовлены экспериментальные серии с различным содержанием NaCI: 0; 0,3; 0,6; 0,72; 0,9 %. Изотоничнось раствора поддерживалась добавлением недостающего количества мальтозы, которая выполняла также роль стабилизатора. В ряде образцов дополнительно использовался глицин в концентрации 0,1 М. Кроме того, согласно рекомендациям Barandun S., Isliker H. (1986), была изучена возможность использования следовых

количеств пепсина (1:105 и 1:106) для предотвращения возрастания АКА, помутнения раствора и появления агрегатов в препарате иммуноглобулина.

Проведенный сравнительный анализ приготовленных экспериментальных серий ВВИГ показал, что наилучшими качественными характеристиками обладали препараты следующего состава:

- обработанный пепсином в дозе 1: 106 и содержащий в качестве

стабилизаторов 10 % мальтозы и 0,1 М глицина, без добавления NaCI (содержание димеров - 3,8 %, мономеров - 96,2 %, АКА-0 СН50/мгбелка);

- не обработанный пепсином и содержащий единственный стабилизатор - мальтозу в концентрации 10 %, без добавления NaCI (содержание димеров - 5,0 %, мономеров - 95,0 %, АКА-0,1 СН50/мгбелка).

Исследование титров анти-ЦМВ антител в анализируемых препаратах выявило их наименьшее изменение после ускоренного старения во ВВИГ, не подверженном пепсиновой обработке и не содержащем NaCI, стабилизированном мальтозой в концентрации 10 %. Падение титра антител к ЦМВ в нем составило 10,8 %.

Таким образом, анализ молекулярных параметров, АКА и сохранности антицитомегаловирусных антител после искусственного старения показал преимущества немодифицированного пепсином препарата иммуноглобулина, содержащего в качестве стабилизатора мальтозу в конечной концентрации 10 %, с минимальным содержанием натрия хлорида.

Для изучения эффективности различных стабилизаторов были приготовлены экспериментальные образцы иммуноглобулина, содержащие мальтозу, глицин, маннит, сорбит в различных соотношениях. Анализ молекулярных параметров, АКА и титров антиел к ЦМВ показал, что оптимальным является использование мальтозы в концентрации 10 %.

Для снижения АКА рядом авторов [Gehringer W., Selosse P., 1993, Mitra G. et al., 1995] рекомендовано выдерживать иммуноглобулин с мальтозой при величине рН 4,0 в течение различного времени, при разных концентрациях мальтозы и температурах. Было приготовлено несколько экспериментальных серий ВВИГ, которые инкубировали с мальтозой при температурах 4, 23, 30 и 37 °С. Установлено, что для приготовления нормального иммуноглобулина инкубацию необходимо проводить при температуре 30 °С, а для производства специфического антицитомегаловирусного иммуноглобулина можно рекомендовать инкубацию препарата с мальтозой при температуре 37 °С для лучшей сохранности антител к цитомегаловирусу.

На основании полученных экспериментальных данных была предложена технологическая схема производства жидкой стабильной формы мономерного иммуноглобулина для внутривенного введения,- предусматривающая, получение нормального и специфического иммуноглобулина против цитомегаловируса (рис. 1).

Технологический* процесс предусматривает специальную стадию инактивации вирусов, и этап устранения пирогена, которые, просты в исполнении, не требуют введения в препарат химических реагентов и их последующего удаления, а.также не оказывают негативного влияния на свойства иммуноглобулина.

Согласно требованиям: Европейской Фармакопеи, ВВИГ подлежат контролю на содержание всех веществ, добавленных в препарат, или остающихся в нем после технологической обработки. В результате проведенных исследований был разработан - оригинальный метод контроля содержания-мальтозы в лекарственной форме; основанный на сочетании неспецифической количественной реакции на редуцирующие вещества с хроматографическим разделением Сахаров.

В проект фармакопейной статьи предприятия на препарат иммуновенин-М были также внесены методы определения концентрации антител к HBsAg и изогемагтлютининов Содержание антител к HBsAg в нем составило 10,5+3,5 МЕ/г, титр изогемагглютининов: анти-А -1:2, анти-В -1:1.

Рисунок 1. Технологическая схема производства внутривенного иммуноглобулина:

1 - нормального;

2 - антицитомегаловирусного

Изучение качественных показателей и стабильности внутривенных иммуноглобулинов различного производства

Целью дальнейшего исследования являлось сравнение разработанного препарата иммуновенин-М с рядом отечественных и зарубежных иммуноглобулинов для внутривенного введения.

Анализ молекулярных параметров исследуемых препаратов показал, что нативные ВВИГ (октагам, Ig Vena N.I.V., имбиоглобулин, габриглобин, иммуновенин-М) отличались более высоким содержанием мономерной фракции и более низким содержанием димеров, чем препараты, подвергавшиеся в процессе производства ферментативной (сандоглобулин, иммуновенин) или химической (интра-глобин, цитотект) обработке.

Среди жидких препаратов максимальное содержание мономеров и минимальное - димеров отмечено в препарате Ig Vena. Иммуновенин-М стал вторым по содержанию мономеров, при этом содержание агрегатов и фрагментов в нем было минимальным среди нативных ВВИГ (рис. 2).

Рисунок 2. Молекулярные параметры препаратов нативного иммуноглобулина для внутривенного введения

Примечание. Препараты: 1 - Октагам, 2 - Ig Vena N.I.V., 3 - Имбиоглобулин, 4 - Габриглобин, 5 - Иммуновенин-М

Среди причин возникновения побочных реакций при инфузии ВВИГ необходимо отметить анафилаксию, которая может возникать у ^-дефицитных пациентов. Поэтому в ходе исследования было определено содержание ^ в анализируемых препаратах ВВИГ (табл. 1).

Таблица 1

Содержание IgA и IgE в препаратах внутривенных иммуноглобулинов

Препараты (число серий) IgA, мкг/мл IgE, МЕ/мл

Ig Vena (n=2) 7,7±3,6 31,06+0,55

Октагам (n=4) 91,3+3,5 70,0+38,8

Имбиоглобулин (n=1) 97,0 26,8

Иммуновенин (n=5) 173,0±15,3 27,2+0,6

Иммуновенин- М (п=3) 206,0+29,3 48,3+3,7

Сандоглобулин (п=1) 337,0 27,9

Габриглобин (п=3) 314,0+29,8 182,7+15,1

Интраглобин (п=6) 2111,0±125,8 54,2+20,7

Наиболее безопасным в отношении побочных реакций, обусловленных дефицитом IgA, может считаться препарат Ig Vena. Разработанный ВВИГ иммуновенин-М относится к группе препаратов с низким (менее 300 мкг/мл) содержанием IgA и может быть использован с незначительным риском для лечения lgA-дефицитных больных.

Существуют данные о том, что повышенное содержание во ВВИГ IgE может вызывать побочные реакции немедленного и замедленного типа [Quinti I. et al., 1987], поэтому во всех исследуемых препаратах был определен уровень IgE (табл. 1).

По содержанию IgE проанализированные препараты ВВИГ были условно разделены на три группы: с низким (25-45 МЕ/мл) -иммуновенин, Ig Vena N.I.V., имбиоглобулин, сандоглобулин; средним (45-100 МЕ/мл) - октагам, интраглобин, иммуновенин-М и высоким (более 100 МЕ/мл) - габриглобин уровнем IgE. Таким образом, препараты первых двух групп являются наиболее безопасными при лечении больных, склонных к аллергическим реакциям.

Далее все анализируемые образцы были исследованы на распределение субклассов IgG (табл. 2). Оно оказалось максимально близким к распределению в нормальной плазме в препаратах габриглобин, октагам, иммуновенин-М. Препараты сандоглобулин, Ig Vena, имбиоглобулин, цитотект и интраглобин

отличались пониженным содержанием lgG3 субкласса. В обработанных пепсином препаратах иммуновенин и сандоглобулин отмечалось пониженное содержание lgG2, что согласуется с данными Robert G. (1989) о том, что обработка пепсином приводит к снижению уровня субкласса lgG2.

Таблица 2

Распределение субклассов иммуноглобулина G в препаратах внутривенного иммуноглобулина

Препарат Субклассы IgG, %

lgG1 lgG2 igG3 igG4

Иммуновенин-М 62,9+1,8 26,1 +2,1 8,7 + 0,3 2,3 ±0,01

Иммуновенин 69,4 ± 2,3 18,8 + 1,9 9,6 ±1,2 2,2± 0,01

Габриглобин 63,2 + 1,6 26,5 ±2,3 8.1 ±0,5 2,2 ±0,01

Сандоглобулин 75,3 21,7 1,0 2,0

Цитотект 62,6 29,0 5,5 2,9

Ig Vena 63,5 + 1,9 32,1 +0,6 2,4± 1,3 2,0± 0,02

Октагам 62,5 + 3,5 28,2 ±3,5 7,0± 0,9 2,3 ±0,03

Интраглобин 61,7 + 2,1 30,1 ±1,9 5,5± 2,1 2,7 ±0,01

Имбиоглобулин 64,3 29,1 4,3 2,3

Плазма* 60,0 30,0 7,0 3,0

* - по В В Анастасиеву, 2000

Таким образом, анализ содержания IgA, IgE и распределения субклассов IgG показал, что разработанный препарат иммуновенин-М по данным показателям не уступает большинству исследованных внутривенных иммуноглобулинов

Эффективность препаратов ВВИГ определяется содержанием в них антител различной специфичности, поэтому во всех анализируемых препаратах были определены титры антител к 10 видам возбудителей. Кроме того, был определен уровень антител к денатурированной и неденатурированной ДНК человека и к тиреоглобулину, которые в дальнейшем обозначались как «аутоантитела».

Максимальные титры антител к большинству исследованных возбудителей наблюдались в препаратах Ig Vena N.I.V.,

габриглобин и октагам. Однако именно в этих ВВИГ был отмечен высокий уровень титров аутоантител. Разработанный препарат иммуновенин-М по содержанию антител к большинству проанализированных возбудителей уступал только трем вышеперечисленным препаратам. При этом уровень антител к денатурированной и неденатурированной ДНК человека и к тиреоглобулину в нем был низким. Обнаруженная зависимость между уровнем специфической активности и содержанием аутоантител в препаратах внутривенного иммуноглобулина может стать дополнительным критерием их качества, однако эти данные требуют дальнейшего углубленного изучения.

Иммуновенин-М отличался максимальным титром антител к вирусу простого герпеса среди всех проанализированных внутривенных иммуноглобулинов По содержанию антител к ЦМВ он-уступал только габриглобину и имбиоглобулину (рис. 3).

Рисунок 3. Титры антител к вирусам семейства

Herpesviridae в препаратах внутривенного иммуноглобулина

Примечание. Препараты 1 - Интраглобин, 2 - Октагам, 3 — Ig Vena, 4 - Имбиоглобулин, 5 - Сандоглобулин, 6 - Габриглобин, 7 - Иммуновенин, 8 - Иммуновенин-М

В ходе анализа полученных данных была обнаружена сильная корреляционная связь (коэффициент корреляции от 0,7 до 1,0) между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина. Вероятно, одна из коррелирующих инфекций может стать тестовой, и по титру антител к ней можно будет судить о величине титров антител к другим коррелирующим инфекциям. Это позволит назначать препараты ВВИГ не только по узким показаниям, для лечения конкретной инфекции, но и для терапии смешанных инфекций.

Таким образом, проведенный сравнительный анализ девяти отечественных и зарубежных внутривенных иммуноглобулинов показал, что препарат иммуновенин-М, приготовленный по разработанной технологической схеме, не уступал большинству исследованных образцов по основным показателям качества - антикомплементарной активности, молекулярным параметрам, а также по своей специфической активности

Выводы

1. Оптимизирована технологическая схема производства иммуноглобулина для внутривенного введения, позволяющая получать жидкую стабильную форму препарата с высоким содержанием . мономерного IgG. Производственный процесс включает стадии уменьшения антикомплементарной активности, инактивации вирусов и удаления пирогена.

2. Определены оптимальные значения величины рН и концентрации хлорида натрия, обеспечивающие стабильность препарата иммуноглобулина для внутривенного введения по антикомплементарной активности, молекулярным параметрам и содержанию антител различной специфичности.

3. Подобран стабилизатор (мальтоза) и условия его внесения в препарат, предложен оригинальный метод контроля мальтозы в растворе иммуноглобулина, сочетающий хроматографическое разделение Сахаров и неспецифическую количественную реакцию на редуцирующие вещества.

4. Проведенный сравнительный анализ отечественных и зарубежных препаратов продемонстрировал соответствие разработанного иммуноглобулина требованиям Европейской Фармакопеи. Полученный препарат обладал минимальным содержанием агрегатов и фрагментов среди исследованных жидких форм внутривенных иммуноглобулинов и низкой антикомплементарной активностью, составившей (0,3±0,2) СН50/мг белка.

5. По уровню нежелательных примесей (IgA, IgE, гемагглюти-нинов) исследованные препараты внутривенного иммуноглобулина были условно разделены на три группы, характеризующиеся низким, средним или высоким их содержанием. Количество данных примесей в препарате иммуновенин-М было незначительным.

6. Полученный препарат после - искусственного старения и воспроизведения условий транспортировки был наиболее стабильным среди исследованных жидких форм внутривенных иммуноглобулинов по содержанию антител различной специфичности. Распределение субклассов IgG в препарате иммуновенин-М было близким к их распределению в нормальной плазме крови.

7. Выявлена сильная корреляционная связь (коэффициент корреляции >0,7; Р<0,05) между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Алсынбаев М.М., Исрафилов А.Г., Мостовская Е.В. Стабилизаторы и осмолярность препаратов внутривенных иммуноглобулинов. Необходимость оценки конечной лекарственной формы при назначении внутривенных иммуноглобулинов // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - Москва. - 2003. -№5.-С. 9-16.

2. Исрафилов А.Г., Бакиева И.Г., Трофимов В.А., Мостовская Е.В., Кудашева Г.Б. Влияние ультрафильтрации на содержание нежелательных примесей и антиаллергическую активность внутривенных иммуноглобулинов // Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофарма-кологии: Сборник трудов. - Москва. - 2002. - Т. 2. - С. 625.

3. Исрафилов А.Г., Лютов А.Г., Корнилова И.А., Мостовская Е.В. Предварительная подготовка полуфабриката для получения внутривенного иммуноглобулина // Актуальные вопросы прикладной биохимии и биотехнологии: Материалы конференции биохимиков Урала и Западной Сибири. - Уфа. - 1998. -С. 182-184.

4. Исрафилов А.Г., Мостовская Е.В., Алсынбаев М.М., Кудашева Г.Б., Кулагин В.Ф., Хабибуллина В.В. Сравнение качественных показателей препаратов внутривенного иммуноглобулина, отличающихся составом и способом получения // Медицинская иммунология. - Санкт-Петербург. - 2002. - Т. 4. -С. 361-362.

5. Лютов А.Г., Алешкин В.А., Кудашева Г.Б., Исрафилов А.Г., Мостовская Е.В., Корнилова И.А. Антикомплементарная активность иммуноглобулинов // Человек и лекарство: IV Российский национальный конгресс. - Москва. -1997. - С. 329.

6. Лютов А.Г., Евченко Т.А., Алешкин В.А., Исрафилов А.Г., Корнилова И.А., Кудашева Г.Б., Мостовская Е.В., Соломатин В.В. Возможность получения мономерного иммуноглобулина для внутривенного введения // Человек и лекарство: V Российский национальный конгресс. - Москва. -1998. - С. 504.

7. Лютов А.Г., Кудашева Г.Б., Алешкин В.А., Исрафилов А.Г., Мос-товская Е.В., Корнилова И.А. Внутривенные иммуноглобулины для иммунотерапии // Человек и лекарство: IV Российский национальный конгресс. - Москва. -1997. - С. 273.

8. Мостовская Е.В., Алсынбаев М.М., Исрафилов А.Г. Зависимость молекулярных параметров внутривенного препарата иммуноглобулина Иммуновенин-М от содержания в нем мальтозы // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке:

Материалы Всероссийской научной конференции. - Пермь. -2003.-С. 114-116.

9. Мостовская Е.В., Исрафилов А.Г., Алсынбаев М.М. Анти-А, анти-В гемагглютинины в препаратах внутривенных иммуно-глобулинов//Там же. - С. 116-119.

10. Мостовская Е.В., Исрафилов А.Г., Кудашева Г.Б., Алсынбаев М.М., Кулагин В.Ф., Хабибуллина В.В. Сравнение препаратов внутривенных иммуноглобулинов с различным значением рН // Медицинская иммунология. - Санкт-Петербург. -2002.-Т. 4.-С. 368-369.

11. Мостовская Е.В., Исрафилов А.Г., Кудашева Г.Б., Трофимов В.А Влияние температуры инкубации с мальтозой на свойства внутривенного иммуноглобулина // Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии».- Уфа. - 2004. - С. 169-171.

12. Мостовская Е.В., Исрафилов А.Г., Лютов А.Г., Алсынбаев М.М. Сравнительный анализ качественных характеристик внутривенных иммуноглобулинов // Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения: Сборник материалов научно-практической конференции. - М. - 2003. - С. 12-13.

13. Мостовская Е.В., Исрафилов А.Г., Трофимов ВА Модифицированный метод определения гемагглютининов в препаратах внутривенных иммуноглобулинов // Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии». - Уфа. - 2004. - С. 164-165.

14. Мостовская Е.В., Исрафилов А.Г., Трофимов В.А., Куда-шева Э.Ю., Корнилова ИА Титры антител к различным возбудителям и аутоантигенам в препаратах внутривенного иммуноглобулина // Там же. - С. 141 -144.

15. Мостовская Е.В., Исрафилов А.Г., Трофимов В.А, Муллагу-лова М.Н. Методика определения мальтозы во внутривенном иммуноглобулине//Там же. - С. 166-168.

Соискатель ученой степени кандидата биологических наук

Е.В. Мостовская

Мостовская Елена Викторовна

Оптимизация технологии получения жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ответственный за выпуск Р.К. Каримова

Подписано в печать 16.04.04 г. Бум. офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Arial Cyr». Отп. на ризографе. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ 516

РИО ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, филиал «Иммунопрепарат» 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105, тел: (3472)213-214

Актуальность проблемы исследования. Среди широкого спектра иммунобиологических препаратов внутривенные иммуноглобулины занимают одно из ведущих мест. Препараты иммуноглобулинов являются высокоэффективным, безопасным и широко используемым средством лечения и профилактики многих инфекционных заболеваний [1].

Рынок препаратов нормальных и специфических ВВИТ постоянно расширяется. В России зарегистрирован ряд отечественных и зарубежных препаратов, большинство из которых получено ферментативной или химической модификацией — иммуноглобулин для внутривенного введения (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «ИмБио», Нижний Новгород), иммуновенин (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат», Уфа), сандоглобулин (Novartis, Швейцария), интраглобин (Biotest, ФРГ) и др. К числу нативных ВВИТ, зарегистрированных в России, относятся октагам (Octapharma AG, Австрия), Ig Vena N I.V. (Farma-Biagini, Италия), Gamimune N (США), габриглобин (ОСПК, Иваново), имбиоглобулин (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «ИмБио», Нижний Новгород).

Согласно рекомендациям ВОЗ, препараты ВВИТ должны максимально сохранять интактную структуру молекулы, иметь длительный полупериод полувыведения и близкое к естественному распределение субклассов IgG [117]. Нативные ВВИТ наиболее полно удовлетворяют данным требованиям, поскольку, в отличие от модифицированных, обладают более высокой биологической и функциональной активностью как Fe-, так и Fab-фрагментов молекул и более продолжительным периодом полувыведения из организма.

Препараты иммуноглобулина для внутривенного введения различаются величиной pH, составом стабилизаторов, ионной силой, стабильностью при хранении, уровнем антител разной специфичности.

К основным показателям качества ВВИТ относится не только эффективность их применения, но и безопасность, обусловленная низкой АКА, отсутствием или минимальным содержанием агрегатов, димеров и фрагментов, а также нежелательных примесей, таких как ^А, изогемагглютинины. Обсуждается вопрос о безопасности применения препаратов ВВИТ с повышенным содержанием 1&Е [141].

Технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения должна обеспечивать не только соответствие препарата вышеуказанным требованиям, но и стабильность данных показателей при хранении и транспортировке. Лиофилизация позволяет продлить срок годности препарата и обеспечивает большую стабильность. Однако время приготовления раствора ВВИТ из лиофилизированной формы может быть достаточно продолжительным [47]. Кроме того, антикомплементарная активность препаратов может резко повышаться после сублимационного ^ высушивания [6]. Жидкая форма является более экономичной, удобной для потребителя, однако она требует особого контроля стабильности препарата во время хранения и транспортировки.

Поскольку оценить стабильность качественных характеристик ВВИТ можно только в процессе хранения его в течение установленного срока годности, актуальным является использование при разработке препарата специальных ускоренных тестов, имитирующих условия хранения и транспортировки. В литературе описаны методы, воспроизводящие хранение препарата в течение двух лет [9] и условия транспортирования [94]. Их использование позволяет изучить влияние каждого параметра технологического процесса на стабильность лекарственной формы.

Сохранение параметров иммуноглобулина обеспечивается внесением в препарат определенных стабилизирующих агентов, которые требуют обязательного контроля за их содержанием в готовой лекарственной форме. Однако, контроль отдельных стабилизирующих веществ затруднителен в связи с отсутствием доступных специфических методов их определения.

Процесс изготовления ВВИГ нередко сопровождается потерей или снижением содержания отдельных подклассов [48]. Технологический процесс получения препарата должен обеспечивать максимальную сохранность всех субклассов поскольку антитела к различным видам возбудителей относятся к определенным субклассам что является особенно важным при производстве специфических иммуноглобулинов, например, против цитомегаловируса [73].

Для оценки сохранности антител в процессе производства ВВИГ Р. Ма1е^зсЬик е1 а1. (2002) рекомендуют определять титр антител к возбудителям наиболее распространенных среди населения инфекций, таких как цитомегаловирус, вирус герпеса или гриппа [115].

Кроме того, рекомендуется оценивать уровень антител к НВзА§, что позволяет обеспечивать определенную вирусологическую безопасность ВВИГ. Экспертами ВОЗ рекомендовано ограничить нижний предел содержания антител к НВбА§ величиной 0,1 МЕ/мл, с целью инактивации возможно присутствующих вирусных частиц гепатита В [15]. Определение титра антител к HBsAg до настоящего времени не внесено в отечественную ФС на иммуноглобулин для внутривенного введения.

Согласно требованиям Европейской Фармакопеи, технология получения ВВИГ должна содержать одну или несколько специальных стадий вирусной инактивации. Другой проблемой, существующей при производстве иммуноглобулина для внутривенного введения, является пирогенность отдельных серий препарата. Поэтому перед разработчиками возникает задача выбора способов инактивации вирусов и устранения присутствующего в препарате пирогена, не оказывающих негативного влияния на качественные характеристики готового препарата.

Таким образом, разработка технологии получения стабильной жидкой формы отечественного нативного препарата ВВИГ, максимально удовлетворяющего требованиям Европейской Фармакопеи, остается актуальной. Использование тестов на ускоренное старение и перемешивание позволяет проанализировать влияние каждого параметра производства препарата на его стабильность. На основании вышеизложенного была сформулирована цель и определены задачи настоящего исследования.

Цель исследования. Оптимизировать технологический процесс производства иммуноглобулина для внутривенного введения для получения жидкой формы нативного препарата и провести его сравнительный анализ с отечественными и зарубежными образцами.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать технологическую схему производства внутривенного иммуноглобулина для получения стабильной жидкой лекарственной формы, приготовить экспериментально-производственные серии препарата и представить необходимую нормативно-техническую документацию в Департамент здравоохранения МЗ РФ.

2. Определить оптимальную величину рН и содержание хлорида натрия раствора иммуноглобулина, обеспечивающие стабильность показателя антикомплементарной активности, молекулярных параметров и титров антител препарата во время хранения.

3. Подобрать стабилизатор физико-химических параметров иммуноглобулина и разработать метод качественного и количественного контроля содержания выбранного стабилизатора в готовой лекарственной форме.

4. Провести сравнительный анализ полученного внутривенного иммуноглобулина и ряда отечественных и зарубежных препаратов по основным качественным показателям: антикомплементарной активности и молекулярным параметрам.

5. Оценить содержание нежелательных примесей - ^Е и гемагглютининов в препаратах внутривенных иммуноглобулинов.

6. Изучить распределение субклассов и уровень антител к возбудителям бактериальных и вирусных инфекций в различных препаратах иммуноглобулина для внутривенного введения.

Научная новизна. Разработана технологическая схема производства стабильной жидкой формы препарата нативного иммуноглобулина для внутривенного введения иммуновенин-М.

Предложен оригинальный метод определения мальтозы в препаратах внутривенного иммуноглобулина, сочетающий неспецифическую количественную реакцию на редуцирующие вещества с хроматографическим разделением Сахаров.

Установлено, что падение титра антител к цитомегаловирусу после ускоренного старения корреляционно связано с возрастанием агрегации в препарате.

Выявлена корреляционная связь между уровнем титров антицитомегаловирусных антител и содержанием димеров в препаратах внутривенного иммуноглобулина.

Найдена корреляция между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.

Показана зависимость между величиной титра антител к тиреоглобулину и уровнем антител к цитомегаловирусу и вирусу герпеса 8-го типа.

Практическая значимость работы. Адаптированные методы определения изогемагглютининов, антител к HBs-антигену и оригинальный способ качественной идентификации и количественного определения мальтозы используются с 1.10.02 г. в цехе препаратов крови и ОБТК Уфимского филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» для стандартизации иммуноглобулина и внесены в нормативно-техническую документацию на препарат иммуновенин-М.

Проведен комплексный сравнительный анализ ряда отечественных и зарубежных препаратов внутривенных иммуноглобулинов, зарегистрированных в России, показавший преимущества того или иного препарата по содержанию IgA, IgE, гемагглютининов, содержанию антител к различным возбудителям и распределению субклассов IgG. Показано, что препарат иммуновенин-М соответствует требованиям Европейской Фармакопеи.

Внедрение результатов исследования в практику. Стабильная жидкая форма препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, получившего название «Иммуновенин-М», прошла контроль отдела биологического и технологического контроля, его экспериментально-производственный выпуск с 09.2002 г. начат цехом препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе.

Нормативно-техническая документация на препарат иммуновенин-М направлена для утверждения в Департамент здравоохранения РФ.

Модифицированный метод определения изогемагглютининов и адаптированный способ анализа анти-HBs антител для препаратов внутривенных иммуноглобулинов внесены в проект фармакопейной статьи предприятия на препарат иммуновенин-М.

Предложенный оригинальный метод определения содержания мальтозы включен в проект фармакопейной статьи предприятия на препарат иммунове'нин-М, а также в фармакопейные статьи предприятия на препарат габриглобин-IgG производства ЗАО «Иммуно-Гем», Челябинской областной станции переливания крови и Свердловской областной станции переливания крови.

Предложен метод расчета результатов реакции связывания комплемента при определении антикомплементарной активности иммуноглобулинов с использованием стандартных компьютерных программ Excel и Statistika (StatSoft Inc., USA), который используется в цехе препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе и в лаборатории иммуноглобулинов ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизирована технологическая схема производства иммуноглобулина для внутривенного введения, позволяющая получать стабильную жидкую форму нативного препарата, который характеризуется:

- величиной рН 5,5;

- содержанием натрия хлорида менее 0,2 %;

- стабилизатором - мальтозой в концентрации 10 %. Технологическая схема производства включает:

- инкубацию полуфабриката иммуноглобулина с мальтозой при 30 °С (для получения нормального внутривенного иммуноглобулина) или при 37 °С (для производства специфического антицитомегаловирусного иммуноглобулина для внутривенного введения);

- стадии инактивации вирусов и депирогенизации, не ухудшающие свойства препарата.

2. Сравнительный анализ отечественных и зарубежных препаратов продемонстрировал соответствие разработанного иммуноглобулина требованиям Европейской Фармакопеи. Иммуновенин-М отличается высоким содержанием мономерного иммуноглобулина G, низким уровнем IgA и гемагглютининов.

3. Обнаружена корреляция между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (Москва, 2003) и научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).

Апробация проведена на заседании Ученого совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (научного отдела) филиала ФГУП

НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе 10.12.2003 г. (протокол № 11) и на заседании секции Ученого совета «Медицинская биотехнология» ГУ «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ» 16.03.2004 г. (протокол № 2).

Раздел исследований по получению экспериментально-производственных серий препарата иммуновенин-М выполнен в цехе препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе совместно с начальником цеха препаратов крови к.м.н. Г.Б. Кудашевой и микробиологом И.А. Корниловой.

Раздел работы, посвященный исследованию тиров антител к различным возбудителям в препаратах внутривенных иммуноглобулинов выполнен совместно с сотрудником цеха препаратов крови к.б.н. В.В. Хабибуллиной.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

116 Выводы

1. Оптимизирована технологическая схема производства иммуноглобулина для внутривенного введения, позволяющая получить жидкую стабильную форму препарата с высоким содержанием мономерного Производственный процесс включает стадии уменьшения антикомплементарной активности, инактивации вирусов и удаления пирогена.

2. Определены оптимальные значения величины рН и концентрации хлорида натрия, обеспечивающие стабильность препарата иммуноглобулина для внутривенного введения по антикомплементарной активности, молекулярным параметрам и содержанию антител различной специфичности.

3. Подобран стабилизатор (мальтоза) и условия его внесения в препарат, предложен оригинальный метод контроля мальтозы в растворе иммуноглобулина, сочетающий хроматографическое разделение Сахаров и неспецифическую количественную реакцию на редуцирующие вещества.

4. Проведенный сравнительный анализ отечественных и зарубежных препаратов продемонстрировал соответствие разработанного иммуноглобулина требованиям Европейской Фармакопеи. Полученный препарат обладал минимальным содержанием агрегатов и фрагментов среди исследованных жидких форм внутривенных иммуноглобулинов и низкой антикомплементарной активностью, составившей (0,3 ± 0,2) СН50/мг белка.

5. По уровню нежелательных примесей (1§А, 1§Е, гемагглютининов) исследованные препараты внутривенного иммуноглобулина были условно разделены на три группы, характеризующиеся низким, средним или высоким их содержанием. Количество данных примесей в препарате иммуновенин-М было незначительным.

6. Полученный препарат после искусственного старения и воспроизведения условий транспортировки был наиболее стабильным среди исследованных жидких форм внутривенных иммуноглобулинов по содержанию антител различной специфичности. Распределение субклассов IgG в препарате иммуновенин-М было близким к их распределению в нормальной плазме крови.

7. Выявлена сильная корреляционная связь (коэффициент корреляции >0,7; Р<0,05) между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Препараты иммуноглобулинов находят широкое применение для лечения больных, страдающих врожденными и приобретенными иммунодефицитами, гипогаммаглобулинемий, тяжелыми формами бактериально-токсических и вирусных инфекций, послеоперационными осложнениями, сопровождающимися бактериемией и септическим состоянием. В настоящее время на Российском рынке существует ряд отечественных и зарубежных ВВИТ, которые различаются технологиями производства (нативные и модифицированные), формой выпуска (жидкие и лиофилизированные), стадиями вирусной инактивации и депирогенизации. Вследствие различия технологических процессов получения данные препараты имеют различный уровень биологической и функциональной активности.

На основании многочисленных исследований безопасности и эффективности применения ВВИТ были выработаны общие требования к технологии получения и качественным характеристикам немодифицированной формы ВВИТ, которые наиболее полно отражены в Европейской Фармакопее [9].

К сожалению, в настоящее время отечественные препараты ВВИГ уступают зарубежным по следующим критериям: соответствие требованиям Европейской Фармакопеи; наличие специальной стадии инактивации вирусов; обеспечение контроля большинства компонентов, входящих в конечный состав препарата.

Поэтому проблема разработки технологии получения ВВИГ, обеспечивающей при высокой лечебной эффективности препарата его максимальную толерантность при внутривенном введении, остается актуальной.

На качество ВВИГ оказывают влияние технологические особенности его получения: величина рН препарата [43, 87, 152, 154], его ионная сила [79, 136], состав стабилизаторов и способы их внесения в препарат [7], наличие специальных стадий инактивации вирусов и депирогенизации. Поэтому при разработке технологии получения стабильной жидкой формы ИГ для внутривенного введения мы обратили особое внимание именно на эти моменты.

Поскольку значение рН препаратов ВВИГ оказывает существенное влияние на АКА, молекулярные параметры, Рс-функции, а также на стабильность [116, 143, 152, 153], первым этапом исследования стал выбор оптимального значения рН препарата. С этой целью были приготовлены экспериментальные серии ВВИГ с различной величиной рН: 4,0; 5,0; 5,5; 6,2; 7,0 и проанализированы в тестах на искусственное старение.

Анализ молекулярных параметров приготовленных ВВИГ показал, что среди свежеприготовленных образцов агрегаты отсутствовали, содержание димеров было менее 5 %, а мономеров - более 95 % в препаратах с величиной рН 4,0; 5,0 и 5,5. При этом минимальное содержание димеров и максимальное - мономеров было отмечено в препарате с величиной рН 4,0. Однако в испытательных тестах на искусственное старение оптимальным оказался препарат с величиной рН 5,5, поскольку после воспроизведения условий транспортировки в нем было отмечено минимальное содержание агрегатов и фрагментов, а после ускоренного старения - максимальное содержание мономерной фракции, по сравнению с другими исследуемыми образцами.

По способности спонтанно активировать систему комплемента все свежеприготовленные экспериментальные серии соответствовали требованиям Европейской Фармакопеи, при этом наиболее низкой АКА обладали препараты с величиной рН 4,0 и 5,5. После ускоренного старения препарат со значением рН 7,0 стал обладать значительной АКА - более 2 СН50/мг белка, при норме не более 1 СН50/мг. Следовательно, при хранении данный препарат склонен к спонтанному увеличению АКА выше допустимого предела. 1.Р.МсСие е1 а1. (1986) и 8.Вагапёип е1 а1. (1962) также сообщают об образовании агрегатов в ИГ с физиологическим значением рН, которое, по их мнению, может стать причиной спонтанной активации комплемента [45, 116].

При разработке технологии получения нормального ВВИТ нас интересовала возможность использования данной технологии и для производства специфического антицитомегаловирусного иммуноглобулина, поэтому все приготовленные экспериментальные серии ВВИТ были проанализированы на сохранность антител к цитомегаловирусу в процессе искусственного старения. Было обнаружено, что наибольшей стабильностью титров АТ к ЦМВ обладал препарат с величиной рН 5,5. После ускоренного старения снижение титра АТ в нем составило всего 11,0 %, при падении его уровня на 63,2 % при величине рН 5,0; на 38,4 % - при величине рН 6,2 и на 42,1 % - при величине рН 7,0. В препарате со значением рН 4,0, наоборот, наблюдалось значительное повышение титра анти-ЦМВ АТ после искусственного старения. Возможно, подобное повышение титра анти-ЦМВ АТ можно объяснить определенными конформационными измененниями структуры молекулы ИГ при кислом рН. Подобное явление описано С.ЗсИгетег е1 а1. (1998) [154], которые связывали появление ложно-положительных реакций на наличие АТ к вирусу гепатита С в препарате gamimune N с величиной рН 4,25 с наблюдаемыми гидрофобными конформационными изменениями (усилением гидрофобности).

Таким образом, сравнительный анализ препаратов с различным значением рН выявил преимущества ВВИТ, формулированного при величине рН 5,5, как по стабильности базовых показателей качества - АКА и молекулярных параметров, гарантирующей его безопасность, так и специфической активности - титров антицитомегаловирусных антител, обеспечивающей эффективность препарата.

В связи с необходимостью определения возможного расширения диапазона рН при производстве ВВИТ по данной схеме, были приготовлены экспериментальные серии препарата со значениями рН от 5,1 до 6,1 с шагом 0,2 единицы.

Все приготовленные серии соответствовали требованиям Европейской Фармакопеи по уровню АКА как до, так и после искусственного старения. По распределению молекулярных параметров в исходных и подвергнутых тесту на перемешивание препаратах также не наблюдалось особого отличия.

После ускоренного старения в препаратах с величиной рН 5,1 и 6,1 было отмечено возрастание агрегации. Кроме того, уровень фрагментации в образце со значением рН 5,1 был максимальным. В связи с этим диапазон допустимых значений рН при производстве ВВИТ по данной схеме был ограничен величинами 5,3 и 5,9.

Другим фактором, влияющим на свойства ВВИТ, является концентрация хлорида натрия в препарате. Содержание NaCl существенно сказывается на переносимости ВВИТ [19, 163]. Еще в 1949 г. Oncley et al. выяснили, что хлорид натрия является причиной агрегации, мутности, понижения титров АТ в препаратах внутривенного иммуноглобулина. Ионная сила влияет и на степень взаимодействия антитела с антигеном [79]. В то же время, проблема влияния концентрации натрия хлорида на качественные характеристики ВВИТ мало изучена.

Для определения оптимальной концентрации NaCl были приготовлены экспериментальные серии ВВИТ с различным его содержанием: 0; 0,3; 0,6; 0,72; 0,9. Изотоничнось раствора поддерживалась добавлением недостающего количества мальтозы, которая одновременно выполняла роль стабилизатора.

В качестве стабилизатора также использовался глицин в концентрации 0,1 М, поскольку добавление в препарат 0,1 М глицина в сочетании с 10 % мальтозы способствует увеличению прозрачности раствора и препятствует образованию преципитатов при хранении и в тесте на термостабильность [112].

При производстве ВВИТ существует серьезная проблема самопроизвольного возрастания АКА препаратов при хранении. Поэтому, согласно рекомендациям S. Barandun, Н. Isliker (1986), была проанализирована возможность использования следовых количеств пепсина для предотвращения помутнения раствора, возрастания АКА, появления агрегатов, увеличения содержания димеров во внутривенном иммуноглобулине [45]. Пепсин добавлялся в препарат в дозах 1:105 и 1:106.

Проведенный сравнительные анализ экспериментальных серий ВВИТ показал, что наилучшими качественными характеристиками обладали препараты следующего состава:

- обработанный пепсином в дозе 1:106 и содержащий в качестве стабилизаторов 10 % мальтозы и 0,1 М глицина, без добавления NaCl (содержание димеров -3,8 %, мономеров - 96,2 %, АКА - 0 СН50/мг белка);

- не обработанный пепсином и содержащий единственный стабилизатор - мальтозу в конечной концентрации 10 %, без добавления NaCl (содержание димеров - 5,0 %, мономеров - 95,0 %, АКА - 0,1 СН50/мг белка).

Исследование титров анти-ЦМВ AT в анализируемых препаратах выявило их наименьшее изменение после искусственного старения во ВВИТ, не подверженном пепсиновой обработке и не содержащем NaCl, стабилизированном мальтозой в концентрации 10 %. Падение титра AT против ЦМВ после ускоренного старения составило в нем 10,8 %, при его падении на 41,3 % в препарате, обработанном пепсином в дозе 1:106 и содержащем в качестве стабилизаторов 10 % мальтозы и 0,1 М глицина, без добавления NaCl.

Таким образом, анализ молекулярных параметров, АКА и сохранности антицитомегаловирусных AT после искусственного старения показал преимущества немодифицированного пепсином препарата ИГ, ф содержащего в качестве стабилизатора мальтозу в концентрации 10 %, с минимальным содержанием натрия хлорида.

Во ВВИТ, подверженных пепсиновой обработке, стабильность титра анти-ЦМВ антител наилучшим образом поддерживалась добавлением ИаС1 в концентрации 0,72 %. При этом снижение титра составило 13,5 % при дозе пепсина 1:105 и 14,6 % при дозе пепсина 1:106. Однако, препарат, обработанный пепсином в дозе 1:106, отличался более низкой АКА и более высоким содержанием мономерной фракции. Поэтому, как один из вариантов производства специфического антицитомегаловирусного ИГ, можно рекомендовать обработку полуфабриката пепсином в дозе 1:106 в присутствие 2 % мальтозы с последующим добавлением натрия хлорида до концентрации 0,72 %.

В ходе анализа обнаружилась сильная корреляционная связь между * содержанием димеров и титром АТ к ЦМВ в свежеприготовленных обработанных пепсином препаратах (ц=0,847±0,019; п=5; Р<0,05). Следовательно, можно предположить, что повышение титра анти-ЦМВ АТ в данных препаратах ВВИТ связано с возрастанием содержания в них димеров. Полученные результаты подтверждаются данными Т.Ь. УаББПеу е1 а1. (1995), показавшими, что обогащение ВВИТ димерами приводит к возрастанию антительной активности [174].

Далее была исследована возможность использования различных стабилизаторов при производстве внутривенного иммуноглобулина. Итогом анализа молекулярных параметров, АКА и титров АТ к ЦМВ в препаратах, содержащих различные стабилизаторы, стало подтверждение того, что оптимальным является использование мальтозы в концентрации 10 % в качестве единственного стабилизатора без добавления других стабилизирующих агентов (пепсина, глицина, маннита, сорбита).

По данным многих исследователей, внесение в препарат мальтозы в концентрации 10 % способствует снижению антикомплементарной активности. Обработка препаратов мальтозой осуществляется в разных ф условиях: при различных температурах, концентрациях мальтозы, времени инкубации [76, 112, 124, 125].

В связи с этим были проанализированы различные способы обработки препарата мальтозой. Результатом данного анализа стал вывод о том, что при производстве препарата нормального ВВИТ с величиной рН 5,5, стабилизированного мальтозой в концентрации 10 %, инкубацию следует проводить при температуре 30 °С (рисунок 12-1). Если же данная технология будет использована для производства специфического антицитомегаловирусного ИГ для внутривенного введения, то инкубацию препарата с мальтозой необходимо проводить при температуре 37 °С для лучшей сохранности титров АТ к цитомегаловирусу (рисунок 12-2).

Согласно Европейской Фармакопее 2000 г. в технологический процесс производства ВВИТ должна быть включена хотя бы одна стадия ^ вирусной инактивации. Инкубация препарата при кислом значении рН для инактивации вирусов получила широкое распространение. Этот способ прост и не требует внесения в препарат химических реагентов и последующего их удаления. Наиболее жестким режимом обработки ИГ при кислом значении рН является его выдерживание в течение 21 суток при температуре 27 °С.

Нами была проанализирована возможность использования данного метода инактивации вирусов для разрабатываемого препарата ВВИТ. Поскольку сравнительный анализ препаратов, полученных из одного полуфабриката с использованием и без использования данной стадии вирусной инактивации не выявил существенных различий их качественных характеристик, в технологическую схему получения ВВИТ была включена стадия инактивации вирусов путем выдерживания полуфабриката после добавления в него мальтозы в течение 21 дня при температуре 27 °С.

При масштабировании разработанной технологии в условиях производства возникла проблема пирогенности некоторых из приготовленных серий ВВИГ при полном их соответствии требованиям ф ФСП по молекулярным параметрам, АКА и другим показателям качества.

Существуют литературные данные о том, что выстаивание препаратов в течение нескольких месяцев приводит к разрушению небактериального пирогена, что во многих случаях позволяет использовать их в дальнейшем [34]. Анализ изменения уровня пирогена в изначально пирогенных сериях ВВИГ при их выстаивании в холодильнике при температуре 2-8 °С в течение 12 суток показал, что содержание пирогена в препарате достигало допустимого уровня через 6 суток после начала выстаивания и не возрастало в дальнейшем. Данный способ очень прост и не требует введения в препарат химических реагентов и их последующего удаления, а также не оказывает негативного влияния на свойства препарата.

Таким образом, была разработана технология получения стабильной жидкой формы препарата ВВИГ, позволяющая полностью отказаться от ^ использования пепсина. Препарат содержит единственный стабилизатор мальтозу в концентрации 10 %. Инкубация с мальтозой проводится при температуре 30 °С (при производстве нормального ВВИГ) или при 37 °С (при производстве специфического антицитомегаловирусного ВВИГ).

Завершающим этапом получения препарата перед стерилизующей фильтрацией и розливом является выдерживание его при температуре 2-8 °С в течение недели с целью депирогенизации.

В связи с тезисом об обязательной идентификации всех веществ, добавленных в препарат, или остающихся в нем после технологической обработки [9] возникла необходимость внесения в проект ФСП качественного и количественного методов контроля содержания мальтозы в готовом препарате.

На сегодняшний день для специфического определения концентрации мальтозы существуют только два метода: ферментативный, с использованием тест-систем с иммобилизованным ферментом мальтазой, которые выпускаются только зарубежными производителями [105] и достаточно дороги, и хроматографический, который требует наличия специального оборудования, что не позволяет использовать его повсеместно. Поэтому был разработан метод контроля содержания мальтозы в препарате, основанный на сочетании неспецифической количественной реакции на редуцирующие вещества с хроматографическим разделением Сахаров.

В проект ФСП на препарат иммуновенин-М, помимо метода контроля за содержанием мальтозы, были внесены методы определения концентрации антител к HBsAg и изогемагглютининов.

Далее был произведен комплексный сравнительный анализ препарата иммуновенин-М и 8-ми ВВИТ различного производства: интраглобин, октагам, Ig Vena N.I.V., цитотект, имбиоглобулин, сандоглобулин, габриглобин, иммуновенин. Технология получения оказывает существенное влияние на качественные характеристики внутривенного иммуноглобулина.

Анализ молекулярных параметров выявил преимущества нативных препаратов над модифицированными. По содержанию мономеров препарат иммуновенин, отличающийся их максимальным содержанием (85,4 %) среди исследованных модифицированных ВВИТ, уступал октагаму, в котором содержание мономерной фракции было минимальным среди нативных ВВИТ (89,8 %). Кроме того, модифицированные препараты отличались повышенным содержанием димеров, которое, по данным W.K. Bleeker et al. (2000), может быть причиной побочных реакций [52]. Также было выдвинуто предположение о том, что именно наличие стадии сольвент-детергентной обработки в технологии получения ВВИТ октагам ухудшает его качественные характеристики.

По уровню АКА все проанализированные препараты ВВИТ соответствовали требованиям Европейской Фармакопеи.

Титры гемагглютининов в проанализированных сериях ВВИТ, зарегистрированных в РФ, а также в препарате иммуновенин-М были минимальны, намного ниже критического уровня 1:32 [9]. Следовательно, данные препараты могут быть использованы без риска возникновения гемолитических реакций, опосредованных анти-А или анти-В -антителами.

Одной из причин возникновения побочных реакций при инфузии ВВИТ является анафилаксия, которая может возникать у IgA-дефицитных пациентов. Поэтому в ходе исследования было определено содержание IgA в анализируемых препаратах ВВИТ. На основании полученных данных, препараты были условно разделены на 4 группы: со следовым (до 10 мкг/мл) - Ig Vena; с низким (менее 300 мкг/мл) - октагам, имбиоглобулин, иммуновенин, иммуновенин-М; со средним (300-350 мкг/мл) - габриглобин, сандоглобулин; с высоким (до 2500-5000 мкг/мл) - интраглобин и цитотект, содержанием IgA. Таким образом, ВВИТ Ig Vena является наиболее безопасным для IgA-дефицитных больных.

Разработанный ВВИТ иммуновенин-М относится к группе препаратов с низким содержанием IgA, и может быть использован с незначительным риском для лечения больных с дефицитом IgA.

Существуют сообщения о том, что обогащение ВВИТ IgE может вызывать побочные реакции немедленного и замедленного типа [141]. Поэтому во всех исследуемых ВВИТ был определен уровень IgE.

По содержанию IgE проанализированные препараты ВВИТ были условно разделены на три группы: с низким (25-45 МЕ/мл) иммуновенин, Ig Vena N.I.V., имбиоглобулин, сандоглобулин; средним (45100 МЕ/мл) - октагам, иммуновенин-М и высоким (более 100 МЕ/мл) -габриглобин уровнем IgE. Таким образом, препараты первых двух групп наиболее безопасны при лечении больных, склонных к аллергическим реакциям.

При производстве ВВИГ необходимо стремиться к тому, чтобы содержание подклассов IgG в препарате было аналогично их распределению в плазме крови. Использование различных технологий при получении ВВИГ, нередко сопровождается потерей или снижением содержания отдельных подклассов IgG [48]. Поэтому все анализируемые препараты ВВИГ были исследованы на распределение субклассов IgG.

Оно оказалось максимально близким к распределению в нормальной плазме в препаратах габриглобин, октагам, иммуновенин-М. Внутривенные иммуноглобулины сандоглобулин, Ig Vena, имбиоглобулин, цитотект и интраглобин отличались пониженным содержанием IgG3 субкласса. Исследователями W.Stephan, Н. Dichtelmuller (1983) и R. Rufenacht, А. Morell (1991) также был зарегистрирован низкий уровень IgG3 в препарате интраглобин [152, 162]. Среди субклассов иммуноглобулина G IgG3 является самым сильным активатором системы комплемента [10], вероятно поэтому препараты Ig Vena N.I.V., цитотект и интраглобин, обладали минимальной АКА. Более высокая АКА препарата сандоглобулин, видимо, обусловлена повышенным содержанием в нем IgGl, который также является сильным активатором комплемента. В обработанных пепсином препаратах иммуновенин и сандоглобулин отмечалось пониженное содержание IgG2, что согласуется с данными G.Robert (1989) о том, что обработка пепсином приводит к снижению уровня субкласса IgG2 [149]. O.E. Beck, P.E. Kaiser (1981) также отмечали пониженное содержание IgG2 в препарате сандоглобулин [48]. Препараты иммуновенин и сандоглобулин отличались повышенным содержанием IgGl.

Таким образом, анализ содержания IgA, IgE и распределения субклассов IgG показал, что разработанный препарат иммуновенин-М по данным показателям не уступает большинству исследованных ВВИГ, зарегистрированных на российском рынке и может быть использован с меньшим риском для лечения больных, склонных к аллергическим реакциям и IgA-дефицитных больных.

Эффективность препаратов ВВИГ определяется содержанием в них AT к различным видам возбудителей. Поэтому во всех анализируемых препаратах были определены титры AT к вирусу простого герпеса, герпес-вирусу человека 8-го типа, вирусу краснухи, антигенам Chlamydophila pneumoniae и Chlamydophila psittaci, Chlamydia trachomatis, цитомегаловирусу, HBs-антигену вируса гепатита В, вирусу Эпштейна-Барр, антигенам рода Trichomonas (Trichomonas vaginalis, Trichomonas tenax), вирусу гепатита A.

Было отмечено, что подвергнутый химической модификации с использованием бета-пропиолактона ВВИГ интраглобин обладал пониженным содержанием AT к большинству проанализированных возбудителей по сравнению с другими исследованными препаратами. J. Romer et al. (1982) также указывали на то, что в результате химического преобразования получают продукты с хорошей толерантностью в отношении внутривенного введения, однако это всегда сопровождается значительным снижением биологической активности [150].

В препаратах ВВИГ были также определены титры аутоантител к денатурированной и неденатурированной ДНК человека и к тиреоглобулину.

Анализ титров антител к различным бактериальным и вирусным антигенам в рассматриваемых ВВИГ показал, что максимальные титры AT к большинству исследованных инфекций наблюдались в препаратах Ig Vena N.I.V., габриглобин и октагам. Однако именно в этих ВВИГ был отмечен самый высокий уровень титров аутоантител.

Одним из основных критериев применения лекарственных препаратов является их эффективность, в частности, ВВИГ должны обладать высокой специфической активностью по отношению к возбудителям инфекций. Разработанный препарат иммуновенин-М по содержанию AT к большинству проанализированных инфекций уступал только трем вышеперечисленным препаратам. При этом уровень титров аутоантител в нем был низким. Иммуновенин-М отличался максимальным ф титром AT к вирусу простого герпеса среди всех проанализированных препаратов, а по содержанию AT к ЦМВ он уступал только габриглобину и имбиоглобулину. Это является свидетельством того, что данная технология может быть использована для производства специфических антицитомегаловирусного и противогерпетического внутривенных иммуноглобулинов.

В ходе анализа полученных данных была обнаружена сильная корреляционная связь (коэффициент корреляции от 0,7 до 1,0) между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина. Вероятно, одна из коррелирующих инфекций может стать тестовой, и по титру антител к ней можно будет судить о величине титров антител к другим коррелирующим инфекциям. Это позволит назначать препараты ВВИТ не только по узким показаниям, для лечения конкретной инфекции, но и для терапии смешанных инфекций.

Также была выявлена сильная корреляционная связь между титрами антител к некоторым возбудителям и уровнем титров аутоантител в препаратах внутривенных иммуноглобулинов. Так, корреляция наблюдалась между титром AT к тиреоглобулину и титрами AT к ЦМВ, вирусу герпеса 8-го типа и Trichomonas vaginalis, а также между титрами AT к денатурированной и неденатурированной ДНК и титрами AT к вирусу краснухи, Эпштейна-Барр, HBsAg, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae.

Поскольку сырьем для получения исследованных ВВИТ была неспецифическая плазма, то возрастание аутоантительной активности в них нельзя связывать с повышенным содержанием AT к определенному fl' виду возбудителей инфекции. Следовательно, можно предположить, что на величину аутоантительной активности препаратов оказывают влияние технологии их получения.

Обнаруженная зависимость между уровнем специфической активности и содержанием аутоантител в препаратах внутривенного иммуноглобулина может стать дополнительным критерием их качества, однако эти данные требуют дальнейшего углубленного изучения.